На правах рукописи

Леванов Лев Николаевич

ВИРУСНЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ РЕКОМБИНАНТНЫЕ АНТИТЕЛА

ПРОТИВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

03.00.03 – «молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Кольцово – 2009

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель доктор биологических наук, доцент Тикунова Нина Викторовна

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор Евстропов Александр Николаевич доктор биологических наук Разумов Иван Алексеевич

Ведущая организация Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

Защита состоится «2» октября 2009 года в часов на заседании диссертационного совета при ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан «_» 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета Л.И. Карпенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Разработка гибридомной технологии определила бурный прогресс в использовании антител как для исследовательских, так и для практических целей. Созданы десятки тысяч высокоаффинных антител, связывающихся с белками, углеводами, нуклеиновыми кислотами, а также с низкомолекулярными антигенами. На их основе получены конъюгаты с различными функциональными соединениями – токсинами, ферментами, а также магнитными частицами, радиоактивными и рентгеноконтрастными атомами. Однако все упомянутые выше антитела и их производные широко используются, в основном для целей диагностики и биотехнологии. Их применение для терапии ограничивается тем, что с помощью гибридомной технологии удается получать, главным образом, молекулы мышиных иммуноглобулинов, которые вызывают у человека иммунный ответ, что приводит к их связыванию и удалению из организма (Gonzales, 2005;

Hwang, 2005; Presta, 2006). Создание человеческих гибридом затрудняется из-за сложности получения иммунных лимфоцитов, отсутствия подходящих миеломных клеточных линий, низкой эффективности гибридизации и нестабильности образующихся гибридных клеток. Именно это обстоятельство инициировало поиск путей снижения иммуногенности мышиных моноклональных антител (МКА) путем удаления отдельных фрагментов или замены их на аналогичные участки иммуноглобулинов человека. Для решения этой проблемы были разработаны подходы, позволяющие с помощью методов генетической инженерии избегать нежелательного иммунного ответа: создание химерных антител путем соединения вариабельных доменов антител мыши с константными доменами человеческих антител, “гуманизация” путем замены гипервариабельных районов в молекуле антитела человека на аналогичные участки из мышиного антитела, получение полноразмерных антител человека с помощью трансгенных мышей и технологии фагового дисплея.

В последние годы внимание исследователей и фармацевтических компаний привлекают химерные антитела. Технология получения химерных антител относительна проста и экономически выгодна, а терапевтический эффект достаточно высок. Именно поэтому в списке рекомбинантных антител, одобренных и разрешенных FDA для терапевтических целей, подавляющее количество антител являются химерными.

На сегодняшний день в клинике используются следующие препараты химерных антител: abciximab (ReoproR: Fab anti-GpIIb/IIIa, Centocor/Eli Lilly) – для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, Rituximab (RitxanR: IgG1 anti-CD20, Biogen-IDEC) – для лечения больных неходжкинскими лимфомами, infliximab (RemicadeR: IgG1 anti-TNFCentocor) – для лечения ревматоидных артритов и болезни Крона, Basiliximab (SimulectR: IgG1 anti-CD25, Novartis) – в трансплантологии при отторжении трансплантата, Cetuximab (ErbituxR: IgG1 anti-EGRF, ImClone) – для лечения рака прямой кишки (Gavilondo, 2000; Laffly, 2005; Gonzales, 2005; Hwang, 2005; Presta, 2006).

К настоящему времени получены химерные антитела против ряда вирусных патогенов: вируса иммунодефицита человека (Major, 1994), вируса гепатита В (Preston, 1998; Bose, 2006), С (Law, 2008) и E (Luo, 2007), вируса Varicella-Zoster (Shankar, 2005).

Показано, что химерные антитела могут осуществлять протекцию и нейтрализацию вирусных агентов (Shankar, 2005; Bose, 2006; Luo, 2007).

Одним из наиболее патогенных для человека вирусных агентов на территории Российской Федерации является вирус клещевого энцефалита (КЭ), который способен вызывать серьезные поражения нервной системы. Современная эпидемическая ситуация в некоторых регионах Сибири и Дальнего Востока в отношении КЭ характеризуется значительным ростом заболеваемости (Локтев, 2007). Эта закономерность характерна не только для этих регионов России, где регистрируется большая часть случаев заболеваний, но и для многих европейских стран. В настоящее время единственным специфическим средством лечения этого заболевания является гамма-глобулин против вируса КЭ, получаемый из крови иммунизированных людей. Высокая стоимость данного препарата, его дефицит и возможный риск при его применении делают необходимым поиск альтернативных терапевтических средств. Таким альтернативным средством могли бы стать вируснейтрализующие химерные антитела против вируса КЭ.

Целью данной работы являлось получение вируснейтрализующих химерных и одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита и исследование их свойств.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• клонировать гены, кодирующие вариабельные домены тяжелых (VH) и легких (VL) цепей МКА 13D6 и 10C2 против вируса КЭ и определить их нуклеотидные последовательности;

• сконструировать на основе полученных VH- и VL-генов рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие химерные и одноцепочечные антитела против вируса КЭ;

одноцепочечных антител;

• исследовать вируснейтрализующие свойства полученных рекомбинантных антител.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК, обеспечивающие продукцию вируснейтрализующих химерных и одноцепочечных антител против вируса КЭ в эукариотических клетках и в клетках E. coli, соответственно. Определены нуклеотидные и выведены аминокислотные последовательности этих антител. Показано, что одноцепочечное антитело sc13D6 и химерное антитело ch13D6 способны ингибировать инфекционность вируса КЭ в культуре эукариотических клеток.

