На правах рукописи

Щербакова Юлия Владимировна

ВЛИЯНИЕ ТЕПЛОВОЙ ОБРАБОТКИ НА КОМПОНЕНТЫ

АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ МОЛОКА И ЕГО ИНТЕГРАЛЬНУЮ

АНТИОКСИДАНТНУЮ АКТИВНОСТЬ

03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2011

Работа выполнена на кафедре промышленной биотехнологии ФГБОУ ВПО «Казанского национального исследовательского технологического университета»

(ФГБОУ ВПО КНИТУ)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доктор химических наук, профессор ФГБОУ ВПО МГАВМиБ Зайцев Сергей Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Преображенский Сергей Николаевич доктор биологических наук Букова Наталия Константиновна

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э.

Баумана»

Защита диссертации состоится 2011 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 220.042.04 при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.

Скрябина» (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел. 377-93-83;

http://www.mgavm.ru/)

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГАВМиБ.

Автореферат разослан 2011 года и размещен на сайте http://www.mgavm.ru/

Ученый секретарь диссертационного совета Фомина В.Д.

1.

Общая характеристика работы

Для получения востребованной Актуальность темы.

конкурентоспособной молочной продукции, которая отвечает требованиям функционального питания и снижает риск развития свободнорадикальных патологий, необходимо изучение интегральной антиоксидантной активности (ИАА) молока. Это связано с тем, что ухудшающиеся экологические условия и напряженный жизненный ритм, приводящие к изменению прооксидантных и антиоксидантных ресурсов организма, способствуют росту патологий различной природы [Журавлев и др., 1982; Бурлакова и др., 1992; Кармолиев и др., 2002;

Ренсли и др., 2004; Скулачев, 2007]. Поэтому возрастает роль традиционных продуктов, содержащих в нативном виде значительное количество антиоксидантов различной природы и действия, что повышает их лечебнопрофилактическую значимость. В первую очередь к ним относятся молочные и кисломолочные продукты, содержащие большой природный комплекс биологически активных веществ, проявляющих антиоксидантные свойства [Cervato et al., 1999; Шидловская, 2010]. Однако их количество, а также активность подвержены большим колебаниям в процессе обработки молока, особенно при тепловой обработке, являющейся обязательной технологической операцией на молокоперерабатывающих заводах [Радаева и др., 2007; ГОСТ 13277-79]. Возникает необходимость достоверно контролировать изменение антиоксидантной активности молока при технологических процессах, которая может претендовать на роль современного показателя его качества. Но многообразие и полифункциональный характер антиоксидантов молока, роль которых может существенно различаться в разных условиях активации свободно радикальных процессов, и невозможность их отдельного определения из-за недостаточного развития инструментально-аналитической базы обусловливает важность знания интегральной антиоксидантной активности молока.

Поэтому очевидна актуальность исследований в области изучения интегральной активности антиокислительной системы коровьего и козьего молока, как уникального альтернативного источника молочного сырья, и влияния на данный параметр и ключевые компоненты антиоксидантной системы молока промышленных режимов пастеризации [СанПиН 2.3.4.551-96].

Выбранный нами метод кулонометрического определения интегральной антиоксидантной активности с помощью электрогенерированного брома, способного вступать в радикальные и окислительно-восстановительные реакции, а также в реакции электрофильного замещения и присоединения по кратным связям, позволяет охватить практически все группы соединений, проявляющих антиоксидантные свойства [Будников и др., 2004-2010; Абдуллин и др., 2002].

Цель и задачи работы. Цель работы заключалась в изучении интегральной антиоксидантной активности коровьего и козьего молока с одновременной оценкой изменений в ключевых биологически активных компонентах при влиянии промышленных режимов пастеризации. Для достижения этой цели в работе решались следующие задачи:

1) оценка ИАА коровьего и козьего молока методом кулонометрического титрования с помощью электрогенерированного брома;

2) изучение изменения ИАА при пастеризации;

3) изучение влияния промышленных режимов пастеризации на содержание отдельных водо- и жирорастворимых витаминов;

4) оценка уровня пероксидного окисления липидов (ПОЛ) и каталазной активности при пастеризации молока;

5) изучение изменения полипептидного состава молока с последующей идентификацией наиболее термолабильных компонентов.

Научная новизна работы. Впервые дана сравнительная оценка ИАА натурального и термообработанного коровьего и козьего молока методом кулонометрического титрования электрогенерированным бромом. Установлено, что наибольшее изменение ИАА молока наблюдалось для проб коровьего и козьего молока, полученных до кормления животных. Выявлен режим промышленной пастеризации, обеспечивающий максимально возможную сохранность биологически активных веществ натурального молока и высокую ИАА. Впервые идентифицированы наиболее термолабильные полипептиды молока методом «MALDI-TOF MS», в том числе: гормон роста; ингибитор регулятора клеточных циклов «PIN1»; три белка эпидермального фактора роста 8;

гомолог белка «MTO1»; белок 4, взаимодействующий с «ADF» – рибозилирующим фактором 6; лактоферрин; предшественник сывороточного альбумина и ряд других белков.

