На правах рукописи

Селиванова Мария Александровна

ВЛИЯНИЕ НА ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ БАКТЕРИИ БЕТА- И АЛЬФАИЗЛУЧАЮЩИХ РАДИОНУКЛИДОВ НА ПРИМЕРЕ

ТРИТИЯ И АМЕРИЦИЯ-241

03.01.02 – биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2013 2

Работа выполнена на кафедре биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный университет», г. Красноярск.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор Кудряшева Надежда Степановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Новиков Кирилл Николаевич, ведущий научный сотрудник лаборатории физико-химии биомембран Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова доктор химических наук, профессор Шишкина Людмила Николаевна, заведующая лабораторией физико-химических проблем радиобиологии и экологии Института биохимической физики им Н. М. Эмануэля РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук (ИБК РАН), г. Пущино.

Защита диссертации состоится «29» мая 2013 года в 13.30 час. на заседании диссертационного совета Д 002.039.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук по адресу: 119334, г. Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук.

Автореферат реферат разослан «» апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Мазалецкая Л.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы:

В настоящее время рост в окружающей среде радиоактивных загрязнений техногенного характера ставит перед исследователями задачу изучения воздействия низкодозового облучения на организмы, а также поиска новых методов мониторинга состояния окружающей среды.

Микроорганизмы являются простейшими и одновременно важнейшими компонентами биосферы, и их состояние может служить индикатором состояния экосистемы в целом. В данной работе в качестве биологической тестовой системы нами выбраны морские люминесцентные бактерии. Эти бактерии представляют собой удобные модельные объекты для изучения закономерностей воздействия радиоактивного излучения на организмы, так как интенсивность их свечения чрезвычайно чувствительна к присутствию экзогенных соединений. Именно поэтому биолюминесцентные системы уже более 40 лет используются в качестве биотестов для мониторинга токсичности различных сред [1] и механизмы их взаимодействия с экзогенными соединениями достаточно хорошо изучены [2]. Биолюминесцентные биотесты характеризуются высокой скоростью анализа (1-5 мин), чувствительностью и возможностью приборной регистрации параметра физиологической активности – интенсивности свечения. Кроме того, возможность использования биолюминесцентных систем различной сложности (биолюминесцентных бактерий и выделенных ферментов), позволяет сравнивать эффекты на клеточном и биохимическом уровнях.

Выбор объектов исследования (бета-излучающего радионуклида трития и альфа-излучающего радионуклида америция-241) связан с тем, что в последние годы наблюдается увеличение содержания данных радионуклидов в окружающей среде.

Тритий, бета-излучающий изотоп водорода, является одним из самых распространенных продуктов распада радиоизотопов, использующихся в ядерной промышленности. Тритий находится в окружающей среде в основном в виде тритиевой воды и обладает высокой проникающей способностью; его содержание в организмах пропорционально его концентрации в окружающей среде. По химическим свойствам тритий аналогичен стабильному изотопу водорода и способен замещать его в органических соединениях. Несмотря на то, что энергия бета-частиц трития мала и он считается одним из самых безопасных радиоизотопов, попадая в ткани, он создает значительную плотность ионизации среды. Положительно заряженный ион гелия-3, который (наряду с электроном) является продуктом радиоактивного распада трития, – чрезвычайно активная частица, способная акцептировать электрон из окружающей среды до завершения устойчивой электронной оболочки инертного газа, гелия. При этом в организме интенсифицируются процессы переноса заряда.

Благодаря низкой энергии бета-распада, тритий является удобным объектом для изучения защитных реакций организма в условиях низких и средних доз облучения. Понимание молекулярных механизмов активации и подавления физиологических функций организмов в таких условиях чрезвычайно актуально в настоящее время.

Америций-241, альфа-излучающий радионуклид, имеет техногенное происхождение и является одним из побочных продуктов ядерного производства. Известно, что до 20% общего содержания америция- связывается с биологическими тканями организмов [3].

Сравнение действия альфа- и бета-излучающих радиоизотопов на организмы в настоящее время является актуальным.

Цель исследования – изучение хронического воздействия радионуклидов трития и америция-241, характеризующихся соответственно бета- и альфа- распадом, на морские люминесцентные бактерии.

В работе поставлены следующие задачи:

1. Сравнение хронического воздействия альфа- и бета-излучающих радионуклидов на примере америция-241 и трития на кинетику биолюминесценции Photobacterium phosphoreum и выделенной ферментативной системы НАД(Ф)H:ФМН-оксидоредуктаза – люцифераза.

2. Оценка накопления радионуклидов клетками бактерий и молекулами ДНК.

3. Выявление роли пероксидных соединений в процессе воздействия радионуклидов на люминесцентные бактерии.

4. Изучение поврежденности клеток методом электронной микроскопии.

5. Изучение изменения структуры внутриклеточных компонентов при воздействии радионуклидов методом ИК-спектроскопии.

6. Сравнение воздействия радионуклидов америция-241 и трития на рост бактерий.

Научная новизна. На примере трития впервые исследовано воздействие растворов бета-излучающего радионуклида на биолюминесцентные системы:

интактные и лиофилизированные бактерии P.phosphoreum, а также на выделенную ферментативную систему сопряженных реакций. Показано, что реакция клеток светящихся бактерий на воздействие альфа- и бета-излучающих радионуклидов америция-241 и трития является схожей: кинетика люминесценции включает три последовательные стадии, а именно, отсутствие эффекта, активация и ингибирование свечения, которые можно интерпретировать как соответственно распознавание стресс-фактора, радиационный гормезис и подавление физиологической функции.

Отклик ферментативной системы на воздействие трития включает только один эффект – активацию либо ингибирование свечения (в зависимости от радиоактивности среды). Зависимость интенсивности биолюминесценции от радиоактивности тритиевой воды носит монотонный характер.

На примере америция-241 доказано участие пероксидных соединений в эффектах альфа-излучающих радионуклидов высокой удельной активности на биолюминесцентные тестовые системы.

В ИК-спектрах бактериальных клеток обнаружен сдвиг полосы амид-I клеточных белков на +6 см–1 при воздействии трития, что предполагает увеличение доли -структурированных белков в качестве защитной реакции бактерий на стрессовое воздействие. Не обнаружено достоверных сдвигов в ИК-спектрах при воздействии америция-241.

Определено накопление трития и америция-241 в клетках бактерий.

Визуализированы изменения бактериальных клеток при воздействии трития.

Показано, что присутствие америция-241 (0,37-6,67 кБк/л) в питательной среде вызывает подавление роста бактерий, в то время как тритий активирует бактериальный рост при удельных активностях 10-104 кБк/л и подавляет при удельных активностях, превышающих 105 кБк/л.

биолюминесцентные системы могут быть использованы в экологических исследованиях для мониторинга воздействия растворов радионуклидов на водные микроорганизмы при различных дозах хронического облучения.

Результаты работы могут являться основой для разработки биолюминесцентных методик мониторинга радиотоксичности изотопов, характеризующихся альфа- и бета-распадом, в растворах низкой и средней радиоактивности.

Времена начала активации и ингибирования бактериальной биолюминесценции предложены в качестве тестового параметра для оценки чувствительности бактерий к тритию.

Положения, выносимые на защиту:

1. Три последовательных стадии воздействия трития и америция-241 на кинетику люминесценции бактерий: отсутствие эффекта, активация и ингибирование люминесценции. Отсутствие этой последовательности в кинетике биолюминесценции ферментативной системы.

2. Участие пероксидных соединений в биологических эффектах альфаизлучающих радионуклидов высокой удельной радиоактивности в биолюминесцентных тестовых системах.

3. Сдвиг полосы амид-I клеточных белков в ИК-спектрах бактериальных клеток при воздействии трития, предполагающий увеличение доли -структурированных белков в качестве защитной реакции бактерий на стрессовое воздействие; отсутствие этой реакции при воздействии америция-241.

Апробация работы. Основные положения работы представлены на 15-ой, 16-ой и 17-ой Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008, 2009, 2010), 3-ей Российской школе по радиохимии и ядерным технологиям (Озерск, 2008), 5-ой молодежной научно-практической конференции «Ядерно-промышленный комплекс Урала:

проблемы и перспективы» (Озерск, 2009), Международной конференции «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды» (Сыктывкар, 2009), 6-ой Российской конференции по радиохимии «Радиохимия-2009» (Москва, 2009), 16-ом и 17-ом Международных симпозиумах по биолюминесценции и хемилюминесценции (Лион, Франция, 2010; Гелф, Канада, 2012), 10-ой Международной научнопрактической конференции «Интеллект и наука» (Железногорск, 2012), Практикуме по коммерциализации технологий в рамках программы "Фундаментальные исследования и высшее образование" (Владивосток, 2010), 14-ом и 15-ом Международном симпозиуме по биолюминесцентной спектрометрии (Прага, Чешская республика, 2010; Барселона, Испания, 2012), 5-ой Центрально-Европейской конференции «Химия в Биологии» (Примоштен, Хорватия, 2010), Международной конференции молодых ученых «Проблемы экологии» (Иркутск, 2010), 10-ой Конференции по радиационной физике и радиационной защите (Каир, Египет, 2010), Конференции «Спектроскопия в биологических науках 21 века» (Пекс, Венгрия, 2011), 37-ом Международном спектроскопическом коллоквиуме (Рио-де-Жанейро, Бразилия, 2011), 14-ом Международном конгрессе по радиационным исследованиям (Варшава, Польша, 2011), 6-ом Съезде Российского фотобиологического общества (пос.

