На правах рукописи

ИЛАТОВСКАЯ Мария Евгеньевна

Участие эндотелина-1 в развитии

реноваскулярной гипертензии у крыс с интактными семенниками и у

гонадэктомированных половозрелых самцов

03.03.01 – физиология

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2013

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (заведующий кафедрой – доктор биологических наук, профессор А.А. Каменский).

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор, Медведева Наталия ведущий научный сотрудник кафедры Александровна физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова доктор медицинских наук, профессор Мальков Павел Георгиевич кафедры патологической анатомии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования»

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Кошелев Владимир заведующий кафедрой физиологии и общей Борисович патологии факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова доктор биологических наук, главный научный Завалишина Лариса сотрудник ФГБУ «Российский центр судебно- Эдуардовна медицинской экспертизы Минздрава России»

Ведущая организация: ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»

РАМН

Защита состоится 2 декабря 2013 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д501.001.93 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 2 ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного Б.А. Умарова совета, доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Изучение механизмов патогенеза артериальной гипертонии является актуальной проблемой как для физиологии и патофизиологии сердечнососудистой системы, так и для клинических исследований. Формирование повышенного артериального давления представляет собой многофакторный процесс, однако принято считать, что в подавляющем числе случаев гипертензия обусловливается и связана с почечной патологией.

Согласно современным представлениям, эндотелиальная выстилка сосудов представляет собой эндокринный орган, изменение секреторного фенотипа которого является одним из звеньев многих заболеваний сердечнососудистой системы. Одним из синтезируемых эндотелием веществ является эндогенный пептид эндотелин-1 (ЭТ-1) – мощный вазоконстрикторный, провоспалительный и профибротический фактор. Большие количества ЭТ- синтезируют и почки [Wilkes B.M. и др., 1991], где этот пептид, действуя паракринно, может индуцировать фиброзно-склеротические процессы. Dhaun N. и соавторы [2009] показали, что уровень экскреции ЭТ-1 увеличивается пропорционально тяжести почечной недостаточности. В связи с этим возрос интерес к ингибиторам системы эндотелина, в том числе, ингибиторам эндотелинпревращающего фермента, как к ренопротективным и гипотензивным препаратам [Kuruppu S., Rajapakse N.W., Smith A.I., 2013]. С другой стороны, почечный синтез ЭТ-1 в медуллярном слое может иметь адаптивное значение, поскольку стимулирует диуретические и натриуретические реакции [Kohan D.E. и др., 2011]. Одно из первых предположений о физиологической значимости почечного ЭТ-1 было высказано, когда обнаружили сниженный уровень экскреции пептида при эссенциальной гипертензии, особенно у пациентов с солезависимыми формами заболевания [Hoffman A. и др., 1994]. Применение блокаторов рецепторов эндотелина в остром эксперименте на наркотизированных крысах [Vassileva I., Mountain C., Pollock D., 2003] подтвердило натриуретические эффекты ЭТ-1, опосредованные синтезом оксидом азота. А эксперименты на мышах с избирательно нокаутированным геном предшественника ЭТ-1 в собирательной трубке почек позволили высказать предположение о стимулирующем действии этого пептида на диурез, причем выведенная линия мышей имела повышенное артериальное давление [Ge Y. и др., 2005; Strait K., Stricklett P., Kohan D., 2007].

В связи с неудачными клиническими испытаниями ряда блокаторов эндотелиновых рецепторов, в том числе, связанными с возникновением отеков и анемии при их использовании [Kirkby N.S. и др., 2008], актуальной задачей является более глубокое изучение осморегулирующей и диуретической роли ЭТ-1 при патологиях почек, приводящих к повышению артериального давления. Кроме того, экспериментальные данные свидетельствуют, что система ЭТ-1 в почках имеет половые особенности как на уровне рецепторов, так и на уровне синтеза ЭТ-1. Показано, что системный и почечный синтез ЭТможет увеличиваться под влиянием тестостерона [Polderman K. и др., 1993;

Yanes L., Sartori-Valinotti J., Reckelhoff J., 2008]. В связи с этим, актуальной задачей является изучение влияния мужского полового гормона тестостерона на участие ЭТ-1 в регуляции почечной функции в норме и при патологии, приводящей к увеличению системного артериального давления. В качестве модели реноваскулярной гипертонии, индуцированной снижением объемрегулирующей функции почки, в экспериментах на животных используют модель “одна почка, один зажим” [Liard J.-F. и др., 1974]. С учетом предполагаемых диуретических функций ЭТ-1 в почках, данная модель является адекватной и была использована в настоящей работе.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилось изучение роли ЭТ-1 в развитии реноваскулярной гипертензии (модель “одна почка, один зажим”) с помощью хронического применения ингибитора синтеза ЭТ-1 в экспериментах на крысах с интактными и удаленными семенниками.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

эндотелинпревращающего фермента (ЭПФ) на динамику артериального давления при развитии гипертензии у крыс с интактными или удаленными семенниками.