Определены концентрации 50% ингибирования вирусной инфекционности для одноцепочечного и химерного антител sc13D6 и ch13D6 в реакциях ингибирования фокусообразования на монослое эукариотических клеток Vero E6 и в реакции ингибирования бляшкообразования на монослое эукариотических клеток СПЭВ.

Исследованы иммунохимические свойства одноцепочечных и химерных антител. С помощью методов иммуноферментного анализа определены константы аффинности полученных рекомбинантных одноцепочечных и химерных антител.

В ходе данной работы впервые были получены химерные антитела против вируса КЭ, обладающие вируснейтрализующими свойствами. Полученные антитела после проверки их терапевтических свойств могли бы стать основой для разработки препарата для лечения клещевого энцефалита.

Получен стабильный штамм-продуцент растворимых вируснейтрализующих одноцепочечных антител против вируса КЭ, который задепонирован в коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ “Вектор” Роспотребнадзора.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано статьи, получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства. Материалы диссертации были представлены на 8 Международных конференциях: 7th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology “The interface between Immunology and Medicine” (Москва, Россия, 2005), 8th International EMBL PhD Student Symposium “Biology of Disease A Molecular Battlefield” (Гейдельберг, Германия, 2006), 8th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology “Immunology and viral infection” (Москва, Россия, 2007), 1st International Summer School 2008 “Pathogen-Host Interplay” (БерлинПотсдам, Германия, 2008), International Life Sciences Students’ Conference (Варшава, Польша, 2008), FEBS Practical Course “Structural variations in genome, gene expression, single cell analysis: arrays, beads, high-throughput sequencing” (Прага, Чехия, 2008), the 13th CIMO Winter School “Biomolecules in health and disease” (Хельсинки, Финляндия, 2009), 34th FEBS Congress “Life’s Molecular Interactions” (Прага, Чехия, 2009); и одной Российской конференции - III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, включая 38 рисунков и 3 таблицы, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (141 наименований).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В процессе конструирования рекомбинантных антител всегда встает вопрос о сохранении их биологических свойств и о том, какой аффинностью они будут обладать.

Последний показатель особенно важен для антител, предназначенных для медицинского применения. Как было неоднократно показано, антитела с высокой константой аффинности более эффективны в терапии, поскольку они успешнее конкурируют за целевой антиген (Xie, 2005). Кроме того, от аффинности в значительной степени зависит терапевтическая доза препарата и отчасти его фармакокинетические свойства.

Для того чтобы оценить, какой будет аффинность у целевых полноразмерных рекомбинантных антител, обладающих двумя центрами связывания с антигеном, возможно измерение аффинности их моновалентных аналогов с поправкой на бивалентную природу молекулы иммуноглобулина (Ройт, 2000). Такими аналогами могут быть одноцепочечные антитела. Поскольку такие антитела представляют собой антигенсвязывающий домен исходного иммуноглобулина, они, как правило, сохраняют специфичность и обладают сходным сродством к антигену (Bird, 1988). Перед тем как конструировать химерные антитела, мы решили получить одноцепочечные антитела на основе тех же вариабельных доменов и детально исследовать проблему сохранения сродства рекомбинантных антител к целевому антигену. Кроме того, одноцепочечные антитела интересны как инструмент для изучения возможных механизмов нейтрализации вирусной инфекционности исходными МКА.

Для конструирования рекомбинантных антител к вирусу КЭ в качестве прототипа были использованы МКА 13D6 и 10С2, продуцируемые мышиными гибридомами (Цехановская, 1993). Эти гибридомы были получены в результате слияния миеломной клеточной линии Sp2/0-Ag14 cо спленоцитами мыши, иммунизированной очищенным белком Е вируса КЭ, штамм Софьин (Цехановская, 1993). Выбор этих гибридом был обусловлен тем, что МКА 13D6 и 10С2 способны блокировать гемагглютинирующую активность вируса КЭ и по предварительным данным защищать модельных животных от вирусной инфекции в реакции биологической нейтрализации. Кроме того, МКА 13D способно ингибировать инфекционную активность штаммов Софьин и 205 вируса КЭ в культуре эукариотических клеток (Цехановская, 1993).

Получение генов, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей моноклональных антител 13D6 и 10C На первом этапе работы амплифицировали гены, кодирующие вариабельные домены тяжелых (VH) и легких (VL) цепей мышиных МКА против вируса КЭ. Для этого из клеток гибридом 13D6 и 10С2, любезно предоставленных Матвеевым Л.Э. (ИХБиФМ СО РАН, Новосибирск) была выделена суммарная РНК. Синтез кДНК и амплификацию генов, кодирующих вариабельные домены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов мыши, проводили методом ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров. Дизайн праймеров для амплификации VH- (Vhdir и Vhrev) и VL-генов (Vldir и Vlrev) проводили на основе литературных данных по оптимизации олигонуклеотидов для амплификации последовательностей, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов мыши (Wang, 2000). Концевые сайты рестрикции в этих праймерах были модифицированы нами для дальнейшей встройки целевых фрагментов в экспрессионные плазмидные вектора. Так в праймеры Vhdir и Vhrev были введены сайты для XhoI и BstEII эндонуклеаз рестрикции, соответственно, а в праймеры Vldir и Vlrev были введены сайты для SacI и BglII эндонуклеаз рестрикции, соответственно.

