На правах рукописи

РАЛКОВ Иван Александрович

ВЛИЯНИЕ ИНТЕГРАЦИИ ГЕННЫХ КОНСТРУКЦИЙ

MT1-GRF И WAP-hGH НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ И

ХОЗЯЙСТВЕННО-ПОЛЕЗНЫЕ ПРИЗНАКИ ТРАНСГЕННЫХ

СВИНЕЙ РАЗНЫХ ПОКОЛЕНИЙ

03.02.07 – ГЕНЕТИКА

03.03.01 - ФИЗИОЛОГИЯ

АВ Т ОР ЕФЕ Р АТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы-2011

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

доктор сельскохозяйственных наук, Научные руководители:

академик РАСХН Эрнст Лев Константинович;

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАСХН Зиновьева Наталия Анатольевна доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Калашникова Любовь Александровна;

доктор биологических наук, профессор Шихов Игорь Яковлевич Ведущее учреждение – ФГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита состоится июля 2011 года, в 10 часов, на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы, ГНУ ВИЖ.

т/факс (4967)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «» июня 2011 года.

Ученый секретарь Совета Д 006.013.03 И.В. Гусев 1. ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Разработка методов интеграции чужеродных генов в геном организмов открыла новый этап исследований в области генетики сельскохозяйственных животных (Hammer R.E. et al., 1985, Brem G.

et al., 1985). С использованием таких методов были получены трансгенные животные разных видов (Church R.B., 1989, Brem G. et al., 1993, Pursel V.G. et al., 1993, Зиновьева Н.А. и др., 1998, Эрнст Л.К. и др., 2002), что явилось доказательством возможности функционирования интегрированных единиц наследственности в организме реципиента. Благодаря технологиям трансгенеза человек получил совершенно новые, неизмеримо более эффективные системы изменения генома животных (Эрнст Л.К. и др., 1993, Эрнст Л.К., 1995). На современном этапе развития науки перспективным является создание трансгенных животных, обладающих заданными продуктивными качествами (Эрнст Л.К., Зиновьева Н.А., 2008). Вместе с тем, взаимодействие интродуцированной конструкции и генома-хозяина не может быть сведено к простому суммированию различных генетических задатков.

Интеграция чужеродных генов, являясь по своей природе сходной мутации (инсерции), может привести к изменению в системе морфологических корреляций, затрагивая, тем самым, известную область процессов индивидуального развития, а не изолированный процесс отдельного признака (Кленовицкий П.М., 1997, Калашникова Л.А., 1998).

Исходя из выше изложенного, актуальным является изучение биологических и продуктивных особенностей живых организмов, стабильно интегрировавших чужеродную ДНК.

Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы явлось изучение влияния интегрированных в геном генных конструкций рилизингфактора гормона роста человека (MT1-GRF) и гормона роста человека (WAPhGH) на физиолого-биохимические и иммунологические особенности, а также хозяйственно-полезные признаки трансгенных свиней разных поколений.

Для достижения цели диссертационной работы были поставлены следующие задачи:

Выполнить исследование уровня соматотропина в крови свиней, трансгенных по WAP-hGH, MT1-GRF (генерации II и VIII), а так же их аналогов.

Изучить особенности роста и развития опытных и контрольных свиней.

Оценить биохимический статус трансгенных свиней и их аналогов.

Изучить особенности гуморального иммунитета трансгенных свиней в норме и при повышенной иммунной нагрузке (вакцинация комплексной вакциной ОКЗ).

Выполнить гистологические и морфометрические исследования некоторых внутренних органов и тканей опытных и контрольных свиней в пренатальный и постнатальный периоды.

Изучить показатели мясной и откормочной продуктивности опытных и контрольных свиней.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование свиней, трансгенных по генной конструкции MT1-GRF 2-й и 8-й генераций, а так же свиней, трансгенных по WAP-hGH 4-й генерации. Показано стабильное сохранение повышенного уровня соматотропина в сыворотке крови трансгенных свиней разных генераций. Установлено влияние интеграции и экспрессии трансгенов на изменение ряда физиологобиохимических показателей индивидуумов: показателей сыворотки крови, характеризующих уровень обмена веществ (концентрации общего белка, активности АЛТ и АСТ, содержания полиненасыщенных жирных кислот), гистологических и морфометрических показателей внутренних органов в пренатальный (поздний плодный) и постнатальный периоды (диаметр мышечных волокон, диаметр фолликулов щитовидной железы), титров антител к возбудителям острых кишечных инфекций в норме и при повышенной иммунной нагрузке (вакцинация комплексной вакциной ОКЗ).

Практическая значимость. Показано сохранение интеграции и экспрессии трансгенов в ряде поколений, что служит основой создания стабильных линий трансгенных животных. Установлены повышенные темпы роста свиней, трансгенных по MT1-GRF, начиная с возраста 200 дней, что позволяет их рекомендовать для откорма до тяжелых кондиций.

Повышенный уровень соматотропина в крови трансгенных свиней Более высокие темпы роста свиней, трансгенных по MT1-GRF, при откорме до тяжелых кондиций Изменение некоторых биохимических показателей крови трансгенных свиней Повышение содержания антител к антигенам возбудителей острых кишечных заболеваний у трансгенных свиней по сравнению с аналогами Изменение гистологических и морфометрических показателей некоторых внутренних органов трансгенных свиней.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на конференциях:

III международной научно-практической конференции «Современные технологические и селекционные аспекты развития животноводства России», п. Дубровицы, ВИЖ, 2005;

конференции Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, п. Дубровицы, май 2011 г.

Структура и объем работы. Диссертация написана на 105 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит таблиц и 10 рисунков. Список литературы включает 161 источник, в том числе 82 источника на иностранном языке.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ (Достижения науки и техники АПК, Свиноводство).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии в период с 2003 по 2010 гг. по схеме, представленной на рисунке 1.

II III IV

Контрольный откорм до живой массы 110-120 кг Контрольный убой трансгенных и контрольных свиней Сравнительный анализ опытных и контрольных животных Свиньи были получены в экспериментальном хозяйстве института ФГУП э/х «Кленово-Чегодаево» методом искусственного осеменения трансгенных и нетрансгенных маток семенем трансгенных хряков. Для проведения научно-хозяйственного опыта по достижении свиньями живой массы 25-30 кг они были перевезены на физиологический двор ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, где были сформированы группы по принципу одногнездовых аналогов. Откорм проводили до достижения свиньями возраста 280 дней. Кормление осуществляли два раза в день полнорационным комбикормом СК-5 с повышенным (на 20%) за счет добавления рыбной муки уровнем протеина в сравнении с детализированными нормами кормления.

Содержание соматотропина в крови свиней определяли в возрасте 5-и 9и месяцев методом иммуноферментного анализа. Биохимический анализ крови свиней проводили в возрасте 9-и месяцев совместно с сотрудниками лаборатории биохимии ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии. Для изучения иммунного ответа животные были вакцинированы вакциной ОКЗ, согласно наставлению по применению, с последующей ревакцинацией (исследования были проведены совместно с лабораторией болезней молодняка МГАВМиБ им. К.И. Скрябина под руководством академика Воронина Е.С.). По окончании опыта и при достижении свиньями живой массы 110-120 кг в условиях убойного пункта фермы «Дубровицы» был произведен контрольный убой подопытных животных по методике ВИЖ с детальным изучением развития и гистологической структуры некоторых внутренних органов, анатомо-морфологического состава туш.

Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым