На правах рукописи

Аклеев Андрей Александрович

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ

ГРАНУЛОЦИТОВ У ЛИЦ, ПОДВЕРГШИХСЯ ХРОНИЧЕСКОМУ

РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ

14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Челябинск – 2014 2

Работа выполнена в научно-исследовательском институте иммунологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Долгушин Илья Ильич доктор медицинских наук, профессор Гребенюк Александр Николаевич

Официальные оппоненты:

Смолягин Александр Иванович доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России, проблемная лаборатория по изучению механизмов естественного иммунитета, заведующий Гусев Евгений Юрьевич доктор медицинских наук, доцент, Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, лаборатория иммунологии воспаления, заведующий

Ведущая организация: Институт иммунологии Федерального медикобиологического агентства России, г. Москва

Защита состоится «19» июня 2014 года в «_» часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации и на сайте:

www.chelsma.ru Автореферат разослан « »_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Ю.С. Шишкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности Одной из важнейших проблем современной иммунологии является анализ влияния различных экологических факторов на иммунный ответ, а также на развитие иммунодефицитов и иммунозависимой патологии.

Особенно велико значение данной проблемы в современных условиях возрастающей техногенной нагрузки на окружающую среду (Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.М. Экологическая иммунология. М.: ВНИРО, 1995.

219 c.; Черешнев В.А. Будущее Российского Севера: доктринальные основы социальной и экологической региональной политики. Вестник Уральской медицинской академической науки. 2005. № 2. С. 54-56.; Смолягин А.И и др.

Экспериментальное исследование влияния бензола и хрома на иммунную систему организма. Иммунология. 2013. № 1. С. 57-60.).

В настоящее время особо пристальное внимание привлекают медикобиологические эффекты хронического радиационного воздействия с низкой мощностью дозы, что обусловлено широким использованием источников ионизирующей радиации (ИР) в промышленности, сельском хозяйстве, медицине и науке. Значительный интерес к проблеме реакций иммунной системы на хроническое радиационное воздействие также обусловлен реальной возможностью пролонгированного облучения человека (например, космонавтов в условиях длительных полетов, населения при террористических актах или после радиационных аварий) (Recommendations of the International Commission on Radiological Protection. Аnnals of the ICRP.

2007. ICRP Publication 103. 332 p.). Как показала авария на АЭС Фукусима-1, современные технологии не в состоянии обеспечить безаварийную работу ядерных реакторов, что может привести к загрязнению обширных территорий радионуклидами, в том числе долгоживущими, и длительному облучению проживающего на них населения.

Необходимо отметить, что в ряде стран (Китай, Индия, Бразилия, Иран и др.) имеются регионы, многие поколения жителей которых подвергаются облучению вследствие повышенного естественного радиационного фона (Boice J.D. et al. Low-dose rate epidemiology of high background radiation areas. Radiat Res. 2010. Vol. 173, № 6. P. 1-6.). Уклад жизни современного человека способствует длительному пребыванию людей в помещениях, где могут создаваться достаточно высокие концентрации радона (Darby S. et al. Radon in homes and risk of lung cancer: collaborative analysis of individual data from 13 European case-control studies. BMJ. 2005. Vol.

330. P. 223-227.). Все это делает проблему хронического низкоинтенсивного радиационного воздействия на иммунную систему современного человека чрезвычайно актуальной и определяет ее как приоритетную в деятельности таких международных организаций, как Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), Международная комиссия по радиологической защите (МКРЗ), Научный комитет по действию атомной радиации Организации Объединенных Наций (НКДАР ООН) и других.

К настоящему времени получены клинические и экспериментальные данные, свидетельствующие о высокой радиочувствительности иммунной системы (UNSCEAR 2006 Report. Effects of ionizing radiation. New York:

United Nations. 2009. Vol. 2. 334 p.). При этом важно отметить, что наиболее хорошо изученными являются ответы иммунной системы человека на острое облучение в высоких дозах (Черешнев В.А. и др. Иммунология комбинированных радиационных поражений. Екатеринбург: Издательство, 1997. 164 с.; Гребенюк А.Н., Легеза В.И. Противолучевые свойства интерлейкина-1. СПб.: Фолиант. 2012. 216 с.), тогда как отдаленные эффекты хронического облучения с низкой мощностью дозы остаются мало исследованными. Имеющиеся результаты показывают, что хроническое радиационное воздействие может индуцировать реакции не только со стороны адаптивного, но и врожденного иммунитета (Godekmerdan A. et al.