Синтезированные праймеры добавляли в реакционные смеси, состоящие из компонентов коммерческого набора “Titan one tube RT-PCR”. Для амплификации VH-генов МКА в реакционную смесь добавляли праймеры Vhdir и Vhrev, а для синтеза VL-генов - Vldir и Vlrev. Результаты ОТ-ПЦР представлены на рис. 1.

На следующем этапе проводили определение нуклеотидных последовательностей амплифицированных VH- и VL-фрагментов МКА 13D6 и 10С2. Сравнительный анализ последовательностей, полученных нами фрагментов VH и VL доменов, с имеющимися в базе данных GenBank позволил определить семейства V-генов, к которым они принадлежат. В результате было показано, что VH-сегменты МКА 13D6 и 10С принадлежат к семействам VHJ558.45 и VHJ558.47 тяжелых цепей антител мыши, входящим в состав III группы, а VL-сегменты принадлежат к III группе -цепей.

Конструирование рекомбинантных плазмид, кодирующих одноцепочечные антитела против вируса клещевого энцефалита Амплифицированные VH- и VL-гены МКА 13D6 далее объединяли между собой в единую молекулу с помощью олигонуклеотида, кодирующего линкерный пептид (Gly4Ser)3.

Для этого были синтезированы две пары олигонуклеотидов, после отжига которых получали фрагмент ДНК с концевыми сайтами рестрикции BstEII и SacI (рис. 2).

Рис. 2. Структура олигонуклеотидного коннектора, кодирующего линкерный пептид (Gly4Ser) Полученный в результате отжига олигонуклеотидов BstEII/SacI-фрагмент сшивали при помощи ДНК-лигазы фага Т4 с 3’-концом VH-гена, обработанного эндонуклеазами рестрикции XhoI и BstEII, и с 5’-концом VL-гена, обработанного эндонуклеазами рестрикции SacI и BglII. Таким образом был получен ген одноцепочечного антитела sc13D6.

Далее ген одноцепочечного антитела встраивали в плазмиду pGEM1 под транскрипционный контроль позднего промотора бактериофага Т7. В эту же плазмиду в 5/-конец гена, кодирующего одноцепочечное антитело 13D6, был встроен фрагмент ДНК, кодирующий лидерный пептид пектатлиазы В (pelB) Erwinia carotovora, полученный на основе плазмиды pET (rF11) (Беспалов, 1995) с использованием ПЦР. Известно, что лидерные пептиды эффективно секретируемых прокариотических белков, таких как pelB, направляя секрецию в периплазматическое пространство, способствуют правильной упаковке молекул одноцепочечных антител. Считается, что секреция белка в периплазму бактерий имитирует его транспорт через эндоплазматический ретикулум в эукариотических клетках. В результате была получена рекомбинантная плазмида pSC13D6. Аналогичным образом была сконструирована плазмида pSC10C2 (рис. 3).

Правильность встраивания ДНК-фрагментов подтверждали секвенированием.

Экспрессия генов одноцепочечных антител в клетках E. coli Для экспрессии генов одноцепочечных антител сконструированными плазмидами pSC13D6 и pSC10C2 трансформировали клетки E. coli BL21(DE3). Клетки E. coli среднелогарифмической стадии роста и культивировали в течение ночи.

Электрофоретический анализ лизатов клеток E. coli BL21(DE3)/pSC13D6 и E. coli BL21(DE3)/pSC10C2 показал в обоих случаях наличие в индуцированных культурах дополнительного белка с молекулярной массой около 26 кДа, что соответствует расчетной молекулярной массе одноцепочечных антител (рис. 4, дорожки 2, 3). В контрольном лизате индуцированных клеток, содержащих плазмиду без встройки, этот белок отсутствовал (рис. 4, дорожка 1). Уровень продукции sc13D6 и sc10C2 составлял около мг на литр культуральной жидкости. Исследование внутриклеточной локализации sc13D и sc10С2 показало, что в обоих случаях одноцепочечные антитела секретировались в периплазматическое пространство (рис. 4, дорожки 5, 6).

Для подтверждения специфичности одноцепочечных антител, продуцируемых клетками E. coli, была протестирована способность лизатов этих клеток связывать вирус КЭ штамм 205, сорбированный на поверхность иммунологического пластика. В качестве контроля использовали лизаты клеток E. coli BL21(DE3)/pGEM1. Результаты ИФА показали, что значение оптической плотности при связывании с вирусом КЭ образцов, содержащих рекомбинантные одноцепочечные антитела, достоверно превышает таковое в контроле, что доказывает способность sc13D6 и sc10C2 эффективно связываться с вирусом КЭ (рис. 5).

Рис. 4. Электрофореграмма в 12% ДСН-ПААГ лизатов клеток, периплазматических и цитоплазматических фракций, а также очищенных одноцепочечных антител. Дорожки:

лизаты клеток E. coli BL21(DE3)/pGEM1 (1), E. coli BL21(DE3)/pSC13D6 (2), E. coli BL21(DE3)/pSC10С2 (3); периплазматические фракции клеток E. coli BL21(DE3)/pGEM (4), E. coli BL21(DE3)/pSC13D6 (5), E. coli BL21(DE3)/pSC10С2 (6); цитоплазматические фракции клеток E. coli BL21(DE3)/pGEM1 (7), E. coli BL21(DE3)/pSC13D6 (8), E. coli BL21(DE3)/pSC10С2 (9); очищенные sc13D6 (10) и sc10C2 (11); М – стандарты молекулярных масс.

