На правах рукописи

СУХОВЕРШИН

Роман Александрович

МЕТАБОЛИЗМ АРГИНИНА И ЕГО МЕТИЛИРОВАННЫХ

АНАЛОГОВ В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ И ПРИ

ОСТРОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ПОЧЕК У КРЫС

03.03.01 – физиология

03.01.04 – биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт физиологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель доктор биологических наук ГИЛИНСКИЙ Михаил Абрамович

Официальные оппоненты:

ИВАНОВА Людмила Николаевна академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУН «Институт цитологии и генетики» СО РАН, советник РАН ВАВИЛИН Валентин Андреевич доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «НИИ молекулярной биологии и биофизики» СО РАМН, руководитель лаборатории метаболизма лекарств и фармакокинетики

Ведущая организация Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится 30 мая 2012 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 001.014.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт физиологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4; тел.: 8-383-334

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научноисследовательский институт физиологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4).

Автореферат разослан 27 апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Бузуева Ирина Ивановна Общая характеристика диссертации Актуальность темы Оксид азота (NO) выполняет в организме многие жизненно важные функции. Анализу этих функций посвящено несколько обзоров [Lowenstein and Snyder, 1992; Марков, 2001]. Нарушение продукции NO вовлечено в развитие ряда заболеваний, включая эндотелиальную и эректильную дисфункции, гипертензию и атеросклероз [Родионов и др., 2008].

Аминокислота аргинин (АРГ) и её метилированные аналоги (метиларгинины) играют ведущую роль в регуляции биодоступности NO в организме [Гилинский, 2007]. АРГ служит субстратом внутриклеточного фермента NO-синтазы (NOS), производящего эндогенный NO [Sessa, 1994]. Монометиларгинин (ММА) и асимметричный диметиларгинин (АДМА) являются конкурентными ингибиторами всех изоформ NOS. Они блокируют АРГ-связывающий участок фермента, препятствуя образованию фермент-субстратного комплекса [Rees et al., 1990; Vallance et al., 1992]. Даже небольшое повышение концентрации АДМА вне клетки соответствует такому изменению внутриклеточного уровня АДМА, которое достаточно для подавления активности NOS [Cardounel et al., 2007]. Структурный изомер АДМА – симметричный диметиларгинин (СДМА), не влияет на активность NOS, но конкурирует с АРГ за трансмембранные переносчики в клетку, ограничивая доступность АРГ для NOS [Closs et al., 1997].

В этой связи изучение метаболизма АРГ и метиларгининов, а также особенностей регуляции продукции NO эндогенными метиларгининами в физиологических условиях и при различной патологии in vivo в последнее время привлекает внимание всё большего количества исследователей [Bger, 2009].

Известно, что АРГ синтезируется в организме, а также высвобождается из клеточных белков и поступает с пищей [Morris, 2006].

Метиларгинины образуются при посттрансляционной модификации АРГ-содержащих белков и высвобождаются в результате протеолиза [Anthony et al., 2005]. Только свободные АДМА и ММА способны ингибировать NOS.

Элиминация свободных ММА и АДМА осуществляется преимущественно путём ферментативного гидролиза диметиларгинин диметиламиногидролазой (ДДАГ) [Ogawa et al., 1987]. Лишь небольшая доля данных веществ выводится с мочой в неизменном виде [Achan et al., 2003]. Напротив, СДМА не подвергается ферментативной деградации и элиминируется путём экскреции с мочой [Yudkoff et al., 1984].

Важным органом для метаболизма АРГ и его метилированных аналогов являются почки. Они не только обеспечивают экскрецию данных веществ с мочой, но участвуют в реализации и других механизмов, связанных с поддержанием определённого уровня циркулирующих в крови АРГ и метиларгининов. Клетки проксимальных канальцев почки являются основным местом продукции АРГ в организме млекопитающих [Dhanakoti et al., 1990] и этот метаболический путь служит важным источником циркулирующего в крови АРГ [Featherson et al., 1973]. Кроме того, в ткани почки содержится большое количество ДДАГ, обеспечивающее ферментативную элиминацию АДМА и ММА [Tojo et al, 1997; Leiper et al., 1999].

