На правах рукописи

МОШКОВСКИЙ

Сергей Александрович

ПРОТЕОМНЫЙ ШТРИХ-КОД ПЛАЗМЫ КРОВИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ

ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ

03.01.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2012 г.

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научноисследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «ИБМХ» РАМН)

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор академик РАМН, Арчаков Александр Иванович

Официальные оппоненты: Ляхович Вячеслав Валентинович доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, директор ФГБУ «НИИМББ»

СО РАМН

Васильев Андрей Валериевич доктор биологических наук, профессор, зав. отделом ФГБУ «НИИ питания» РАМН Ипатова Ольга Михайловна доктор биологических наук, зав. отделом ФГБУ «ИБМХ» РАМН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук

Защита состоится 18 октября 2012 г. в 13-00 часов на заседании совета Д 001.010.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук по адресу 119121, г. Москва, Погодинская ул. д.10, стр.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН.

Автореферат разослан ”” июля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.010. кандидат химических наук Карпова Е.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Злокачественные опухоли являются распространенной причиной смерти человека и многих других позвоночных животных. По последним оценкам, они вызывают более десяти процентов летальных случаев в человеческой популяции (www.cancer.org).

Согласно современным представлениям, фатальные поломки в организме млекопитающего вызваны патологическим усилением одного из физиологических процессов – пролиферации, с одной стороны, что вызывает злокачественные опухоли, и старения, с другой стороны, что стимулирует дистрофии и нейродегенеративные заболевания. Более того, установлены общие биологические основы рака и старения, а указанные различные исходы связаны со сдвигом равновесия в ту или иную сторону (Finkel, Serrano, and Blasco 2007).

Несмотря на очень большое разнообразие генетических предпосылок развития злокачественных опухолей, разнообразие их морфологических и, что более важно, клинических проявлений не столь велико. Иными словами, в основе двух разных, сходных по клинической картине и морфологии опухолей могут лежать мутации в различных биохимических каскадах. Примером этого явления может служить недавняя работа (Kobel et al. 2008), в которой описаны большие различия в экспрессии белков в разных морфологических типа аденокарциномы яичника, притом что в клинической практике есть потребность в диагностике этой опухоли независимо от ее клеточных и биохимических типов. Поэтому идея о единственном биохимическом биомаркере, будь то последовательность нуклеиновой кислоты, белок или метаболит, для первичной или дифференциальной диагностики большинства типов рака в настоящее время отвергнута большинством специалистов. В качестве альтернативного направления развивается понятие о молекулярной сигнатуре (Subramanian and Simon 2010) или штрих-коде (Zimmer et al. 2006). Сигнатура включает в себя набор качественно или количественно оцениваемых молекулярных параметров, например, генетических полиморфизмов, уровня экспрессии транскриптов, белков, уровня липидов или других метаболитов, измерение которых обеспечивает высокую точность диагностики заболевания (Yurkovetsky et al. 2010). Для получения мультиплексного (многопараметрического) штрих-кода клинического образца могут использоваться различные методы. Если речь идет о протеомном, белковом штрихкоде, то это в первую очередь иммунный анализ (Edgell et al. 2010) и масс-спектрометрия (Zimmer et al. 2006; Rodriguez et al. 2010). Важным аспектом при разработке штрих-кода является статистическая обработка мультиплексных данных. Для корректного вычисления диагностической точности метода, расчета рисков и применения на практике требуется использование специальных алгоритмов распознавания данных (Hamacher et al. 2009).

В настоящей работе в качестве экспериментальной подхода к диагностике рака яичника, предстательной железы и Т-клеточной лимфомы кожи нами использованы основанные на MALDI-TOF-масс-спектрометрии плазмы1 крови штрих-коды, изучена природа компонентов, обеспечивающих диагностику, а также сформулированы проблемы и перспективы новой области знания, связанной с протеомными профилями плазмы крови для диагностики.