Практическая значимость работы. Полученные результаты послужили основой для разработки рекомендаций по оптимизации параметров тепловой обработки молока, обеспечивающей максимально возможную сохранность важнейших компонентов его антиоксидантной системы. Установлены оптимальные температура и продолжительность обработки коровьего и козьего молока, обусловливающие высокую пищевую и биологическую ценность молочного сырья. Продемонстрирована возможность использования метода кулонометрического титрования электрогенерированным бромом для определения ИАА.

Основные положения работы использованы в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий по курсу «Биохимия», «Основы научных исследований» и «Биоконверсия растительного сырья» в ФГБОУ ВПО КНИТУ и ФГБОУ ВПО МГАВМиБ.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Антиоксидантная активность молока зависит от вида животного и его физиологического состояния.

2. Тепловая обработка приводит к повышению интегральной антиоксидантной активности коровьего и козьего молока. Ее зависимость от режима пастеризации носит экстремальный характер.

3. Де- и реструктуризация полипептидов при пастеризации обусловливает рост ИАА коровьего и козьего молока. Оптимальный режим пастеризации, обеспечивающий максимально возможную сохранность биологической ценности молока: 76 С, 5 мин.

4. Результаты исследования изменения содержания жиро- (А, Е) и водорастворимых (В2, С) витаминов при тепловой обработке коровьего и козьего молока свидетельствуют о разной степени влияния изученных режимов пастеризации на их сохранность.

5. Уровень интенсивности развития ПОЛ при тепловой обработке молока, изученный на основании изменения каталазной активности и содержания ТБК-реагирующих продуктов, зависит от режима пастеризации.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены: на 12 и 13 Международных конференциях молодых ученых, студентов и аспирантов «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений – Кирпичниковские чтения» (Казань, 2008, 2009); на II Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008);

на Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии переработки сельскохозяйственного сырья в обеспечении качества жизни: наука, образование и производство» (Воронеж, 2008); на XII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2008» (Волгоград, 2008); на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009); на Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы совершенствования технологии производства и переработки продукции сельского хозяйства» (Йошкар-Ола, 2009, 2010); на III Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2010); на Международных конференциях молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2007-2010); на отчетных конференциях ФГБОУ ВПО КНИТУ (2008 - 2011) и ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (2009, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 печатных работ, в том числе 6 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1 статья в сборнике научных трудов, 1 научно-методическое пособие, 19 тезисов.

Структура и объем работы. Работа включает следующие разделы: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждения собственных исследований (3-6 главы), выводы, практические предложения, список литературы, приложения. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка, таблицы, список литературы включает 207 источника, в том числе 61 зарубежных и 146 российских авторов.

Благодарности. Выражаю особую благодарность и признательность старшему преподавателю кафедры промышленной биотехнологии ФГБОУ ВПО КНИТУ Ахмадуллиной Фариде Юнусовне, принимавшей участие в постановке задач работы, проведении технологических консультаций и обсуждении диссертационной работы. Выражаю благодарность зав. лаборатории сигнальных систем учреждения Российской академии наук Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, доктору биологических наук Каримовой Фатиме Габдуллазяновне за предоставление базы для проведения электрофоретических исследований молока, за внимание и помощь в подготовке диссертации.

Работа выполнена на базе кафедры промышленной биотехнологии ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет», в лаборатории сигнальных систем учреждения Российской академии наук Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН и на молокозаводе ООО «Эдельвейс-М» г. Казани в течение 2007гг. Экспериментальные исследования проводились с нативным молоком коров черно-пестрой голштинофризской породы возраста 2-8 лет и 25 коз зааненской породы возраста 1,5-7 лет (опыт 1, контроль) и пастеризованным молоком при следующих аналогах промышленных режимов пастеризации: 65 0С, 30 мин (опыт 2); 76 0С, 5 мин (опыт 3); 90 0С, 20 с (опыт 4); 95 0С, 5 мин (опыт 5).

Молоко отбирали утреннее, как до, так и после кормления независимо от сезона от здоровых животных на сельхозпредприятии ООО имени Тукая Ютазинского района, благополучного в отношении инфекционных заболеваний (для коровьего молока) и из частного сектора (для козьего молока). Предварительное исследование молока основывалось на определении основных нормативных показателей, значения которых лежали в диапазоне: а) титруемая кислотность – от 16 до 21 0Т; б) плотность – не менее 1027,0 кг/м3; в) массовая доля жира – 2,8г) массовая доля белка – не менее 2,8%; д) массовая доля сухих обезжиренных веществ – не менее 8,2%, е) количество мезофильных аэробных и факультативно-аэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) – от 3*104 до 4* КОЕ/см3. Схема проведения исследований представлена на рис.1.

Определение основных нормативных показателей, подтверждающих пригодность молока на молочных предприятиях (титруемая кислотность, плотность, массовая доля жира, массовая доля белка, массовая доля Интегральная Показатели Полипептидный ТБК-реагирующие Каталазная Определение основных нормативных показателей молока (титруемая кислотность, плотность, массовая доля жира, массовая доля белка, массовая доля сухих обезжиренных веществ) проводили на анализаторе молока и молочных продуктов «MilkoScan FT 120» («Foss Analytical A/S», Дания) [Сертификат №25319, зарегистрирован в Государственном реестре под № 16424-06].