Шепси, 2011), 34-ом Съезде европейского сообщества радиационных исследований (Виетри-суль-маре, Италия, 2012).

Работа выполнена при финансовой поддержке следующих фондов и организаций: Министерства образования и науки РФ, НОЦ «Енисей», 2007;

Сибирского федерального университета (молодежные инновационные проекты), 2007; фонда Бортника по программе УМНИК, 2008-2009; НОЦ «Поведение актинидов в окружающей среде» ГЕОХИ РАН, 2009; РФФИ (07а, 09-08-98002-р_сибирь_а, 10-05-01059-а), 2007-2009, 2009-2010, 2010-2012; Министерства образования и науки РФ (Государственные контракты № 14.740.11.0437 от 30.09.2010 и № 14.740.12.0866 от 22.04.2011 в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы), 2010, 2011.

Работа удостоена премии главы города Красноярска в 2012 году.

Личный вклад автора состоял в адаптации биолюминесцентных методик для исследования эффектов радионуклидов, проведении основных экспериментов, активном участии в обработке и обсуждении экспериментальных данных, подготовке публикаций. Основная часть результатов была получена в сотрудничестве с Бадуном Г.А., Бондаревой Л.Г., Дементьевым Д.В., Кузнецовым А.М., Выдряковой Г.А., Могильной О.А., Камневым А.А., Тарантилисом П.А., Полиссиу М.Г., Тугаровой А.В., Кудряшевым М.А. Вклад соавторов отражен в публикациях. Автор приносит благодарность всем коллегам за участие в совместных работах и обсуждении результатов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в журналах из перечня ВАК, 28 тезисов докладов, представленных на конференциях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, четырех глав с изложением результатов работы, выводов и списка литературы. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, проиллюстрирована рисунками и 1 таблицей. Библиография включает 180 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе диссертации рассмотрены предпосылки использования люминесцентных бактерий для изучения влияния радиоактивных элементов на организмы. Обсуждаются элементарные физико-химические процессы в биолюминесцентной реакции, механизмы действия экзогенных соединений на биолюминесцентные системы, использование биолюминесцентных систем для мониторинга химической токсичности. Приводится обзор литературы по природе радиоактивного излучения и оценке его воздействия на организмы.

Рассмотрены биологические эффекты ионизирующих излучений. Обоснованы преимущества использования биолюминесцентных систем различной сложности для изучения влияния на организмы радиоактивных элементов, характеризующихся альфа- и бета-распадом.

Вторая глава диссертации посвящена описанию материалов и методов исследования. В работе использовали интактные светящиеся бактерии Photobacterium phosphoreum 1883 IBSO из коллекции Института биофизики СО РАН (Красноярск); препарат Микробиотест 677F, изготовленный на основе лиофилизированных светящихся бактерий Р. phosphoreum 1883 IBSO.

Использован также Комплект Реактивов Аналитической Биолюминесценции (КРАБ), включающий лиофилизированные препараты люциферазы Photobacterium leiognathi (0,5 мг/мл) и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы из Vibrio fischeri (0,15 ед. активности). Перечисленные препараты произведены в Институте биофизики СО РАН.

В качестве источника радиации использовали тритиевую воду (НТО) и водный раствор 241Am(NO3)3. Препарат 241Am предоставлен лабораторией радиоэкологии ИБФ СО РАН (Красноярск), НТО – кафедрой радиохимии МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва). В биолюминесцентных бактериальных суспензиях и ферментативных растворах удельные радиоактивности 3H составляли 10 - 2·105 кБк/л, a 241Am 0,37 - 6,67 кБк/л.

Для определения роли активных форм кислорода (АФК) в воздействии радионуклидов на люминесцентные бактерии использовали НАДН (1,310-4M) в растворе калий-фосфатного буфера (0,05 M), водно-щелочной раствор люминола (10-4 M), водный раствор K3[Fe(CN)6] (10-3 M) и 3%-ый раствор H2O2.

Интактные бактерии выращивали в растворах радионуклидов, строили кривую их роста; пробы для измерения биолюминесценции отбирали на экспоненциальной и стационарной стадиях роста.

лиофилизированных бактерий, а также ферментативной системы, образцы помещали в микропланшеты (Microplate) и через определенные промежутки времени измеряли интенсивность свечения с помощью прибора “TriStar Multimode Microplate Reader LB 941” (Berthold Technologies, Германия).

Регистрировали интенсивность свечения контрольных (Icontr) и радиоактивных (Irad) образцов.

