На правах рукописи

ФЕДОТОВСКАЯ ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА

АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ AMPD1, CKMM, G6PC2 И

MCT1 ЧЕЛОВЕКА С МЫШЕЧНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬЮ РАЗЛИЧНОЙ

МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ НАПРАВЛЕННОСТИ

14.03.11 – Восстановительная медицина, спортивная медицина, лечебная

физкультура, курортология и физиотерапия 03.02.07 – Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в секторе биохимии спорта Федерального государственного бюджетного учреждения «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт физической культуры» (ФГБУ СПб НИИФК) доктор медицинских наук

Научный руководитель:

АХМЕТОВ Ильдус Ильясович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научный центр физической культуры и спорта» (ФГБУ ФНЦ ВНИИФК), руководитель управления центра инновационных технологий сопровождения спорта высших достижений и спортивного резерва АБРАМОВА Тамара Федоровна доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медикостоматологический университет», заведующий лабораторией медицинских генетических технологий ПЕТРИН Александр Николаевич Государственное бюджетное образовательное

Ведущая организация:

учреждение высшего профессионального образования Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И.Мечникова

Защита состоится «25» апреля 2012 года в 14 часов на заседании совета Д311.002. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук, созданного на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научный центр физической культуры и спорта» (ФГБУ ФНЦ ВНИИФК) по адресу: 105005, Москва, Елизаветинский пер., д.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научный центр физической культуры и спорта» (ФГБУ ФНЦ ВНИИФК)

Автореферат разослан «_» марта 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук С.А. Неборский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Успешная реализация многолетней международной программы «Геном человека» оказала большое влияние на фундаментальную и прикладную медико-биологическую науку (Рогозкин В.А. и др., 2005). В настоящее время молекулярными биологами и генетиками активно проводится детальная расшифровка функций генома человека, представляющая собой, помимо транскриптомных и протеомных исследований, детекцию полиморфных участков ДНК, влияющих на экспрессию генов, активность и структуру функциональных продуктов (белков, РНК).

Генетические факторы наряду с эпигенетическим воздействием и факторами внешней среды играют важную роль в детерминации индивидуальных различий в развитии и проявлении физических качеств и адаптационных возможностей человека (Ahmetov I.I. and Rogozkin V.A., 2009). Результаты исследований влияния полиморфных генов на значимые в условиях спортивной деятельности фенотипы позволят модернизировать систему медико-генетического обеспечения физической культуры и спорта с учетом оценки генетического потенциала организма спортсмена, внедрить в практику основы профилактической персонифицированной медицины, помочь в планировании и коррекции тренировочного процесса спортсменов.

В исследовании, проводимом в рамках проекта HERITAGE, были выявлены группы испытуемых с различными значениями концентраций ферментов, участвующих в основных путях энергообеспечения скелетных мышц. Причем, среди членов семей значения активности ферментов имели меньший разброс, чем среди всех обследованных («семейное сходство») (Rico-Sanz J. et al., 2003). Это позволяет считать преобладание у индивида определенных механизмов энергообеспечения мышечной деятельности наследуемым признаком, что создает предпосылки к поиску молекулярно-генетических маркеров предрасположенности к мышечной деятельности различной метаболической направленности, характеризующейся разными вкладами механизмов энергообеспечения.

аденозинмонофосфатдезаминазы (АМФД-М) и креатинфосфокиназы (КК-М) – ферментов, участвующих в реакциях ресинтеза АТФ в процессе энергообеспечения сокращающихся мышц. Катализируемая АМФД-М реакция дезаминирования АМФ смещает миокиназную реакцию в сторону продукции АТФ и минимизирует накопление АДФ в скелетных мышцах в процессе их сокращения. Фермент КК-М осуществляет фосфотрансферазную реакцию между креатинфосфатом (КФ) и АДФ, поставляя вновь синтезированную АТФ к сократительным элементам мышечного волокна (Яковлев Н.Н., 1983). Помимо этого, КК-М участвует в транспорте макроэргического фосфата из митохондрий к сокращающимся миофибриллам («креатинфосфатный челнок») (Bessman S.P. and Geiger P.J., 1981; Saks V.A. et al., 2007). Ген G6PC2 кодирует каталитическую субъединицу глюкозо-6-фосфатазы типа (Г6ФК2) – фермента, который участвует в регуляции уровня глюкозы в крови, использующейся сокращающимися скелетными мышцами для ресинтеза АТФ. Ген МСТ1 кодирует белок-транспортер монокарбоновых кислот 1 типа (МКТ1), который обеспечивает транспорт лактата из кровотока в медленные мышечные волокна, где он может быть использован в качестве энергетического субстрата (Dubouchaud H. et al., 2000). Эффективное функционирование МКТ1 способствует поддержанию кислотно-щелочного равновесия крови и мышечной ткани, что препятствует развитию утомления в процессе выполнения интенсивной физической нагрузки (Thomas С. et al., 2005).