Целью работы является выявление протеомного штрих-кода плазмы крови, измеряемого посредством масс-спектрометрии, подходящего для диагностики злокачественных опухолей на примере рака яичника и предстательной железы, а также Тклеточной лимфомы кожи.

Основные задачи исследования Получение посредством MALDI-TOF-масс-спектрометрии мультиплексного сигнала от образцов плазмы крови пациентов с раком яичников, пациентов с раком предстательной железы, а также пациентов с Т-клеточной лимфомой кожи и соответствующих всем указанным патологиям контрольных субъектов.

статистики для выявления маркерных компонентов протеомного штрих-кода и оценки точности, специфичности и чувствительности протеомной диагностики.

литературных источников компонентов протеомного штрих-кода, вносящих вклад в предстательной железы и Т-клеточной лимфомы кожи.

                                                              В разных разделах данной работы используются образцы плазмы и образцы сыворотки крови. Как правило, результаты протеомного штрих-кода мало зависят от того, какой препарат крови получают. В общих разделах работы (введение, заключение, выводы) термин «плазма крови» будет охватывать как разные виды плазмы, так и сыворотку крови.   Сопоставление данных протеомной диагностики рака яичника, рака предстательной железы с результатами анализа принятых в клинической практике молекулярных маркеров этих опухолей.

Применение в случае Т-клеточной лимфомы кожи в дополнение к MALDI-TOFмасс-спектрометрии направленного протеомного анализа цитокинов сыворотки экспериментальные масс-спектрометрические штрих-коды для диагностики рака яичника, объединенные с данными иммуноферментного анализа. При анализе белковых штрихкодов были однозначно идентифицированы некоторые его компоненты, самым значимым из которых для диагностики является сывороточный амилоид А. Для получения штрихкодов разрабатывали и применяли оригинальные модификации методов обработки образца.

При обработке диагностических масс-спектров впервые применяли особый некоррелирующих между собой компонентов штрих-кода с последующим применением классификатора – метода опорных векторов.

Важным результатом работы является подтверждение того, что массспектрометрические штрих-коды плазмы и сыворотки крови способны достоверно распознавать образцы, полученные от пациентов со злокачественными опухолями, по меньшей мере, яичника и предстательной железы. Представленная работа, кроме того, раскрывает биологический смысл наблюдаемых отличий посредством идентификации значимых компонентов профиля. В работе подчеркивается значение белка сывороточного амилоида А не только как маркера воспаления, но и его очевидная связь с патогенезом ряда злокачественных опухолей.

Цитокиновые профили плазмы крови при Т-клеточной лимфоме кожи позволили выявить новый, не описанный ранее биомаркер данного заболевания - хемокин с мотивом C-X-C 10 (CXC10).

Основные положения, выносимые на защиту В качестве биомаркера рака яичника, предстательной железы и Т-клеточной лимфомы кожи используют мультиплексный сигнал масс-спектрометрии плазмы крови, одновременно характеризующий множественные белки плазмы крови – протеомный штрих-код. Принятие диагностического решения осуществляют методами многомерной статистики.

Протеомный штрих-код плазмы крови, регистрируемый посредством MALDI(SELDI)-TOF-масс-спектрометрии, на тестируемых выборках обеспечивает диагностику пациентов с раком яичника и раком предстательной железы с точностью свыше 90%.

Отличия протеомных масс-спектрометрических профилей плазмы крови при раке яичника и раке простаты реализуются преимущественно за счет различных изоформ сывороточного амилоида А острой фазы (SAA) и транстиретина (TTR).

В случае Т-клеточной лимфомы кожи мультиплексный анализ цитокинов в плазме крови обеспечивает точность дифференциальной диагностики лимфомы от псориаза свыше 80%, в основном, в связи с концентрацией нового биомаркера данной опухоли хемокина с мотивом C-X-C 10 (CXC10).

