На правах рукописи

Туровский Егор Александрович

ИССЛЕДОВАНИЕ КАЛЬЦИЕВОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

БЕЛЫХ АДИПОЦИТОВ. КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ,

СОПРЯЖЕННЫХ С IP3- И РИАНОДИНОВЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ

03.01.02 – Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино – 2012 -1

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук.

Пущинском Государственном естественно-научном институте

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Долгачева Людмила Петровна

Официальные оппоненты:

Новоселов Владимир Иванович – доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки РАН, главный научный сотрудник лаборатории механизмов рецепции Гончаров Николай Васильевич – доктор биологических наук, НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА России, ведущий научный сотрудник лаборатории аналитической токсикологии.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук.

Защита диссертации состоится «15» ноября 2012 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан «» октября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Смолихина Татьяна Ивановна

-2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ожирение рассматривается как один из основных факторов высокой смертности населения вследствие развития неалкогольного стеатогепатита, диабета 2-го типа и сердечно-сосудистых заболеваний (Асташкин и Глезер, 2008; Boguszewski et al., 2010). Развитие этих заболеваний при ожирении обусловлено «дислипидэмией» – избытком циркулирующих в крови токсинов – жирных кислот. Гипертрофия и дисфункция белой жировой ткани (WAT) несет в себе большой патогенный потенциал, ввиду ее неспособности эффективно устранять из крови жирные кислоты, а также за счет трансформации эндокринных и иммунных функций жировой ткани (Bays et al., 2008). Известно, что симпатическая нервная система и нейротрансмиттер норадреналин (НА) играют важную роль в процессе липолиза WAT (Tavernier et al., 2005). Модулирующий эффект норадреналина на функции жировой клетки является комплексным и вовлекает не только различные подтипы адренорецепторов, но и различные системы трансдукции сигналов. В ряде работ показано, что липолиз, стимулированный норадреналином, обеспечивается активацией -адренорецепторов, аденилатциклазы и синтезом сАМР, а также ключевых липаз HSL и ATGL и фосфорилированием перилипина.

Ингибирование этого процесса обеспечивается в результате активации 2адренорецепторов, гетеротримерного белка Gi, i-субъединицы, ингибирующей аденилатциклазу и синтез сАМР. Важную роль в процессах передачи сигналов от рецептора к мишеням играют и -субъединицы Gi-белков. В последние годы стало известно, что липолиз также может быть стимулирован предсердным натрийуретическим пептидом с последующим накоплением сGMP и активацией протеинкиназы G.

Что касается парасимпатической нервной системы и ее нейротрансмиттера ацетилхолина, то кроме ингибирования процесса липолиза, о его действии на жировые клетки ничего не известно.

Роль Ca2+ в регуляции липолиза и липогенеза белой жировой ткани практически не исследована, несмотря на то, что в роли вторичного мессенджера ионы кальция опосредуют действие более 100 нейротрансмиттеров и гормонов и регулирует многочисленные клеточные функции. Считается, что рост Ca2+ должен приводить к ингибированию липолиза протеинкиназой CaMKII и Ca2+-зависимыми фосфодиэстеразами (PDEIII, IV), снижению концентрации сAMР и cGMP и активности протеинкиназ A и G, соответственно.

Цель исследования. Целью данной работы является получение новых знаний о функционировании системы кальциевой сигнализации белых адипоцитов.

Основные задачи исследования.

1. Исследовать механизмы генерации кальциевых сигналов белыми адипоцитами в культуре в ответ на стимуляцию адренергических и холинергических рецепторов.

2. Изучить механизм действия L-аргинина на кальциевую сигнализацию мускариновых ацетилхолиновых рецепторов;

4. Изучить механизмы конвергенции сигнальных систем, сопряженных с IP3-зависимыми (IP3R) и рианодиновыми (RyR) рецепторами.

Научная новизна работы. В работе показано, что норадреналин, действуя на - и -адренергические рецепторы белых адипоцитов, вызывает 3 типа кальциевых ответов, отличающихся по амплитуде и длительности сигнала. Агонисты 1-адренорецепторов активируют фосфоинозитидный путь передачи сигналов, что приводит к генерации кальциевого ответа типа пик-плато. Для 2-адренергических рецепторов, помимо известного пути ингибирования аденилатциклазы, показано функционирование нового пути передачи сигнала за счет -субъединиц Gi-белков на рианодиновый рецептор эндоплазматического ретикулума, активация которого вызывает импульсное увеличение Са2+ в цитозоле.

Показан механизм возникновения и поддержания кальциевых колебаний, индуцируемых ацетилхолином, в котором ведущее значение имеет рианодиновый рецептор (RyR).

Продемонстрирована конвергенция сигнализации для рецепторов, сопряженных с IP3R и RyR, основанная на том, что гормоны, действуя через рецепторы, сопряженные с G-белком, включают общую схему сигнализации с участием -субъединиц для Gq, Gi и Gs белков, которые активируют одну общую мишень – фосфатидилинозитол 3-киназу (PI3K).

Научно-практическая ценность. Полученные результаты позволяют расширить понимание механизмов сигнализации белых адипоцитов. Исследованная трансдукция сигналов с М3-холинорецепторов и адренергических рецепторов способствует не только пониманию действия ацетилхолина и норадреналина на клетки белого жира, но и может быть использована как потенциальная фармакологическая цель для понимания механизмов возникновения ожирения и связанных с ним нарушений обмена веществ. В силу универсальности PI3K-PKG-RyR пути передачи сигнала и существования множества заболеваний, связанных с нарушениями этого пути, полученные результаты могут стать основой для нового направления фармакологической коррекции этих заболеваний.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация»

(Пущино, 2009, 2011), на конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2008), на школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, 2008), Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2012), IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), а также на Международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика '12» (Пущино, 2012).