В крови пациентов с хронической болезнью почек (ХБП) зарегистрированы повышенные уровни АДМА и СДМА [Schwedhelm and Bger, 2011]. Увеличение циркулирующего в крови АДМА сопровождалось подавлением синтеза NO, и ассоциировалось с развитием сердечно-сосудистой патологии (эндотелиальная дисфункция, атеросклероз, гипертензия и пр.) [Siroen et al., 2006]. Из представленных в литературе данных видно, что роль почек в метаболизме метиларгининов комплексная и изучена недостаточно. Большинство исследований в отношении метаболизма АРГ и его метилированных аналогов при нарушении функции почек являются клиническими и сфокусированы на ХБП. В то же время в литературе отсутствуют работы, направленные на изучение влияния острого повреждения почек на уровни циркулирующих в крови метиларгининов и их экскрецию с мочой. Однако такие исследования, вероятно, могли бы способствовать более полному пониманию роли почек в регуляции уровней метиларгининов. Кроме того, эти исследования помогли бы выяснить, имеют ли метиларгинины какую-либо патогенетическую значимость при синдроме острой почечной недостаточности (ОПН).

Определить влияние острого повреждения почек на почечную экскрецию и метаболизм аргинина и его метилированных аналогов, а также выяснить роль данных веществ в нарушении продукции оксида азота при остром повреждении почек на модели глицериновой острой почечной недостаточности.

1. Исследовать суточную экскрецию аргинина, монометиларгинина, асимметричного и симметричного диметиларгининов с мочой в физиологических условиях и при остром повреждении почек.

2. Определить концентрации аргинина, монометиларгинина, асимметричного и симметричного диметиларгининов, а также их соотношения в плазме крови и почечной ткани в физиологических условиях и при остром повреждении почек.

3. Оценить активность диметиларгинин диметиламиногидролазы в почечной ткани в физиологических условиях и при остром повреждении почек.

4. Измерить скорость продукции аргинина в почечной ткани в физиологических условиях и при остром повреждении почек.

5. Определить концентрацию в крови и суточную экскрецию с мочой конечных стабильных метаболитов оксида азота (нитрит/нитрат-ионов) в физиологических условиях и при остром повреждении почек.

Впервые показано, что почечная экскреция аргинина, монометиларгинина и симметричного диметиларгинина не изменяется при остром повреждении почек, индуцированном глицерином у крыс, а экскреция асимметричного диметиларгинина многократно увеличивается.

Обнаружено, что при острой почечной недостаточности у крыс концентрация циркулирующего в крови асимметричного диметиларгинина значимо не меняется, несмотря на значительный рост экскреции этой аминокислоты с мочой. Напротив, на фоне сохранной почечной экскреции аргинина, монометиларгинина и симметричного диметиларгинина, уровень аргинина в системном кровотоке снижается, а симметричного диметиларгинина значительно увеличивается.

Выявлено, что содержание аргинина и его метилированных аналогов в почечной ткани при остром повреждении почек, индуцированном глицерином, уменьшается вдвое.

Впервые продемонстрировано, что при остром повреждении почек в организме возрастает продукция симметричного диметиларгинина, несмотря на то, что общий метаболизм монометиларгинина (предшественника симметричного диметиларгинина) не изменяется.

Установлено, что активность диметиларгинин диметиламиногидролазы и скорость продукции аргинина в почечной ткани уменьшаются под влиянием острой почечной недостаточности. Подавление активности диметиларгинин диметиламиногидролазы в ткани почки не приводит к повышению концентрации асимметричного диметиларгинина в плазме за счёт увеличения его экскреции с мочой.

Впервые выявлено, что при остром повреждении почек, как в крови, так и в почечной ткани уменьшается отношение АРГ/(ММА+АДМА). Изменение баланса субстрата и эндогенных ингибиторов NO-синтазы приводит к снижению биодоступности оксида азота (количество эндогенного оксида азота, доступного для клеток-мишеней) в организме.

Научно-практическая значимость Данная работа носит преимущественно фундаментальный характер и существенно расширяет представления о механизмах регуляции уровня циркулирующих в крови аргинина и его метилированных аналогов. Полученные данные также демонстрируют вклад изменений метаболизма аргинина и метиларгининов в снижение синтеза оксида азота и являются шагом к разработке способов коррекции нарушений биодоступности оксида азота при патологии почек.

Полученные результаты работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов.