Научно-практическая значимость работы. Высокие результаты точности диагностического метода, сочетающего данные MALDI-TOF-масс-спектрометрии и иммуноферментного анализа, иллюстрируют перспективы методов протеомики для последующего внедрения в практику, после преодоления проблемы технической вариабельности метода.

Биомаркеры-компоненты масс-спектрометрического штрих-кода, в том числе идентифицированный в настоящей работе сывороточный амилоид А, предложены в качестве компонентов диагностических панелей для диагностики и мониторинга лечения злокачественных опухолей. Так, сывороточный амилоид А рассматривается как один из маркеров ответа пациентов с раком яичника на направленное действие лекарственного антитела цетуксимаб, со ссылкой на материалы настоящей работы (Schilder et al. 2009).

Кроме того, данный белок входит в диагностическую панель, которая проходит клинические испытания для диагностики рака яичников (Edgell et al. 2010), также со ссылкой на представленную работу.

Таким образом, результаты, полученные в представленной работе, получили развитие и используются в нескольких прикладных клинических испытаниях, что указывает на потенциально высокую практическую значимость работы.

Апробация работы. Материалы настоящей работы представлялись на 2-й международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика в медицине» в Москве (Россия) в 2004 г., на HUPO 3th Annual World Congress в Пекине (КНР) в 2004 г., на школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» в Москве (Россия) в 2005 г., на HUPO 4th Annual World Congress в Мюнхене (Германия) в 2005 г., на 3-й международной конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине» в Новосибирске (Россия) в 2006 г., на HUPO 5th Annual World Congress в Лонг-Биче (США) в 2006 г., на 3-й международной школе-конференции молодых ученых «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» в Звенигороде (Россия) в 2007 г., на 4th International Symposium on Computational Methods In Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources в Москве в 2007 г., на HUPO 6th Annual World Congress в Сеуле (Южная Корея) в 2007 г., на HUPO 7th Annual World Congress в Амстердаме (Нидерланды) в 2008 г., на 4-й международной конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине» в Москве и Нижнем Новгороде (Россия) в 2008 г., на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов в Новосибирске (Россия) в 2008 г., на HUPO 8th Annual World Congress в Торонто (Канада) в 2009 г., на HUPO 9th Annual World Congress в Сиднее (Австралия) в 2010 г., на 1-й международной научно-практической конференции молодых ученых «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» в Москве (Россия) в 2010 г., на Taiwan-Russia Research Cooperation Symposium “New mass spectrometry methods in proteomics” в Гаосюне (Тайвань) в 2011 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 49 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе, 21 статья в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, и 28 публикаций в трудах конференций.

Индекс Хирша автора составляет 7 по данным системы Scopus.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 239 страницах, содержит 32 рисунка, 17 таблиц. Список литературы включает источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы описано развитие методов и подходов для получения диагностических штрих-кодов плазмы и сыворотки крови посредством массспектрометрии, а также описаны способы статистической обработки таких масс-спектров.

Обсуждается состав белков и пептидов, идентифицируемых в диагностических штрихкодах, в контексте их дифференциальной экспрессии при злокачественных опухолях разного генеза. Кроме того, в данном разделе подводятся итоги десятилетия развития диагностической протеомики и перспективы внедрения ее результатов в клиническую практику.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Определения параметров диагностического метода. В работе используются ключевые характеристики диагностических методов – точность, чувствительность и специфичность диагностики. Чувствительность и специфичность теста в общем виде предствляют собой статистические характеристики бинарного теста классификации.

Чувствительность представляет собой частное числа правильно определенных случаев заболевания и суммы этого числа и числа ложноотрицательных случаев (то есть, неверно определенных случаев заболевания). Специфичность равна частному числа правильно определенных случаев контроля и суммы этого числа и числа ложноположительных случаев. Чувствительность и специфичность теста взаимозависят от принятого уровня отсечения, поэтому рассматривать их по отдельности некорректно. Самостоятельной характеристикой теста является точность (accuracy) диагностики, представляющая собой частное числа правильно определенных случаев и общего числа случаев.