работах, из них 5 статей в реферируемых журналах, 5 статей в сборниках и 5 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах с использованием 51 рисунка, 3 таблиц и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы содержит ссылки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПРЕАДИПОЦИТОВ БЕЛОЙ

ЖИРОВОЙ ТКАНИ. Все операции по выделению преадипоцитов из белой жировой ткани мышей линии NMRI (возраст 5–6 недель) производились в стерильных условиях на льду. Процедура выделения и культивирования клеток подробно описана в нашей работе (Туровский, 2011). Полученную суспензию преадипоцитов ресуспендировали в культуральной среде, включающей DMEM (Sigma), 10% FBS (Gibco), 4мМ L-Glutamine acid (Sigma), 4нм инсулина (Sigma), 0,004% гентамицина и 0,25мкг/мл аскорбата натрия (Sigma), и наносили на круглые покровные стекла диаметром 25мМ из расчета 30000 клеток на 1 стекло в объеме 100 мкл и помещали в 35мм чашки Петри. Культивировали во влажной атмосфере СО2-инкубатора (5% СО2 и 95% воздуха). Для ингибирования пролиферации фибробластов использовали 10нM цитозин-арабинозида. В экспериментах использовали культуру в возрасте 9 дней (9 DIV). Белые адипоциты в культуре идентифицировали по морфологическим признакам: форма клеток и наличие жировых включений в цитоплазме.

ИЗМЕРЕНИЯ УРОВНЯ ЦИТОЗОЛЬНОГО КАЛЬЦИЯ МЕТОДОМ

ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ. Эксперименты проводили с помощью флуоресцентной станции на базе инвертированного микроскопа Axiovert 200M, оснащенного монохромной CCD-камерой AxioCam HSM (Carl Zeiss, Германия) и системой высокоскоростной смены возбуждающих светофильтров Ludl MAC5000. В эксперименте получали серии изображений культуры белых адипоцитов с интервалом 3 секунды. При измерении уровня цитозольного кальция и NO использовались объектив Plan Neofluar 10/0,3 и 20/0,7. Для регистрации уровня цитозольного кальция использовали зонд Fura-2. Флуоресценцию Fura-2 в двух длинах волн возбуждали с помощью светофильтров BP 340/30 и BP 387/15.

Регистрацию проводили в диапазоне 465–555нм. После предварительного вычитания фонового сигнала рассчитывали отношение интенсивности флуоресценции Fura-2 при возбуждении в 340 и 380нм (Fura-2, 340/380).

ИЗМЕРЕНИЕ ПРОДУКЦИИ ОКСИДА АЗОТА (NO). Для регистрации продукции NO клеточную культуру белых адипоцитов нагружали 10мкМ DAF FM в течение 40мин при 37оС. Затем клетки дважды промывали HBSS и оставляли на 10мин. После этого вновь промывали HBSS и монтировали в специальную стадиях загрузки зондом и отмывки, а также при аппликации различных агонистов включала 200мкМ L-аргинина для поддержания NO-синтазы в активном состоянии.

Для возбуждения флуоресценции DAF-FM применяли светофильтр BP 475/40. Для регистрации флуоресценции использовали фильтр BP 530/50.

Изображения клеток регистрировали с интервалом в 20 сек. Полученные серии 8-битных изображений анализировали с помощью программы ImageJ.

СИСТЕМА АППЛИКАЦИИ И ОТМЫВКИ ВЕЩЕСТВ. Для аппликации веществ нами была разработана система смены раствора в экспериментальной ячейке. Эта система позволяет осуществлять перфузию со скоростью 10 мл/мин.

Разработанная система позволяет производить добавки известных концентраций агонистов и антагонистов рецепторов, а также растворов других соединений, и осуществлять полную их отмывку.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

УВЕЛИЧЕНИЕ [Ca2+]i ПОД ДЕЙСТВИЕМ НОРАДРЕНАЛИНА. Аппликации норадреналина (НА) к культивируемым белым адипоцитам (9 DIV) в диапазоне концентраций от 300нM до 30мкM инициирует Са2+-ответы (рис. 1А), которые можно разделить на три группы: 1) высокоамплитудный ответ типа пик-плато с полумаксимальной длительностью 27±15 секунд; 2) импульсный ответ с полумаксимальной длительностью 10±0,5 секунд; 3) медленный Са2+-ответ с лагпериодом 3-5 мин. Следует отметить, что каждый из трех типов ответов существенно отличается друг от друга и достоверно воспроизводится.

Известно, что норадреналин действует через различные типы - и адренорецепторов, сопряженных с различными системами трансдукции сигналов.

Для выяснения типа рецепторов, ответственных за формирование каждого из Са2+сигналов был проведен ингибиторный анализ. Преинкубирование адипоцитов с антагонистом 1-адренорецепторов празозином полностью подавляет Са2+-ответы 1го типа (пик-плато) (рис. 1В). Антагонист 2-адренорецепторов – раувольфин препятствует появлению импульсных Са2+-сигналов 2-го типа (рис. 1Г), а антагонист -адренорецепторов – пропранолол, ингибирует медленные ответы 3-го типа (рис. 1Д).

Второй путь доказательства наличия нескольких популяций клеток, отличающихся набором адренорецепторов, основывается на предположении, что каждый из этих рецепторов сопряжен со своей системой передачи сигналов.

Известно, что 1-адренорецепторы сопряжены с фосфоинозитидной системой передачи сигналов и IP3-зависимой мобилизацией Са2+. Ингибирование ключевых молекул этого пути (фосфолипазы С и IP3-рецептора) подавляет ответ 1-го типа (рис. 1Б), и не влияет на генерацию импульсных и медленных сигналов 2-го и 3-го типов.

анализ.

(А) – три типа Са2+-ответов белых адипоцитов на аппликацию норадреналина; (Б) – добавление 400 nM ксестоспонгина С – ингибитора IP3-рецепторов; (В) добавление 3мкM празозина – антагониста 1-адренорецепторов; (Г) – добавление 3мкM раувольфина – антагониста 2адренорецепторов; (Д) – добавление 5мкM пропранолола – антагониста -адренорецепторов;

Антагонисты добавляли за 5 минут до аппликации норадреналина. Эксперименты выполнены на (3-5)-ти клеточных культурах, с 5-ю повторами для каждой культуры.

КАЛЬЦИЕВЫЕ ОТВЕТЫ АДИПОЦИТОВ НА АГОНИСТЫ 1АДРЕНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ. ВКЛАД 1А-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ. Третий

путь доказательства наличия нескольких популяций клеток, отличающихся набором адренорецепторов, состоит в применении агонистов, селективных к отдельным типам адренорецепторов. Селективные активаторы 1-адренорецепторов – фенилэфрин, циразолин и А61603 (1А-адренорецепторы) дозозависимо вызывают кальциевые ответы типа пик-плато (рис. 2А), подобные 1-му типу сигналов при аппликации норадреналина.