Diminished cellular and humoral immunity in workers occupationally exposed to low levels of ionizing radiation. Arch Med Res. 2004. Vol. 35. P. 324-328.;

Кириллова Е.Н. и др. Иммунный статус у работников ПО «Маяк» и жителей г. Озерска. Вопросы радиационной безопасности. 2006. № 2. С. 13-23.). Более того, иммуносупрессия, развивающаяся после хронического облучения, может сохраняться длительное время (Pecaut M.J., Nelson G.A., Gridley D.S.

Dose and dose rate effects of whole-body gamma-irradiation. Lymphocytes and lymphoid organs. In Vivo. 2001. Vol. 15. P. 195–208.).

По мнению Генеральной Ассамблеи ООН (2011) наиболее важным источником информации об эффектах хронического облучения человека является наблюдение за жителями прибрежных сел реки Теча, которые подверглись многолетнему радиационному воздействию с низкой мощностью дозы, но в широком диапазоне доз вследствие сбросов жидких радиоактивных отходов (ЖРО) комбинатом «Маяк» в реку Теча. По результатам эпидемиологических исследований у них отмечен повышенный радиационный риск заболеваемости и смертности от злокачественных опухолей и лейкозов (Krestinina L.Y. et al. Leukaemia incidence in the Techa River Cohort: 1953-2007. BJC. 2013. Vol. 109. P. 2886-2893.; Schonfeld S. et al.

Solid cancer mortality in the Techa River Cohort (1950-2007). Radiat Res. 2013.

Vol. 179. P. 183-189.).

Исходя из важной роли нейтрофилов в поддержании генетического гомеостаза, а также в реализации иммунного надзора и противоопухолевой защиты организма (Долгушин И.И, Андреева Ю.С., Савочкина А.Ю.

Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов. М.: Издательство РАМН, 2009. 207 с.) представляло интерес исследование функционального состояния системы нейтрофильных гранулоцитов у жителей прибрежных сел реки Теча в отдаленном периоде, когда реализуются соматико-стохастические эффекты. Важность исследования определялась также тем, что в условиях длительного сочетанного воздействия внешнего - и внутреннего -излучения дозы на красный костный мозг (ККМ), который является центральным органом иммунопоэза, достигали высоких значений (9 Гр).

Изучить функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у жителей прибрежных сел реки Теча в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия.

Оценить показатели функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов в отдаленные сроки у лиц, подвергшихся хроническому облучению в широком диапазоне доз облучения красного костного мозга. Исследовать их зависимость от мощности дозы и кумулятивной дозы облучения красного костного мозга, а также факторов нерадиационной природы (пол, этническая принадлежность, возраст на время облучения и исследования, наличие сопутствующей патологии, сезон исследования).

Исследовать интенсивность апоптоза нейтрофилов периферической крови, их способность образовывать внеклеточные ловушки, а также содержание гранулоцитарного и гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующих факторов в сыворотке крови у облученных Изучить зависимость показателей адгезивной, фагоцитарной, лизосомальной активности, параметров внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови, интенсивности их апоптоза и способности образовывать внеклеточные ловушки in vitro от дозы острого -излучения у лиц пожилого возраста.

Исследовать влияние фетальных гемопоэтических клеток на функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у облученных лиц с нейтропенией.

Исследование выполнено в соответствии с плановой тематикой научноисследовательских работ ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ в рамках комплексной темы «Роль нейтрофилов в регуляции иммунитета, антимикробной и антистрессорной резистентности организма» (№ государственной регистрации 01201153155). Исследование являлось рандомизированным. Исследуемую группу составили 318 жителей прибрежных сел реки Теча, подвергшихся многолетнему радиационному воздействию в широком диапазоне доз на ККМ (0,08-4,69 Гр, средняя поглощенная доза – 1,09±0,05 Гр). По реакции гранулоцитарного ростка на облучение были выделены подгруппы людей, перенесших ХЛС (37 человек;

средняя поглощенная доза – 0,73±0,1 Гр) и облученных лиц, имевших на время обследования нейтропению (25 человек; средняя поглощенная доза – 1,43±0,21 Гр). Группу сравнения составили 134 человека аналогичного возраста и пола, проживавших в тех же административных районах, доза облучения которых согласно НРБ – 99-2009 не превышала допустимые пределы для населения России.

