На правах рукописи

АРСЛАНОВА

Динара Ришатовна

СИСТЕМА «ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ - АНТИОКСИДАНТЫ»

У КРЫС НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ОНТОГЕНЕЗА И КАНЦЕРОГЕНЕЗА

03.00.13 – физиология

16.00.02 – патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ульяновск – 2009

Работа выполнена на кафедре физиологии и патофизиологии в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет Научные руководители:

Доктор биологических наук, Генинг Татьяна Петровна профессор кандидат медицинских наук, доцент Антонеева Инна Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Балашов Владимир Павлович професcор доктор биологических наук, Каталымов Леонид Лазаревич профессор Государственное образовательное

Ведущая организация:

учреждение высшего профессионального образования Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет

Защита диссертации состоится « 11 » июня 2009г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 212.278.07 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет по адресу: ул. Набережная реки Свияги,106, корпус 1, аудитория 703.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ульяновского государственного университета, а с авторефератом – на сайте ВУЗа http://www.uni.ulsu.ru Отзывы на автореферат направлять по адресу: 432000, г.Ульяновск, ул.Л.Толстого,42, Ульяновский государственный университет, управление научных исследований

Автореферат разослан «» 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент С.В. Пантелеев

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) - в строго ограниченных пределах - это физиологический процесс, который принимает участие в регуляции клеточных функций [Зенков Н.К.,2001; Сазонтова Т.Г.,2007]. При повышении уровня свободнорадикального окисления возможно быстрое разрушение клеточных структур в результате их повреждения. Показано, что практически все патологические состояния помимо специфического ответа сопровождаются повышенным уровнем ПОЛ [Анисимов В.Н.,2003; Биленко М.В.,1989; Коган А.Х.,1997]. Повреждающим фактором при этом служит избыточный уровень активных форм кислорода (АФК), которые меняют свою физиологическую, сигнальную роль на патогенетическую. Одним из универсальных механизмов защиты клетки от избыточного ПОЛ является многоуровневая система антиоксидантов. Оценить баланс прооксидантов и антиоксидантов позволяет соотношение ПО-АО [Лю Б.Н.,2003].

На сегодня показано, что процесс физиологического старения организма носит многофакторный, многоочаговый, необратимый характер. Современная свободнорадикальная теория старения предполагает, что наступающая с возрастом дезадаптация связана с повреждениями важных биомолекул продуктами ПОЛ [Лю Б.Н., 2003;Harman D.,1994; Liu L.Z.,2006]. В ходе многочисленных экспериментов выяснено, что митохондрии – наиболее уязвимое и основное «стартовое» звено в старении клетки [Скулачев В.П., 2001; Gershon D.,1999; Lestienne P.,1997]. Внутриклеточная гипероксия, как результат первичного процесса старения митохондрий, становится фактором поражения не только всех субклеточных структур, но внеклеточных образований.

Полагают также, что модификация структуры плазматической мембраны – один из наиболее вероятных механизмов нарушения регуляции тканевого метаболизма при старении [Голубев А.Г.,1996]. Исследование параметров системы ПОЛ-АО в крови, тканях печени, мозга у животных разных возрастных групп позволило определить существенную роль избыточности процессов пероксидации и недостаточности антиоксидантной защиты в возрастных перестройках этих тканей [Анисимов В.П.,1999;

Гусев В.А.,1997; Tian L.,1998]. Однако работ, посвященных возрастной динамике в системе ПОЛ-АО в яичнике, являющимся органом, рано подверженным инволютивным процессам, нет.

Накопление соматических мутаций в клетке, как результат воздействия эндогенных метаболитов вообще и продуктов повышенного ПОЛ в частности, может представлять один из механизмов патогенеза – общий для процессов старения и канцерогенеза [Имянитов Е.Н.,1999; Anisimov V.N., 1998; Cortopassi P.,1995; Nusbaum N.J.,1998].

Злокачественный рост, который является болезнью регуляции, в первую очередь регуляции размножения и дифференцировки, может сопровождаться изменениями или сбоями в работе системы ПОЛ-АО [Горожанская Э.Г., 2002; Кондакова И.В.,2005;

Desuoki M.M.,2005; Франциянц Е.М.,1995]. Установлено, что как для малигнизации, так и для поддержания трансформированного состояния клеток активно растущих участков опухоли необходимо создание внутри клеток гипероксических условий [Лю Б.Н.,2004].

Однако оксидативный стресс, наблюдаемый в неопластической клетке, может возникнуть не только при избыточности активных форм кислорода, но и при недостаточности антиоксидантов.

Существует мнение, что дисбаланс в системе продукции и инактивации АФК может с одной стороны вызывать изменения функциональной активности яичников в процессе онтогенеза, а с другой, являться одной из причин, провоцирующей канцерогенную ситуацию [Антонеева И.И.,2006; Франциянц Е.М.,1995]. Однако в доступной литературе отсутствуют данные, позволяющие оценить динамику компонентов системы ПОЛ-АО в яичнике в онтогенезе и на различных стадиях канцерогенеза.