Определение КМАФАнМ в молоке определяли согласно ГОСТ 9225-84.

Интегральную антиоксидантную активность молока определяли методом кулонометрического титрования электрогенерированным бромом на приборе «Эксперт-006» [МВИ 01-44538054-07]. Электрогенерацию осуществляли при постоянной силе тока 55,3 мА из водных 0,2 М растворов КВr в 0,1 М Н2SO4 с определением конца титрования вольтамперометрической индикацией с двумя поляризованными электродами из инертного металла. Выбор метода был обусловлен его экспрессностью, высокой точностью, хорошей воспроизводимостью результатов, а также способностью брома вступать в радикальные и окислительно-восстановительные реакции, а также в реакции электрофильного замещения и присоединения по кратным связям, что позволяет охватить практически все группы биоантиоксидантов [Будников и др., 2004].

Данные по антиоксидантной активности приведены в пересчете на рутин (стандартный образец) [ТУ 9369-141-04868244-07], а также в % от величины антиоксидантной активности нативного молока. Уровень перекисного окисления липидов молока оценивали спектрофотометрическим методом, основанным на образовании в кислой среде в присутствии тиобарбитуровой кислоты окрашенного триметинового комплекса, имеющего характерный спектр поглощения с максимумом = 532 нм [Хасанов и др., 2004]. Каталазную активность молока в работе определяли перманганатометрическим методом [Охрименко и др., 2005]. Изменение дисперсного состава липидной фракции молока оценивали методом микроскопирования на лазерном сканирующем микроскопе «LSM 510 META» (Carl Zeiss). Приведены размеры жировых глобул в нм и их количество в световом поле. Количественную оценку степени деструктурирования жировых шариков молока проводили с помощью программы «LSM Image Examiner». Определение жирорастворимых витаминов А и Е осуществлялось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на анализаторе жидкости «Флюорат 02-3», витамина С - титриметрическим методом по гостированным методикам: МВИ 04-10-96 и ГОСТ 30627.2-98. Витамин В определяли люмифлавиновым методом [Скурихин и др., 1998]. Изменение полипептидного спектра молока до и после термообработки исследовалось с помощью одномерного (1DE) и двумерного (2DE) электрофореза [Laemmli, 1970] в градиентном (6-16%) полиакриламидном геле. Степень деструкции полипептидов (ПП) оценивали по количеству исчезающих ПП по отношению к контролю, в %.

Идентификацию белков проводили с помощью метода «MALDI-TOF MS», по соответствующим протоколам [Mann at al., 1993; Lokhov at al., 2004]. Учитывая применение метода денатурирующего электрофореза, далее в работе при описании изменений, происходящих в белковой фракции, использовали термин полипептиды.

Статистическая обработка. Для получения достоверной информации все эксперименты проводили не менее чем в трехкратной повторности. Для электрофореза приведены результаты характерных опытов. Результаты остальных исследований были обработаны с помощью программы статистического анализа Excel. Значения критерия достоверности определяли на основе распределения Стьюдента с учетом принятого для научных экспериментов уровня значимости (р) 0,05.

3.Результаты и обсуждения собственных исследований Результаты проведенного кулонометрического исследования молока показали значительное влияние физиолого-биохимических и зоотехнических факторов на ИАА. Величины ИАА колебались в диапазоне 3,15-8,66 г/л и 4,87 – 14,99 г/л, соответственно для коровьего и козьего молока. Выявлено снижение величины ИАА для козьего молока с увеличением возраста животного, которое достоверно описывается полиноминальной зависимостью второго порядка (R2=0,91) (рис.2).

Установлена зависимость величины ИАА от времени отбора проб: до и после кормления (рис.3).

ИАА, г/л Рис. 3. Зависимость ИАА а) – коровьего и б) - козьего молока от времени отбора проб: до кормления; после кормления (для всех значений р 0,05) Выявлено, что ИАА молока выше для проб, отобранных после кормления по сравнению с пробами, взятыми до кормления.

Результаты наших экспериментов показали достоверное повышение величины ИАА молока при всех промышленных режимах термообработки независимо от возраста и вида животного (рис. 4).

ИАА, % Рис. 4. Влияние режимов термообработки на ИАА а) - коровьего и б) - козьего молока: до кормления; после кормления (для всех значений р 0,05) Выявленная зависимость изменения ИАА молока (в относительных единицах для корректного сопоставления экспериментальных данных) при пастеризации имеет экстремальный характер с максимумом при режиме 760С, мин. Для пастеризованного коровьего молока выявлено смещение максимума ИАА при режиме 90 0С, 20 с (~ 85% исследуемых животных) по сравнению с козьим, отобранным после кормления животных.