2. Проанализировать изменения системной концентрации ЭТ-1 в крови и экскреции ЭТ-1 с мочой при развитии гипертензии у крыс с применения ингибитора ЭПФ на эти параметры.

(гистоархитектоники клубочкового аппарата почки и эндотелининдуцированного фиброза) у крыс с интактными или удаленными семенниками при применении ингибитора ЭПФ на фоне развития гипертензии.

4. Изучить механизмы влияния хронического применения ингибитора ЭПФ на показатели осморегуляции (осмоляльность и ионный состав крови, осмоляльность мочи, суточные объемы потребления воды и мочевыделения) у крыс с интактными или удаленными семенниками с гипертензией.

В представленной диссертационной работе впервые в хроническом эксперименте на крысах была показана антигипертензивная функция эндогенного почечного эндотелина-1, на модели объем-зависимой реноваскулярной гипертонии. У животных с интактными семенниками и у кастрированных крыс с почечной гипертензией было показано значительное увеличение экскреции эндотелина-1, что свидетельствует об увеличении его синтеза. Применение ингибитора ЭПФ приводило к уменьшению экскреции ЭТ-1 и потенциации артериальной гипертонии у животных с интактными семенниками, а у кастрированных животных эффекта выявлено не было, что говорит о наличии взаимосвязи между уровнем содержания тестостерона и почечным синтезом эндотелина-1. В исследовании на бодрствующих крысах было проведено сравнение комплекса осморегуляторных эффектов применения ингибитора эндотелинпревращающего фермента у половозрелых и кастрированных самцов крыс на фоне гипертензии. Было показано, что ингибитор ЭПФ у гипертензивных крыс с интактными семенниками вызывает увеличение осмоляльности крови. У кастрированных крыс ингибитор ЭПФ не приводил к изменениям осморегуляции. Полученные результаты расширяют представления об эффектах ингибиторов эндотелинпревращающего фермента и свидетельствуют об отличиях механизмов участия эндотелина-1 при развитии реноваскулярной гипертензии у половозрелых самцов крыс в зависимости от наличия или отсутствия семенников.

Теоретическая и практическая значимость работы В работе было показано, что хроническое применение ингибитора ЭПФ способно селективно снижать содержание ЭТ-1 в плазме крови или его экскрецию с мочой, которая является общепринятым показателем синтеза ЭТ- в почках. Степень активации системы эндотелина, наличие или отсутствие семенников, развитие реноваскулярной гипертензии приводило к изменению селективности действия ингибитора. Это свойство использованного в работе ингибитора может иметь перспективы при терапии и изучении патогенеза заболеваний, сопровождаемых увеличением синтеза ЭТ-1 в почках.

Гонадэктомия половозрелых самцов крыс, представляющая собой модель возрастного снижения продукции тестостерона, позволила выявить влияние тестостерона на систему почечного эндотелина. Отсутствие эффекта ингибитора ЭПФ на почечный синтез ЭТ-1 может свидетельствовать об изменении ферментативного пути синтеза этого регулятора у самцов на фоне гонадэктомии. Это может иметь значение при изучении и разработке фармакологических препаратов для снижения синтеза ЭТ-1 у пожилых мужчин.

1. Применение ингибитора ЭПФ на фоне развития реноваскулярной гипертензии оказывало различное воздействие на почечную экскрецию ЭТ-1 у половозрелых крыс в зависимости от наличия или отсутствия семенников.

реноваскулярной гипертензией и интактными семенниками возникало вследствие снижения почечного синтеза ЭТ-1, о чем говорит уменьшение экскреции ЭТ-1 с мочой.

3. Хроническое применение ингибитора ЭПФ, приводящее к уменьшению гипертензивных крыс интактными семенниками, что могло лежать в основе его прогипертензивного действия.

Основные положения диссертации были представлены на конференции «Физиологическая активность регуляторных пептидов», посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.П. Ашмарина (Россия, Москва, 2010), на XXI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Россия, Калуга, 2010); 21st European Meeting on Hypertension and Cardiovascular Prevention (Italy, Milan, 2011); 23rd European Meeting on Hypertension and Cardiovascular Prevention (Italy, Milan, 2013); ERA-EDTA (European Renal Association European Dialysis and Transplant Association) 50th Congress (Turkey, Istanbul, 2013); на XXII съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Россия, Волгоград, 2013); в виде устных сообщений на XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых ЛОМОНОСОВ- международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, Россия, 2012).

По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 3 статьи - в отечественных научных журналах, рекомендуемых ВАК, и 8 тезисов докладов – в сборниках материалов отечественных и международных конференций.

Диссертация изложена на 154 страницах и включает введение, обзор литературы, описание методов исследования, результаты, обсуждение, выводы, список цитируемой литературы (содержит 232 источника, в том числе опубликовано в отечественных изданиях). Работа иллюстрирована рисунками и содержит 35 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все исследования были проведены в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и Хельсинской декларацией о гуманном отношении к животным.