Результаты исследований в области биохимии, физиологии и молекулярной генетики физической активности указывают на то, что вариации в генах AMPD1, CKMМ, G6PC2 и MCT1, белковые продукты которых участвуют в энергообеспечении мышечной деятельности, могут влиять на эффективность мышечной деятельности в результате изменения метаболизма мышечной ткани и процессов адаптации скелетных мышц к физическим нагрузкам.

Гипотеза. Предполагается, что полиморфизмы в генах AMPD1, CKMM, G6PC2 и MCT1 человека могут быть генетическими маркерами, детерминирующими предрасположенность к выполнению мышечной деятельности различной метаболической направленности.

Цель исследования – изучить ассоциации полиморфизмов генов AMPD1, CKMM, G6PC2 и MCT1 с предрасположенностью к мышечной деятельности различного характера, морфометрическими характеристиками скелетных мышц и функциональными особенностями организма человека.

Задачи исследования:

Проанализировать полиморфные варианты генов AMPD1 (C34T), CKMM (A/G), G6PC2 (G/A) и MCT1 (А1470Т), определить распределение частот генотипов и аллелей у спортсменов различной специализации и квалификации, сравнить их с данными контрольной группы (незанимающиеся спортом жители России).

Изучить ассоциации полиморфизмов генов AMPD1, CKMM, G6PC2 и MCT1 с параметрами физиологических функций спортсменов и их динамикой при тренировке аэробной направленности.

Изучить ассоциации полиморфизмов генов AMPD1, CKMM, G6PC2 и MCT1 с морфометрическими параметрами мышечных волокон в группе физически активных людей.

Изучить взаимосвязи полиморфизма гена G6PC2 с базальным уровнем глюкозы в крови и полиморфизма гена MCT1 с уровнем лактата в крови при предельной физической нагрузке.

Объект исследования. Закономерности влияния полиморфных генов, белковые продукты которых участвуют в энергообеспечении мышечной деятельности, на значимые в условиях спортивной деятельности фенотипы.

Предмет исследования. Полиморфизм ДНК, функциональные особенности и морфометрические характеристики мышц квалифицированных спортсменов, физически активных людей и незанимающихся спортом лиц.

Научная новизна. Впервые изучены полиморфизмы генов AMPD1 (C34T), CKMM (A/G), G6PC2 (G/A) и MCT1 (А1470Т) у жителей России и российских спортсменов. Показано, что исследованные вариации генов ассоциированы с предрасположенностью к занятиям различными видами спорта, а также с показателями аэробной работоспособности, силовыми, морфометрическими и физиологическими параметрами скелетных мышц.

Теоретическая значимость. Результаты настоящей работы вносят вклад в развитие геномики физической активности. Изучение полиморфных вариантов генов, белковые продукты которых связаны с энергообеспечением мышечной деятельности, поможет выявить новые сведения о механизмах, которые лежат в основе срочной и долговременной адаптации к мышечной деятельности.

Практическая значимость. Анализ полиморфизмов генов AMPD1 (C34T), CKMM (A/G), G6PC2 (G/A) и MCT1 (А1470Т) в комплексе с другими молекулярногенетическими маркерами и фенотипическими показателями можно рекомендовать для оценки предрасположенности к развитию и проявлению физических качеств человека. Проведение подобного комплексного анализа поможет индивидуализировать тренировочный процесс, сохранить здоровье спортсмена в условиях интенсивной спортивной деятельности, а также существенно повысит прогностические возможности спортивного отбора. Результаты диссертационной работы внедрены в практику подготовки спортсменов-биатлонистов Училища Олимпийского резерва №2 города Санкт-Петербурга, учащихся спортивного центра подготовки «Касатка» и в тренировочный процесс сборной команды СанктПетербурга по лыжным гонкам.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Полиморфизмы генов AMPD1 (C34T), CKMM (A/G), G6PC2 (G/A) и MCT (А1470Т) ассоциируются с двигательной деятельностью человека. В группе спортсменов, занимающихся видами спорта с преимущественным проявлением выносливости, частоты AMPD1 СС генотипа, СКММ А аллеля, G6PC2 GG генотипа и МСТ1 АА генотипа статистически значимо выше по сравнению с контрольной группой (незанимающиеся спортом жители России). Частоты AMPD1 СC генотипа, СКММ G аллеля, G6PC2 GG генотипа и МСТ1 AА генотипа превалируют в группе спортсменов, занимающихся видами спорта, направленными на развитие быстроты/силы. На этом основании СКММ G аллель можно рассматривать как маркер предрасположенности к развитию и предрасположенности к развитию и проявлению выносливости. Носительство AMPD1 СС, G6PC2 GG и МСТ1 АА генотипов ассоциировано с повышенной физической работоспособностью: носители данных генотипов и аллелей в одинаковой степени предрасположены к занятиям любыми изученными в настоящей работе видами спорта.