Исследование функциональной активности нейтрофилов периферической крови проводилось с использованием современных иммунологических методов. В целях изучения радиочувствительности отдельных функций нейтрофилов человека данные клетки, выделенные из периферической крови в составе лейкоцитарной взвеси или чистой фракции, in vitro подвергались острому -облучению в дозах 0,1; 0,25; 1; 4 и 10 Гр.

Кроме того, в рамках ограниченного клинического исследования, проведенного в ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России, проспективно оценивалось влияние фетальных ГК на функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов периферической крови у пациентов с отдаленной нейтропенией. Протокол исследования одобрен этическим комитетом ФГБУН УНПЦ РМ (Протокол от 17.03.2008 года).

Статистическая обработка полученных данных проводилась методами непараметрической статистики с использованием пакетов прикладных программ Statistica 6.0 и SPSS 22.0.

Степень достоверности, апробация результатов и личное участие Достоверность полученных результатов обусловлена достаточным объемом выборки, четко сформулированными критериями включенияисключения в исследование, подбором сопоставимой по нерадиационным факторам группы сравнения, использованием адекватных поставленным задачам иммунологических методов исследования и современного сертифицированного оборудования, применением современных методов статистического анализа.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 9-ой Российской конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011 г.), Международной конференции «Медико-биологические проблемы действия радиации» (Москва, 2012 г.), 13-th International Congress of the International Radiation Protection Association (Glasgow, Scotland, 2012), 10-ой Российской конференции иммунологов Урала (Тюмень, 2012 г.), 57-th annual meeting of the Health Physics Society (Sacramento, USA, 2012), 7-ой Всероссийской конференции с международным участием «Иммунологические чтения в г.

Челябинске» (Челябинск, 2012 г.), 39-th annual meeting of the European Radiation Research society (Italy, Vietri sul Mare, 2012), Региональной научнопрактической конференции, посвященной 15-летию биологического факультета ЧелГУ (Челябинск, 2013 г.), 4-ой Международной научнопрактической конференции молодых ученых (Челябинск, 2013 г.), Global Conference on Radiation Topics (Germany, Munich, 2013), 8-ой Всероссийской конференции с международным участием «Иммунологические чтения»

(Челябинск, 2013 г.).

Автор принимал непосредственное участие в разработке дизайна исследования, формулировании его цели и задач. Автором лично проведен анализ современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, сформированы исследуемые группы, проведено иммунологическое исследование, анализ и статистическая обработка первичных данных, их интерпретация, результаты представлены в научных публикациях и докладах на конференциях, подготовлена диссертация.

1. Система нейтрофильных гранулоцитов человека в условиях хронического облучения красного костного мозга (максимальная поглощенная доза 4,69 Гр) обладает достаточно высокой радиорезистентностью.

2. Адгезивная, фагоцитарная, лизосомальная активность, внутриклеточный кислородзависимый метаболизм и апоптоз нейтрофилов периферической крови человека in vitro характеризуются высокой толерантностью к острому -излучению, тогда как способность активированных пирогеналом нейтрофилов образовывать внеклеточные ловушки стимулируется малыми дозами радиации (0, 3. Инфузия фетальных гемопоэтических клеток облученным лицам с нейтропенией (доза 1,4106/кг массы тела пациента) на фоне кратковременного повышения относительного содержания нейтрофилов в крови и сывороточного гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующего фактора вызывает угнетение их фагоцитарной активности.

Впервые в отдаленные сроки (через 60 и более лет после начала облучения) у жителей прибрежных сел реки Теча, включая лиц, перенесших ХЛС, и имеющих в отдаленные сроки нейтропению, был проведен комплексный анализ системы нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, который включал оценку их функционального состояния, интенсивности апоптоза и способности образовывать внеклеточные ловушки.

На фоне снижения числа нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови у облученных лиц установлено компенсаторное повышение уровня КСФ-ГМ в сыворотке крови. Нарушения функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов (супрессия лизосомальной активности и активация внутриклеточного кислородзависимого метаболизма) были наиболее выраженными у облученных людей с нейтропенией. Спонтанная интенсивность апоптоза и способность нейтрофилов периферической крови образовывать внеклеточные ловушки у облученных лиц в отдаленные сроки не отличались от таковых в группе сравнения. Выявленные изменения в системе нейтрофильных гранулоцитов, как правило, не зависели от мощности и дозы облучения ККМ, что свидетельствовало о существенном влиянии в отдаленном периоде факторов нерадиационной природы. Не получено убедительных доказательств, что отдаленная нейтропения у облученных лиц является следствием угнетения гранулоцитопоэза в период максимального радиационного воздействия.

