На правах рукописи

МИЛЮХИНА ИРИНА ВАЛЕНТИНОВНА

ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЦИТОКИНЫ

ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА

14.01.11 – нервные болезни

03.03.01 – физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург-2013 2

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины»

Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук Скоромец Александр Анисимович Научные руководители:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Клименко Виктор Матвеевич доктор медицинских наук, профессор Помников Виктор Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, ФГБОУ ДПО "Санкт-Петербургский институт усовершенствования врачейэкспертов» Министерства труда и социальной защиты Российской Федерации, заведующий кафедрой неврологии, медико-социальной экспертизы и реабилитации.

Якимовский Андрей Федорович доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Первый СанктПетербургский государственный медицинский университет имени акад.

И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой нормальной физиологии.

Ведущая организация: ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им.

С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Защита состоится « » 2013 года в часов на заседании диссертационного совета Д 208.090.06 при ГБОУ ВПО «Первый СанктПетербургский государственный медицинский университет имени акад. И.П.

Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, дом 6-8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад. И.П. Павлова» МЗ РФ

Автореферат разослан « » 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук, доцент Матвеев Сергей Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Болезнь Паркинсона (БП) – хроническое, неуклонно прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, в основе которого лежит преимущественно дегенерация дофаминергических нейронов черной субстанции. Клинически БП проявляется сочетанием гипокинезии с мышечной ригидностью, тремором и постуральными нарушениями, а также разнообразными немоторными проявлениями. (Голубев В.Л., 1999;

Литвиненко И.В., 2010; Левин О.С. и др., 2012).

В рамках основных клинических проявлений БП существуют различные комбинации симптомов, что обусловливает выраженную фенотипическую гетерогенность заболевания (Иллариошкин С.Н., 2010;

Иванова-Смоленская И.А. и др., 2010), которая в первую очередь проявляется в виде различных форм БП (акинетико-ригидной, дрожательной и смешанной), а также различиями в темпе прогрессирования, выраженности моторных и немоторных симптомов, преимущественной латерализации клинической симптоматики. В связи с клинической неоднородностью затруднено выделение общих патогенетических механизмов, характерных для заболевания в целом, и уникальных для определенного клинического варианта болезни звеньев патогенеза. Идентификация не только фенотипических, но и биохимических особенностей развития клинических форм БП имеет большое фундаментальное и прикладное значение и может стать основанием для целенаправленной симптоматической терапии.

Современные исследования по изучению патогенеза БП особое внимание уделяют иммунологическим механизмам развития болезни (Chavarria C.,2013; Benkler M., 2009), при этом наибольшее значение придается изучению включения про- и противовоспалительных цитокинов в процесс нейродегенерации (Mosley M., 2012; Perry, 2012, Reale M., 2009). Имеется обширный экспериментальный материал и клинические исследования, посвященные выявлению изменений содержания отдельных цитокинов в крови пациентов с БП, но без учета гетерогенности заболевания. Поэтому очевидна необходимость проведения исследования показателей цитокинового профиля, характерного для определенных клинических форм и темпов прогрессирования БП, в том числе с учетом применяемой противопаркинсонической терапии.

Степень разработанности темы исследования эпидемиологические, патоморфологические, патофизиологические отличия.

Существует даже мнение, что описанные клинические формы БП могут быть самостоятельными нозологическими вариантами первичного паркинсонизма (Steelman et al., 2008).

В процессе прогрессирования и лечения БП происходит постепенная трансформация клинической картины: нарастает тяжесть существующих симптомов, на первый план выходят новые ятрогенные и неятрогенные симптомы, плохо поддающиеся терапии, оказывающие сильное стрессорное воздействие на пациента. Это создает сложную картину клинического патоморфоза БП и обуславливает необходимость корректировки алгоритма лечения в зависимости от формы БП и с учетом эволюции заболевания (Hely M.A., 2008).

Авторы, исследующие гетерогенность БП, смотрят на проблему исключительно с клинической позиции. Так, Erro R. с соавторами в исследовании 2013 г. с помощью кластерного анализа выделяют 4 группы пациентов с БП в зависимости от преобладания в клинической картине двигательных или недвигательных симптомов (Erro R. et al, 2013). В другом исследовании выделяют подтипы БП, исходя из учета скорости прогрессирования и выраженности моторных нарушений (Selikhova M. et al., 2009). Однако для идентификации клинических форм БП кроме совокупности фенотипических проявлений и вариантов течения болезни необходимо учитывать биохимические показатели, в частности, уровень прои противовоспалительных цитокинов в биологических жидкостях пациентов с БП.