свидетельствуют в пользу того, что 1-адренорепторы культивируемых белых адипоцитов инициируют Ca2+-ответы по классическому фосфоинозитидному пути.

Известно, что адипоциты WAT разных видов млекопитающих могут экспрессировать различные подтипы 1-адренорецепторов: 1А, 1B или 1D. Для исследования подтипа 1-адренергических рецепторов, ответственных за генерацию Ca2+-сигнала 1-го типа в белых адипоцитах мыши, нами были использованы селективный агонист 1А-подтипа адренорецепторов – А61603 и селективный антагонист – WB4101, который полностью предотвращает появление Са2+- ответов на аппликацию не только А61603, но и фенилэфрина, и циразолина (рис. 2Б).

Следовательно, 1А-адренорепторы белых адипоцитов мыши играют ведущую роль в реализации Ca2+-ответа по классическому фосфоинозитидному пути.

Рис. 2. Изменение [Ca2+]i при активации 1-адреноргических рецепторов, участие ключевых молекул.

(А) – типичные Са2+-ответы клеток при аппликации селективных агонистов 1-адренорецепторов:

кривая 1 – А61603 (активатор 1А-адренорецепторов), кривая 2 – фенилэфрин, кривая 3 – циразолин; (Б) – ингибиторный анализ: действие антагонистов и ингибиторов ключевых молекул фосфоинозитидного сигнального каскада на амплитуду кальциевого ответа (АКО) при аппликации активаторов 1-адренорецепторов. U73122 – ингибитор фосфолипазы C, фентоламин – антагонист 1,2-адренорецепторов, ксестоспонгин С (XeC) – ингибитор IP3-рецепторов, празозин – антагонист 1-адренорецепторов, BMY7378 – антагонист 1D-адренорецепторов, WB4101 – антагонист 1Аадренорецепторов. В процентах выражена доля клеток, в которых наблюдается подавление амплитуды Са2+-сигналов.

Са2+-ОТВЕТЫ БЕЛЫХ АДИПОЦИТОВ НА АГОНИСТЫ 2АДРЕНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ. ИССЛЕДОВАНИЕ ПУТИ ПЕРЕДАЧИ

СИГНАЛОВ. Более тридцати лет назад с помощью радиолигандных методов были идентифицированы 2-адренорецепторы в белой жировой ткани. Позже установлена их способность подавлять процесс липолиза. Для активации 2-адренорецепторов были использованы селективные агонисты – гуанабенц и UK-14,304 в присутствии физиологической концентрации (200мкМ) L-аргинина (рис. 3А). Са2+-ответы имеют вид быстрых одиночных импульсов, которые отличаются от ответов под действием амплитуды, что указывает на активацию выброса Са2+ из внутриклеточного депо.

Аналогичный Са2+-ответ регистрировали при аппликации норадреналина (2-й тип ответов). Во всех случаях Са2+-сигнал не зависит от присутствия антагонистов 1адренорецепторов и полностью подавляется антагонистами 2-адренорецепторов – раувольфином и иохимбином. Ингибиторы PLC и IP3R не влияли на генерацию Са2+-сигнала в адипоцитах. При этом инкубирование клеток с ингибитором рианодинового рецептора рианодином препятствует появлению кальциевых импульсов на аппликацию селективных 2-агонистов. Кроме этого, преинкубирование клеток с коклюшным токсином, который препятствует диссоциации G-субъединиц Gi-белков (Michal et al., 2007), также ингибирует появление импульсных сигналов. В виду того, что мобилизация Са2+ при активации 2-адренорецепторов происходит не за счет IP3-рецептора, а рианодинового рецептора, активатором которого (по литературным данным) является циклическая АДФ-рибоза, а рецепторы, связанные с активацией Gq-и Gi-белков за счет Gсубъединиц, могут участвовать в активации Akt/PKB (Joshi et al., 2007, McCarthy et al., 2003) мы предположили функционирование сигнального каскада:

Akt/PKBeNOSsGCPKGСD38RyRCa2+, приводящего к высвобождению Са2+ через RyR.

Ингибиторный анализ данного сигнального пути показал, что ингибиторы PI3K – LY294002 и вортманнин подавляли появление Са2+-ответов на активацию 2рецепторов селективными агонистами (рис. 3Б). Ингибиторы NO-синтазы – LNAME и 7NI, а также АДФ-рибозилциклазы (СD38) – никотинамид – препятствовали генерации Са2+-импульсов.

Рис. 3. Изменение [Ca2+]i в ответ на гуанабенц и UK-14,304, участие ключевых молекул.

(А) – генерация Са2+-импульсов при повторной аппликации селективных агонистов 2адренорецепторов не подавляется ингибиторами PLC (U73122) и IP3R (ксестоспонгин С, XeC). (Б) – подавление АКО (в %) на аппликацию 1мкM гуанабенца в присутствии: U73122 – ингибитор PLC, празозин – антагонист 1 –адренорецепторов, ксестоспонгин С (XeC) – ингибитор IP3Rрецепторов, рианодин (Rya)– ингибитор RyR, NAM – конкурентный ингибитор CD38, Wort и LY 294,002 – ингибиторы PI3K.

-9РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДОВАННОЕ ДЕЙСВИЕ L-АРГИНИНА НА БЕЛЫЕ

АДИПОЦИТЫ МЫШИ. В соответствии с литературными данными, L-аргинин оказывает многочисленные эффекты на клетки различных типов.

Продемонстрировано положительное воздействие аргинина на метаболизм животных, страдающих диабетом 2 типа (Fu et al., 2005). Кроме того, в экспериментах на кардиомиоцитах было показано, что наличие в средах выделения клеток небольших концентраций L-аргинина (200мкМ) способствует стабилизации получаемых ответов (Са2+-токов L-каналов) при действии норадреналина и ацетилхолина (Dynnik et al., 2005). Было также показано, что L-аргинин при добавлении в среду инкубации, участвует в регуляции L-токов, действуя через 2-адренорецепторы, PI3K, eNOS и PKG (Ненов и др., 2009).