Для выяснения причин повышения ИАА молока и экстремального характера ее зависимости от режима пастеризации нами проведено изучение изменения белковой и липидной фракции молока, содержания жиро- и водорастворимых витаминов и уровня пероксидного окисления липидов.

Микроскопирование натуральных и термообработанных проб молока показало увеличение «мелкодисперсных» шариков жира (от 1 до 3 нм) при одновременном уменьшении более «крупнодисперсных» шариков после пастеризации (от 4 до 6 нм) (рис. 5).

Деструктурирование липидной фракции обусловливает высвобождение в плазму молока антиоксидантов - компонентов жировых шариков молока (фосфолипиды, сфингомиэлинподобные каротиноиды, жирорастворимые витамины, белки оболочек жировых шариков [Тиняков и др., 1963]). Это подтверждается установленным в работе увеличением ИАА пастеризованного молока в зависимости от его жирности (рис. 6).

Содержание % Рис. 5. Влияние термообработки на дисперсный состав липидной фракции Рис. 6. Влияние жирности на изменение ИАА при пастеризации коровьего и козьего молока. Для коровьего молока (а):

- массовая доля жира=3,2%; массовая доля жира=3,6%. Для козьего молока (б):

- массовая доля жир=3,9%;

- массовая доля жира=4,6% (для всех значений р 0,05) Составляющая молока белковая фракция при термообработке подвергается значительным изменениям, что оказывает существенное влияние на изменение его антиоксидантных свойств, как проявление защитного эффекта неспецифических компонентов антиоксидантной системы молока. На рис. представлены данные по разделению ПП нативного и термообработанного при режиме пастеризации 76 0С, 5 мин коровьего и козьего молока. Пастеризация коровьего и козьего молока приводила к изменениям спектров ПП, особенно минорных.

Рис. 7. Влияние промышленных режимов пастеризации на полипептидный состав молока (нагрузка: для коровьего 690 мкг белка на гель, для козьего 450 мкг):

а) коровье молоко (контроль); б) козье молоко (контроль);

в) коровье молоко, 76 С, 5 мин.;

1 - антиген гликопротеин; 2 – лактоферрин; 3 – ингибитор регулятора клеточных циклов «PIN 1»; 4 - белок 4, взаимодействующий с «ADFрибозилирующим» фактором 6; 5,6,7 – белки жировых шариков молока, фактор 8; 8,9 – альбумины; 10 - гомолог предшественника митохондриального белка «МТО 1»; 11 – гормон роста.

Для коровьего и козьего молока наблюдали значительное снижение и исчезновение как мажорных, так и минорных «высокомолекулярных» ПП (выше 70 кДа). В то же время появлялось много ПП с молекулярной массой 45-80 кДа и повышалось содержание «низкомолекулярных» мажорных ПП молекулярной массой 12-36 кДа во всем диапазоне рI. Режим пастеризации 76 0С, 5 мин вызвал наименьшее изменение спектров ПП в сравнении со всеми другими режимами пастеризации (65 0С, 30 мин; 90 0С, 20 с; 95 0С, 5 мин (данные представлены в диссертации)). При этом сохраняется большее число «высокомолекулярных» ПП.

Следует заметить, что режим 90 0С, 20 с также приближался к оптимальному режиму пастеризации 76 0С, 5 мин. Выявленные нами значительные изменения спектров ПП, особенно минорных, при пастеризации коровьего и козьего молока, очевидно, вызваны разложением более высокомолекулярных ПП, высвобождением оболочечных белков жировых шариков, а также образованием гликозилированных форм ПП по разным аминокислотным остаткам и другими посттрансляционными модификациями [Горбатова, 1993; Leonil et al., 1997;

Marvin et al., 2002].

Количественная оценка разрушенных полипептидов нативного и пастеризованного при различных режимах молока, по данным 2DE (табл. 1), показала, что при всех режимах пастеризации коровьего и козьего молока степень деструкции нативных ПП изменялась от 15 до 27% и от 20 до 35% соответственно. Большая степень деструкции козьего молока связана по данным литературы с его меньшей термоустойчивостью [Меркушева и др., 2005]. Однако эти цифры лишь приближенно оценивают изменение ПП спектра молока вследствие ограничений метода 2DE.

Таблица 1. Влияние режимов обработки на деструкцию полипептидов молока Появление новых более мелких пептидов при тепловой обработке молока может служить подтверждением установленного нами повышения его антиоксидантной активности при всех изученных режимах пастеризации.

Согласно данным литературы для малых пептидов антиоксидантная активность выше, чем для пептидов и белков с большей молекулярной массой [Gomez et al, 2008]. Этому может способствовать также повышение активности ряда протеаз при тепловой обработке молока [Горбатова и др., 2003]. Кроме того, денатурация и деструктурирование белков может приводить к дополнительному вкладу в увеличение величины ИАА коровьего и козьего молока за счет увеличения числа и повышения доступности как сульфгидрильных групп [Горбатова и др., 2003;

Высокогорский и др., 2008], так и других боковых групп аминокислот, которые могут играть роль ловушек для активных форм кислорода (АФК). Сведения об АФК-протекторном действии аминокислот известны с 1983 г. [Moak et al., 1983].