Изучение показателей цитокинового статуса при БП проводится уже более 10 лет, однако, несмотря на длительный период исследования и большое количество клинических работ по этой теме, данные о концентрации различных цитокинов в крови и ликворе при БП носят противоречивый и разрозненный характер. Например, Stypula и соавторы в 1996 г. определяли интерлейкина (ИЛ)-1, ИЛ-2, ИЛ-6 в крови больных БП и обнаружили достоверное повышение только ИЛ-2 (Stypula et al., 1996). В то время как по другим данным отмечается снижение продукции ИЛ-2 в моноцитах крови пациентов с БП после стимуляции митогеном (Kluter, 1995) в сочетании с повышением ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО (Bessler H., 1999), что не было обнаружено в более ранних исследованиях. При этом в большинстве работ не учитывается влияние получаемой пациентами медикаментозной терапии. В последние годы исследователей стало интересовать не только сам факт изменения уровня определенных цитокинов, но и связь этих изменений с клиническими проявлениями БП (Reale M., 2008). Например, Lindqvist D. и соавторы обнаружили, что повышение ИЛ-6 и фактора некроза опухоли (ФНО) в крови пациентов с БП, положительно коррелирует с выраженностью некоторых немоторных проявлений (Lindqvist D. et al., 2012).

Однако с учетом вышеописанных фенотипической гетерогенности и патоморфоза БП вопросы связи показателей полного цитокинового профиля в крови и ликворе с формой, стадией, возрастом начала БП и скоростью ее прогрессирования, преимущественной латерализацией имеющихся нарушений, выраженностью моторных, немоторных проявлений, а также с особенностями противопаркинсонической терапии остаются открытыми.

Целью исследования явилось изучение особенностей цитокинового статуса и показателей окислительного стресса при различных формах и вариантах течения БП для усовершенствования диагностики и оптимизации терапии.

Задачи исследования 1. Изучить структуру и характер моторных и немоторных нарушений у пациентов с различными формами БП на разных стадиях;

2. Определить уровень цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-1РА, ФНО, ИЛ-6, ИЛ-10) в сыворотке крови и ликворе пациентов с БП, уровень антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы (СОД) и церулоплазмина (ЦП) в сыворотке крови пациентов с БП;

3. Сопоставить уровень цитокинов и антиоксидантных ферментов со стадией, длительностью, возрастом начала, скоростью прогрессирования БП, тяжестью моторных и аффективных нарушений у пациентов;

4. Оценить влияние терапии препаратами леводопы на уровень цитокинов, циркулирующих в крови и ликворе пациентов с БП;

5. Обосновать необходимость изучения показателей цитокинового профиля для диагностики и прогнозирования развития моторных и противопаркинсонической терапии.

Научная новизна работы В проведенном исследовании впервые показано, что для разных клинических форм и вариантов прогрессирования БП характерно различное содержание про- и противовоспалительных медиаторов в крови и ликворе:

при акинетико-ригидной форме наблюдается снижение уровня ИЛ-10 в крови и повышение уровня ФНО в ликворе на всех стадиях заболевания по сравнению с дрожательной формой. Выявлено, что для больных БП с ранним началом характерно снижение уровня церулоплазмина в крови.

Получены приоритетные данные об изменении содержания показателей нейровоспаления, характерных для аффективных и когнитивных проявлений БП, их взаимосвязи с обменом меди, уровнем супероксиддисмутазы и церулоплазмина.

Подтверждено, что уровень про- и противовоспалительных цитокинов в крови и ликворе связан со стадией заболевания, выраженностью моторных и немоторных нарушений при БП.

леводопотерапии на уровни ИЛ-6 и ИЛ-10 в крови и ликворе.

Теоретическая и практическая значимость исследования Результаты настоящего исследования расширяют современные представления о связи показателей цитокиновой сети и окислительного стресса со скоростью прогрессирования БП, выраженностью моторной симптоматики, наличием и выраженностью аффективных нарушений.

Проведенные исследования цитокинового профиля позволили углубить понимание патогенетических механизмов двигательных и недвигательных нарушений на разных стадиях БП и при разных клинических формах, что имеет практическую значимость при выборе противопаркинсонических препаратов, своевременности и последовательности их назначения.

Результаты выявленных изменений продукции цитокинов на фоне депрессии при БП позволяют осуществлять более точную диагностику данных нарушений и выбор адекватного подхода к лечению.