Преинкубирование белых адипоцитов с 200мкМ L-аргинина в течение 10 и более минут с последующей кратковременной (30–40 сек.) аппликацией миллимолярных (1–10мМ) концентраций L-аргинина (pH=7,4), приводит к генерации кальциевого импульса. После отмывки аргинина и паузы, последующая добавка такой же концентрации L-аргинина приводит к повторному появлению кальциевого ответа, амплитуда которого в среднем может совпадать с первой амплитудой. По типу кальциевого ответа и амплитуде, увеличение [Ca2+]i на добавку L-аргинина крайне похоже на активациею 2-адренорецепторов селективными агонистами (рис. 4А – черная кривая). Ингибиторы PLC и IP3R не влияют на кальциевый ответ, вызываемый аппликацией 10мМ L-аргинина, но, как и в случае с селективными агонистами 2-рецепторов, подавляется селективными антагонистами.

Рис. 4. Импульсное увеличение [Са2+]i в белых адипоцитах мыши.

(А) – увеличение [Са2+]i в белых адипоцитах мыши под действием 1мкМ гуанабенца, 3мкМ UK-14,304 и 10мМ L-аргинина; (Б) – преинкубирование адипоцитов с ингибитором PKG – KT (5мкМ) в течение 5 мин. подавляет генерацию импульсных сигналов на добавку 10мМ Lаргинина. Представлены усредненные ответы клеток. В процентах выражена доля клеток, для которых характерен представленный Са2+-сигнал.

сигнального пути: Akt/PKBeNOSsGCPKGСD38RyRCa2+, что говорит о его действии через 2-адренергические рецепторы на мобилизацию Са2+ через рианодиновые рецепторы ЭПР белых адипоцитов. При этом, в случае инкубирования клеток с ингибитором PKG – KT5822, происходит подавление импульсных Са2+-сигналов на L-аргинин, однако, ответ клеток приобретает вид медленного увеличения [Са2+]i (рис. 4Б), что может быть обусловлено либо действием L-аргинина на аденилатциклазу и увеличение концентрации сАМР (Kersten, 2001), либо ингибированием АТФазы плазматической мембраны.

РОЛЬ -АДРЕНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ В КАЛЬЦИЕВОЙ

СИГНАЛИЗАЦИИ БЕЛЫХ АДИПОЦИТОВ. В культивируемых белых адипоцитах мыши, аппликация агониста -адренорецепторов – изопротеренола на фоне антагониста 1-, 2-адренорецепторов фентоламина приводит к появлению кальциевых ответов, схожих с 3-им типом сигналов при добавлении норадреналина (рис. 5А), к подобным эффектам приводит активация 2-адренорецепторов – добутамином и 3-адренорецепторов – BRL37344 и CGP12177. Пропранолол – антагонист -адренорецепторов приводит к полному подавлению такого типа Са2+-ответа адипоцитов (рис. 5Б).

Рис. 5. Увеличение [Ca2+]i в дифференцированных белых адипоцитах при активации -адренорецепторов и протеинкиназы А.

(А) – активация -адренорецепторов селективными агонистами – изопротеренол (1,2,3, кривая 1), BRL-37344 (3, кривая 2), аденилатциклазы (форсколин, кривая 3) и протеинкиназы А (8-BromocAMP, кривая 4) приводит к медленному увеличению [Ca2+]i;. (Б) – изопротеренол (1мкМ), добавленный на фоне антагониста -адренорецепторов – пропранолола (3мкМ) и антагониста адренорецепторов – фентоламина 5мкМ. Контроль – кривая 1, добавка изопротеренола (1мкМ).

добавлен в начале записи. Антагонисты адренорецепторов добавлены к клеткам за 5 минут до начала эксперимента, их концентрацию поддерживали в течение всего эксперимента.

клеток с проникающим аналогом сАМР (8-Bromo-cAMP) приводит к медленному росту [Ca2+]i (рис. 5А кривая 3 и 4 соответственно). Наблюдаемое увеличение [Ca2+]i происходит после 5 минутного лаг-периода в случае форсколина, а в случае 8-Bromo-cAMP – лаг-период составляет более 10 минут, что, по-видимому, связано с необходимостью проникновения соединения через плазматическую мембрану клеток до необходимой концентрации, активирующей PKA. Ингибитор протеинкиназы А (PKA) – Н-89, добавленный в концентрации 200нМ за 5 минут до аппликации агонистов 3-адренорецепторов, либо форсколина, предотвращает появление кальциевых ответов белых адипоцитов у 76% клеток, у остальных 24% адипоцитов АКО уменьшалась в 3–4 раза по сравнению с контролем.

Таким образом, в адипоцитах белой жировой ткани мыши, норадреналин, способен вызывать 3 типа кальциевых ответов, отличающихся по механизму формирования. Действуя через 1-адренорецепторы (1А), сопряженные с Gq белком и фосфоинозитидным сигнальным каскадом, НА приводит к мобилизации кальция через IP3-рецептор. Через 2-адренорецепторы норадреналин и L-аргинин Akt/PKBeNOSsGCPKGСD38RyRCa и интермедиатов (NO, cGMP, cADPR). Появление 3-го типа ответов (медленное увеличение [Ca2+]i) обусловлено действием норадреналина на -адренорецепторы и аденилатциклазный сигнальный каскад.

ХОЛИНЕРГИЧЕСКАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ БЕЛЫХ

АДИПОЦИТАХ МЫШИ. Са2+-СИГНАЛЫ, ГЕНЕРИРУЕМЫЕ БЕЛЫМИ

АДИПОЦИТАМИ В ОТВЕТ НА АЦЕТИЛХОЛИН. Помимо симпатической иннервации, белая жировая ткань также регулируется парасимпатической нервной системой и нейротрансмиттером ацетилхолином (ACh). Аппликация AСh к клеткам белого жира в концентрации от 0,1 до 10мкМ инициирует колебания цитозольного кальция (рис. 6) в 61–93% клеток. Сразу после аппликации AСh, наблюдается быстрый ответ клеток с увеличением [Са2+]i относительно исходного уровня в 2– раза. Затем происходят колебания, у которых максимумы и минимумы постепенно опускаются (дрейфуют) до некоторого окончательного положения. При этом амплитуда колебаний обычно растет, частота уменьшается за счет удлинения межспайкового интервала и достигает ~1мин-1. Между спайками [Са2+]i достоверно выше начального уровня. В целом, колебания у большинства (67–78%) клеток длятся менее 5 минут. У остальных 22–33% клеток колебания имеют те же характеристики, но могут длиться до 10 минут (рис. 6 серая кривая).