1. Острое повреждение почек у крыс не оказывает влияния на почечную экскрецию аргинина, монометиларгинина, симметричного диметиларгинина и увеличивает экскрецию асимметричного диметиларгинина. При этом продукция симметричного диметиларгинина в организме увеличивается, а метаболизм монометиларгинина не изменяется.

2. Ферментативный путь элиминации асимметричного диметиларгинина в почечной ткани при остром повреждении почек подавляется, однако это нарушение не приводит к повышению концентрации асимметричного диметиларгинина в плазме крови за счёт компенсаторного увеличения его почечной экскреции.

3. Продукция аргинина почечной тканью при остром повреждении почек подавляется, а его концентрация в крови и ткани почки снижается, что приводит к уменьшению количества субстрата NOсинтазы (аргинина) на единицу её эндогенных ингибиторов (монометиларгинина и асимметричного диметиларгинина) и, как следствие, к снижению биодоступности оксида азота в почке и в целом организме.

Материалы, изложенные в диссертации, представлены на XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (г. Калуга, 19сентября 2010 г.), на XLVII ERA-EDTA Congress (г. Мюнхен, Германия, 25-28 июня 2010 г.), 5th International Symposium on ADMA (г. Чикаго, США, 11-12 ноября 2010 г.), на I всероссийской научной конференции молодых учёных «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (г. Санкт-Петербург, 21-22 декабря 2010 г.), на конкурсе молодых учёных ФГБУ «НИИ физиологии» СО РАМН на лучшую научно-исследовательскую работу (г. Новосибирск, марта 2012 г.).

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ (из них – 5 статей в центральной печати).

Материал диссертации изложен на 119 страницах машинописного текста, содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов, заключение, выводы, список литературы. Диссертация содержит 13 таблиц и 24 рисунка. Список цитируемой литературы включает 182 источника, в том числе 8 отечественных и зарубежных авторов.

Эксперименты проведены на половозрелых самцах крыс Wistar массой 180 – 220 г. Животные содержались индивидуально в метаболических клетках (Tecniplast, Italy) при 12-часовом цикле освещения со свободным доступом к воде и пище. Экспериментальный протокол одобрен этическим комитетом ФГБУ «НИИ физиологии»

СО РАМН и выполнен в соответствии с директивами 86/609/EC.

Острое повреждение почек (n=33) инициировали инъекцией 50% водного раствора глицерина в мышцы обеих задних конечностей (всего 10 мл/кг веса) [Zager, 1996]. За 24 ч до инъекции животных лишали доступа к воде. Сразу после введения глицерина доступ к воде восстанавливали. Животным контрольной группы (n=31) вводили 0.9% раствор NaCl в том же объёме. Спустя 72 ч после инъекции регистрировали суточный объём мочи и забирали образец мочи для анализа. Затем животных декапитировали для забора крови и ткани почки.

Концентрации креатинина и мочевины в плазме и суточной моче определяли стандартными диагностическими наборами (Fluitest, Biocon, Germany). Почечный клиренс вещества (XCL) рассчитывали по формуле XCL=UX*V/PX/1440, где XCL – клиренс вещества X (мл/мин), UX – концентрация X в моче, PX – концентрация X в плазме крови, V – объём мочи (мл). Скорость клубочковой фильтрации (СКФ) принимали равной клиренсу креатинина. Экскретируемую EFX=XCL*100/СКФ, где EFX – экскретируемая фракция (%), XCL – клиренс вещества X (мл/мин). Долю реабсорбции (R, %) клубочкового фильтрата рассчитывали как R=100*(СКФ–минутный диурез)/СКФ.

Концентрации АРГ и метиларгининов в плазме крови, суточной моче и гомогенатах почечной ткани определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуоресцентной детекцией после твердофазной экстракции [Teerlink, 2007].

Вкратце, 200 мкл плазмы, мочи или депротеинизированного гомогената смешивали со 100 мкл 40 мкМ раствора внутреннего стандарта (гомоаргинин) и 700 мкл фосфатного буфера (pH 7.0). Эту пробу наносили на картридж Oasis MCX (1cc, 30mg, Waters, USA) для твердо-фазной экстракции основных аминокислот. Картриджи кондиционировали 1 мл метанола и 1 мл воды. После нанесения пробы на сорбент, картриджи последовательно промывали 1 мл 0.1 М HCl и 1 мл метанола. Аналиты элюировали с помощью 1 мл смеси концентрированного аммиака/воды/метанола/1 М NaOH (10/40/50/0.5).