Для оценки влияния радионуклидов на биолюминесцентные системы использовали величину относительной интенсивности свечения Irel:

Вычисляли среднее значение величины Irel. Ошибка определения Irel не превышала 15%. Далее строили зависимости Irel от времени воздействия радионуклида.

Для регистрации спектра биолюминесценции бактерий P. phosphoreum использовали спектрофлуориметр Fluorolog 3-22 (Horiba Jobin Yvon, Франция) с функцией счета единичных фотонов.

Для определения роли АФК в эффектах радионуклидов изучали действие Am и 3H на растворы эндогенного восстановителя НАДН и действие пероксида водорода на биолюминесцентные системы. Концентрацию пероксида водорода в растворах определяли с помощью хемилюминесцентного люминольного метода с использованием K3[Fe(CN)6] в качестве катализатора.

Клетки разделяли на фракции (клеточную и внеклеточную) с помощью центрифугирования. Затем, измеряя радиоактивность каждой фракции, определяли процентное содержание 241Am и 3H в клеточной и внеклеточной фракциях. При этом за 100% принимали общее содержание радионуклидов в культуре.

Выделяли ДНК из рабочих образцов; концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически.

Радиоактивность 3H в растворах бактерий и в образцах ДНК измеряли методом жидкостной сцинтилляционной спектрометрии с помощью “TriCarbTR” (Canberra Packard, США) с использованием программного обеспечения "RadSpectraDec". Радиоактивность растворов 241Am определяли с помощью гамма-счетчика Wallac Wizard 1480 (PerkinElmer, Finland).

Образцы сухой биомассы бактерий, отмытых от среды и радионуклидов, осажденных и высушенных под вакуумом, исследовали с помощью ИК-фурьеспектроскопии в режиме диффузного отражения (ИКФС-ДО).

Третья глава посвящена экспериментальному исследованию влияния 3H и 241Am на биолюминесценцию бактерий и ферментативной системы.

Исследовано воздействие НТО различных удельных активностей на люминесценцию интактных и лиофилизированных бактерий.

На рис. 1 в качестве примера приведены кинетические кривые люминесценции интактных бактерий, выращенных в присутствии и отсутствии НТО.

Выходы квантов люминесценции интактных бактерий, рассчитанные по площади под кинетическими кривыми, практически не отличались от контроля при всех радиоактивностях трития (0,01 - 103 МБк/л).

Аналогичные изменения кинетики биолюминесценции в присутствии трития наблюдали и для лиофилизированных бактерий. Выходы квантов люминесценции лиофилизированных бактерий в аналогичных условиях увеличились примерно в 1,5 раз по сравнению с контролем.

На рис. 2 приведены зависимости относительной интенсивности свечения, Irel, от времени для интактных бактерий, отобранных на экспоненциальной стадии роста (5 ч) (А) и лиофилизированных бактерий (Б) в НТО удельной радиоактивности 2,0 МБк/л. Аналогичные кривые получены и для других удельных радиоактивностей НTO, а также интактных бактерий, отобранных на стационарной стадии роста.

Не обнаружено зависимостей интенсивности биолюминесценции от удельной радиоактивности растворов как на стадии активации, так и на стадии ингибирования.

Рис. 2. – Зависимость интенсивности биолюминесценции, I, интактных (А) и лиофилизированных (Б) бактерий от времени воздействия НТО, А=2,0 МБк/л.

Из сопоставления данных рисунков 2А и 2Б видно, что в кинетике свечения бактерий наблюдаются три последовательных стадии: (1) отсутствие эффекта, (2) активация биолюминесценции, (3) ингибирование биолюминесценции.

Активация и ингибирование люминесценции интактных бактерий начинается позже, чем лиофилизированных (около 20 и 59 часов (рис. 2А) по сравнению с 6 и 29 часами (рис. 2Б) соответственно). Причиной этого может быть то, что препарат лиофилизированных бактерий включает значительное количество поврежденных клеток [4]. Повреждения, вероятно, делают бактерии более чувствительными к излучению и поэтому ускоряют их отклик на воздействие НТО. Времена начала активации и ингибирования биолюминесценции (Та и Ти, рис. 2А, 2В) могут быть выбраны в качестве параметров для сравнения чувствительности различных видов светящихся бактерий к радиоактивному воздействию. Для оценки чувствительности к радиации других организмов могут быть также использованы параметры, аналогичные Та и Ти бактерий.

Стадия активации свечения на рис. 2А и 2Б может быть приписана феномену радиационного гормезиса. Активация жизненных функций при воздействии низких концентраций токсичных веществ, низких доз радиации и других стресс-факторов – широко известное общее свойство живых организмов. Примером гормезиса может служить неспецифический адаптивный синдром у растений [5] и стрессовая реакция у животных [6].