Пациенты и контрольные субъекты, привлеченные для исследования. Образцы сыворотки и плазмы крови у субъектов использовали с их информированного согласия. На пилотной стадии работы для исследования посредством двумерного электрофореза использовали образцы 30 пациенток с раком яичника, молочной железы, матки и доброкачественными опухолями яичника, а также на группе здорового контроля из женщин (всего 40). Для обнаружения биомаркера амилоида А использовали плазму крови от 27 женщин с раком яичника и 34 контрольных субъектов (всего 61). Для поиска протеомного штрих-кода рака яичника использовали сыворотку от 34 женщин с раком яичника и 56 контрольных не больных раком субъектов (всего 90). Для изучения рака предстательной железы привлекали 36 больных и 46 здоровых субъектов (всего 82). Для исследования Т-клеточной лимфомы кожи использовали образцы от 23 пациента с лимфомой кожи, 29 пациентов с псориазом и 22 здоровых доноров (всего 74). Итого в диссертации использовали клинический материал от 347 индивидуумов.

Методы исследования термостабильной фракции сывороток посредством двумерного электрофореза. Исследование проводили на четырех группах пациентов с раком яичника, молочной железы, матки и доброкачественными опухолями яичника, а также на группе здорового контроля, по 10 человек в каждой. Образцы, связанные с онкогинекологией, для исследования в этом и последующих разделах работы получали на кафедре акушерства и гинекологии лечебного факультета РНИМУ им. Н.И.Пирогова в соответствии с принятыми в данной организации этическими требованиями.

Термостабильную фракцию сыворотки крови получали путем подщелачивания и нагревания при 98С с полиэтиленгликолем. Процедуру 2D-электрофореза образцов данной фракции проводили с использованием прибора для изофокусирования белков Protean IEF Cell (Bio-Rad, США) и установки для 2D-электрофореза Protean II xi Cell (BioRad, США). Разделение в первом направлении проводили путем изоэлектрофокусирования на полосках (стрипах) IPG pH 3-10 (Bio-Rad, США), по инструкции производителей. Для разделения белков во втором направлении использовали 9–16% вертикальные градиентные гели, приготовленные по стандартному протоколу (Gorg and Weiss 1999). Гели окрашивали серебром с тиосульфатом натрия и кумасси голубым в соответствии с методиками, описанными в (Blum, Beier, and Gross 1987) и (Neuhoff et al. 1988), соответственно. Размер гелей для обоих типов окраски составлял 0,152020 см. Отсканированные изображения гелей анализировали с использованием программы Melanie III (GeneBio, Швейцария).

Оценивали отличия в интенсивности окраски белковых пятен между группами при помощи непараметрических критериев. Дифференциально экспрессирующиеся белки расщепляли в геле трипсином и идентифицировали с помощью MALDI-TOF(-TOF) массспектрометрии по способу пептидного фингерпринта (прибор Ultraflex, Bruker Daltonics, Германия), оснащенного ультрафиолетовым лазером 337 нм, в режиме положительных ионов. Погрешность определения масс ионов пептидных фрагментов составляла примерно 50 частей на миллион.

протеомного штрих-кода рака яичника. Для анализа использовали полученную, как описано выше, до оперативного вмешательства, термостабильную фракцию плазмы крови от 27 женщин с раком яичников. В качестве контроля получали образцы от 34 женщин без гинекологической патологии. Масс-спектрометрию SELDI-TOF термостабильной фракции сыворотки осуществляли по инструкциям производителя на чипах SELDI с сильным анионообменником (SAX) (Ciphergen Biosystems2, США) и на чипах SELDI с металлоаффинной поверхностью Ni-IMAC3.