Целью настоящей работы явилось изучение системы «перекисное окисление липидов-антиоксиданты» у крыс на разных стадиях онтогенеза и канцерогенеза.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить динамику активности компонентов системы «перекисное окисление липидов - антиоксиданты» в ткани яичников, плазме крови и эритроцитах у крыс в процессе онтогенеза.

2. Оценить уровень митоза и апоптоза в покровном эпителии яичника крыс на разных стадиях онтогенеза.

3. Определить изменения в системе ПОЛ-АО в опухолевых клетках, асцитической жидкости, плазме крови и эритроцитах животных-опухоленосителей с асцитной опухолью яичника на разных стадиях канцерогенеза.

4. Изучить динамику в системе ПОЛ-АО в опухолевых клетках, асцитической жидкости, плазме крови и эритроцитах у животных-опухоленосителей на разных стадиях онтогенеза.

Научная новизна: Получены новые данные об изменении системы ПОЛ-АО в яичниках крыс в процессе индивидуального развития и при прогрессировании асцитной опухоли яичника у крыс. Также впервые оценен уровень ферментативного звена АОС (супероксиддисмутазы, каталазы, глутатион-редуктазы) в плазме и эритроцитах крови животных-опухоленосителей. Проведены морфологические исследования покровного эпителия яичника крыс в процессе старения органа. Впервые установлена корреляционная связь между накоплением продукта ПОЛ - МДА в яичниках крыс с возрастом животных, а также с уровнем митоза и апоптоза в покровном эпителии яичников. Проведена оценка параметров системы ПОЛ-АО в опухолевых клетках, асцитической жидкости, плазме крови и эритроцитах крыс с асцитной опухолью яичников в логарифмическую и терминальную фазу процесса в разных возрастных группах.

Научно-практическая значимость. Результаты работы о роли липопероксидации в онтогенезе могут быть использованы в теоретической и прикладной геронтологии при разработке теории старения и методов коррекции оксидативного стресса на поздних этапах онтогенеза. Данные полученные в результате оценки уровня ПОЛ в ткани яичников на разных этапах онтогенеза и канцерогенеза могут быть использованы в онкогинекологии при оценке факторов риска заболевания раком яичников. Полученные показатели митотического и апоптотического индексов в клетках покровного эпителия яичников, а также данные по оценке их коррелятивных связей с динамикой МДА могут быть использованы в возрастной физиологии при оценке функций репродуктивной системы. Результаты изучения активности ферментативного звена антиоксидантной системы в опухолевой ткани, асцитической жидкости, плазме и эритроцитах животныхопухоленосителей могут быть использованы в теоретической и практической онкогинекологии, а также в экспериментальной онкологии животных при разработке терапевтических схем на разных стадиях опухолевого процесса.

Положения, выносимые на защиту:

1. В ходе индивидуального развития в яичниках и крови крыс происходят разнонаправленные изменения в системе ПОЛ-АО. Старение яичника сопровождается накоплением МДА и снижением активности ферментов антиоксидантной защиты.

Наиболее выраженный дисбаланс в системе ПОЛ-АО в ткани яичников наблюдается у старых животных в возрасте 21 месяц.

2. На исследуемых этапах онтогенеза (4,9,15,21 месяц) одновременно с нарастанием уровня МДА в ткани яичников крыс в покровном эпителии отмечено снижение митотического и возрастание апоптотического индексов.

3. Функционирование системы ПОЛ-АО в клетках асцитной опухоли яичников зависит от стадии роста опухоли. На терминальной стадии по сравнению с логарифмической наблюдается усиление окислительного стресса, что проявляется в снижении активности СОД и каталазы на фоне увеличения содержания МДА.

4. Рост асцитной опухоли яичников сопровождается увеличением уровня МДА в асцитической жидкости, плазме крови и эритроцитах. У молодых животныхопухоленосителей (4 месяца) по мере прогрессирования опухоли степень и направленность динамики ферментов антиоксидантной защиты в эритроцитах, плазме и асцитической жидкости отлична от аналогичных показателей животных 15 месяцев.

5. Динамика активности компонентов системы ПОЛ-АО в яичниках крыс в процессе онтогенеза сходна с таковой в процессе канцерогенеза.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на Всероссийской научной конференции «Механизмы индивидуальной адаптации» (Томск, 2006), конгрессe с международным участием «Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении» (Турция, 2006), на 2-й Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2007), Всероссийской конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторноприспособительных процессов» (Новосибирск, 2007), Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на севере» (Сыктывкар,2008), VIII Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар,2009).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации: диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 97 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 рисунками и 8 таблицами. Список используемой литературы содержит 172 источника, из которых 89 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования послужили инбредные крысы возраста 4 месяцев – начало репродуктивного периода (молодые), 9 месяцев – пик репродуктивной активности (взрослые), 15 месяцев – начало снижения репродуктивной функции (стареющие), месяц – отсутствие циклической деятельности яичников (старые) по классификации Фролькиса В.В.[1982].