2. Обнаружена взаимосвязь генотипов AMPD1, CKMM и МСТ1 с аэробными возможностями спортсменов, занимающихся академической греблей, лыжными гонками и биатлоном. У носителей AMPD1 СС, CKMM AA и МСТ1 АА генотипов обнаружены бльшие значения максимального потребления кислорода (VO2max) при выполнении теста со ступенчато повышающейся нагрузкой до отказа. У обладателей AMPD1 СС и CKMM AA генотипов выявлены бльшие значения максимальной аэробной мощности. В результате длительной тренировки выносливости прирост VO2max больше у обладателей AMPD1 CC и СКММ АА генотипов. CKMM GG генотип связан с высокими силовыми показателями спортсменов, занимающихся академической греблей и тяжелой атлетикой.

3. A1470T полиморфизм гена МСТ1 и G/A полиморфизм гена G6PC ассоциированы с размером мышечных волокон. Носители МСТ1 АА генотипа имеют бльшие значения площади поперечного сечения (ППС) медленных мышечных волокон. У обладателей G6PC2 GG генотипа обнаружены бльшие значения ППС быстрых мышечных волокон.

4. У спортсменов, носителей МСТ1 Т аллеля, выявлен более высокий уровень лактата в крови при предельной физической нагрузке по сравнению с обладателями МСТ1 АА генотипа. Обнаружена корреляция носительства G6PC G аллеля c повышенной базальной концентрацией глюкозы в крови.

5. Ассоциации полиморфных вариантов генов AMPD1, CKMM, G6PC2 и MCT1 с предрасположенностью к определенным типам двигательной деятельности согласуются с результатами корреляционного анализа данных полиморфизмов в отношении физиологических, морфометрических и биохимических параметров скелетных мышц.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на межвузовской научно-технической конференции: ХХХІІ неделя науки СПбГПУ (Санкт-Петербург, 2004), политехническом симпозиуме: Молодые ученые – промышленности Северо-Западного региона (Санкт-Петербург, 2004), ежегодных научных итоговых конференциях ФГУСПбНИИ физической культуры (СанктПетербург, 2004, 2005), X конгрессе Европейского колледжа спортивных наук (Белград, Сербия и Черногория, 2005), III Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва, 2005), Всероссийской конференции молодых ученых «Физиология и медицина» (СанктПетербург, 2005), III Международной научной конференции «Актуальные проблемы спортивной морфологии и генетики человека» (Москва, 2009), XII и XIII Всероссийских конференциях «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2009, 2010), Российском Конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины – возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010), V Международном конгрессе «Человек, спорт, здоровье» (Санкт-Петербург, 2011).

Личное участие автора. Автором лично выполнены обзор литературы, планирование исследований, разработка методик определения G/A полиморфизма гена G6PC2 и А1470Т полиморфизма гена MСТ1, весь объем молекулярногенетической диагностики (забор биологического материала, выделение ДНК различными методами, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов), статистический анализ и обработка полученных результатов, подготовка к печати публикаций по результатам работы, написание и оформление рукописи диссертации.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 15 печатных работ, в том числе 5 работ в ведущих научных рецензируемых изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания организации и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 149 страницах, содержит 23 рисунка и 21 таблицу. Список литературы включает 224 источника, из которых 19 опубликованы в отечественных изданиях и 205 – в иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Организация исследования. Обследовали спортсменов (мужчины, n = 743, возраст: 20.6 ± 5.4 лет; женщины, n = 253, возраст: 19.3 ± 2.8 лет) различной специализации и квалификации. В соответствии с типом энергообеспечения и характером физической нагрузки группа спортсменов была разделена на три подгруппы: I – виды спорта с преимущественным проявлением выносливости; II – виды спорта с проявлением смешанных качеств (выносливость, быстрота/сила); III – виды спорта с преимущественным проявлением быстроты/силы. На момент забора биологического материала для исследований ДНК, 17 спортсменов являлись заслуженными мастерами спорта (ЗМС), 32 – мастерами спорта международного класса (МСМК), 302 – мастерами спорта (МС), 407 – кандидатами в мастера спорта (КМС) и 238 имели первый взрослый разряд. Контрольная группа состояла из жителей города Санкт-Петербурга (мужчины, n = 201, возраст: 19.5 ± 4.7 лет;

