На правах рукописи

АЗАРЕНОК

АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

РОЛЬ ВИРУСА ГРИППА И ЕГО ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ В РАЗВИТИИ ДИСФУНКЦИИ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ

03.02.02. - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2014

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Жилинская Ирина Николаевна доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

Исаков Валерий Александрович, доктор медицинских наук, профессор кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии с курсом ВИЧ-медицины ГОУ ВПО «Первый СПбГМУ им. акад.И.П.Павлова» Росздрава.

Киселева Ирина Васильевна, доктор биологических наук, ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, зав. лаб. вакцинных штаммов отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева.

Ведущая организация: Федеральное бюджетное государственное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.

Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучию человека Российской Федерации

Защита диссертации состоится в часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.131.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им.

Д.И. Ивановского» Минздрава России (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научноисследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 16)

Автореферат разослан « »_

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук Бурцева Елена Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Грипп представляет собой инфекцию, занимающую доминирующее положение в структуре инфекционной заболеваемости, как по числу случаев заболевания, так и по наносимому экономическому ущербу [Киселев и др., 2010;

Львов и др., 2010]. Однако, несмотря на интенсивное изучение возбудителя этой инфекции с момента его открытия и до наших дней, патогенез гриппа остается предметом интереса большого числа исследователей. Это связано в первую очередь с установленным фактом, что вирус гриппа вызывает не только нарушения дыхательной системы, но и поражает нервную систему, кишечник, а также вызывает изменения в системе гемостаза [Богомолов и др., 2001; Жилинская и др.,2003;]. Механизм этих множественных нарушений при гриппе до сих пор невыяснен. Взаимосвязь гриппозной инфекции и нарушений гемостаза клиницисты отмечали еще в 60-е года прошлого века [Сергеев и др., 1962]. Подтверждением этой взаимосвязи явилась эпидемия 2009гг., во время которой наблюдались тяжелые осложнения в виде энцефалопатий и тромбогеморрагических пневмоний, ключевым моментом в развитии которых явилось повреждение эндотелия кровеносных сосудов вирусом гриппа [Цинзерлинг и др.,2011;

Горфинкель и др.,2011]. Кроме того, эпидемиологические данные также указывают на то, что имеется корреляция между ежегодными эпидемиями гриппа и ростом числа больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями [Богомолов и др., 2001;

Carrat et al., 2006; Wong et al., 2006]. Так как среди причин развития сердечнососудистых заболеваний дисфункция эндотелия занимает одно из первых мест [Петрищев, 2003], то можно предполагать, что в случае подтверждения способности вируса гриппа поражать эндотелий кровеносных сосудов человека, гриппозная инфекция может представлять угрозу возникновения сердечно-сосудистой патологии. Поэтому, представляло интерес выяснить, влияет ли гриппозная инфекция на развитие дисфункции эндотелия.

Эндотелий кровеносных сосудов в настоящее время рассматривается не просто как барьер между кровью и окружающими тканями, но как диффузный эндокринный орган, пронизывающий все системы организма[Furchgott 1999; Гомазков 2000; Лупинская и др.,2008]. Основной функцией эндотелия является поддержание гемостаза, то есть непрерывного тока крови, но кроме этого клетки эндотелия участвуют в процессах воспаления, ангиогенеза и т.д. В связи с этим эндотелий оказывается мишенью для большинства патогенов, как бактериальных, так и вирусных.

Большое число исследований посвящено воздействию на эндотелиальные клетки таких вирусов, как вирус иммунодефицита, цитомегаловирус, вирусы-возбудители геморрагических лихорадок [Bibas et al., 2011; Popovic et al., 2012; Brown et al., 2011]. На этом фоне количество работ, посвященных влиянию вируса гриппа и его белков на клетки эндотелия, крайне незначительно и проведение подобных исследований при изучении патогенеза гриппозной инфекции представляется актуальным [Klenk et al.,2005]. Фундаментальные исследования по изучению механизмов взаимодействия вируса гриппа с клетками эндотелия в России не проводятся. Имеется ряд сообщений о патоморфологических исследованиях клеток эндотелия при гриппозной инфекции [Цинзерлинг, 1977; Горфинкель и др.,2011], а также клинические исследования, касающиеся терапии ДВС-синдрома и геморрагических пневмоний при гриппе [Роганова, 2009]. Монографий на данную тему, а также защищенных кандидатских и докторских диссертаций не имеется. В основе работы лежат данные, полученные доктором биологических наук Жилинской И.Н. (сотрудником ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ) – докторская диссертация «Роль вирусных белков в патогенезе гриппозной инфекции», 2003 год.