Очистка одноцепочечных антител Одноцепочечные антитела выделяли из смеси периплазматических белков гельфильтрацией на сорбенте сефакрил S-300. На рис. 6 и рис. 7 представлены хроматографический профиль, а также электрофореграмма анализа фракций. Пробы, содержащие мини-антитело, объединяли, белок концентрировали и использовали в дальнейших исследованиях. Результаты очистки одноцепочечных антител представлены на рис. 4 (дорожки 10, 11).

Анализ геля с помощью программы “Gel-Pro” показал, что уровень очистки целевых белков составил приблизительно 70%. Концентрация белка в полученных образцах, измеренная с помощью метода Лоури-Фолина (Досон, 1991), составила (2.8 ± 0.1) мг/мл и (2.6 ± 0.1) мг/мл для антител sc13D6 и sc10C2, соответственно.

Рис. 6. Профиль гель-фильтрации. VR – объем удержания. Одноцепочечное антитело выходит между 90 и 100 мл элюента.

Рис. 7. Электрофореграмма в 14% ДСН-ПААГ, иллюстрирующая состав различных фракций. Дорожки: 4-5 – фракции, содержащие белок E. coli с молекулярной массой около 36 кДа, 11-12 – фракции, содержащие одноцепочечное антитело. М – стандарт молекулярных масс.

Специфичность очищенных sc13D6 и sc10С2 подтверждали с помощью вестернблот анализа. Было показано, что оба одноцепочечных антитела (в концентрации 20 нг) выявляли рекомбинантный белок Е вируса КЭ. В качестве положительного контроля использовали исходные МКА 13D6 и 10С2. В качестве отрицательного контроля использовали нормальную неиммунную мышиную сыворотку (рис. 8).

Конструирование химерных антител против вируса клещевого энцефалита Химерные антитела (ch) против вируса КЭ конструировали на основе полученных VH- и VL-генов МКА 13D6 и МКА 10С2. Кроме того, исходным генетическим материалом для создания целевых антител послужили следующие плазмиды:

а) pBVK14a2 и pBVK1-6, кодирующие лидерные последовательности соответственно тяжелой и легкой цепей мышиного МКА F10 (Radko, 2002);

б) pCIgG1, кодирующая константные домены CH1-CH2-CH3 тяжелой цепи IgG человека (Aliev, 2002);

в) pCkap, кодирующая каппа-домен легкой цепи IgG человека (Шингарова, 2007).

Плазмиды, кодирующие лидерные последовательности и константные домены, были любезно предоставлены к.х.н. Шингаровой Л.Н., с.н.с. лаборатории инженерии белка ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова (г. Москва).

Из имеющихся конструкций для каждого одноцепочечного антитела проводилась сборка двух рекомбинантных плазмидных ДНК, одна из которых кодирует полипептид со свойствами тяжелой цепи, другая - со свойствами легкой цепи химерного антитела.

Совместная ко-трансфекция этими плазмидами клеток человека линии HEK293Т обеспечивает синтез полипептида со свойствами химерного антитела класса IgG1.

Конструирование плазмидной ДНК, кодирующей тяжелую цепь химерного антитела, проходило в несколько этапов:

На первом этапе с помощью ПЦР была получена лидерная последовательность иммуноглобулина мыши для объединения с VH-фрагментом 13D6. В качестве матрицы для амплификации лидерной последовательности тяжелой цепи была использована плазмида pBVK14a2. VH-фрагмент 13D6 был также получен с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиды pSC13D6. Продукты амплификации после элюции из ПЦР смеси использовали в качестве матриц на второй стадии ПЦР в присутствии соответствующих праймеров. Полученный объединенный фрагмент ДНК размером около 465 п.н., содержал последовательности генов, кодирующие лидерную последовательность и вариабельный домен тяжелой цепи sc13D6. После элюции из ПЦРсмеси фрагмент обрабатывали рестриктазами NheI и ApaI и повторно элюировали из агарозного геля для последующего лигирования.

На втором этапе был получен фрагмент ДНК размером около 800 п.н, кодирующий константные домены CH1-CH2-CH3 тяжелой цепи IgG1 человека. Этот фрагмент получали путем обработки плазмидной ДНК pCIgG1, содержащей данный ген, эндонуклеазами рестрикции ApaI и XhoI.

экспрессионную плазмиду pcDNA3.1(+), предварительно обработанную рестриктазами NheI и XhoI. Скрининг клонов, после трансформации клеток E. coli XL1Blue лигазной смесью, проводили ПЦР-анализом. В результате была получена рекомбинантная плазмида pD6H, кодирующая тяжелую цепь ch13D6 против вируса КЭ (рис. 9 а). Аналогичным образом была получена плазмида pC2H, кодирующая тяжелую цепь ch10С2 против вируса КЭ. Правильность встраивания ДНК-фрагментов подтверждали секвенированием.

Конструирование плазмидной ДНК, кодирующей легкую цепь химерного антитела:

На первом этапе с помощью ПЦР была получена лидерная последовательность иммуноглобулина мыши для объединения с VL-фрагментом 13D6. В качестве матрицы для амплификации лидерной последовательности легкой цепи была использована плазмида pBVK1-6. VL-фрагмент 13D6 был также получен с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиды pSC13D6. Продукты амплификации после элюции из ПЦР смеси использовали в качестве матриц на второй стадии ПЦР в присутствии соответствующих праймеров. Полученный объединенный фрагмент ДНК размером около 390 п.н., содержал последовательности генов, кодирующих лидерную последовательность и вариабельный домен легкой цепи sc13D6. После элюции из ПЦР смеси фрагмент обрабатывали рестриктазами NheI и XmaJI и повторно элюировали из агарозного геля для последующего лигирования.