Для идентификации некоторых пиков белки и пептиды термостабильной фракции восстановленных остатков цистеина. Масс-спектры получали на масс-спектрометре MALDI-TOF Reflex III и Ultraflex (Bruker Daltonics, Германия). Спектры MS-MSфрагментации расщепленных трипсином пептидов получали с использованием массспектрометра MALDI-TOF-TOF Ultraflex (Bruker Daltonics, Германия).

Двумерный электрофорез фракций для исследования форм сывороточного амилоида А осуществляли в основном, как описано выше в настоящем автореферате.

Для дальнейшей идентификации белков термостабильную фракцию плазмы разделяли путем ВЭЖХ. Термостабильную фракцию плазмы предобрабатывали на сделанном в лаборатории из пластикового наконечника для пипетки картридже объемом 0,1 мл, содержащем частицы хроматографической фазы Lichrosorb C18 диаметром 10 мкл с размером пор 300 (Merck). Анализ ВЭЖХ проводили с использованием хроматографа MilliChrom A-02 (ЗАО Институт хроматографии «ЭкоНова», Россия). Использовали колонку 752 мм с частицами Nucleasil C18 диаметром 5 мкм с размером пор (Macherey-Nagel, Германия). Состав фракций оценивали посредством SELDI-TOF-MS на чипах с нормальной фазой NP20 (Ciphergen) по указаниям производителя.

Методы анализа протеомного штрих-кода для диагностики рака яичника. Для исследования использовали сыворотки 34 женщин, больных раком яичника, в том числе сывороток пациенток с раком в ранней (1 и 2-ой) стадии; 13 сывороток женщин больных доброкачественными опухолями яичника и 16 – миомой матки; одна сыворотка больной                                                              В настоящее время фирмы Ciphergen Biosystems не существует. Технология SELDI передана в компанию Bio-Rad Laboratories (США) и коммерчески доступна от указанной компании.

миомой матки и фибромой яичника и 26 сывороток здоровых женщин. В качестве контроля были использованы 26 сывороток здоровых женщин, полученных при плановом гинекологическом обследовании.

иммуноферментного анализа Human SAA (Biosource, США) в соответствии с протоколами производителя. Для измерения концентрации ракового антигена 125 (CA125) использовали набор для иммуноферментного анализа СА125 EIA (CanAg, Канада), также в соответствии с инструкцией производителя.

Для оптимизации условий профилирования SELDI-TOF использовали различные типы белковых чипов: NP20 (нормальнофазовые), SAX2 (сильные анионообменники), WCX (слабые катионообменники), H4 (обращеннофазовые) (Ciphergen Biosystems, США).

Оптимальные результаты получали при использовании чипов NP20. В качестве матрицы для этого чипа использовали насыщенный раствор -циано-4-гидроксикоричной кислоты в 50% (об./об.) ацетонитриле, содержащем 0,5% (об./об.) трифторуксусной кислоты (ТФУ), разведенный в два раза тем же растворителем. Профилирование проводили на массспектрометре SELDI-TOF Protein Biology System II (PBS II) (Ciphergen, США), получая спектры автоматически в диапазоне масс 7000-70000 Да.

Пики масс-спектров в пределах m/z от 5500 до 17500 Да находили и размечали посредством программы Biomarker Wizard™ (Ciphergen). Использовали для классификации 48 таких пиков и данные иммуноферментного анализа о концентрациях ASAA и СА125, применяя метод опорных векторов (support vector machine, SVM (Vapnik and Chapelle 2000)) и метод логистической регрессии. Перед применением SVM проводили отбор признаков для улучшения параметров модели по алгоритму рекурсивного исключения признаков (Recursive Feature Elimination, RFE, (Guyon et al. 2002)). В качестве альтернативы SVM для разработки диагностического алгоритма применяли метод логистической регрессии. Для отбора признаков для логистической регрессии использовали ступенчатую модель отбора, основанную на информационном критерии Акаике (AIC). Для проверки чувствительности и специфичности разработанных диагностических моделей, использовали 10-кратную перекрестную проверку достоверности. Для диагностических алгоритмов, полученных как методом SVM, так и методом LR использовали 10-кратную перекрестную проверку достоверности, которую проводили по 100 раз. Для каждого диагностического алгоритма вычисляли точность, чувствительность и специфичность с доверительными интервалами. Дополнительно для классификации использовали упрощенный метод пар с наибольшим счетом TSP (Tan et al.