Цель и задачи исследования. Целью работы было показать возможность репродукции вируса гриппа в клетках эндотелия сосудов человека и выявить роль вируса гриппа и его поверхностных белков – гемагглютинина и нейраминидазы – в развитии дисфункции эндотелиальных клеток.

Для достижения поставленной цели планировалось решить следующие задачи:

1). Выявить особенности репродукции эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа человека и птиц в культуре клеток эндотелия человека EAhy926.

2). Оценить воздействие эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа и его поверхностных белков на дыхательную активность митохондрий эндотелиальных клеток.

3) Выяснить воздействие эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа и его поверхностных белков на апоптоз клеток эндотелия.

4) Изучить влияние эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа и его поверхностных белков на выживаемость клеток эндотелия.

5) Оценить развитие дисфункции эндотелия под воздействием эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа и его поверхностных белков по активности человеческого тканевого активатора плазминогена.

Научная новизна работы. Доказано, что вирус гриппа способен репродуцироваться в клетках эндотелия человека in vitro (на модели клеточной культуры EAhy926).

На модели клеточной культуры репродукция вируса гриппа была зарегистрирована вирусологическим, молекулярно-биологическим и электронно-микроскопическим методами, а также была подтверждена при изучении аутопсийного материала легких, мозга и сердца.

Впервые показано развитие дисфункции эндотелия под воздействием вируса гриппа и его поверхностных белков с использованием нескольких критериев: по развитию апоптоза, по угнетению метаболизма клеток эндотелия, по активации тканевого активатора плазминогена.

Развитие апоптоза было подтверждено данными по активации каспазы-3 и регистрации аннексин V положительных апоптотических клеток. Впервые было показано, что вирус гриппа типа А вызывает активацию каспазы-3 в эндотелиальных клетках через 30 минут после их инфицирования. Аналогичные данные получены и для поверхностных белков исследуемых вирусов – гемагглютинина и нейраминидазы. Исследуемые штаммы вируса гриппа и их поверхностный белок нейраминидаза вызывали развитие апоптоза на ранних сроках воздействия (4-8часов), что регистрировалось по появлению аннексин V положительных клеток (6% от общего числа клеток). При изучении воздействия другого поверхностного белка – гемагглютинина – было показано, что, несмотря на активацию каспазы-3, гемагглютинин вируса гриппа вызывает гибель эндотелиальных клеток только по некротическому пути.

Показано угнетение метаболизма клеток эндотелия как цельным вирусом гриппа типа А, так и его поверхностными белками, что регистрировалось по изменению активности внутриклеточных дегидрогеназ.

Выявлена активация процесса фибринолиза (увеличение активности тканевого активатора плазминогена) под влиянием вируса гриппа и его поверхностных белков в клетках эндотелия человека in vitro (на модели клеточной культуры EAhy926) и in vivo (в эуглобулиновой фракции крови крыс). Можно предположить, что механизмом активации процесса фибринолиза может служить мимикрия аминокислотных последовательностей тканевого активатора плазминогена в структуре гемагглютинина и нейраминидазы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Возможность репродукции вируса гриппа типа А в клетках эндотелия человека как in vitro, так и in vivo имеет большое значение для практической медицины, так как открывает новый аспект патогенеза гриппозной инфекции. Показано, что репродукция вируса гриппа приводит к изменению морфологии клеток эндотелия, к угнетению метаболизма, развитию апоптоза и активации тканевого активатора плазминогена. Все перечисленные критерии указывают на то, что гриппозная инфекция приводит к прямому повреждению эндотелиальных клеток, которое выражается в развитии дисфункции. Все эти данные согласуются с клинической картиной при гриппозной инфекции.