На втором этапе был получен фрагмент ДНК размером около 400 п.н, кодирующий каппа-домен иммуноглобулина человека. Этот фрагмент получали путем обработки плазмидной ДНК pCkap, содержащей данный ген, эндонуклеазами рестрикции XmaJI и XhoI.

экспрессионную плазмиду pcDNA3.1(+), предварительно обработанную рестриктазами NheI и XhoI. Скрининг клонов, после трансформации клеток E. coli XL1Blue лигазной смесью, проводили ПЦР-анализом. В результате была получена рекомбинантная плазмида pD6L, кодирующая легкую цепь ch13D6 против вируса КЭ (рис. 9 б). Аналогичным образом была получена плазмида pC2L, кодирующая легкую цепь ch10С2 против вируса КЭ. Правильность встраивания ДНК-фрагментов подтверждали секвенированием.

RBS RBS

SV40 pA Рис. 9. Схема строения рекомбинантных плазмид, кодирующих тяжелые (а) и легкие (б) цепи химерных антител 13D6 и 10C2. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. Pcmv – цитомегаловирусный промотор; RBS – сайт связывания рибосомы; Ampicillin – ген устойчивости к ампициллину; Neomycin – ген устойчивости к неомицину.

Экспрессия генов химерных антител в клетках HEK 293T Для экспрессии генов химерных антител против вируса КЭ использовали клетки линии HEK293Т (клетки почек человека). Известно, что эта линия клеток трансформирована вирусом SV40 с дефектной областью начала репликации и обладает способностью экспрессировать вирусный Т-антиген. Поэтому при трансфекции клеток экспрессионной плазмидой, содержащей область начала репликации вируса SV40, последняя эффективно взаимодействует с эндогенным T-антигеном, что сопровождается внехромосомной репликацией плазмиды с образованием большого числа ее копий в цитоплазме клеток. Подбор времени культивирования трансфецированных клеток в нашем случае проводили с использованием плазмидных конструкций, кодирующих ch10C2. Для этого клетки линии HEK293Т трансфецировали сконструированной парой плазмид pC2H и pC2L, с использованием реагента “Липофектамин 2000”. Аликвоты культуральной жидкости, отобранные после 5, 48, 72 и 96 часов инкубации до нанесения на аффинную колонку анализировали в твердофазном ИФА по связыванию с рекомбинантным белком Е вируса КЭ для анализа эффективности трансфекции и характера экспрессии антител в процессе культивирования трансфецированных клеток.

Анализ результатов твердофазного ИФА показал, что при использовании реагента для трансфекции “Липофектамин 2000” специфическая активность рекомбинантного продукта выявлялась через 48 часов культивирования и сохранялась практически на одном уровне с незначительным понижением к 96 часам культивирования. Фракции, продемонстрировавшие специфическую активность, объединяли и из суммарной культуральной жидкости выделяли химерное антитело.

Выделение химерного антитела ch10C2 из культуральной жидкости проводили методом аффинной хроматографии на колонке с носителем Protein A Sepharose 4 Fast Flow.

В результате из 150 мл культуральной жидкости было выделено 0,5 мг ch10С2.

Фракции, содержащие химерное антитело, объединяли и диализовали против буфера ФСБР. Уровень продукции для ch10С2 составлял 3,4 мг/л. Очищенное и диализованное антитело характеризовали с помощью электрофореза в 12% ДСН-ПААГ в присутствии и отсутствии 2-меркаптоэтанола. Результаты электрофореза демонстрировали наличие бэндов, по подвижности соответствующих природным иммуноглобулинам класса G (рис. 10).

Химерное антитело ch13D6 получали аналогичным образом. Из 150 мл культуральной жидкости было выделено 0,85 мг ch13D6. Уровень продукции для ch13D составил 5,7 мг/л.

Рис. 10. Электрофореграмма в 12% ДСН-ПААГ очищенных ch13D6 и ch10C2. Дорожки:

1,2 – ch13D6 и ch10C2, обработанные 2-меркаптоэтанолом при температуре 95°С, 3,4 – ch13D6 и ch10C2, не обработанные 2-меркаптоэтанолом (температура 37°С); М – стандарты молекулярных масс.

Специфичность очищенных ch13D6 и ch10С2 подтверждали с помощью вестернблот анализа. Было показано, что оба химерных антитела (в концентрации 20 нг) выявляли рекомбинантный белок Е вируса КЭ. В качестве положительного контроля использовали исходные МКА 13D6 и 10С2. В качестве отрицательного контроля использовали нормальную неиммунную мышиную сыворотку (рис. 11).

кДа Определение констант аффинности рекомбинантных антител На следующем этапе были определены константы аффинности полученных одноцепочечных и химерных антител. Константы аффинности определяли с помощью методов ИФА. В случае с одноцепочечными антителами были определены константы для двух типов равновесия: образования комплексов антиген-антитело в растворе, а также на поверхности полистирола. В первом случае константа аффинности характеризует взаимодействие с антигеном, циркулирующем в организме. Вторая система имитирует процесс связывания антитела с антигеном, экспонированным на поверхности клеточной мембраны. Вследствие возможных конформационых изменений, а также некоторых поверхностных эффектов, константа гетерофазного равновесия может существенно отличаться от константы равновесия в растворе.