Впервые исследована зависимость интенсивности апоптоза нейтрофилов периферической крови и их способности образовывать внеклеточные ловушки in vitro от дозы острого -излучения. Установлено, что активация нейтрофилов пирогеналом стимулирует образование НВЛ при облучении в малых дозах (0,1 Гр), тогда как средние (0,25 и 1 Гр) и большие (4 и 10 Гр) дозы не влияли на способность активированных нейтрофилов образовывать НВЛ. Не было отмечено влияния -излучения в диапазоне доз 0,1-10 Гр на интенсивность апоптоза нейтрофилов у пожилых людей in vitro.

Впервые по результатам проспективного наблюдения (более трех лет) оценено влияние фетальных ГК на функциональное состояние нейтрофилов периферической крови у пациентов с нейтропенией. Отмечено существенное снижение активности фагоцитоза нейтрофилов, достигавшей минимальных значений через 13-36 мес. после введения фетальных ГК.

Теоретическая и практическая значимость работы Исследование позволило оценить функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов у людей, подвергшихся хроническому облучению в широком диапазоне доз на фоне инволюционных процессов.

Значимость работы определяется комплексным анализом системы нейтрофильных гранулоцитов человека после многолетнего облучения ККМ, что позволяет оценить возможную роль этой системы в формировании отдаленных радиационных последствий. В исследованиях in vitro показано, что функциональная активность зрелых нейтрофильных гранулоцитов является достаточно резистентной к действию острого -излучения.

Выявленное иммуносупрессивное действие фетальных ГК предполагает разработку строгих показаний для терапии стволовыми клетками (СК) и регулярный мониторинг функционального состояния нейтрофилов периферической крови.

Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования используются в учебной деятельности на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, на кафедре радиобиологии ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет»

Министерства образования и науки РФ, а также в практической деятельности ФГБУН «Уральский научно-практический центр радиационной медицины»

Федерального медико-биологического агентства.

Соискатель имеет 17 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 13 научных работ общим объемом 3,3 печатных листа, в том числе 4 статьи в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, а также 4 работы в зарубежных научных изданиях; 7 работ опубликованы в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов.

Диссертация изложена на 159 страницах компьютерного текста и включает 24 таблицы, 15 рисунков, 1 фотографию. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего работы отечественных и 110 иностранных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Исследование показателей функционального состояния нейтрофилов у облученных лиц осуществлялось на базе НИИ иммунологии ГБОУ ВПО ЮУГМУ Министерства здравоохранения Российской Федерации и клиникофизиологической лаборатории ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России.

Планирование и разработка дизайна исследования проводилась автором совместно с руководителями диссертационной работы. Исследование являлось рандомизированным. Случайная выборка включала 318 жителей прибрежных сел реки Теча, многолетнее облучение которых произошло в результате сбросов ЖРО комбинатом «Маяк» в реку Теча. Облучение носило сочетанный (внешнее -излучение и внутреннее -излучение за счет остеотропного 90Sr) характер. Максимальные значения поглощенной дозы пришлись на ККМ и достигали 4,69 Гр (диапазон индивидуальных значений – 0,08-4,69 Гр). Наибольшая мощность дозы облучения ККМ имела место в период максимальных сбросов в 1951 году, достигая 1,26 Гр. Группу сравнения составили 134 человека аналогичного возраста и пола, проживавших в тех же административных районах, доза облучения которых не превышала согласно НРБ-99/2009 допустимые пределы для населения России.

Различия в реакции гранулоцитарного ростка кроветворения на хроническое облучение в раннем и отдаленном периоде позволили выделить подгруппу облученных людей, перенесших ХЛС (37 человек), и подгруппу облученных лиц, имевших на время обследования нейтропению (число нейтрофилов в периферической крови менее 2109/л) – 25 человек.

Максимальные дозы облучения ККМ отмечались у лиц с нейтропенией (1,43±0,21 Гр), а минимальные – у лиц, перенесших ХЛС (0,73±0,10 Гр).

Третью подруппу составили 256 облученных лиц, не имевших в анамнезе ХЛС и нейтропении на время исследования (поглощенная доза облучения ККМ – 1,10±0,05 Гр). Расчет индивидуализированных доз облучения был проведен сотрудниками биофизической лаборатории ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России (зав. лабораторией – М.О. Дегтева).