Вероятно, в условиях наших экспериментов молекулы HTO способны легко проникать через клеточную мембрану бактерий; продукты радиоактивного распада 3H (электроны и катионы гелия-3), могут воздействовать на клеточные структуры (начиная от наружной мембраны и заканчивая ферментами и их субстратами внутри клеток), ускоряя внутриклеточные процессы, связанные с переносом заряда [7]. Те же воздействия, но при больших временах, ингибируют люминесцентную функцию бактерий.

Исследовано влияние HTO на биолюминесценцию выделенной ферментативной системы сопряженных реакций: НАД(Ф)Н:ФМНоксидоредуктаза – люцифераза, которая рассматривается в качестве упрощенной модели люминесцентной функции бактерий [8]. Кинетические кривые биолюминесценции ферментативной системы в НТО различной радиоактивности приведены на рисунке 3А. Данные этого рисунка использовали для построения зависимости интенсивности свечения ферментативной системы от удельной радиоактивности НТО (рис. 3Б).

Время отбора проб (18 мин) для построения этого графика указано стрелкой на рисунке 3А. Из рис. 3Б видно, что существует монотонная зависимость интенсивности биолюминесценции ферментативной системы от радиоактивности НТО. Радиоактивность НТО, равная 10 МБк/л, является переходной между активацией и ингибированием биолюминесценции (рис. 3, А, Б). Для различных времён отбора проб эта переходная величина варьировалась в наших экспериментах в интервале 2-10 МБк/л.

Рис.3. – Зависимость интенсивности биолюминесценции ферментативной системы, (А) от времени воздействия НТО, (Б) от радиоактивности НТО. Радиоактивность растворов на рис. А: 1 - 0,0002; 2 - 0,002; 3 - 0,02; 4 - 0,2; 5 - 2; 6 - 10; 7 - 20; 8 - 50; 9 - 100 МБк/л. Время отбора проб для данных на рис. Б равно 18 мин.

Анализ спектров биолюминесценции в НТО (11 МБк/л) показал, что присутствие трития не влияет на форму спектра. Это указывает на то, что активация и ингибирование биолюминесценции тритием связаны с его воздействием на стадиях, предшествующих образованию электронновозбужденных состояний эмиттера биолюминесценции.

Исследовано воздействие растворов альфа-излучающего радионуклида Am различных удельных радиоактивностей на люминесценцию интактных и лиофилизированных бактерий.

Все три стадии в кинетике биолюминесценции, обнаруженные в НТО (рис. 2А), прослеживаются и в растворах 241Am (рис. 4). Однако, длительность первой и второй стадий (отсутствия эффекта и активации) в присутствии Am меньше, что может быть связано с более высокой поражающей способностью его излучения.

Таким образом, не обнаружено монотонных зависимостей интенсивности биолюминесценции бактерий от времени воздействия 3H и 241Am, что является демонстрацией нелинейности зависимости доза-эффект при воздействии малых и средних доз радиации [9]. Кинетика биолюминесценции бактерий в присутствии 3H и 241Am включает три последовательные стадии, а именно, отсутствие эффекта, активацию и ингибирование свечения, которые можно интерпретировать как соответственно распознавание стресс-фактора, радиационный гормезис и подавление физиологической функции.

В четвертой главе изучено накопление 3H и 241Am клетками бактерий, отобранными на двух стадиях роста – экспоненциальной и стационарной.

Показано, что в бактериях, отобранных на экспоненциальной стадии роста, содержание 3H составляет не более 10%, а на стационарной – не более 25% от общего его содержания в растворе. Не обнаружено зависимости доли накопленного трития от общего его содержания в растворе.

Обнаружено, что во всех образцах с 241Am бактерии, отобранные на стационарной стадии роста, накапливают 60-70% от общего его содержания в растворе. Так же, как и в случае с тритием, не обнаружено зависимости доли накопленного 241Am от общего его содержания в растворе.

Значительное накопление 241Am связано с его способностью связываться с органическими веществами [10], концентрироваться на поверхности клеток и проникать через клеточную мембрану с участием специфичных клеточных белков – сидерофоров [11].

С учетом 20%-ного накопления 3Н клетками бактерий, доза, накопленная интактными бактериями к моменту начала активации (24 часа, рис. 2А), приблизительно равна 0,01 Гр, а к моменту начала ингибирования (60 часов) – 0,03 Гр в расчете на 1 кг биомассы бактерий. Расчет был проведен для максимальной используемой радиоактивности трития, А = 200 МБк/л.

С учетом 60%-ного накопления 241Am клетками бактерий, доза, накопленная интактными бактериями к моменту начала активации (7 часов, рис. 4), приблизительно равна 0,007 Гр, а к моменту начала ингибирования ( часов) – 0,02 Гр в расчете на 1 кг биомассы бактерий. Расчет был проведен для максимальной используемой радиоактивности америция, А = 6,67 кБк/л.