женщины, n = 298, возраст: 19.3 ± 5.9 лет) и студентов Казанского медицинского университета (мужчины, n = 360, возраст: 18.8 ± 1.5 лет; женщины, n = 530, возраст:

18.3 ± 1.2 лет). Главным условием для включения в контрольную группу являлось отсутствие стажа регулярных занятий спортом и спортивного разряда.

В таблице 1 представлены структура и объем исследований ассоциаций полиморфизмов генов AMPD1 (C34T), CKMM (A/G), G6PC2 (G/A) и MCT1 (А1470Т) с фенотипами физической активности.

Контрольная группа Все спортсмены частотах генотипов и аллелей генов по сравнению с Гребцы-академисты Лыжники-гонщики, биатлонисты Гребцы-академисты Физически активные мужчины Гребцы-академисты Лыжники-двоеборцы 17 предельной физической нагрузке Физически активные Определение взаимосвязи генотипов и аллелей гена мужчины и женщины G6PC2 с базальным уровнем глюкозы в крови Лыжники-гонщики, биатлонисты Все испытуемые были проинформированы о целях и условиях экспериментов.

Участие в исследованиях было добровольным. Обследования были одобрены Физиологической секцией Российской Национальной комиссии по биологической этике, комиссией по биоэтике Института медико-биологических проблем РАН, этическим комитетом СПбГУ.

Молекулярно-генетические методы. Выделение ДНК проводили из эпителиальных клеток ротовой полости методом щелочной экстракции или сорбентным методом, из сухих пятен крови стандартным фенольно-хлороформным методом, из лейкоцитов крови сорбентным методом.

Для определения полиморфизмов генов G6PC2 (G/A) и МСТ1 (А1470Т) были разработаны методики с использованием биотехнологической информационной базы данных NCBI. Для идентификации полиморфизмов применяли приложение «SNP», для подбора праймеров – программы «Primer 3» и «PrimerBLAST». Определение генотипов проводили при помощи анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Для выявления однонуклеотидных замен ампликоны инкубировали с эндонуклеазами рестрикции: NspI (AMPD1, С34Т rs17602729), Bsp19I (CKMM, A/G rs8111989), Bst4CI (G6PC2, G/A rs560887), BссI (МСТ1, А1470T rs1049434).

Анализ длин продуктов рестрикции проводили электрофоретическим разделением в полиакриламидном либо агарозном гелях с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете.

Определение показателей аэробной и анаэробной работоспособности.

Определение аэробных и анаэробных возможностей в тесте со ступенчато повышающейся нагрузкой у гребцов-академистов на механическом гребном эргометре PM 3 (Concept II, США) проводили сотрудники Института медикобиологических проблем РАН к.б.н. Попов Д.В., Миссина С.С. и д.б.н. Виноградова О.Л. Начальная нагрузка составила 150 Вт для мужчин и 100 Вт – для женщин, длительность ступени – 3 минуты, время отдыха между ступенями – 30 секунд.

Работа выполнялась до отказа. Во время теста каждый дыхательный цикл регистрировали параметры внешнего дыхания и частоту сердечных сокращений (газоанализатор MetaMax 3B (Cortex, Германия) и Vmax229 (SensorMedics, США)).

Максимальное потребление кислорода (VO2max, л/мин) определяли по значениям показателей газообмена усредненных за последние 30 секунд каждой ступени теста.

Концентрацию лактата (Lmax, мМ) определяли электрохимическим методом в цельной крови (Super GL easy, Dr. Mueller, Германия). Капиллярную кровь (20 мкл) брали из пальца после каждой ступени и сразу после окончания работы.

Определение аэробных и анаэробных возможностей в тесте с нарастающей нагрузкой у спортсменов, занимающихся лыжными гонками, биатлоном и лыжным двоеборьем, на тредбане Saturn (НР Сosmos, Германия) проводили сотрудники СанктПетербургского НИИ физической культуры Черенина С.В., Масанова Ф.М., к.б.н.