Объектом исследования являлись нейтрофильные гранулоциты периферической крови. Оценивались показатели функционального состояния нейтрофилов, выделенных из периферической крови в составе лейкоцитарной взвеси или чистой фракции. Исследование фагоцитарной, лизосомальной активности (Фрейдлин И.С. Методы изучения фагоцитирующих клеток при оценке иммунного статуса человека.

Ленинград, 1986. 37 с.) и внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов (Маянский А.Н., Виксман М.К. Способ оценки функциональной активности нейтрофилов человека по реакции восстановления нитросинего тетразолия: Методические рекомендации.

Казань, 1979. 11 с.) проводилось в лейкоцитарной взвеси. Параметры адгезивной способности (Зурочка А.В. Иммунобиологические свойства секреторных продуктов нейтрофилов (нейтрофилокинов): Дис. … д-ра мед.

наук. Челябинск, 1991. 231 с.), интенсивность апоптоза нейтрофилов (Vermes I., Haanen C., Reutelingsperger C. Flow cytometry of apoptotic cell death. JIM.

2000. № 243. P. 167-190.) и их способность образовывать внеклеточные ловушки (Долгушин И.И., Андреева Ю.С. Способ обнаружения НВЛ: патент на изобретение. № 2384844 от 01.04.2008.) определялись в чистой фракции нейтрофилов. Уровни КСФ-Г и КСФ-ГМ определялись методом ИФА в сыворотке крови пациентов (Кишкун А.А. Иммунологические исследования и методы диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике.

М.: Медицинское информационное агентство, 2009. 712 с.).

Зависимость «доза-эффект» оценивалась in vitro для следующих функций нейтрофилов: фагоцитарной, адгезивной и лизосомальной активности, параметров внутриклеточного кислородзависимого метаболизма, интенсивности апоптоза, а также их способности образовывать НВЛ. Для этого лейкоцитарную взвесь или чистую фракцию нейтрофилов, полученные от 10 человек группы сравнения (возраст 63-84 года), подвергали острому облучению в дозах 0,1; 0,25; 1; 4 и 10 Гр. Облучение проводилось на исследовательской установке ИГУР-1 (мощность дозы – 0,7 Гр/мин., источник -излучения – 137Cs).

Применение фетальных ГК для коррекции нейтропении у облученных лиц осуществлялось на базе клинико-физиологической лаборатории ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России (зав. лабораторией – Возилова А.В.) в рамках ограниченного клинического исследования. Протокол исследования утвержден Ученым Советом ФГБУН УНПЦ РМ и одобрен этическим комитетом ФГБУН УНПЦ РМ (Протокол от 17.03.2008 года). Фетальные ГК, предоставленные лабораторией клеточных технологий Томского НИИ курортологии и физиотерапии ФМБА России, вводились однократно внутривенно капельно (доза 1,4106 кл/кг массы тела пациента). Оценка влияния фетальных ГК на функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов выполнялась непосредственно автором на базе НИИ иммунологии ЮУГМУ. Исследуемая группа включала 12, а группа сравнения 7 облученных лиц, имевших на момент обследования отдаленную нейтропению. Исследование состояния нейтрофильных гранулоцитов проводилось в динамике через 6 и 12 мес., а затем ежегодно.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием непараметрических методов статистического анализа.

Сравнение несвязанных групп проводилось при помощи U-критерия МаннаУитни. Анализ частот встречаемости тех или иных явлений в исследованных группах проводился с использованием критерия 2. Сравнение трех и более связанных групп осуществлялось методом рангового дисперсионного анализа по Фридмену с вычислением коэффициента конкордации Кендалла (Реброва О.Ю. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.:

Медиа Сфера, 2002. 312 с.). Зависимость показателей функционального состояния нейтрофилов от дозовых характеристик оценивалась методом непараметрического корреляционного анализа по Спирмену и линейного регрессионного анализа. Для оценки влияния комплекса факторов радиационной и нерадиационной природы на состояние системы нейтрофилов использовался многофакторный дисперсионный анализ.

Статистическую обработку данных проводили при помощи табличного редактора Microsoft Excel 2010, а также пакетов прикладных программ Statistica 6.0 и SPSS 22.0.

Результаты собственных исследований Показатели функциональной активности и интенсивности апоптоза нейтрофилов у жителей прибрежных сел реки Теча В отдаленные сроки у лиц, подвергшихся хроническому