Приведенные расчеты указывают на то, что накопленные бактериями дозы классифицируются как малые [12].

Проанализировано содержание 3H и 241Am в ДНК бактерий.

Электрофоретическая диаграмма ДНК всех образцов не выявила видимых изменений, что указывает на отсутствие заметных деструктивных повреждений ДНК в условиях наших экспериментов. Радиоактивность (1,7 мБк/мкг) была обнаружена только в ДНК, выделенной из образца с максимальной удельной активностью 241Am (6,67 кБк/л). Ни в одном из образцов ДНК, выделенных из бактерий с тритием, радиоактивность не обнаружена.

Пятая глава посвящена выявлению возможных механизмов влияния радионуклидов на биолюминесцентные бактерии.

Исследована роль активных форм кислорода в эффектах радионуклидов на бактериальную биолюминесценцию.

Хемилюминесцентным люминольным методом определено содержание пероксидных соединений в растворах Am(NO3)3 и в НТО. На рис. представлены зависимости концентрации пероксидных соединений от удельной радиоактивности растворов данных нуклидов.

Из рис. 5А видно, что присутствие 241Am в растворах значительно увеличивает содержание пероксидных соединений по сравнению с фоновым значением. Этот результат предполагает, что действие радионуклидов, характеризующихся альфа-распадом, на биолюминесцентные системы может быть связано с формированием в водной среде пероксидных соединений в качестве вторичных продуктов радиоактивного распада.

С, мМ 0, 0, 0, Рис. 5. – Зависимость концентрации, С, пероксидных соединений от удельной радиоактивности, А, (А) раствора Am(NO3)3, (Б) НТО.

Из рис. 5Б видно, что изменение радиоактивности НТО не влияет на содержание пероксидных соединений. Этот результат показывает, что вклад в изменение интенсивности биолюминесценции (рис.2) могут вносить и другие процессы, не связанные с пероксидными соединениями, но, вероятно, имеющие отношение к ионизации среды.

Исследовано действие радионуклидов 241Am и 3H на компонент биолюминесцентной реакции – эндогенный восстановитель НАДН (табл.1).

Установлено, что присутствие 241Am в растворе увеличивает скорость окисления НАДН по сравнению с контрольным образцом. Это может быть результатом накопления в растворе пероксидных соединений, обладающих окислительными свойствами. Присутствие трития не приводит к изменению скорости окисления НАДН по сравнению с контрольным образцом (табл.1).

Скорости окисления НАДН (V) в присутствии радионуклидов 241Am и 3Н разной удельной радиоактивности (А). СНАДH = 1,310–4 М. Длина волны регистрации 340 нм.

Ошибка определения V равна 10-8 М/мин.

контроль А(241Am)=0,3 кБк/л А(241Am)=6 кБк/л А(3Н)= 6 кБк/л А(3Н)= 600 кБк/л Таким образом, увеличение скорости расходования эндогенного восстановителя НАДН, компонента биолюминесцентной реакции, в присутствии 241Am может вносить вклад в ингибирование биолюминесценции.

Ингибирование биолюминесценции тритиевой водой не связано аналогичным образом с изменением концентрации НАДН.

Проведено исследование действия H2O2 как модельного источника пероксидных соединений на три биолюминесцентные системы: интактные и лиофилизированные бактерии P. phosphoreum и биолюминесцентную биферментную систему НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаза – люцифераза.

Получены зависимости интенсивности свечения бактерий от времени их инкубирования с H2O2 (рис. 6А). Из этого рисунка видно, что на начальной стадии (до 5 часов) наблюдали активацию свечения бактерий, а при больших временах – его ингибирование по сравнению с контрольным образцом.

Варьировали концентрацию H2O2 в растворе. Зависимость интенсивности свечения бактерий от концентрации H2O2 при времени регистрации 1 час представлена на рис. 6Б. Малые концентрации (210-7 – 10-4 М) пероксида водорода активировали свечение бактерий, а большие (более 510-4 М) – ингибировали его.

Рис. 6. – Зависимость интенсивности биолюминесценции, I, интактных бактерий (А) от времени воздействия H2O2 (C=310-6 М), (Б) от концентрации H2O2.

биолюминесцентных систем – лиофилизированных бактерий и ферментативной системы.

Таким образом, продемонстрировано сходство во влиянии 241Am и H2O на биолюминесцентные системы: при начальных временах воздействия 241Am и малых концентрациях H2O2 наблюдается активация люминесценции систем;

избыток америция приводит к ингибированию люминесценции, аналогично увеличению концентрации H2O2.

Активация биолюминесценции пероксидными соединениями связана, вероятно, с увеличением скорости образования интермедиата биолюминесцентной реакции (пероксихемиацеталя) в случае ферментативной системы, а также с увеличением скоростей окислительных процессов в бактериях под действием более сильного окислителя, чем кислород воздуха.