Моделирование реноваскулярной гипертензии «одна почка, один зажим» и деление животных на экспериментальные группы В исследование брали половозрелых самцов стока Wistar массой 200- г, часть из которых подвергали кастрации, а вторую часть делили на 4 группы.

Крысам из групп Гипер и Гипер-РР проводили операцию по удалению правой почки и наложению зажима на артерию левой, у животных из групп ЛО и ЛОРР ту же операцию проводили без удаления почки и наложения зажима.

Крысам из групп Гипер-РР и ЛО-РР в течение 4-х недель после операции индивидуально в питьевую воду в дозе 2,3 мг/кг в сутки добавляли ингибитор ЭПФ – вещество РР36, синтезированное в Институте Биомедицинской химии РАН им. Ореховича Поздневым В.Ф., которое было показано эффективным в отношении снижения концентрации ЭТ-1 в плазме крови [Симонова А.И. и др., 2008; Rufanova V.A. и др., 2009]. Аналогичным образом делили по группам кастрированных животных, операцию по моделированию гипертензии проводили на 18-21 день после кастрации у групп к-Гипер и к-Гипер-РР, и ложную операцию – у групп к-ЛО и к-ЛО-РР.

Оценка динамики и степени развития гипертензии Перед экспериментом и после операции еженедельно у каждой крысы измеряли системное систолическое давление в хвостовой артерии с помощью плетизмографического метода [Malkoff J., 2005; Feng M., 2008]. Регистрацию и обработку результатов проводили в программе LGraph2. Для оценки выраженности гипертрофии левого отдела сердца в конце эксперимента измеряли абсолютный вес левого желудочка.

Оценка осморегулирующей и выделительной функции почек За несколько суток до операции и в конце эксперимента (через 4 недели после операции), крыс помещали в метаболические камеры со свободным доступом к воде и проводили сбор мочи в течение 24 часов. На следующий день собирали кровь для анализа содержания креатинина, мочевины – показателей выделительной функции почек [Кутырина И.М., 2000; Рябов С.И., Наточин Ю.В., 1997], измерения проводили на биохимических анализаторах Architect 4000 (Abbott) и А25 (Biosystems, Испания) используя оригинальные наборы реактивов. Для оценки осморегуляции, оценивали осмоляльность мочи и крови (при помощи криоскопического осмометра OSMOMAT 030 (Gonotec, Германия)), содержание ионов натрия и калия (при помощи ионоселективных электродов), суточные объемы потребления воды и экскреции мочи.

Эндокринологичекого научного центра Минздрава России. Осмотический клиренс (ОК) и клиренс осмотически свободной воды (КСВ), показатели осморегулирующей функции почек [Наточин Ю.В., 2009; Shoker A.S., 1994], рассчитывали по формулам:

мочеотделения, UOsm – осмоляльность суточной мочи, POsm – осмоляльность плазмы или сыворотки крови (в случае кастрированных крыс).

Объемы экскреции мочи и потребления воды, а также ОК и КСВ относили к весу животного, поскольку к окончанию эксперимента мы наблюдали увеличение различий между группами по массе тела крыс.

Поскольку эндотелин-1 оказывает профибротические эффекты в тканях, для изучения степени развития склерозно-фибротических процессов в корковом веществе почек проводили гистологическое исследование (работа выполнена в лаборатории патоморфологии и цитологии ГБУЗ КДЦ №6 Департамента здравоохранения г. Москвы, заведующий – доктор мед. наук Мальков П.Г.).

гломерулосклероза, проводили на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином в соответствии с общепринятыми признаками (клеточность мезангия, площадь мезангия, прорисовка капиллярных петель клубочка, состояние капилляров и мочевого пространства) [Серов В.В., Варшавский В.А., интерстициальных склерозно-фибротических изменений проводили подсчет соединительнотканными волокнами. Для этого на препаратах, окрашенных трихромом по Массону, на увеличении x20 считали количество полей зрения с тубулоинтерстициальным фиброзом (из 5ти находящихся рядом) в 7- отдельных участках коркового слоя почки.

Анализ содержания эндотелина-1 в крови и его мочевой экскреции Определение содержания ЭТ-1 проводили с помощью набора для иммуноферментного анализа (Biomedica, Австрия) в образцах свежей мочи и плазмы крови (содержащей ЭДТА, 1 мг/мл), собранных в конце эксперимента.

Образцы плазмы, сыворотки и мочи хранили при -20 оС.

Статистическую обработку результатов осуществляли при помощи программы Statistica 8.0 (Statsoft). Данные подвергали проверке на нормальность распределения с помощью тестов Колмогорова-Смирнова и Лиллифорса (Lilliefors test), а также проводили проверку на наличие выбросов.

Затем сравнивали значения между группами, при этом в соответствии с полученным распределением величины, выбирали параметрический (ANOVA, c использованием апостериорной оценки (post hoc) по методу Фишера) или непараметрический метод (критерий Крускалла-Уоллиса). Различия считали