Таким образом, впервые показана важная роль клеток эндотелия в патогенезе гриппозной инфекции. Полученные данные указывают на необходимость комплексной терапии при гриппе, а также открывают новые подходы в разработке противогриппозных препаратов. Кроме того, становится очевидным, что развитие дисфункции эндотелия при гриппозной инфекции может привести к развитию сердечно-сосудистой патологии в виду ежегодных эпидемий гриппа.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Вирус гриппа типа А способен репродуцироваться в клетках эндотелия кровеносной системы человека.

2. Вирус гриппа типа А и его поверхностные белки вызывают дисфункцию эндотелиальных клеток, которая выражается:

а) в развитии апоптоза.

б) в угнетении метаболизма эндотелиальных клеток;

в) в активации процесса фибринолиза путем увеличения активности тканевого активатора плазминогена.

3. Поверхностные белки вируса гриппа типа А – гемагглютинин и нейраминидаза – также вызывают развитие дисфункции эндотелия по тем же параметрам, что и цельный вирус гриппа.

Личный вклад автора. Автором выполнен основной объем работ по всем разделам диссертации: изучению репродукции вирусов гриппа, выявлению активности каспазы-3, исследованию дыхательной активности и апоптоза, изучению активности активатора плазминогена в клетках эндотелия. Автором проведен анализ использованной литературы и полученных данных; подготовлены материалы по основным публикациям; сформулированы выводы диссертации.

Внедрение результатов работы. Все исследования входили в плановую научную тематику лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ.

Материалы исследования используются в учебном процессе в курсе тематического усовершенствования, сертификационном курсе и курсе профессиональной переподготовки по специальности «Вирусология» на базе кафедры медицинской микробиологии ГБОУ СЗГМУ им.И.И.Мечникова.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» Санкт-Петербург 2010г.; Четвертой научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии» Санкт-Петербург 2010г.;

Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии(XV Кашкинские чтения) Санкт-Петербург 2012 г.; Юбилейной научно-практической конференции «Грипп: эпидемиология, вирусология и лечение» Санкт-Петербург, 2012г.; Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии(XVI Кашкинские чтения) Санкт-Петербург 2013 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них - 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Объем работы составляет 183 страницы машинописного текста, включая 6 таблиц и 31 рисунок. Список литературы из 328 наименований, из них 49 отечественных и 279 зарубежных.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с Жилинской И.Н., Прочухановой А.Р., Ильинской Е.В., Сироткиным А.Н., Козловой Н.М., Еропкиной Е.М., Царевой Т.Р. и Сорокиным Е.В. - сотрудниками ФГБУ НИИ гриппа РАМН МЗ РФ; Ляпиной Л. А. и Оберган Т.Ю. – сотрудниками кафедры защитных систем крови МГУ, Москва; Харченко Е.П. - сотрудником Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН; Люблинской О.Г. и Зениным – сотрудниками Института цитологии РАН.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вирусы. Исследовали три штамма вируса гриппа: 1) Эпидемический штамм вируса гриппа человека А/Брисбейн/10/2007 (Н3N2);

2) реассортантный штамм вируса гриппа птиц А/курица/Курган/5/05 NS1Н5N1). Этот штамм получен методом обратной генетики в лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии НИИ гриппа; геном включает следующие гены: а) полимеразы РВ2 и РА, нуклеопротеин (NP), неструктурные белки (NS) – от вируса А/PR/8/34(H1N1); полимераза РВ1 – от вируса А/Техас/1/77 (Н3N2); б) гемагглютинин (НА) от дикого штамма А/курица/Курган/5/05 (Н5N1), модифицированный по сайту расщепления; в) нейраминидаза (NA) и мембранные белки (М) - от дикого вируса птиц А/курица/Курган/02/05 (Н5N1);

3) Пандемический штамм А/Санкт-Петербург/2/2009(H1N1) pdm 09. Все вирусы получены из лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа.