Гольберг Н.Д. и Сабурова В.В. Начальная нагрузка для мужчин составила 6 км/ч, для женщин – 5 км/ч, длительность ступени – 3 минуты, шаг – увеличение угла наклона на 2.5% и скорости: мужчины – 6 км/ч, 9 км/ч, 12 км/ч; женщины – 5 км/ч, 8 км/ч, км/ч. Работа выполнялась до отказа. На протяжении всего теста регистрировали параметры внешнего дыхания и частоту сердечных сокращений (газоанализатор MetaMax 3B (Соrtex, Германия) и пульсометр Polar S610 (Финляндия)). Содержание лактата определяли энзиматическим колориметрическим методом (Screen Master Point, Hospitex, Швейцария) в сыворотке капиллярной крови при помощи набора реактивов фирмы «Ольвекс Диагностикум» (Санкт-Петербург). Капиллярную кровь брали из пальца до и через 3 минуты после окончания выполнения тестирующей нагрузки.

Определение силовых показателей. Определение динамометрических показателей спортсменов, занимающихся академической греблей, проводили сотрудники Института медико-биологических проблем РАН к.б.н. Нетреба А.И., д.б.н. Виноградова О.Л. Значения максимальной произвольной силы (МПС) мышц бедра определяли в тренировочном движении методом одноповторного максимума с использованием измерительного комплекса BIODEX System 3 Pro (США).

Фенотипирование осуществляли во время соревнований. Проводили сбор анкетных данных о личных рекордах в подъеме штанги. Для определения стандартного веса, поднятого в толчке или рывке, нормализованного с учетом веса и пола спортсменов, использовали критерий Роберта Уилкса.

Определение гистоморфометрических показателей мышечных волокон m.

vastus lateralis. Биопсию скелетных мышц физически активных здоровых мужчин проводили сотрудники Института медико-биологических проблем РАН (Москва) Любаева Е.В., к.б.н. Таракин П.П., д.б.н. Шенкман Б.С. Пробы мышечной ткани из m.

vastus lateralis брали методом игольчатой биопсии по Бергстрему. Для иммуногистохимического выявления тяжелых цепей миозина использовали иммунопероксидазную технику. Применяли антитела против медленных и быстрых цепей миозина (клоны NCL-MHCs и NCL-MHCf (а+b), Novocastra Laboratories). Для выявления изоформ тяжелых цепей миозина использовали вторичные антитела, конъюгированные с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC). Распределение мышечных волокон (МВ) было выражено как соотношение между числом МВ каждого типа на срезе к общему количеству МВ. Площадь поперечного сечения (ППС) была измерена не менее чем для 100 МВ каждого типа (не менее 40% всех МВ).

Определение концентрации глюкозы в крови. Базальную концентрацию глюкозы определяли сотрудники Казанского Государственного Медицинского Университета (руководитель – Борисова А.В.) в цельной крови, взятой натощак из пальца, при помощи биохимического экспресс-анализатора CardioChek.

Методы статистической обработки данных. Статистический анализ данных был выполнен с применением программы «GraphPad InStat». Определяли среднее значение (M), среднее квадратическое отклонение (± SD). Сравнительный анализ проводили с использованием критерия 2, точного теста Фишера, непарного t теста и дисперсионного анализа ANOVА. Корреляционный анализ проводили при помощи метода Спирмена для непараметрических данных. Для оценки вклада генетического компонента в фенотипическую дисперсию использовали регрессионный анализ. Силу ассоциаций оценивали по значениям показателей отношения шансов (OR) и доверительного интервала для OR (95%CI). Различия считались статистически значимыми при Р 0.05. При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони.

1. Результаты генотипирования спортсменов и контрольной группы 1.1. Распределения частот генотипов и аллелей гена AMPD Частота редкого AMPD1 T аллеля в контрольной группе составила 15.0%, не отличалась у женщин и мужчин (15.3% против 14.7%, Р = 0.86) и была схожа с данными европейской популяции (Р = 0.39) (Norman B. et al., 1998). Наблюдаемое в контрольной группе распределение генотипов подчинялось равновесию ХардиВайнберга (Р = 0.21).

Частота Т аллеля в группе спортсменов была ниже, чем в контрольной группе (7.8% против 15.0%; Р < 0.0001) и не отличалась у спортсменок и спортсменов (7.6% против 7.8%, Р = 0.92). Распределение генотипов в группе спортсменов подчинялось равновесию Харди-Вайнберга (Р = 0.75) и отличалось от распределения в контрольной группе (Р < 0.0001). При разделении всех спортсменов на три группы в соответствии с типом энергообеспечения мышечной деятельности во всех группах было обнаружено преобладание С аллеля и СС генотипа по сравнению с контрольной группой (табл. 3).

Распределения частот генотипов и аллелей гена AMPD1 у спортсменов и в Группа