Выявлено, что максимальной способностью связывать супероксид-анион радикал обладает лизин, затем глутамат, цистеин и гистидин [Чистяков и др., 2005].

Пролин связывает гидроксильные радикалы [Smirnoff et al., 1989] и синглетный кислород [Alia et al., 2001].

Для идентификации методом «MALDI-TOF-MS» были выбраны 11 ПП из числа исчезнувших, сильно изменяющихся по содержанию или появившихся при пастеризации; результаты представлены в табл. 2.

Для идентификации ПП по масс-спектрометрическим пептидным картам использовали поисковую программу «Mascot» (www.matrixscience.com). Поиск проводился в базе данных (http://ncbi.nlm.nih.gov/), поддерживаемой NCBI, с ограничением по таксону (млекопитающие). Аминокислотные последовательности идентифицированных ПП молока приведены в работе.

Таблица 2. Полипептиды, идентифицированные из коровьего и козьего молока Из идентифицированных ПП коровьего молока полифункциональный белок из семейства трансферринов (лактоферрин), обладающий сильными антиоксидантными свойствами, исчезает при всех исследованных режимах пастеризации, за исключением 76 0С, 5 мин. Однако и при этом режиме его содержание значительно уменьшается. Известно, что при его дезамидировании и автофрагментации с образованием пептидных составляющих происходит нарастание антирадикальных свойств, которые могут самостоятельно проявлять антиокислительные свойства [Белизи и др., 2001], что может обусловливать увеличение ИАА молока при пастеризации. Ингибитор регулятора клеточных циклов «PIN1» появляется в молоке после его пастеризации, за исключением режима 65 0С, 30 мин, вероятно в результате разрушения жировых шариков молока и выходом в плазму дополнительных ПП. Он, по-видимому, обладает антирадикальными свойствами и повышает антиоксидантные свойства пастеризованного молока.

В козьем молоке при всех режимах пастеризации наблюдалось исчезновение ПП: белка 4, взаимодействующего с «ADF – рибозилирующим»

фактором 6; гомолога предшественника митохондриального белка «МТО 1» и гормона роста. Практически все режимы пастеризации приводили к увеличению содержания ПП типа альбуминов, являющихся предшественниками сывороточного альбумина, обладающего сильными антиоксидантными свойствами. Наблюдалось увеличение содержания ПП жировых шариков (в основном № 6,7) при пастеризации козьего молока (за исключением режима 95 0С, 5 мин).

Экстремальный характер полученной зависимости ИАА коровьего и козьего молока с максимумом, соответствующим режиму пастеризации 760С, 5 мин (рис.4), может быть объяснен различной степенью инактивации и деструкции термолабильных компонентов антиоксидантной системы молока и уровнем ПОЛ при пастеризации, что подтверждается результатами работы.

На рис. 8 представлены данные по изменению содержания жирорастворимых витаминов А и Е, важнейших термолабильных компонентов защитной системы молока.

Содержание, мкг/г Рис. 8. Влияние режимов пастеризации на изменение содержания витамина А (а) и Е (б) в молоке:

- коровье молоко; - козье молоко (для всех значений р 0,05) Полная деструкция витамина А (рис. 8а) наблюдалась при режиме термообработки 95 0С, 5 мин. Наиболее мягким режимом, обеспечивающим максимально возможную сохранность данного витамина, является режим 76 0С, 5 мин. Выявлен более высокий уровень деструкции витамина А в коровьем молоке. В зависимости от режима пастеризации содержание ретинола (%) снижается на 17,9 – 77 и 1,7 - 37,1 в коровьем и козьем молоке соответственно.

Влияние промышленных режимов пастеризации на изменение содержания витамина Е было сходным с ретинолом (рис. 8б). Содержание токоферола (%) в зависимости от режима пастеризации снижалось на: 19,4 – 76,3 и 5,0 – 35,9 для коровьего и козьего молока соответственно.

Рис. 9. Влияние режимов пастеризации на изменение содержания витамина В2 в молоке:

- коровье молоко; - козье молоко (для всех значений р 0,05) Наши результаты показали (рис.9), что в отличие от жирорастворимых витаминов при всех изученных режимах пастеризации не наблюдалась полная инактивация и/или разложение рибофлавина. Максимальное снижение витамина В2 не превышало 25-26%. Следует отметить, что данные по содержанию рибофлавина в термообработанных пробах молока практически сопоставимы.

Однако, режим 90 0С, 20 с обеспечивал незначительно более высокую сохранность рибофлавина при пастеризации.

Из всех исследованных витаминов-антиоксидантов аскорбиновая кислота при пастеризации подвергается наибольшей деструкции (табл.3): при всех режимах пастеризации разрушается более 50 и 40% витамина соответственно для коровьего и козьего молока. Можно отметить практически полную деструкцию витамина С для коровьего молока при высокотемпературной обработке (температура более 90 0С). Сопоставление двух менее жестких температурных режимов 65 0С, 30 мин и 76 0С, 5 мин показывает большее влияние температурного фактора на сохранность витамина С.