Клеточные культуры. Репродукция вируса гриппа изучалась на культуре клеток эндотелия человека EAhy926, любезно предоставленной д-ром Корой Джин Эйджел из Отдела патологии университета Северной Каролины. Клеточную линию EAhy926 поддерживали в среде DMEM/F – 12 с Хепесом и L- глутамином, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров («Биолот», Санкт-Петербург). Для сравнения была взята культура клеток МDСК из коллекции клеточных культур НИИ гриппа, культивируемая по общепринятой методике. Заражение клеточного монослоя проводили путем адсорбции вируса при 37о С в атмосфере 5% СО2 (инкубатор фирмы SANYO, Япония) в поддерживающей среде DMEM, содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСК(«Sigma»,). Через час после адсорбции клетки отмывали и инкубировали в той же среде в течении 72 часов.

Инфекционную активность вируса гриппа в культуре клеток определяли титрованием вируссодержащего материала в суточной культуре EAhy926 и суточной культуре MDCK с коэффициентом разведения 10 и рассчитывали по методу Reed & Muench (1938). Инфекционную активность вирусов оценивали по ТЦД50 и в РГА с куриными эритроцитами по общепринятому методу через 72 часа после заражения.

Полимеразная цепная реакция. Выделение вирусной РНК проводили с использованием наборов для выделения нуклеиновых кислот РИБО-сорб ЦНИИ эпидемиологии, Москва, РФ (модификация метода Boom R. et al., 1990), согласно инструкции производителя. Синтез кДНК проводился с использованием двух праймеров: универсального для всех сегментов вируса гриппа А - 12-членного праймера, комплементарного 5’-концу вирионной РНК(IAUPF), и универсального для всех сегментов вируса РНК(IAUPR). ПЦР проводили на амплификаторе Rotor Gene 6000. Анализ данных проводили прямым сравнением значений Ct.

Электронно-микроскопический анализ клеточной культуры EAhy926, интактной и инфицированной вирусом гриппа А (доза заражения вирусом 0,01 ТЦД /кл, время репродукции вируса 24 часа), был выполнен на микроскопе JEM-1011.

Клетки фиксировали в 2% глютаральальдегиде на 0,1М какодилатном буфере (рН 7,4) в течение часа при комнатной температуре, постфиксировали в 1% четырехокиси осмия на том же буфере в аналогичных температурных условиях. Материал обезвоживали в этаноле восходящей концентрации и заключали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме LKB-100.

Иммуногистохимический анализ аутопсийного материала легких, мозга и сердца от пациентов, умерших в эпидемию 2009-2010гг., был предоставлен Ленинградским областным патологоанатомическим бюро г. Санкт-Петербурга. Анализировали ткани легких методом иммуногистохимии с моноклональными антителами (МКА) к гемагглютинину (НА) и нуклеопротеину (NP) вируса гриппа и выявляли их с помощью системы визуализации фирмы Novolink (Novocastra), включающей в себя реакцию с ДАБ-хромогеном.

МКА к HA вируса гриппа H1N1pdm09 и к NP белку вируса гриппа A были получены в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа. В качестве контроля был использован аутопсийный материал от пациентов, умерших с признаками прогрессирующей легочной дисфункции и явлениями острого респираторного дистресс-синдрома, не имевших диагноза « грипп».

Выделение белков вируса гриппа. Гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) выделяли из сконцентрированного и очищенного вируса гриппа. С этой целью вирусы ресуспендировали в Na-ацетатном буфере (50 mM ацетат Nа, 2 mM NaCl, 0,2 mM EDTA; pH 7,0) и разрушали 7% октилглюкозидом в течение 2 ч при С. Затем материал центрифугировали при 15000 об/мин в течение 1 ч (ротор Beckman SW50.1). К супернатанту, содержащему HA и NA, добавляли 2 %-ный водный раствор бромида цетримония (CTAB, Sigma) до конечной концентрации 0.1%. Образец наносили на анионообменную колонку (1x3 см; сорбент DEAE-Sephadex A-50; Pharmacia Fine Chemicals), предварительно уравновешенную стартовым буфером (50 mM Tris-HCl, 0.1% октилглюкозид; pH 7 для штамма A/курица/Курган/05/2005 и тот же буфер рН 7.5 для штамма A/Брисбейн/10/2007). NA элюировали 20 мл стартового буфера, HA мл элюирующего буфера (50 mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 7,5).