В процентах выражена доля клеток, для которых характерен данный тип кальциевого ответа.

Представлены типичные кальциевые ответы одиночных адипоцитов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЦЕПТОРА АЦЕТИЛХОЛИНА, УЧАСТВУЮЩЕГО В

ФОРМИРОВАНИИ Са2+-СИГНАЛА. Периодические режимы изменения [Са2+]i сохраняются в присутствии антагонистов M1- (телензепин) и M2- (methoctramine) холинорецепторов. Преинкубирование клеточной культуры белых адипоцитов мыши с антагонистом М3-холинорецепторов (p-Fluorohexahydro-sila-difenidol hydrochloride) в концентрациях от 1нМ до 100нМ всегда приводит к подавлению кальциевых ответов (в том числе периодических режимов) на ацетилхолин у 90% клеток. При этом 10% адипоцитов отвечают на агонист транзитным увеличением цитозольного кальция, который подавляется в присутствии антагониста М3-холинорецепторов совместно с ингибитором PLC (U73122).

ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ПУТИ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА С

М3-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРА АДИПОЦИТОВ. Чтобы исследовать роль входа Са2+ через плазматическую мембрану была использована среда, не содержащая кальция с добавлением 0,5мМ EGTA. Появление нескольких Са2+-спайков в бескальциевой среде говорит о том, что в механизме AСh-индуцируемых колебаний модуляция входящего потока внеклеточного кальция не играет принципиальной роли. В то же время затухание колебаний показывает необходимость входа Са2+ для их поддержания. Ответы [Са2+]i на AСh полностью предотвращаются преинкубацией клеток с 1мкМ тапсигаргина, ингибирующего Са2+-АТФазу эндоплазматического ретикулума.

Механизмы кальциевых колебаний могут быть разделены на два больших класса в зависимости от использования IP3R или RyR для мобилизации Са2+ из внутриклеточных структур (Thomas et al., 1996; Keizer and Levine, 1996). Чтобы различить возможные пути высвобождения Са2+, мы использовали ингибиторы PLC, IP3R и RyR. Инкубация белых адипоцитов с ингибиторами PLC (U73122) и IP3R – последующей добавке AСh, но и никак не влияет на их вид. Более того, эксперимент, представленный на рисунке 7А демонстрирует, что у адипоцитов с незатухающими в течение 10 минут колебаниями, последовательное добавление ксестоспонгина С и затем U73122, не подавляет периодические режимы на аппликацию AСh. Для определения роли RyR в колебаниях, перед стимуляцией ацетилхолином клетки инкубировали с рианодином, который блокирует RyR в состоянии малой проводимости при микромолярной концентрации и в закрытом состоянии при высоких дозах (около 100мкМ) (Dupont and Croisier, 2010). В диапазоне 100нМ – 10мкМ рианодин подавляет кальциевые колебания, вызванные 5мкМ ацетилхолина у 100% адипоцитов в поле зрения (рис. 7Б). Таким образом, механизм колебаний, индуцируемых в адипоцитах ацетилхолином, не зависит от PLC и IP3R, а включает высвобождение Са2+ через RyR из тапсигаргинчувствительного пула.

Рис. 7. Изменения [Са2+]i в белых адипоцитах под действием 5 мкМ ацетилхолина.

(А) – совместное действие ингибиторов PLC (U73122, 3мкМ) и IP3R (ксестоспонгин С, XeC), 500нМ) на ход кальциевых колебаний; (Б) – аппликация ацетилхолина на фоне ингибитора RyR – рианодина (1мкМ). В процентах выражена доля клеток с характерным типом ответа.

ВКЛАД NO-cGMP СИГНАЛЬНОГО ПУТИ В ПЕРЕДАЧУ СИГНАЛА С М3ХОЛИНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ. Рианодиновый рецептор (RyR) имеет множество регуляторов (Dupont and Croisier, 2010), которые могут опосредовать пути к нему от рецепторов AСh. Для исследования сигнального пути c М3-холинорецептора, направленного на мобилизацию Са2+ рианодиновым рецептором, нами были использованы ингибиторы соответствующих внутриклеточных ферментов. Результаты ингибиторного анализа представлены на рис. 8.

Преинкубирование белых адипоцитов с любым ингибитором NO-cGMP сигнального пути препятствует генерации Са2+-колебаний в большинстве клеток.

При этом клетки белого жира реагируют на аппликацию AСh кратковременным увеличением [Са2+]i.

сигнального пути.

(А) – аппликация AСh на фоне ингибитора PI3K – AS605240; (Б) – аппликация ингибитора Akt/PKB (Akt1/2 kinase inhibitor) на фоне колебаний, индуцированных ACh; (В) – предварительное инкубирование клеток с ингибиторома NOS – L-NAME; (Г) – предварительное инкубирование адипоцитов с ингибитором протеинкиназы G – Rp-8-Br-cGMPS препятствует генерации колебаний в 92% адипоцитов. Представлены ответы одиночных клеток.

Исчезновение индуцируемых AСh колебаний после ингибирования NOсинтазы говорит о важной роли данного фермента в генерации периодических режимов в белых адипоцитах. Подтверждением этому является параллельное измерение продукции оксида азота (NO) и кальция во время Са2+-колебаний (рис. 9).

Под действием ацетилхолина, удалось установить, что индуцируя колебания цитозольного кальция, AСh вызывает увеличение продукции NO в 15 раз.

Ингибиторы NO-синтазы – 7NI и L-NAME, добавленные на фоне кальциевых колебаний приводят к подавлению продукции NO, при этом происходит уменьшение амплитуды кальциевых колебаний с дальнейшим прекращением.

адипоцитах сопряжены с периодическими изменениями скорости продукции NO (рис. 9, кривая 2). Фаза повышения уровня [Ca2+]i сопровождается увеличением продукции NO (рис 9, кривая 1), что, по-видимому, свидетельствует об активации eNOS посредством Ca2+.