После упаривания раствора под током азота, аминокислоты растворяли в 200 мкл воды и дериватизировали ортофтальдиальдегидным реагентом, содержащим 3-меркаптопропионовую кислоту. Дериваты разделяли на колонке Luna C18(2) (3 мкм, 100x2 мм, Phenomenex, USA), объём инжекции – 20 мкл (аутоинжектор SIL-10AD, Shimadzu, Japan). В качестве подвижной фазы использовали 50 мM KH2PO4 буфер (pH 6.5) содержащий 8.7% ацетонитрила при скорости потока 0.2 мл/мин (насос LC-10ADvp, Shimadzu, Japan) и температуре колонки 45оС. Флуоресцентную детекцию аналитов проводили детектором RF-10A (Shimadzu, Japan) на волнах возбуждения – 340 нм, эмиссии – 455 нм. После выхода последнего аналита колонку промывали 25% ацетонитрилом в буфере. Расчёт концентраций аналитов осуществляли по отношению площадей пиков стандартных и исследуемых образцов с поправкой на внутренний стандарт (софт LCSolution, Shimadzu, Japan).

Активность ДДАГ в почечной ткани определяли прямым измерением количества АДМА, метаболизированного ферментом [Nonaka et al., 2006]. Гомогенат разделяли на две части: к 90 мкл гомогената и 180 мкл 0.1 М Na2HPO4 буфера (pH 6.5) добавляли 30 мкл мкМ АДМА. Для инактивации ДДАГ в одну из пробирок немедленно добавляли 30 мкл 30% 5-сульфосалициловой кислоты (ССК), затем инкубировали на водяной бане 60 мин при 37oC. В этой пробирке активность ДДАГ образца принималась равной 0. Другую пробирку с гомогенатом инкубировали 60 мин при 37oC перед тем, как добавить 30% ССК. Затем все образцы центрифугировали 10 мин при 9100g и 4oC. Супернатант подвергался процедуре твёрдофазной экстракции и ВЭЖХ анализу, описанным выше. Активность ДДАГ выражали как снижение количества АДМА (пмоль) за минуту на мг белка при 37oC. Концентрацию белка в образцах определяли методом Бредфорда [Bradford, 1976].

Продукцию АРГ в почечной ткани оценивали способом, подобным определению активности ДДАГ, но без использования экзогенного АДМА. Скорость синтеза АРГ выражали как увеличение количества АРГ (пмоль) за минуту на мг белка при 37oC.

Нитрит-ионы определяли реакцией Грисса [Navarro-Gonzlvez et al., 1998]. 150 мкл образца помещали в лунку 96-луночной планшеты, последовательно добавляли 75 мкл 60 мМ раствора сульфаниламида (в 7% HCl) и 75 мкл 0.77 мМ нафтилэтилендиамина дигидрохлорида (NEDA). Спустя 5 мин определяли поглощение света образцом на длинах волн 540 нм и 630 нм в бихроматическом режиме (ELx 808iu, Bio-Tek, USA). Нитрат-ионы восстанавливали до нитрит-ионов гранулами кадмия (Cd), покрытыми медью [NavarroGonzlvez et al., 1998]. Все образцы депротеинизировали раствором ZnSO4 [Ghasemi et al., 2007]. К 250 мкл супернатанта добавляли мкл 0.2 М глицин-NaOH буфера (pH 9.7). В пробирку с образцом помещали 4 гранулы (d~2мм) покрытого медью Cd и встряхивали мин. Затем образец переносили в чистую пробирку и центрифугировали 7 мин при 12000g. Супернатант забирали для определения нитрит-иона. Для покрытия медью, гранулы Cd трижды промывали деионизованной водой и помещали в 5 мМ раствор CuSO4 на 5 мин.

Помешивали на протяжении всей инкубации. Затем дважды промывали глицин-NaOH буфером, подсушивали и сразу использовали.

Анализ данных осуществляли при помощи пакета Statistica (StatSoft, USA). Данные представлены как M±SE. Нормальность распределения оценивали критерием Колмогорова-Смирнова. Значимость различий средних значений между группами определяли tтестом для независимых выборок. Различия считали статистически