Для козьего молока отмечена более высокая сохранность витамина С при ужесточении режима пастеризации. Значительно снижалось количество проб со следовым остаточным содержанием аскорбиновой кислоты при режимах пастеризации 90 0С, 20 с и 95 0С, 5 мин. Выявлены режимы пастеризации молока, обеспечивающие максимально возможную сохранность индивидуальных витаминов– антиоксидантов: 76 0С, 5 мин для витаминов А и Е; 90 0С, 20 с для витамина В2. Для витамина С установлено неоднозначное влияние условий термообработки на его остаточное содержание в зависимости от вида молока. Для коровьего молока оптимальным режимом пастеризации является 65 0С, 30 мин, для козьего 65 0С, 30 мин при концентрации аскорбиновой кислоты в натуральном молоке до 10 мг/кг и 76 0С, 5 мин и 90 0С, 20 с при более высоких начальных концентрациях.

Таблица 3. Влияние режима пастеризации молока на содержание витамина С (мг/кг) Коровье молоко Козье молоко №5 15,20±0,08**** 6,00±0,08**** 7,30±0,14**** 7,50±0,10**** 5,94±0,08**** Для всех значений р 0, * - пробы молока, взятые в зимний период; ** - пробы молока, взятые в весенний период;

*** - пробы молока, взятые в летний период; **** - пробы молока, взятые в осенний период.

пероксидного окисления липидов (табл. 4).

Таблица 4. Влияние режима пастеризации на пероксидное окисление липидов молока (содержание ТБК-реагирующих продуктов* мкмоль/л) Для всех значений р 0, *ТБК-реагирующие продукты – соединения, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой.

Для режимов пастеризации 65 0С, 30 мин, 90 0С, 20 с и 95 0С, 5 мин молока содержание ТБК-реагирующих продуктов значительно увеличивалось (практически для всех доноров более чем на 30 %) по сравнению с натуральным.

Снижение содержания ТБК-реагирующих продуктов наблюдалось при режиме пастеризации 76 0С, 5 мин коровьего и козьего молока. Это может быть объяснено как меньшим воздействием данного режима на компоненты антиоксидантной защитной системы молока, что подтверждается результатами собственных исследований, так и совокупным действием ферментативной системы на процесс пероксидации липидной фракции молока. При этом необходимо учитывать превалирующую роль липолитических ферментов в автокаталитическом окислении жиров в исходном молоке и их полную инактивацию при изученных режимах термообработки [Шидловская, 1985].

Каталазная активность коровьего и козьего молока при изученных режимах пастеризации уменьшалась в сравнении с нативным молоком (табл.5).

Таблица 5. Влияние режима пастеризации на каталазную активность, Е* Группа проб нативное Для всех значений р 0, *Е - стандартная международная единица измерения ферментативной активности (мкмоль/мин); Е=16,67 нкат Подавление активности каталаз можно объяснить как ингибирующим действием первичных и вторичных АФК: Н2О2 и О2-, так и влиянием термофактора, особенно при более жестких режимах пастеризации [Зенков, 2001;

Горбатова, 2003]. Установлен более высокий уровень ПОЛ и каталазной активности в козьем молоке по сравнению с коровьим.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о влиянии как термо-, так и временного факторов на изменение интегральной антиоксидантной активности коровьего и козьего молока и важнейших компонентов его защитной системы. Применение кулонометрического титрования электрогенерированным бромом расширяет спектр измеряемых соединений в молоке, способных проявлять антиоксидантные свойства.

ВЫВОДЫ

1. Методом кулонометрического титрования электрогенерированным бромом определена и сопоставлена интегральная антиоксидантная активность коровьего и козьего молока, изменяющаяся в диапазоне 3,15-8,66 г/л и 4,87-14,99 г/л соответственно. Установлена взаимосвязь интегральной антиоксидантной активности козьего молока и возраста животного, которая достоверно описывается полиномиальной зависимостью второго порядка (R2=0,91):

y=0,3073x2 – 4,0824x + 18,77 (р 0,05).

2. Установлено изменение интегральной антиоксидантной активности молока при всех изученных режимах пастеризации. Выявлен оптимальный режим термообработки (76 0С, 5 мин.), обеспечивающий максимально возможную сохранность ключевых биологически активных компонентов молока.

3. Выявлены оптимальные режимы пастеризации, обеспечивающие наибольшую сохранность витаминов в коровьем и козьем молоке: 76 0С, 5 мин для жирорастворимых витаминов А и Е; 90 0С, 20 с для витамина В2; 65 0С, мин для витамина С при его концентрации до 10 мг/кг.

4. Показано, что увеличение температуры и продолжительности тепловой обработки приводили к активации пероксидного окисления липидов с накоплением ТБК-реагирующих продуктов при снижении каталазной активности, более выраженными для козьего молока.