Константу равновесия в растворе определяли согласно методике, описанной ранее (Friguet, 1985), с незначительными модификациями. В частности для вычисления константы диссоциации проводили нелинейную регрессию результатов эксперимента с использованием следующей зависимости:

где OD405 – оптическая плотность раствора в лунке планшета, A0 – суммарная концентрация антитела в растворе (на стадии первоначальной инкубации), B0 – суммарная концентрация белка Е, Kd – константа равновесия диссоциации комплекса антигенантитело в растворе, N – нормировочный множитель, который определяется параметрами эксперимента и не зависит от концентрации антител. Регрессию осуществляли с использованием математического пакета Origin® 7.0. График зависимости значения оптической плотности раствора от концентрации антитела приведен на рис. 12 а. Константы аффинности для sc13D6 и sc10С2 составили (3,0 ± 0,2) 107 М-1 и (1,2 ± 0,3) 107 М-1, соответственно.

В случае связывания антитела с антигеном, сорбированным на поверхности, константу равновесия определяли согласно методике (Beatty, 1987). Для регрессии экспериментальных данных использовали следующую зависимость оптической плотности раствора от концентрации антител:

где OD405 – оптическая плотность раствора в лунке планшета, A0 – суммарная концентрация антитела в растворе, b0 – общее количество белка Е, сорбированного на поверхности, K*d – константа равновесия диссоциации комплекса антиген-антитело на поверхности, V – объем раствора в лунке, N – нормировочный множитель. Регрессию осуществляли с использованием математического пакета Origin® 7.0. График зависимости значения оптической плотности раствора от концентрации антитела приведен на рис. 12 б.

Константы аффинности для sc13D6 и sc10C2 составили (2,8 ± 0,3) 107 М-1 и (8,1 ± 0,3) 106 М-1, соответственно.

Полученные значения констант свидетельствовали о том, что аффинность sc13D6 и sc10C2 остается приблизительно такой же вне зависимости от того, находится антиген на поверхности или в растворе. Видимо, конформация рекомбинантного белка Е в этих экспериментах не претерпевала существенных изменений.

Одновременно с определением констант аффинности одноцепочечных антител были определены константы гетерофазного равновесия химерных антител и исходных МКА. Константы равновесия для химерных и моноклональных антител определяли согласно методике (Beatty, 1987). Графики зависимости значения оптической плотности раствора от концентрации антитела приведены на рис. 13. Константы аффинности для ch13D6 и ch10C2 составили (7,3 ± 0,2) 107 М-1 и (2,8 ± 0,2) 107 М-1, а для МКА 13D6 и МКА 10С2 - (3,8 ± 0,2) 107 М-1 и (1,4 ± 0,2) 107 М-1, соответственно.

Рис. 12. Иммуноферментный анализ взаимодействия очищенных sc13D6 и sc10C2 с рекомбинантным белком Е вируса КЭ в растворе (а) и на поверхности (б); проявление антивидовым конъюгатом щелочной фосфатазы в разведении 1/1000.

Рис. 13. Иммуноферментный анализ взаимодействия очищенных ch13D6 и ch10C2 (а), а также МКА 13D6 и МКА10С2 (б) с рекомбинантным белком Е вируса КЭ на поверхности;

проявление антивидовым конъюгатом щелочной фосфатазы в разведении 1/1000.

Полученные значения констант связывания (табл. 1) одноцепочечных, химерных, а также исходных моноклональных антител свидетельствуют о незначительной разнице в моноклональными антителами. Следует сказать, что обычно разница в аффинности между одноцепочечными антителами и полноразмерными антителами составляет 1-2 порядка.

Так, в работе Gould с соавторами (2005) было показано, что одноцепочечные антитела scFv и scFv 95 против вируса Западного Нила обладали константами аффинности 1,8 108 М-1 и 3,2 108 М-1, соответственно, а сконструированные на их основе полноразмерные антитела формата scFv-Fc имели константы связывания 7,3 1010 М-1 и 2,9 1010 М-1, соответственно.

Таблица 1. Константы аффинности МКА и рекомбинантных антител, измеренные с помощью методов ИФА.

Подобное отличие в аффинности отметили также Goncalvez с соавторами (2008). В этой работе константы связывания моновалентных Fab-фрагментов против вируса японского энцефалита на 2 порядка отличались от констант связывания гуманизированных антител, созданных на их основе. Однако следует сказать и о том, что имеются работы, в которых разницы между константами связывания моновалентных и полноразмерных антител практически не наблюдалось. Так, в работе Николенко с соавторами (1999) было показано, что рекомбинантное одноцепочечное антитело scFv E6B и исходное МКА E6B против вируса КЭ имели константы связывания 1,1 108 М-1 и 5,5 108 М-1, соответственно, а в работе Itoh с соавторами (2001) рекомбинантный моновалентный Fabфрагмент против онкомаркера CD98 обладал аффинностью, схожей с аффинностью исходного моноклонального антитела. Авторы последней работы объясняют подобную схожесть тем, что исходное МКА взаимодействовало с CD98 одним сайтом связывания.

Видимо, в нашем случае незначительная разница в константах между одноцепочечными и полноразмерными антителами связана с тем, что полноразмерные антитела используют для связывания гликопротеина Е вируса КЭ один антигенсвязывающий сайт.

Как предполагают некоторые исследователи валентность антитела зависит, в первую очередь, от природы молекулы иммуноглобулина. Показано, что способность антитела связываться с антигеном двумя центрами связывания зависит от гибкости его шарнирного участка, который, прежде всего, определяется изотипом антитела. Кроме того, немаловажное значение при связывании имеет расстояние между эпитопами на поверхности молекулы антигена (Reading, 2007).