Каждую фракцию диализовали против буфера STE в течение 72 ч для удаления остатков октилглюкозида и Triton X-100. Контроль чистоты выделенного материала осуществлялся при помощи электрофореза в полиакриламидном геле по методу Лэммли с последующим анализом гелей на денситометре GS-800 (Bio-Rad Laboratories).

МТТ-тест. Метаболизм клеток эндотелия оценивали с помощью МТТ-теста на общую активность внутриклеточных дегидрогеназ, который широко используется для биохимической оценки выживаемости клеток в культуре [Mossman T.,1983]. Метод основан на восстановлении диметилтиазолил-дифенилбромид тетразолия митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами метаболически активных клеток.

Клетки EAhy926 вносили в 96 луночные планшеты в концентрации 32000кл/лунку в 100 мкл культуральной среды. На следующий день клетки либо заражали вирусами по общепринятой методике, либо обрабатывали поверхностными белками исследуемых вирусов в разной концентрации и с разным временем экспозиции.

После экспозиции клеток или с вирусом, или с белком культуральную среду удаляли, к клеткам добавляли раствор МТТ-реактива в бессывороточной культуральной среде в концентрации 5мг/мл и инкубировали 3 часа в СО2-инкубаторе. Затем раствор красителя сливали и заменяли на 960 спирт на 30 минут. Далее планшеты помешали в cпектрофотометр Thermofisher VarioScan и снимали показания при длине волны нм.

Иммуногистоцитохимическое определение активности каспазы-3. Суточный монослой клеток EAhy926 был выращен на предметных стеклах, предварительно покрытых полилизином. Затем клетки либо заражали вирусами по общепринятой методике, либо обрабатывали поверхностными белками исследуемых вирусов в разной концентрации и с разным временем экспозиции. Зараженные и контрольные клетки на предметных стеклах фиксировали смесью ацетон:этанол (1:1), после чего их обрабатывали с помощью набора для выявления МКА к каспазе-3 (фирма Novocastra). Визуализацию первичных антител проводили вторичными антителами, конъюгированными с полимером, сцепленным с пероксидазой (фирма Novolink). Далее следовала окраска ДАБ хромогеном и подкрашивание ядер гематоксилином Майера.

Оценка процессов апоптоза методом проточной цитометрии. 2 500 000 эндотелиальных клеток вносили в лунки 6-ти луночного планшета (Sarstedt,Австрия). Суточный монослой клеток либо заражали вирусами по общепринятой методике, либо обрабатывали поверхностными белками исследуемых вирусов в разной концентрации и с разным временем экспозиции, после чего производили дезинтеграцию монослоя в 0,02% растворе ЭДТА (Биолот,РФ) и переносили клеточную суспензию в микропробирки. Для определения количества клеток в состоянии и апоптоза использовали FITC Annexin V kit 1 (BD Biosciences, США). Аннексин V позволяет выявить экспрессию фосфатидилсерина на наружной поверхности мембраны и, таким образом отделить нормальные жизнеспособные клетки от апоптотических. Эндотелиальные клетки окрашивали аннексином V согласно инструкции производителя. Анализ образцов производили с помощью проточной цитометрии на приборе Epics XL (Becman Coulter, США), снабженном аргоновым лазером с длиной волны 488 нм. Опыт производили в трех повторностях, количество клеток в состоянии некроза и апоптоза выражали в процентах от общего количества анализируемых клеток.

Активность активатора плазминогена (t-PA) определяли по методу Кудряшова и сотр.(1974). Активность t-PA in vitro определяли в cуточном монослое клеток EAhy926, которые либо заражали вирусами по общепринятой методике, либо обрабатывали поверхностными белками исследуемых вирусов в разной концентрации и с разным временем экспозиции. Зараженные и контрольные клетки замораживали при С. После оттаивания суспензию наносили на стандартные фибриновые пластины (непрогретые и прогретые при 86о С в течение 30 мин). Далее пластины инкубировали при 37о С в течение 20-24 ч и регистрировали результаты по разнице площадей зон лизиса на непрогретых и прогретых пластинах. Разница площадей зон лизиса характеризует величину активности t-PA. Активность t-PA in vivo определяли в эуглобулиновой фракции плазмы крови белых беспородных крыс на стандартных фибриновых пластинах.