5. При изученных промышленных режимах пастеризации коровьего и козьего молока степень деструкции нативных полипептидов изменялась от 15 до 27% и от 20 до 35% соответственно. Идентифицированы наиболее термолабильные полипептиды молока методом «MALDI-TOF MS», в том числе: гормон роста;

ингибитор регулятора клеточных циклов «PIN1»; 3 белка эпидермального фактора роста 8; гомолог белка «MTO1»; белок 4, взаимодействующий с «ADF– рибозилирующим» фактором; лактоферрин; предшественник сывороточного альбумина и ряд других.

Рекомендовать к использованию на производстве следующие режимы пастеризации: 1) температура пастеризации 76 0С, продолжительность 5 мин – режим, обеспечивающий максимально возможную сохранность белковой фракции молока, жирорастворимых витаминов токоферола и ретинола, каталазной активности; 2) температура пастеризации 90 0С, продолжительность 20 с – режим, обеспечивающий максимально возможную сохранность рибофлавина; 3) температура пастеризации 65 0С, продолжительность 30 мин – режим, обеспечивающий максимально возможную сохранность аскорбиновой кислоты в коровьем молоке.

Теоретические и практические аспекты диссертации целесообразно использовать в учебной работе при чтении лекций, проведении лабораторнопрактических занятий и научных исследований профильных учреждений высшего профессионального образования, а также при написании монографий, справочников и учебных пособий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1.* Балакирева, Ю.В**. Изучение антиоксидантной емкости коровьего и козьего молока / Балакирева Ю.В., Лапин А.А, Ахмадуллина Ф.Ю. // Вестник Казанского технологического университета. - 2009. - №1. - С. 56-59.

2.* Балакирева, Ю.В**. Влияние промышленных режимов пастеризации на интегральную антиоксидантную и витаминную активности коровьего молока / Балакирева Ю.В., Ахмадуллина Ф.Ю., Лапин А.А., Лопухов Л.В. // Бутлеровские сообщения. - 2010. - Т.19. - №2. - С. 19-25.

3.* Балакирева, Ю.В**. Влияние промышленных режимов термообработки на антиоксидантную активность козьего молока / Балакирева Ю.В., Ахмадуллина Ф.Ю., Лапин А.А., Каримова Ф.Г. // Хранение и переработка сельхозсырья. С. 13-15.

4.* Балакирева, Ю.В**. Влияние термодеструкции жировых шариков молочного сырья казеинового типа на его интегральную антиоксидантную активность / Балакирева. Ю.В., Анисимова Н.И., Мухитов А.Р., Ахмадуллина Ф.Ю., Каримова Ф.Г. // Вестник Казанского технологического университета. С. 121-124.

5.* Балакирева, Ю.В**. Изменение антиоксидантной активности молока при пастеризации / Балакирева Ю.В., Ахмадуллина Ф.Ю., Лапин А.А., Каримова Ф.Г. // Молочная промышленность. - 2010. - №9. - С. 74.

6.* Балакирева, Ю.В**. Влияние режима пастеризации на полипептидный состав молока / Балакирева Ю.В., Зайцев С.Ю., Каримова Ф.Г., Акулов А.Н., Ахмадуллина Ф.Ю. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана. – 2011. – Т.207. – С. 60-66.

7. Балакирева, Ю.В**. Влияние способов первичной обработки на антиоксидантную активность молочного сырья / Балакирева Ю.В., Ахмадуллина Ф.Ю. // Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты: Сборник научных трудов. – Москва, 2007. – Вып. 16 – С.138-143.

8. Балакирева, Ю.В**. Гальваностатическая кулонометрия для оценки антиоксидантной активности молока и молочных продуктов / Балакирева Ю.В., Лапин А.А., Ахмадуллина Ф.Ю., Зеленков В.Н., Каримова Ф.Г. // Научнометодическое пособие – М.:РАЕН, 2009. - с. 9. Балакирева, Ю.В**. Изучение антиоксидантной активности козьего молока / Балакирева Ю.В. Ахмадуллина Ф.Ю. // VII Всероссийская конференция молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии». - Казань, 2007. - С.247.

10. Ибрагимова, Э.Л. Антиоксидантная активность как интегральный критерий выбора оптимальных режимов обработки молочного сырья / Ибрагимова Э.Л., Балакирева Ю.В**., Ахмадуллина Ф.Ю. // Сборник тезисов докладов IХ Международной конференции молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии и биотехнологии». - Казань, 2008. – С. 11. Фархаева, А.Р. Электрофоретические исследования полипептидного состава коровьего молока в зависимости от промышленных режимов обработки / Фархаева А.Р., Балакирева Ю.В**., Ахмадуллина Ф.Ю., Каримова Ф.Г. // Сборник тезисов докладов IХ Международной конференции молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии и биотехнологии». - Казань, 2008. – С. 232.

12. Балакирева, Ю.В**. Интегральный критерий выбора оптимальных режимов обработки молочного сырья / Балакирева Ю.В., Ахмадуллина Ф.Ю., Лапин А.А. // Материалы ХII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2008». - Волгоград, 2008. – С. 155-156.