2005; Xu et al. 2005).

Всю статистическую обработку, включая применение кластерного анализа, метода логистической регрессии, метода опорных векторов, а также отбор признаков проводили с помощью находящегося в открытом доступе языка программирования R (www.rproject.org).

предстательной железы. В Воронежском онкологическом диспансере получали образцы плазмы крови 82 субъектов, у 36 из которых был диагностирован рак предстательной железы, подтвержденный гистологическим исследованием, а 46 субъектов были признаны здоровыми (данные приведены в диссертации). В лаборатории клинической базы у всех субъектов проводили определение в крови уровня простатоспецифического антигена (ПСА) с помощью стандартного метода хемилюминесцентного иммуноанализа. Далее осуществляли выбор метода проведения протеомного исследования образцов плазмы крови. Тестировали нормальнофазовые чипы для SELDI NP20 (Bio-Rad), катионообменные магнитные гранулы ClinProt WCX (Bruker) и хроматографические наконечники ZipTip C (Millipore).

Масс-спектры на MALDI-TOF-масс-спектрометре Ultraflex II (Bruker, Германия) для каждого образца получали в четырех повторах, в диапазоне m/z 1500-20000 Да. Спектры выравнивали и проводили детекцию масс-спектрометрических пиков с использованием программы ClinProTools (Bruker). Масс-спектры обрабатывали следующим образом.

Диагностическую модель строили посредством разработанного на языке R программного обеспечения с использованием метода опорных векторов (SVM) в комбинации с рекурсивным отбором признаков.

В данном исследовании применяли метод опорных векторов с линейным ядром. Для оценки точности диагностики использовали 10-кратную перекрестную проверку достоверности. Для вычисления доверительных интервалов для точности, чувствительности и специфичности диагностики, 10-кратную перекрестную проверку достоверности проводили 100 раз.

Методы анализа масс-спектрометрических и цитокиновых профилей сыворотки крови для диагностики Т-клеточной лимфомы кожи. Работу с пациентами осуществляли в ГНЦ дерматовенерологии Минздравсоцразвития России согласно этическим требованиям, принятым в данном учреждении. Все пациенты, включенные в исследование, были не моложе 18 лет, женщины не находились в периоде беременности или лактации. В критерий исключения входило наличие в истории заболевания особо опасных инфекций (туберкулеза, сифилиса, гепатитов В и С, ВИЧ) и не имеющих отношения к исследованию соматических заболеваний в развернутой стадии, а также других злокачественных опухолей. Для включения пациентов с грибовидным микозом ГМ в исследование использовали следующие критерии: I-III стадия заболевания без генерализации патологического процесса и без вовлечения в него периферической крови (последнее устанавливали по подсчету клеток Сезари на основе классификации ВОЗ/EORTC (Kempf and Sander 2010), >1000 атипических лимфоцитов на мл периферической крови требуется для постановки диагноза синдрома Сезари, который считается отдельной формой Т-клеточной лимфомы кожи); диагностированный ГМ, подтвержденный гистологией и иммунофенотипированием; отсутствие терапии ГМ в течение, по меньшей мере, 2 недель перед взятием крови. Наблюдали 23 пациента с грибовидным микозом, подтвержденным гистологией и иммунофенотипированием.