Полученные новые данные о биохимических особенностях форм БП открывают перспективы для создания иммуномодулирующей противопаркинсонической терапии, направленной на компенсацию дисбаланса в цитокиновой сети с учетом клинической гетерогенности.

Методология и методы исследования В исследовании использовались общенаучные методы: анализ данных, обобщение; частнонаучные: клинические, лабораторные, статистические методы. Работа выполнена в соответствии с принципами доказательной медицины.

Основные положения, выносимые на защиту гетерогенность по соотношению про- и противовоспалительных цитокинов и антиоксидантных ферментов в зависимости от формы, типа прогрессирования и возраста дебюта.

2. Для прогнозирования скорости прогрессирования БП, развития немоторных нарушений наряду с традиционным клинико-неврологическим противовоспалительных цитокинов ИЛ-1, ИЛ-1РА, ФНО, ИЛ-10, ИЛ-6, в сыворотке крови и ликворе.

Степень достоверности результатов Степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным и репрезентативным объемом выборок пациентов, достаточным количеством выполненных наблюдений с использованием широкого спектра современных методов исследования и подтверждена адекватными методами статистической обработки данных. Методы математической обработки полученных результатов адекватны поставленным задачам.

Личный вклад соискателя Автором проведен обзор современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, разработан дизайн исследования. Автор лично осуществляла курирование всех пациентов, сбор анамнеза, неврологическое обследование с использованием диагностических рейтинговых шкал и тестов, динамическое наблюдение за пациентами с БП, выполнение люмбальных пункций, участвовала в проведении лабораторных исследований (методом иммуноферментного анализа), осуществляла анализ всех данных, полученных при клинико-лабораторном обследовании, обработку материала (в том числе статистический анализ данных), анализ результатов работы, интерпретацию, формирование выводов и практических рекомендаций.

Внедрение в практику Научные положения, практические рекомендации внедрены в практическую работу I и II неврологических отделений клиники ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН; результаты исследования и научные положения внедрены в учебный и лекционный процесс на Кафедре неврологии с клиникой ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад. И.П. Павлова» МЗ РФ, в лекционный процесс на Кафедре биофизики СПбГПУ.

Апробация работы Работа апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании Отдела физиологии им. Павлова ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН и кафедры неврологии с клиникой ГБОУ ВПО «ПСПбГМУ им. акад.

И.П.Павлова» МЗ РФ 09 октября 2013 года.

Основные результаты работы доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции молодых ученых “Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия”, посвященной 120-летию со дня основания Института экспериментальной медицины, (Санкт-Петербург, 2010 г.); на Всероссийской молодежной конференции-школы «Нейробиология интегративных функций мозга», (Санкт-Петербург, 2011г.), на II Национальном конгрессе по болезни Паркинсона и расстройствам движений (с международным участием), (Москва, 2011г.); на 15-й Международной междисциплинарной конференции по нейронауке и биологической психиатрии «Стресс и поведение» (15-th Multidisciplinary International Conference on Neuroscience and Biological Psychiatry “Stress and Behavior”) (Санкт-Петербург, 2011 г.), на Всероссийской научнопрактической конференции «Дегенеративные и сосудистые заболевания нервной системы» (Санкт-Петербург, 2013), на ХХ Всемирном Конгрессе «Болезнь Паркинсона и расстройства движения» (XX World Congress on Parkinson’s Disease and Related Disorders, Женева, 2013).

Публикации По теме диссертационного исследования опубликовано 14 печатных работ, в том числе: за рубежом - 3, в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных результатов диссертаций - 2.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка литературы. Основной материал изложен на 146 страницах машинописного текста. Текст диссертации иллюстрирован 14 рисунками, 15 таблицами и 2 клиническими примерами.

Список литературы содержит 256 источников, в том числе 34 отечественных и 222 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования Исследования проведены в Клинике ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН. Все пациенты, принимавшие участие в исследовании, дали свое согласие и отбирались в соответствии с разработанными нами критериями включения/исключения.

Были обследованы 87 пациентов, 47 (54%) женщин и 40 (46%) мужчин, с БП в стадии заболевания с 1,0 по 4,0 по шкале Хен и Яра (Hoehn M.M., Yahr M., 1967), диагноз которым выставлялся в соответствии с критериями Британского банка мозга «Диагностика идиопатической болезни Паркинсона» (Hughes et. al., 1992). Размах выборки по возрасту был от 43 до 82 лет, медиана 65 (57-73) лет. В исследовании преимущественно приняли участие пациенты с 1,5 по 2,5 стадию БП по шкале Хен и Яра – 63 (72%).