13. Балакирева, Ю.В**. Исследование влияния промышленных режимов термообработки на полипептидный состав молочного сырья методом электрофореза / Балакирева Ю.В., Ахмадуллина Ф.Ю., Каримова Ф.Г. // Тезисы докладов 12 Международной конференции молодых ученых, студентов и аспирантов «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений – IV Кирпичниковские чтения». - Казань, 2008.

– С. 187.

14. Балакирева, Ю.В**. Изучение антиоксидантной активности молочного сырья и влияние на нее промышленных режимов обработки / Балакирева Ю.В., АхмадуллинаФ.Ю., Лапин А.А. // Рефераты докладов второго Международного форума «Аналитика и аналитики». - Воронеж, 2008. – С. 578.

15. Балакирева, Ю.В**. Антиоксидантная активность молочного сырья казеинового типа / Балакирева Ю.В., Ахмадуллина Ф.Ю., Лапин А.А. // Материалы Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии переработки сельскохозяйственного сырья в обеспечении качества жизни: наука, образование и производство». - Воронеж, 2008 г. – С. 165-166.

16. Балакирева, Ю.В**. Влияние промышленных режимов термообработки на полипептидный состав коровьего молока / Балакирева Ю.В., Ахмадуллина Ф.Ю., Каримова Ф.Г. // Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы совершенствования технологии производства и переработки продукции сельского хозяйства». - Йошкар-Ола, 2009. – С. 331-332.

17. Яруллина, Г.З. Антиоксидантная активность биологических жидкостей крупного рогатого скота / Яруллина Г.З. Балакирева Ю.В**., Ахмадуллина Ф.Ю., Лапин А.А. // Х Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии». - Казань, 2009. – С. 356.

18. Гимадеева, Д.Р. Деструкция белковых фракций молочного сырья казеинового типа при его термообработке / Гимадеева Д.Р., Балакирева Ю.В**., Ахмадуллина Ф.Ю. // Х Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии». - Казань, 2009. – С. 305.

19. Тимошина, О.А. Влияние режимов обработки коровьего и козьего молока на содержание водо- и жирорастворимых витаминов / Тимошина О.А., Хисматуллина, Г.Н., Балакирева Ю.В**., Ахмадуллина Ф.Ю. // Х Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии». - Казань, 2009. – С. 340.

20. Балакирева, Ю.В**. Исследование белков молока при различных режимах термообработки / Балакирева Ю.В., Акулов А.Н., Ахмадуллина Ф.Ю., Каримова Ф.Г. // Тезисы докладов IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». - Казань, 2009. – С. 184.

21. Хамидуллина, А.И. Влияние различных режимов пастеризации на полипептидный состав молока казеинового типа / Хамидуллина А.И., Балакирева Ю.В**., Ахмадуллина Ф.Ю., Каримова Ф.Г. // Тезисы докладов XIII Международной конференции молодых ученых, студентов и аспирантов «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений – V Кирпичниковские чтения». - Казань, 2009. – С. 366.

22. Анисимова, Н.И. Исследование трансформации белковой и липидной фракции молока при его термообработке / Анисимова Н.И., Балакирева Ю.В**., Ахмадуллина Ф.Ю., Каримова Ф.Г. // Сборник тезисов докладов XI Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии», часть 2. - Казань, 2010. – С. 23. Гайнутдинова, Г.А. Выявление закономерности влияния промышленных режимов пастеризации на содержание витамина С в молочном сырье казеинового типа / Гайнутдинова Г.А., Балакирева Ю.В**., Ахмадуллина Ф.Ю.// Сборник тезисов докладов XI Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии», часть 2. - Казань, 2010. – С. 58.

24. Хамидуллина, А.И. Двумерное фракционирование молочного сырья казеинового типа с последующей идентификацией полипептидов / Хамидуллина А.И., Балакирева Ю.В**., Ахмадуллина Ф.Ю., Каримова Ф.Г. // Сборник тезисов докладов XI Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии», часть 2. - Казань, 2010. – С. 63.

25. Зиганшин, Д.Д. Исследование влияния промышленных режимов пастеризации на каталазную активность молочного сырья казеинового типа / Зиганшин Д.Д., Балакирева Ю.В**., Ахмадуллина Ф.Ю. // Сборник тезисов докладов XI Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии», часть 2. - Казань, 2010. – С. 76.

26. Зиганшин, Д.Д. Влияние некоторых промышленных режимов обработки на антиоксидантную активность молока / Зиганшин Д.Д., Балакирева Ю.В**., АхмадуллинаФ.Ю., Лапин А.А. // Материалы Междунаровдной научнопрактической конференции «Актуальные вопросы совершенствования технологии производства и переработки продукции сельского хозяйства». - Йошкар-Ола, 2010. - С. – 312.

27. Балакирева, Ю.В**. Изменение качества молока в процессе термообработки / Балакирева Ю.В., Ахмадуллина Ф.Ю. // Материалы III Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука XXI века». - Ульяновск, 2010. – С. 288-290.

*- публикации в ведущих рецензируемых журналах и изданиях согласно перечню ВАК России.

**- изменение фамилии Балакирева на Щербакову в соответствии со свидетельством о заключении брака II – КБ № 546037 от 12.08.