Поиск мимикрических последовательностей аминокислот в структуре вирусных белков и t-PA осуществляли с помощью компьютерных программ.

Статистическую обработку данных проводили с применением программного обеспечения Microsoft Exel.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Репродукция исследуемых штаммов вируса гриппа типа А в эндотелиальных клетках.

Инфекционная активность вируса гриппа типа А в культуре клеток EAhy926 Для оценки возможности репродукции вируса гриппа типа А (подтипов H3N2 H5N1 и H1N1pdm 09), культуру клеток эндотелия инфицировали вирусами в дозах 0,01 ТЦД50/кл, 0,001 ТЦД50/кл и 0,0001 ТЦД50/кл. Инфекционную активность вирусов оценивали по ТЦД50/мл и в реакции гемагглютинации (РГА) с куриными эритроцитами (таблица 1).

Как видно из таблицы 1, все исследуемые вирусы были способны репродуцироваться в клеточной культуре EAhy926. Так, через 24 часа после заражения, инфекционная активность вирусов A/Брисбейн/10/2007(H3N2) и Репродукция вируса гриппа А в клетках эндотелия EAhy926 и в МDСК.

МDСК МDСК

жения (ч).

A/Брисбейн/10/ (H3N2) A/Курган/5/05/NS1H5N1) (H1N1) pdm A/Курган/5/05/NS1-81/5:3 (H5N1) составляла 2,3 и 2,4 lg ТЦД50/мл соответственно. Инфекционный титр вируса A/Санкт-Петербург/2/2009 (H1N1) pdm 09 был несколько выше – 3,5 lg ТЦД50/мл. Титр вирусов в культуральной жидкости в РГА составлял 1/16 для вируса A/Курган/5/05/NS1-81/5 :3 (H5N1) и 1/32 для вирусов A/Брисбейн/10/2007(H3N2) и A/Санкт-Петербург/2/2009 (H1N1)pdm 09.

Через 48 часов после инфицирования клеток исследуемыми вирусами, их инфекционная активность возрастала на 0,5-1,0 lg ТЦД50/мл. Гемагглютинирующая активность вирусов также возрастала до 1/64-1/128. Культивирование вирусов гриппа в клетках эндотелия в течение 72 часов приводило к увеличению инфекционной активности вируса, приблизительно на 1 lg ТЦД50/мл, по сравнению с культивированием вируса в течение 24 часов и, приблизительно, на 0,5 lg ТЦД50/мл – в течении 48 часов.

Необходимо отметить, что инфекционный титр вируса в клетках эндотелия и титр их в РГА был ниже, чем в культуре клеток МDСК, которая является пермиссивной культурой для вируса гриппа (таблица 1). Так инфекционная активность всех трех исследуемых вирусов в клетках EAhy926 была на 1,5 – 2 lg ТЦД50/мл ниже, чем в клетках МDСК, а их гемагглютинирующая активность в 2 – 4 раза меньше чем в МDСК. Возможно, это объясняется особенностями физиологии эндотелиальных клеток.

Выявление РНК, исследуемых вирусов, в культуре клеток EAhy926. Для подтверждения возможности репродукции исследуемых вирусов в эндотелиальных клетках линии EAhy926 была проведена ОТ-ПЦР. Эндотелиальные клетки были инфицированы исследуемыми вирусами (заражающая доза 0,01ТЦД50/кл), и через 24 часа после заражения были разрушены замороживанием и оттаиванием. Постановка ПЦР в реальном времени подтвердила наличие синтеза и вирусной РНК (вРНК), и матричной РНК (мРНК) в эндотелиальных клетках, инфицированных вирусом гриппа человека и птиц.