Рис. 9. Параллельное измерение с помощью флуоресцентных зондов Fura-2 и DAF внутриклеточной концентрации ионов кальция [Са2+]i и оксида азота [NO] в белых адипоцитах мыши при аппликации 5мкМ ацетилхолина.

Уровень [Ca2+]i, выражен в единицах отношения флуоресценции Fura-2 при возбуждении в 340 и 380нм (кривая 3). Продукция NO выражена в относительных значениях флуоресценции DAF-FM во времени (кривая 1), где F = F - Fo (F – значение флуоресценции DAF-FM в данной точке, а Fо – уровень флуоресценции в начале эксперимента), а также флуоресценция DAF FM (кривая 2), представленная в виде производной. Стрелками показаны моменты аппликации AСh и ингибитора NO-синтазы – 7NI. Представлен ответ одиночной клетки.

Циклическая АDP-рибоза (cADPR), которая производится ферментом ADPрибозилциклазой (CD38) из NAD, является активатором рианодинового рецептора.

Преинкубирование белых адипоцитов с конкурентным ингибитором CD38 – никотинамидом, предотвращает появление Са2+-колебаний, а аппликация никотинамида на фоне ацетилхолина, прекращает колебания в течение нескольких секунд. Кроме того, активатор и субстрат для CD38 – NAD приводит к генерации колебаний, подобных индуцированным ацетилхолином.

Таким образом, при активации М3-холинорецептора происходит генерация устойчивых Са2+ колебаний при активации сигнального каскада, включающего - 16 активацию: PI3KAkteNOSNOcGMPPKGCD38RyRCa2+, за счет субъединиц Gq-белков, с которыми сопряжен ацетилхолиновый рецептор.

КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ, СОПРЯЖЕННЫХ С IP3 и

РИАНОДИНОВЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ В БЕЛЫХ АДИПОЦИТАХ МЫШИ. Ввиду

того, что норадреналин, L-аргинин и ацетилхолин вызывают различные Са2+-ответы у белых адипоцитов за счет активации различных рецепторов и сигнальных каскадов, а общим для этих агонистов является то, что они действуют через G-белок зависимые рецепторы, которые включают общую систему сигнализации с участием субъединиц Gq-белков от 1 и М3-рецепторов, а также Gi-белков 2-рецепторов.

Кроме того, эти рецепторы имеют собственные пути сигнализации с участием Gq белков на фосфолипазу С и IP3-рецепторы, а со стороны -адренорецепторов – Gsбелков на аденилатциклазу и протеинкиназу А. В таких условиях возможно существование конвергенции сигнализации и наличие различных нелинейных явлений, включая генерацию спайков и периодических процессов. Поэтому представляет интерес исследование взаимодействия адренергической и холинергической сигнальных систем белых адипоцитов.

При концентрации AСh 1–10нМ в среде, Са2+ ответы отсутствуют у 100% клеток. Последующая добавка 1мкМ НА приводит к генерации Са2+-колебаний в 40– 50% клеток (рис. 10Б). Как было показано выше, норадреналин, несмотря на активацию различных подтипов - и -адренорецепторов, не приводит к возникновению периодических колебаний в адипоцитах, что подтверждается нашими экспериментами, в которых на фоне концентраций норадреналина, вызывающих транзитное повышение [Ca2+]i, аппликация наномолярных доз AСh приводит к появлению периодических кальциевых сигналов в адипоцитах мыши (рис. 10В). При более высоких концентрациях AСh, вызывающих колебания [Ca2+]i, добавка микромолярных доз НА увеличивает частоту колебаний без изменения их амплитуды.

Таким образом, преинкубированием белых адипоцитов мыши с низкими дозами ацетилхолина приводит к преобразованию кальциевого ответа клеток на норадреналин, который из транзитного приобретает вид колебательного. В то же время, аппликация наномолярных концентраций ацетилхолина на фоне норадреналина, аппликация которого уже вызвала транзитное увеличение [Ca2+]i, приводит также к генерации кальциевых колебаний. Следовательно, в адипоцитах имеет место потенцирование эффекта AСh посредством норадреналина за счет конвергенции сигналов с М3-холинорецепторов и адренергических рецепторов.

Общая схема сигнализации с участием - и М3-рецепторов, и соответствующих сигнальных путей, а также различных регуляторных связей представлена на рисунке 10А. При достаточно высоких концентрациях AСh (5мкМ), действуя через М3-холинорецепторы и активируя PI3K с участием G белков, запускает периодический процесс. В этом случае НА, действуя через адренорецепторы, способен модулировать частоту колебаний. При слабой передаче сигнала со стороны AСh с участием G белков, когда AСh (10нМ) не способен запустить периодические процессы, добавка НА приводит к возникновению активации eNOS, находящейся в петле положительной обратной связи.

Рис. 10. Конвергенция сигналов с М3-холинорецепторов и адренергических рецепторов.

(А) – аппликация норадреналина (1мкМ) на фоне 10нМ ацетилхолина; (Б) – аппликация 10нМ ацетилхолина на фоне 5мкМ норадреналина; (В) – схема конвергенции сигнальных каскадов, активируемых 1-, 2-адренорецепторами и M3-холинорецепторами.

Обозначения: DAG – диацилглицерол, PIP2 – фосфатидилинозитол бисфосфат, PIP3 – фосфатидилинозитол трисфосфат, PI3K – фосфатидилинозитол-3-киназа, PLC – фосфолипаза С, eNOS – эндотелиальная NO-синтетаза, sGC – растворимая гуанилат-циклаза, Akt (PKB) и PKG – протеинкиназы B и G, CD38 – АДФ-рибозил циклаза, СаМКII – кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа 2, АМРК – АМФ-активируемая протеинкиназа, СаМКК – кальций/кальмодулинзависимая протеинкиназа киназа, IP3 – инозитолтрисфосфат, IP3R – рецептор IP3, cADPR – циклическая АДФ-рибоза, RyR – рианодиновый рецептор.

Таким образом, при наличии высокой суммарной концентрации G белков, активация PKG выполняет несколько функций: обеспечивает селективное выброса Са2+ из RyR-зависимых депо, за счет активации CD38 и накопления cADPR.

Для исследования возможных вариантов конвергенции сигнальных путей, активируемых различными типами рецепторов, нами использована инкубация клеток с малыми дозами AСh с последующей добавкой агонистов к различным рецепторам.

КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛИЗАЦИИ М3-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ И 1АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ. Активация 1-адренорецептора селективным агонистом – фенилэфрином способна вызвать только кратковременный (транзитный) Са2+-ответ у белых адипоцитов. Однако характер ответов на фенилэфрин радикальным образом изменяется в присутствии малых концентраций AСh в среде инкубации клеток. В разных клетках регистрируются динамические режимы двух типов:

высокочастотные с высоким уровнем базального [Ca2+]i (рис. 11А – черная кривая) или низкочастотные, происходящие без повышения базальной концентрации [Ca2+]i (рис. 11А – серая кривая), но с большими амплитудами. Подобное изменение кальциевых ответов происходит при активации 1-адренорецепторов циразолином и А61603. Общей характеристикой Са2+-ответов, вызываемых агонистами 1-адренорецепторов на фоне малой концентрации ацетилхолина является транзитное увеличение [Ca2+]i при аппликации агониста, после чего происходят кальциевые колебания, различающиеся частотой и амплитудой у одиночных клеток.

В отличие от колебаний, индуцируемых микромолярными дозами ацетилхолина, данные периодические режимы не прекращаются в течение времени регистрации (15 минут) у всех отвечающих клеток.

КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛИЗАЦИИ М3-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ И

2-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ. Селективные агонисты 2-адренорецепторов – UK14,304, гуанабенц, а также миллимолярные концентрации L-аргинина, приводят в комбинации с низкими дозами AСh к генерации кальциевых колебаний (рис. 11Б).

Общей чертой таких колебаний является отсутствие базального увеличения [Ca2+]i во всех клетках.

адренергических рецепторов (1, 2, 3).

(А) – аппликация 1мкМ фенилэфрина на фоне 2нМ ацетилхолина; (Б) – аппликация 3мкМ UKна фоне 1нМ ацетилхолина; (В) – аппликация 3-селективного CGP12177 (10мкМ) на фоне 1нМ ацетилхолина; (Г) – аппликация 5мкМ активатора аденилатциклазы – форсколина на фоне 1нМ ацетилхолина. В процентах выражена доля адипоцитов с представленными типами Са2+сигналов.

КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛИЗАЦИИ М3-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ И

1,3-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ. Аппликация агонистов -адренорецепторов (изопротеренол, CGP12177, добутамин) на фоне низких концентраций AСh вызывает появление кальциевых колебаний в культивируемых белых адипоцитах.

Колебания, в отличие от активации -адренорецепторов, сопровождаются ростом базального уровня Са2+ в клетках и наличием лаг-периода (рис. 11В) перед началом колебаний, продолжительность которого различается у отдельных адипоцитов и наблюдается при любой концентрации агониста..

Активация -адренорецепторов связана с последующей активацией Gs белков и действием cAMP и РКА на различные ферменты и каналы в клетке, включая фосфорилирование и активацию IP3R, RyR и Са2+-АТФазы ретикулума (SERCA), что накладывается на регуляцию этих и других клеточных мишеней с участием NO, cGMP, cADPR и PKG. Подтверждением этому являются эффекты, вызванные активатором аденилатциклазы – форсколином. Видно, что форсколин, который приводит к накоплению сАМР и последующей активации РКА, в присутствии малых концентраций ацетилхолина, вызывает генерацию Са2+-колебаний (рис. 11Г), - 20 также сопровождающихся увеличением базального уровня [Ca2+]i и наличием лагпериода у большинства адипоцитов.

Это свидетельствует об известной по литературным данным активации Са2+каналов ретикулума и Са2+-АТФаз с участием РКА.

Таким образом, в белых адипоцитах имеет место конвергенция сигнализации для всех перечисленных агонистов, основанная на том, что данные гормоны, действуя через G белок зависимые рецепторы:

– включают общую систему сигнализации с участием субъединиц (G) для Gq, Gi и Gs белков, и имеющих одну общую мишень – фосфоинозитидкиназу PI3K:

GPIP3KAkt/PKBeNOSNOsGCcGMPPKGCD38cADPRRyRСа2+ – имеют классические пути сигнализации с участием Gq белков (PLC, IP3) и Gs белков (сАМР, РКА).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Фундаментальные механизмы регуляции сигнальных систем жировых клеток изучены недостаточно. Практически не исследованы и не принимаются во внимание механизмы конвергенции различных сигнальных систем, как на уровне входов – рецепторов для различных гормонов и трансмиттеров, так и на уровне вторичных мессенджеров – сАМР, сGМР, Са2+, NO, IP3, cADP.

В представленном исследовании показано, что белые адипоциты при воздействии естественного гормона – норадреналина, способны генерировать различные кальциевые сигналы. Причиной данного различия кальциевых ответов является не только экспрессия нескольких типов адренергических рецепторов, но и активация разных сигнальных каскадов. Первый тип кальциевых ответов характеризуется быстрым транзитным кальциевым ответом, являющимся результатом активации через 1-адренорецептор фосфоинозитидного сигнального каскада и мобилизацией кальция из ЭПР. Второй тип ответов белых адипоцитов характеризуется быстрым кратковременным одиночным импульсом, по кинетике и механизму формирования отличающемуся от первого типа. В основе этого (впервые показанного для адипоцитов) механизма лежит активация сигнального пути PI3KAkt/PKBeNOSsGCPKGCD38RyR при действии норадреналина на 2-адренорецептор через G-субъединицы Gi-белков. Третий тип ответов представляет собой медленное высокоамплитудное увеличение Са2+ в цитозоле, связанное с активацией аденилатциклазного сигнального каскада при действии норадреналина на -адренорецепторы.

Впервые показано действие ацетилхолина на клетки белой жировой ткани. С помощью ингибиторного анализа продемонстрирована экспрессия функционального М3-холинорецептора, активация которого приводит к возникновению колебаний Са2+ через активацию рианодинового рецептора. В поддержании таких кальциевых колебаний ключевую роль играет NO-синтаза и оксид азота, продукция которого возрастает под действием ацетилхолина, а ингибирование фермента предотвращает генерацию периодических режимов в цитоплазме белых адипоцитов мыши.

В работе продемонстрирована конвергенция сигнализации с рецепторов, запускающих сигнальные каскады, сопряженные с активацией IP3R и RyR за счет -субъединиц на одну общую мишень – фосфоинозитидкиназу (PI3K).