Для биохимического исследования использовалась ткань яичников и стабилизированная кровь, которая после центрифугирования 10 мин при 3000 оборотов разделялась на плазму и эритроцитарную массу. Гомогенат яичников готовился на TrisHСl-буфере, рН=7,4.

Интенсивность ПОЛ оценивали по уровню вторичного продукта – МДА в тесте с тиобарбитуровой кислотой [Андреева Л.И.,1988]. При высокой температуре в кислой среде малоновый диальдегид (МДА) реагирует с 2-тиобарбитуровой кислотой, образуя окрашенный триметиновый комплекс, содержащий 1 молекулу МДА и 2 молекулы ТБК с максимумом поглощения при 535 нм.

Метод изучения активности СОД в биологическом материале основан на способности этого антиоксидантного энзима конкурировать с нитросиним тетразолием (НСТ) за супероксидный анион. Эти анионы образуются в результате аэробного взаимодействия восстановленной формы НАДН2 с феназин-метасульфатом (ФМС). В результате этой реакции НСТ восстанавливается с образованием гидразин тетразолия. В присутствии СОД процент восстановления НСТ уменьшается. По расчетному проценту торможения Т%, Т%=(Еф-Еоп)/(Еф-Ек) – определяется процент торможения НСТ [Дубинина Е.Е.,1989; Nishikimi M.,1972].

Определение активности каталазы основано на определении скорости утилизации Н2О2 в реакционной смеси, в которую вносится биологический материал, содержащий фермент. Об интенсивности утилизации Н2О2 судят по скорости снижения экстинции при длине волны 260 нм, на которой Н2О2 имеет максимум светопоглощения [Карпищенко А.И.,1999].

восстановленного НАДФ в присутствии окисленного глутатиона [Асатиани В.С.,1969].

Определение концентрации GSH проводили с использованием дитио-бис-нитробензойной кислоты (ДТНБК). Окисленный глутатион (GSSG) вначале восстанавливали глутатионредуктазой до GSH, а затем определяли в реакции с ДТНБК [Ellman G.L.,1972].

спектрофотометрическим методом и пересчитывались на 1 мг белка для ткани, для эритроцитов - с учетом разведения (1:100). Белок определяли по методу Брэдфорда [Bradford M.M, 1976].

Для морфологического исследования яичник животного, освобожденный от жировой ткани, помещался в 10% нейтральный формалин. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм окрашивались стандартно гематоксилин-эозином. Апоптотический индекс определяли как частоту клеток с апоптотической морфологией ядра. Апоптотические клетки выглядят как округлые или овальные скопления интенсивно эозинофильной цитоплазмы с плотными фрагментами ядерного хроматина [Погорелов В.М.,1995]..

Митотические изменения также оценивались по фигурам митоза. Индексы митоза и апоптоза подсчитывались на 500 клеток эпителия при увеличении х1000.

Для моделирования опухоли использованы инбредные крысы в возрасте 4 месяцев массой 120 г (n=16) и 15 месяцев массой 220 г (n=18), которым внутрибрюшинно перевивали штамм ОЯ (асцитная опухоль яичника, банк опухолевых штаммов РОНЦ им. Блохина) в объеме 0,5 мл 9-дневного инокулята (АЖ с опухолевыми клетками) + 0, мл питательной среды 199 на 100 гр массы животного.

Прогрессирование данного типа опухоли проходит в три этапа: логарифмическая (с 4-х суток после перевивания), стационарная (с 9-х суток) и терминальная (с 14-х суток) фазы. На 4-е сутки отмечался рост опухоли. На 5-е и 14-е сутки у животныхопухоленосителей под эфирным наркозом забирались асцитическая жидкость с опухолевыми клетками и периферическая кровь. После центрифугирования при оборотов для биохимического и цитологического исследования использовались асцитическая жидкость, не содержащая опухолевых клеток, и взвесь опухолевых клеток, разведенных в 10 раз физиологическим раствором. В этом материале, а также в отмытых эритроцитах определялись активность каталазы [Карпищенко А.И.,1999], супероксиддисмутазы [Дубинина Е.Е.,1989], содержание малонового диальдегида (МДА) [Андреева Л.И.,1988], глутатион-редуктазы [Асатиани В.С.,1969]. Белок определяли по методу Брэдфорда [Bradford M.M.,1976].

Статистическая значимость полученных результатов оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни и корреляционного критерия Спирмена (Stata