Выявление вирусных частиц исследуемых штаммов вируса гриппа, в культуре клеток EAhy926 электронно – микроскопическим методом. Был также проведен электронно-микроскопический анализ культуральной среды инфицированных клеток. Культуральная среда отбиралась через 24 часа после инфицирования культуры клеток исследуемыми вирусами (заражающая доза 0,01ТЦД50/кл). На электронограмме были получены снимки полноценных вирусных частиц вируса гриппа A/СанктПетербург/2/2009 (H1N1) pdm09.Аналогичная картина была характерна для вирусов A/Брисбейн/10/2007(H3N2) и A/Курган/5/05/NS1-81/5:3 (H5N1).

Иммуногистоцитохимическое исследование аутопсийного материала от больных, умерших в эпидемию гриппа 2009-2010гг. Репродукция вируса гриппа типа А в клетках эндотелия кровеносных сосудов человека in vivo была зарегистрирована при исследовании аутопсийного материала легких, пациентов, умерших в эпидемию 2009гг. Исследование проводили иммуногистоцитохимически с помощью МКА к гемагглютинину(НА) и нуклеопротеину(NP) вируса гриппа типа А.

Рисунок 1. Иммуногистохимический анализ локализации HA и NP вируса гриппа А (H1N1) pdm 09 в аутопсийном материале легких пациентов.

а, b – интактные клетки; c – локализация НА в клетках: эндотелия сосудов, альвеолярного эпителия, тканевых макрофагах ;d – локализация NP в клетках эндотелия сосудов и в тканевых макрофагах. Обозначения: Э-эндотелий; А-альвеолярный эпителий; ТМ-тканевой макрофаг.Увеличение 100Х c иммерсией; окрашивание клеток ДАБ-хромагеном с последующей окраской гематоксилином Майера.

Как видно из рисунка 1(c), был выявлен НА вируса гриппа H1N1 pdm 09, который локализовался на плазматической мембране и в цитоплазме клеток эндотелия мелких кровеносных сосудов, клеток альвеолярного и бронхиолярного эпителия и внутри альвеолярных и тканевых макрофагов. Это видно по коричневому окрашиванию ДАБ-хромогена, которое отсутствует в интактных клетках. NP антиген этого вируса регистрировался в тех же клетках и тканях, что и НА, но был локализован в ядрах клеток, что отражает особенности репродукции вируса гриппа (рис.1d).

Таким образом, данные полученные вирусологическим, молекулярнобиологическим, электронно-микроскопическим и иммуногистохимическим методами, указывают на то, что исследуемые штаммы вируса гриппа типа А репродуцируются в клетках эндотелия человека как in vitro, так и in vivo.В связи с этим представляло интерес оценить возможные последствия репродукции вируса гриппа в клетках эндотелия.

Дисфункция клеток эндотелия при воздействии исследуемых вирусов гриппа и их поверхностных белков Электронно-микроскопический анализ морфологии клеточной культуры эндотелия, инфицированной вирусом гриппа типа А. При электронномикроскопическом анализе морфологии клеток, инфицированных исследуемыми штаммами вируса гриппа, отмечалось увеличение количества диктиосом и расширение цистерн аппарата Гольджи, а также увеличение количества цистерн шероховатого эндоплазматического ретикулюма. Кроме этого, в инфицированных клетках регистрировалось увеличение количества миелоидных телец. Все это указывает на изменение морфологии эндотелиальных клеток зараженных вирусом гриппа.

Изменение дыхательной активности клеток эндотелия при воздействии исследуемых вирусов гриппа. Дыхательную активность клеток эндотелия изучали по активности дегидрогеназ (митохондриальных и цитоплазматических) с помощью МТТ-теста. С этой целью клетки инфицировали вирусом гриппа и измеряли суммарную дегидрогеназную активность (ДГА) в период от 0 до 72 часов, при двух дозах заражения - 0,01ТЦД50/кл и 0,001ТЦД50/кл.

Рисунок 2. Изменение общей дегидрогеназной активности в культуре клеток EAhy926 при воздействии исследуемых вирусов гриппа типа А:

a – Доза заражения вирусами 0,01ТЦД50/кл; б - Доза заражения вирусами 0,001ТЦД50/кл Брисбейн – вирус гриппа А/Брисбейн/10/2007 (Н3N2); Курган – вирус гриппа А/курица/Курган/5/