В химических процессах, сопровождающих распад трития, важную роль, вероятно, играет увеличение эффективности переноса заряда. Результатом этого может являться увеличение или уменьшение скоростей биохимических процессов.

С помощью ИК-фурье-спектроскопии сухой биомассы бактерий, подвергшихся воздействию радионуклидов, проведена оценка возможных изменений в химическом и фазовом состоянии внутриклеточных макрокомпонентов. Исследованы образцы бактерий, выращенных в присутствии 3H (11 МБк/л) или 241Am (2 кБк/л) (рис.7); проведено сравнение с нерадиоактивным (контрольным) образцом.

Известно, что типичный ИК-спектр диффузного отражения P. phosphoreum в средней ИК-области состоит из нескольких полос, характерных для основных клеточных компонентов грамотрицательных бактерий [13, 14].

В нашем эксперименте мы не наблюдали изменения интенсивности поглощения плеча ~1740 см-1 (валентные колебания C=O полиэфирного фрагмента) в присутствии 3H и 241Am (рис. 7 A,Б) ни в одном из образцов, что свидетельствует о неизменном и относительно невысоком содержании содержания поли-3-гидроксибутирата (ПГБ) [14] при воздействии радионуклидов на бактериальные клетки.

Анализ ИК-спектров диффузного отражения образцов сухой биомассы бактерий, отобранных на экспоненциальной стадии роста (5-часовая культура), показал, что при воздействии 3H наблюдается сдвиг максимума полосы амид-I белков клетки (1674 см-1) на +6 см–1 (рис. 7А), что предполагает увеличение доли -структурированных белков (т.е. -антипараллельных слоев и/или складок, характеризующихся максимумом поглощения в области 1680 см-1 [13]) в качестве защитной реакции клеток на стресс, вызванный излучением трития.

Аналогичная реакция на стрессы наблюдалась ранее для других бактерий [12].

Рис. 7. – ИК спектры диффузного отражения сухой биомассы клеток P.phosphoreum контрольного образца (контроль); клеток, выращенных в питательной среде (А) с 3Н (11 МБк/л, 5-часовая культура); (Б) с 241Am (2 кБк/л, 20-часовая культура).

Не обнаружено изменений (по сравнению с нерадиоактивным контролем) в бактериях, выращенных в НТО и отобранных на стационарной стадии роста (20-часовая культура) (данные не приведены на рисунке). Вероятно, это связано с большей дозой излучения, накопленной бактериями на стационарной стадии роста, подавляющей защитную реакцию клеток. Возможно также, что клетки на стационарной стадии роста становятся менее чувствительными к внешнему воздействию из-за замедления метаболизма по сравнению с активным ростом на экспоненциальной стадии.

ИК-спектры бактерий в режиме диффузного отражения в присутствии Am оказались сходными для всех исследованных образцов, независимо от времени отбора проб. В качестве примера на рис. 6Б приведены спектры контрольного образца и образца, выращенного в присутствии 241Am удельной радиоактивности 2 кБк/л (20-часовая культура P. phosphoreum). Имеющиеся сдвиги на 3–4 см-1 в максимуме полосы амид-I недостаточно велики, чтобы быть надежно интерпретированными как конкретный метаболический ответ.

Таким образом, показано, что 241Am не оказывает выраженного влияния на метаболические реакции с участием заметных методом ИКФС-ДО структурных и/или количественных изменений клеточных макрокомпонентов.

Это означает, вероятно, что 241Am, альфа-излучающий радионуклид высокой удельной активности, в значительно меньшей степени стимулирует защитную реакцию клеток, чем тритий, и может влиять на интенсивность свечения в основном на стадии ферментативного биолюминесцентного процесса.

Проведены электронно-микроскопические исследования 25-часовой бактериальной культуры P. phosphoreum. В отличие от контрольного образца (рис. 8А), клетки, выращенные в присутствии НТО (100 МБк/л), имели бациллярную форму (рис. 8Б), часто с явными признаками лизиса (рис. 8В).

Цитоплазматическая мембрана у многих клеток разорвана, могут быть разрывы и в клеточной стенке (стрелка на рис. 8Б). Нуклеоид конденсирован и располагается у полюсов клетки или распадается на отдельные электронноплотные участки, локализованные по периферии клетки (светлые звездочки на рисунках Б, В). У клеток с признаками лизиса просветленная цитоплазма, что свидетельствует о распаде ее содержимого.

Таким образом, результаты микроскопических исследований демонстрируют значительные изменения в ультраструктуре клеток под действием HTO. Аналогичные изменения клеточных структур наблюдали ранее при воздействии 241Am [15].