Измеренные значения констант аффинности свидетельствуют также о том, что константы связывания исходных МКА и химерных антител различаются примерно в два раза. Следует сказать, что обычно химерные антитела, содержащие константные домены того же изотипа, что и исходные МКА, демонстрируют аффинность схожую с аффинностью исходных моноклональных антител (Morelock, 1994). Однако в нашем случае константы связывания химерных антител были выше констант связывания исходных МКА. Подобные результаты были получены в работе Knight с соавторами (1993), где было показано, что константа аффинности сконструированного химерного антитела A2 против TNF- в 1,5 раза превышала константу связывания исходного МКА того же изотипа. Авторы работы полагали, что некоторое увеличение аффинности в данном случае могло произойти вследствие изменения конформации антигенсвязывающих сайтов в молекуле химерного антитела. Причиной этого изменения, по мнению авторов статьи, может быть замена мышиных константных доменов человеческими. По всей видимости, в нашем случае замена мышиных константных доменов на человеческие аналогичным образом повлияла на антигенсвязывающие свойства химерных антител путем некоторой стабилизации структуры антигенсвязывающих сайтов. При этом и мышиные, и человеческие константные домены принадлежали к IgG1 подклассу антител.

Исследование вируснейтрализующих свойств рекомбинантных антител На заключительном этапе работы, полученные химерные, одноцепочечные, а также исходные моноклональные антитела против вируса КЭ были протестированы в реакции ингибирования фокусообразования на монослое эукариотических клеток Vero E6 (рис. 14), а также в реакции ингибирования бляшкообразования на монослое эукариотических клеток СПЭВ (рис. 15). Результаты этих экспериментов показали, что рекомбинантные антитела sc13D6 и ch13D6, сконструированные на основе МКА13D6, как и прототипное антитело, способны ингибировать и образование фокусов, и образование бляшек вирусом КЭ на монослое эукариотических клеток. Антитела sc10С2, ch10С2 и МКА 10С2 не обладали способностью ингибировать инфекционность вируса КЭ на монослое эукариотических клеток. Для вируснейтрализующих антител были определены концентрации 50% ингибирования вирусной инфекционности (IC50) (табл. 2).

Рис. 14. Нейтрализация вируса КЭ одноцепочечным антителом sc13D6 (а), химерным антителом ch13D6 (б) и моноклональным антителом МКА 13D6 (в) в реакции ингибирования фокусообразования на монослое перевиваемых клеток Vero E6.

Рис. 15. Нейтрализация вируса КЭ одноцепочечным антителом sc13D6 (а), химерным антителом ch13D6 (б) и моноклональным антителом МКА 13D6 (в) в реакции ингибирования бляшкообразования на монослое перевиваемых клеток СПЭВ.

Таблица 2. Концентрации 50% ингибирования вирусной инфекционности МКА 13D6 и его рекомбинантных аналогов.

Рассчитанные значения IC50, позволили нам сравнить их с уже известными значениями для рекомбинантных и моноклональных антител. Показано, например, что значение IC50 для высоконейтрализующего антитела scFv-Fc-9E2 против вируса Западного Нила равняется 0,0825 мкг/мл (Pereboev, 2008), а значение IC50 для МКА 2H2 против вируса Японского энцефалита составляет 0,195 мкг/мл (Wu, 2004). Что касается моновалентных аналогов этих антител, то их значения концентраций 50% ингибирования вирусной инфекционности уступали 1-2 порядка. Рассчитанные нами значения IC50 для исследуемых антител свидетельствуют о незначительной разнице в биологической активности между полноразмерными и одноцепочечными антителами. В нашем случае значения IC50 полноразмерных антител всего лишь в 3-4 раза отличались от значения IC для одноцепочечного антитела. Столь несущественная разница связана с тем, что ch13D и МКА 13D6 вероятно являются моновалентными антителами.

Следует также отметить, что химерное антитело ch13D6 продемонстрировало более высокую нейтрализующую активность на монослое эукариотических клеток Vero E6 и СПЭВ по сравнению с исходным МКА. Подобные результаты описаны для химерного антитела А2, нейтрализовавшего TNF- в культуре эукариотических клеток при более низком значении IC50 по сравнению с исходным моноклональным антителом (Knight, 1993). По всей видимости, в обоих этих случаях изменение биологической активности химерных антител связано с теми конформационными изменениями в антигенсвязывающих сайтах, которые могли произойти при замене мышиных константных доменов человеческими.

Таким образом, в ходе проделанной работы были получены одноцепочечные антитела в растворимой форме против вируса КЭ. Определены аминокислотные последовательности полученных антител. Исследовано связывание одноцепочечных антител с вирусом КЭ и рекомбинантным белком Е вируса КЭ в ИФА и вестерн-блот анализе, соответственно. Определены константы аффинности одноцепочечных антител для равновесия в растворе и на поверхности. Показано, что sc13D6 способно ингибировать инфекционность вируса КЭ на монослое эукариотических клеток Vero E6 и СПЭВ. Определена концентрация 50% ингибирования вирусной инфекционности для sc13D6. На основе охарактеризованных одноцепочечных антител были сконструированы химерные антитела, способные взаимодействовать с рекомбинантным белком Е вируса КЭ в ИФА и вестерн-блот анализе. Определены константы аффинности полученных химерных антител. Показано, что химерное антитело ch13D6 способно ингибировать инфекционность вируса КЭ на монослое эукариотических клеток Vero E6 и СПЭВ.

Определена концентрация 50% ингибирования вирусной инфекционности для ch13D6. На основе полученных результатов о нейтрализующих способностях одноцепочечных, химерных и моноклональных антител были предложены возможные механизмы нейтрализации вирусной инфекционности этими антителами.