С помощью кластерного анализа по методу к-средних нами были выделены две группы больных: в первую группу вошли пациенты с преобладанием в клинической симптоматике дрожательного синдрома, во вторую – акинетикоригидного. В тремор-доминантную (ТД) группу был включен 41 (47%) пациент, в акинетико-ригидно-доминантную (АРД) группу - 46 (53%) пациентов. Темп прогрессирования БП оценивался согласно рекомендациям Центра экстрапирамидных заболеваний Минздрава РФ. Быстрый темп прогрессирования, выявлен у 16 (18,4%) больных, умеренный темп - у (57,5%) больных, медленный темп - у 21 (24,1%) больного.

Продолжительность заболевания колебалась от 2 до 16 лет, преобладали пациенты с длительностью БП от 5 до 9 лет (39,1%). Возраст начала заболевания – от 33 до 76 лет, медиана составила 57,7 (51;67) лет. пациентов (8,1%) – пациенты с ранним паркинсонизмом с возрастом начала БП до 45 лет. Всего 69 пациентов (79,3%), получавших леводопотерапию, разделили на две группы: 1- получающие начальную дозу леводопы (до мг/сутки); 2- получающие стандартную поддерживающую дозу леводопы (от до 1075 мг/сутки). Контрольную группу составили 20 человек (11 женщин и мужчин) в возрасте от 46 до 75 лет, (медиана 64 (55-70)лет), соотносимых по полу и возрасту с основной группой, с отсутствием хронических воспалительных заболеваний, без заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) в анамнезе.

Клиническая оценка состояния больных включала в себя определение клинической формы заболевания, степени тяжести, темпа прогрессирования, выраженности основных симптомов на фоне противопаркинсонической терапии. Неврологический осмотр проводился по стандартной методике (Скоромец А.А. и др., 2012).

объективизацией имеющихся нарушений с помощью шкал:

1. Двигательные нарушения: III часть УШОБП (Fahn S., Elton R.L., 1987). Для клинической оценки постуральной неустойчивости использовали комплексный показатель постуральной нестабильности и нарушений ходьбы – PIGD (Postural Instability and Gait Disorder).

2. Нарушения повседневной активности: II часть УШОБП (Fahn S. et al., 1987); шкала повседневной жизненной активности Шваба и Ингланда (Schwab R.S., 1968) в период «выключения».

3. Оценка выраженности немоторных симптомов проводилась с помощью шкалы немоторных симптомов при болезни Паркинсона PD NMS (Chaudhuri К.R. et al., 2004).

4. Исследование когнитивных функций осуществляли с помощью Краткой шкалы оценки психического статуса (КШОПС) (Folstein et al., 1975), для оценки зрительно-пространственных функций применялся тест рисования часов (ТРЧ) (Manos P., 1994). Для исследования регуляторных функций использовался тест «Батарея лобной дисфункции» (БЛД) (Dubous B.

et al., 1999).

использованием Шкалы депрессии Бека (Beck, 1996), Госпитальной шкалы тревоги и депрессии (HADS) (Zigmond A.S., Snaith R.P., 1983), которая содержит две подшкалы: А- «тревога» и D-«депрессия».

Кровь исследовалась у 87 пациентов с БП и 20 человек контрольной группы, ликвор - у 13 пациентов с БП. Содержание цитокинов ИЛ-1, ИЛРА, ФНО, ИЛ-6, ИЛ-10 и уровень СОД в сыворотке крови и содержание данных цитокинов в ликворе больных определялось методом твердофазного иммуноферментного анализа, выполняемого с помощью специфических тестсистем, разработанных на основе соответствующих моноклональных антител, на анализаторе «ImmunoChem-2100 Microplate Reader» согласно прилагаемой инструкции. Определение содержания ЦП проводилось методами иммуноэлектрофореза и спектрофотометрически. Определение концентрации меди в сыворотке крови проводилось методом атомноабсорбционной спектрометрии.

Статистическая обработка данных проводилась с применением программ Microsoft Excel 2010 и пакета компьютерных прикладных программ Statistica 8.0 (StatSoft, 2008). Оцениваемые признаки охарактеризовались медианой, верхней и нижней квартилью. При сравнении двух независимых групп использовался критерий Манна-Уитни, трех и более групп критерий Кроскала-Уолиса, медианный тест; при анализе статистических зависимостей вычислялся коэффициент корреляции Спирмена. Для решения задач