Контрольные группы состояли из 29 пациентов с диагностированным псориазом и из здоровых доноров. В контрольную группу включали пациентов с развернутым или умеренным псориазом, который оценивали посредством индекса площади поражения и тяжести псориаза (PASI) (Langley and Ellis 2004). Все пациенты с псориазом, вовлеченные в исследование, имели индекс PASI выше 12. Перед MALDI-TOF-масс-спектрометрией образцы сыворотки обрабатывали на нормальнофазовых хроматографических чипах NP для SELDI (Bio-Rad). Перед получением спектров чипы SELDI помещали в адаптер Lucid™ для масс-спектрометров производства Bruker. Масс-спектры получали в линейном режиме в интервале m/z 2-30 кДа с использованием масс-спектрометра Autoflex III MALDI-TOF.

Основанный на технологии xMAP мультиплексный анализ проводили на приборе Bio-Plex 200 System (Bio-Rad) с использованием набора для определения цитокинов BioPlex Pro Human Cytokine 27-Plex Panel (Bio-Rad). Панель цитокинов состояла из тестов на 27 цитокинов, включая PDGF-bb, IL-1b, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, эотаксин, основной FGF, G-CSF, GM-CSF, IFN-, IP-10, MCPMCAF), MIP-1a, MIP-1b, RANTES, TNF-a, VEGF. Анализ проводили по инструкции производителя. Результаты измерения представляли с использованием программного обеспечения Bio-Plex Manager 5.0 (Bio-Rad). Статистическую обработку данных проводили с использованием Microsoft Excel и статистического языка программирования R, находящегося в открытом доступе (www.r-project.org). Обработку массспектрометрических данных и выравнивание пиков проводили с использованием программного обеспечения ClinProTools 2.0 (Bruker Daltonics). Процедура обработки данных масс-спектрометрии и цитокинового анализа для построения диагностического правила была в общих чертах одинаковой и включала анализ главных компонент (PCA) и кластеризацию. Поиск значимых различий по площади индивидуальных пиков или по концентрации конкретных цитокинов между группами выполняли с использованием теста Крускала-Уоллиса для трех групп и U-теста Манна-Уитни для двух групп, если их считали независимыми, используя поправку Бонферрони. Диагностические характеристики каждой переменной и их комбинации рассчитывали с использованием площади под ROC-кривой.

Также вычисляли точность, чувствительность и специфичность диагностики.

Диагностические модели строили с использованием классификатора метода опорных

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Пилотное исследование термостабильной фракции сывороток пациентов с различными злокачественными опухолями, характерными для женщин, методом двумерного электрофореза. Анализировали термостабильные фракции сыворотки крови пациенток, страдающих от рака яичника, матки, молочной железы, от доброкачественных опухолей яичников, а также здоровых женщин, для поиска дифференциально экспрессирующихся в этих состояниях биомаркерных белков. Температурную обработку сыворотки крови использовали для частичного избавления от преобладающих высококопийных белков. Эффективность данного метода для избавления от сывороточного альбумина доказывали посредством 2D-электрофореза (данные приведены в диссертации).

На электрофореграммах выявляли дифференциально экспрессирующиеся белки в сыворотках пациентов с различными злокачественными опухолями, характерными для женщин. Достоверные различия между группами были найдены в шести областях электрофоретической карты. После идентификации белков по пептидному фингерпринту оказалось, что эти пятна соответствуют следующим белкам: кислому гликопротеину- (область 1), кластерину (apo J) (область 2), транстиретину (область 3), apo A-I (область 4), фрагментам apo A-I (область 5) и 1-цепи гаптоглобина (область 6) (см. рис. 1). В таблицу 1 сведены данные об относительной суммарной интенсивности окраски (площадь интенсивность окраски) перечисленных пятен для каждой из исследуемых групп.

Таблица 1. Различия в относительной суммарной интенсивности окраски белковых пятен между группами пациентов с раком яичника, матки, молочной железы, с доброкачественными опухолями яичников и контрольной группой.