ВЫВОДЫ

В клетках белого жира мыши экспрессируются 1А-, 2- и 1,3адренергические рецепторы, активация которых норадреналином способна вызывать различные по типу и механизму формирования кальциевые ответы.

При действии норадреналина и селективных агонистов на 1А-адренорецепторы в белых адипоцитах наблюдается типичное для невозбудимых клеток транзитное увеличение [Ca2+]i за счет активации фосфоинозитидного пути передачи внутриклеточных сигналов.

При активации 2-адренорецепторов норадреналином, L-аргинином и селективными агонистами может активироваться сигнальный путь с участием PI3KAkteNOSNOsGCcGMPPKGCD38RyR, что приводит к импульсному выбросу ионов кальция из эндоплазматического ретикулума.

Ацетилхолин вызывает колебания кальция в адипоцитах, которые обусловлены его взаимодействием с М3-холинорецепторами и селективной PI3KAkteNOSNOsGCcGMPPKGCD38RyR.

В белых адипоцитах имеет место взаимодействие адренергической и холинергической сигнальных систем, выраженное в конвергенции сигналов от 1, 2-адренорецепторов и М3-холинорецепторов на одну общую мишень – PI3K, за счет ее активации -субъединицами соответствующих G-белков.

Конвергенция сигналов с М3-холинорецепторов и -адренергических рецепторов происходит за счет активации PI3K с помощью -субъединиц Gs- и Gqбелков, а также за счет активации PKA, которая приводит к фосфорелированию каналов эндоплазматического ретикулума и Са2+-АТФаз плазматической мембраны.

- 22

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах1. Туровский Е.А., Туровская М.В., Бережнов А.В., Толмачева А.В., Каймачников Н.П., Долгачева Л.П., Зинченко В.П., Маевский Е.И., Дынник В.В.

Конвергенция Са2+-сигнальных путей в адипоцитах. Роль L-аргинина и протеинкиназы G в генерации импульсных и периодических Са2+ сигналов.

Биологические мембраны, 2011. Т.28(6): 1-11.

2. Туровский Е.А., Каймачников Н.П., Туровская М.В., Бережнов А.В., Дынник В.В., Зинченко В.П. Два механизма кальциевых колебаний в адипоцитах.

Биологические мембраны, 2011. Т.28(6):463-72.

3. Туровский Е.А., Конаков М.В., Бережнов А.В., Зинченко В.П., Бронников Г.Е., Долгачева Л.П. Изменение Са2+-ответов культивируемых бурых адипоцитов при адренергической активации. Цитология, 2011. Т.53(6): 466-73.

4. Конаков М.В., Долгачева Л.П., Туровский Е.А., Бронников Г.Е. Изменение концентрации ионов кальция в цитоплазме бурых преадипоцитов при адренергической стимуляции. Биологические мембраны 2010, Т27(1): 77-83.

5. Долгачева Л.П., Туровский Е.А., Туровская М.В., Зинченко В.П., Дынник В.В. адренергический контроль двух Са2+-сигнальных путей адипоцитов.

Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2012 (в печати) Статьи в сборниках 1. Туровский Е.А., Туровская М.В., Бережнов А.В., Толмачева А.В., Ненов М.Н., Долгачева Л.П., Зинченко В.П., Маевский Е.И., Дынник В.В. Регуляция уровня [Ca2+]i в адипоцитах мыши норадреналином, аргинином и ацетилхолином.

Конвергенция сигнализации 1, 2 и m3 рецепторов. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (24мая) 1, стр. 57-63.

2. Туровский Е.А., Туровская М.В., Бережнов А.В., Долгачева Л.П., Зинченко В.П., Маевский Е.И., Дынник В.В. Регуляция уровня Ca2+ в адипоцитах ацетилхолином. Роль m3-холинорецепторов и PKG. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (24мая) 1, стр. 64-70.

3. Конаков М.В., Туровский Е.А., Туровская М.В., Бережнов А.В., Зинченко В.П., Долгачева Л.П. Развитие кальциевого ответа и ретикулума в процессе дифференцировки адипоцитов в культуре. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (24-26 мая) 1, стр.

4. Туровский Е.А., Каймачников Н.П., Туровская М.В., Бережнов А.В., Дынник В.В., Зинченко В.П. Два механизма кальциевых колебаний в адипоцитах.

Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация».

Пущино 2011. (24-26 мая) 1, стр. 391-96.

5. Конаков М.В., Долгачева Л.П., Туровский Е.А., Агафонова Т.А., Бронников Г.Е.

Сравнение Са2+-ответов преадипоцитов мышей и сусликов (SPERMOPHILIS UNDULATUS) июня) 1, стр. 278-82.

Тезисы докладов 1. Дынник В.В., Туровский Е.А., Туровская М.В., Толмачева А.В., Долгачева Л.П., Зинченко В.П. Активация М3-мускариновых рецепторов вызывает колебания Са NOcGMPcADP-riboseCa обратную связь. IV съезд биофизиков России. Нижний Новгород 2012 год.

2. Дынник В.В., Туровский Е.А., Долгачева Л.П., Зинченко В.П. Ожирение, диабет 2-го типа и дисфункция жировой ткани. Международная научная конференция «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем», Минск 2012. стр. 126.

3. Туровский Е.А., Конаков М.В. Суслики (SPERMOPHILIS UNDULATUS) и мыши скорее всего имеют разные механизмы индукции гиперплазии бурой жировой ткани. Школа-конференция для молодых ученых «Методы культивирования клеток», Санкт-Петербург 2008 год, стр.827.

4. Конаков М.В., Туровский Е.А. Суслики (SPERMOPHILIS UNDULATUS) и мыши имеют разные механизмы индукции гиперплазии бурой жировой ткани.

Всероссийская медико-биологическая научная конференция молодых учёных «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (XI Всероссийская конференция «Человек и его здоровье»), Санкт-Петербург 2008 год, стр.162.

5. Туровский Е.А., Долгачева Л.П., Туровская М.В., Дынник В.В., Зинченко В.П. адренергический контроль двух Cа2+-сигнальных путей белых адипоцитов.

Международная конференция молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика '12», Пущино, 2012 год, стр. 52-53.