ВЫВОДЫ

1. Определены нуклеотидные и выведены аминокислотные последовательности VH- и VL-доменов мышиных МКА 13D6 и 10С2, направленных к гликопротеину Е вируса КЭ, и показано, что Vh-сегменты МКА 13D6 и 10С2 принадлежат к семействам VHJ558.45 и VHJ558.47 тяжелых цепей антител мыши, входящим в состав III группы, а Vl-сегменты принадлежат к III группе -цепей.

2. На основе VH- и VL-генов МКА 13D6 и 10С2 сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие одноцепочечные антитела sc13D6 и sc10C2 против вируса КЭ. Получены штаммы-продуценты этих одноцепочечных антител. Показано, что константы аффинности одноцепочечных антител sc13D6 и sc10C2 составили 3,0 107 М- и 1,2 107 М-1 для равновесия в растворе, а в случае образования комплексов антигенантитело на поверхности – 2,8 107 М-1 и 8,1 106 М-1, соответственно.

3. На основе VH- и VL-генов МКА 13D6 и 10С2 сконструированы пары рекомбинантных плазмидных ДНК pD6H и pD6L, а также pC2H и pC2L, обеспечивающих при совместном введении в клетки HEK293T синтез химерных антител ch13D6 и ch10C2, специфично взаимодействующих с рекомбинантным белком Е вируса КЭ. Константы аффинности ch13D6 и ch10C2 составили 7,3 107 М-1 и 2,8 107 М-1, соответственно.

4. Показано, что одноцепочечное антитело sc13D6 и химерное антитело ch13D обладают способностью нейтрализовать инфекционность вируса КЭ в культуре эукариотических клеток. Определены концентрации 50% ингибирования вирусной инфекционности для этих антител в реакциях ингибирования фокусообразования на монослое эукариотических клеток Vero E6 и в реакции ингибирования бляшкообразования на монослое эукариотических клеток СПЭВ, которые составили 16, мкг/мл и 11,2 мкг/мл для одноцепочечного антитела sc13D6 и 4,5 мкг/мл и 1,9 мкг/мл для химерного антитела ch13D6, соответственно.

Основные результаты опубликованы в следующих работах:

1. Леванов Л.Н., Матвеев Л.Э., Юн Т.Э., Лебедев Л.Р., Швалов А.Н., Байков И.К., Матвеева В.А., Рихтер В.А., Тикунова Н.В. Одноцепочечное антитело против гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита // Сибирский медицинский журнал.

– 2008. – Т.82. - №7. - С. 38-43.

2. Леванов Л.Н., Тикунова Н.В., Матвеев Л.Э., Гончарова Е.П., Юн Т.Э., Рыжиков А.Б., Матвеева В.А., Рихтер В.А. // Рекомбинантная плазмидная ДНК pSC13D6, содержащая ген одноцепочечного антитела против вируса клещевого энцефалита, и штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pSC13D6 - продуцент одноцепочечных вируснейтрализующими свойствами. Заявка на патент. Справка о приоритете № 2008115680 от 21.04.2008.

3. Леванов Л.Н., Матвеев Л.Э., Юн Т.Э., Гончарова Е.П., Лебедев Л.Р., Швалов А.Н., Рыжиков А.Б., Байков И.К., Матвеева В.А., Рихтер В.А., Тикунова Н.В.

Нейтрализующее одноцепочечное антитело против вируса клещевого энцефалита // Биоорганическая химия. - 2009. – Т.35. – С. 524-532.

4. Levanov L.N., Matveev L.E., Yun T.E., Tikunova N.V. Generation of chimeric antibodies against tick-borne encephalitis virus. The 7th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology “The interface between Immunology and Medicine”. September 5-9, 2005, Moscow, Russia, p. 27.

5. Леванов Л.Н., Юн Т.Э., Тикунова Н.В. Получение одноцепочечных антител против международным участием “Проблемы инфекционной патологии в регионах Новосибирск, Россия, с. 196.

6. Levanov L.N., Matveev L.E., Yun T.E., Tikunova N.V. Generation and characterization of chimeric antibodies against tick-borne encephalitis virus. The 8th International PhD Student Symposium “Biology of Disease – A Molecular Battlefield”. November 30 – December 2, 2006, Heidelberg, Germany, p. 62.

7. Леванов Л.Н., Матвеев Л.Э., Юн Т.Э., Тикунова Н.В. Получение одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита. Материалы 11го Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. 28-31 мая, 2007, Санкт-Петербург, Россия, с.

149-150.

8. Levanov L.N., Matveev L.E., Yun T.E., Tikunova N.V. Generation and characterization of scFv-antibodies against tick-borne encephalitis virus. The 8th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology “Immunology and Viral Infection”.

September 10-15, 2007, Moscow, Russia, p. 32.

9. Levanov L.N., Matveev L.E., Yun T.E., Tikunova N.V. Generation of chimeric antibodies against tick-borne encephalitis virus. The first international summer school 2008 “Pathogen-Host Interplay”. July 20-27, 2008, Berlin-Potsdam, Germany, p. 76.

10. Levanov L.N., Matveev L.E., Yun T.E., Tikunova N.V. Construction and characterization of recombinant antibodies against tick-borne encephalitis virus.

International Life Sciences Students’ Conference. September 10-14, 2008, Warsaw, Poland, p. 19.

11. Levanov L.N., Matveev L.E., Yun T.E., Tikunova N.V. Construction and characterization of recombinant antibodies against tick-borne encephalitis virus. 34th FEBS Congress “Life’s Molecular Interactions”. July 4-9, 2009, Prague, Czech Republic, p. 375.