Рис.8. – Клетки Р. phosphoreum: (А) - контрольный образец, (Б), (В) - образцы, подвергшиеся воздействию 3H, А = 100 МБк/л.

Шестая глава посвящена изучению воздействия радионуклидов на рост бактерий P. phosphoreum. На рис. 9 приведены кривые роста бактерий в питательной среде с НТО различной удельной радиоактивности. Из рисунка видно, что присутствие НТО может либо увеличивать, либо уменьшать скорости роста бактерий.

Рис. 10 демонстрирует зависимость относительного количества бактерий, N, от удельной радиоактивности 3H и 241Am в питательной среде. Время отбора суспензий – 22 часа.

Рис. 10. – Зависимость количества бактерий, Nrel, от удельной радиоактивности 3H (А) и 241Am (Б), А.

В присутствии 3H (рис. 10А) наблюдается интенсификация роста при удельных радиоактивностях 0,02-10 МБк/л и подавление роста при удельных радиоактивностях свыше 100 МБк/л.

Из рис. 10Б видно, что воздействие 241Am (0,37-6,67 кБк/л) подавляет рост бактерий.

ВЫВОДЫ

1. В кинетике биолюминесценции лиофилизированных и интактных бактерий в присутствии альфа- и бета-излучающих радионуклидов америция-241 и трития обнаружены три последовательные стадии: отсутствие эффекта, активация и ингибирование свечения, которые можно интерпретировать как соответственно распознавание стресс-фактора, радиационный гормезис и подавление физиологической функции бактерий.

2. В кинетике биолюминесценции ферментативной системы не обнаружено вышеуказанной последовательности трех стадий; найдена монотонная зависимость интенсивности биолюминесценции ферментативной системы от радиоактивности НТО: при А < 10 МБк/л наблюдали активацию, а при А > 10 МБк/л – ингибирование свечения.

3. Продемонстрировано участие пероксидных соединений в процессах воздействия америция-241 на биолюминесцентные тестовые системы на основе:

(а) увеличения содержания пероксидов в растворах в присутствии америция-241, (б) уменьшения концентрации эндогенного восстановителя НАДН в присутствии америция-241, (в) сходства зависимостей интенсивности свечения биолюминесцентных систем от концентрации пероксида водорода и от времени воздействия америция-241.

4. Сдвиг полосы амид-I клеточных белков в ИК-спектрах бактериальных клеток, подвергшихся воздействию трития и отобранных на экспоненциальной стадии роста, предполагают увеличение доли -структурированных белков в качестве защитной реакции на стрессовое воздействие. Не обнаружено сдвигов в ИК-спектрах при воздействии америция-241, а также трития для бактерий, отобранных на стационарной стадии роста, что, вероятно, связано с большей дозой облучения клеток и/или с пониженной чувствительностью клеток на стационарной стадии роста.

Методом электронной микроскопии продемонстрированы значительные изменения в ультраструктуре бактериальных клеток под действием HTO (А=100 МБк/л).

6. Присутствие америция-241 (0,37-6,67 кБк/л) в питательной среде вызывает подавление роста бактерий, в то время как тритий интенсифицирует бактериальный рост при удельных радиоактивностях 10-104 кБк/л и подавляет его при удельных радиоактивностях, превышающих 105 кБк/л.

7. Показана принципиальная возможность использования биолюминесцентных систем для мониторинга загрязнения среды тритием.

Времена начала активации и ингибирования биолюминесценции предложены в качестве тестовых параметров для оценки чувствительности различных бактерий к тритию.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в реферируемых журналах:

1. Rozhko T.V., Kudryasheva N.S., Aleksandrova M.A. (Selivanova М.А.), Bondareva L.G., Bolsunovsky A.A., Vydryakova G.V. Comparison of Effects of Uranium and Americium on Bioluminescent Bacteria // Journal of Siberian Federal University:

Biology. 2008. V.1. N.1. P.60-64.

2.Александрова М.А. (Селиванова М.А.), Рожко Т.В., Бадун Г.А., Бондарева Л.Г., Выдрякова Г.А., Кудряшева Н.С. Влияние трития на люминесцентные бактерии // Радиационная биология. Радиоэкология. 2010. Т.50. №5. C.613-618.

3.Alexandrova M. (Selivanova М.), Rozhko T., Vydryakova G., Kudryasheva N.

Effect оf Americium-241 оn Luminous Bacteria. Role оf Peroxides // Journal of Environmental Radioactivity. 2011. V.102. P. 407-411.

4.Kamnev A.A., Tugarova A.V., Selivanova M.A., Tarantilis P.A., Polissiou M.G., Kudryasheva N.S. Effects of americium-241 and humic substances on Photobacterium phosphoreum: bioluminescence and diffuse reflectance FTIR spectroscopic studies // Spectrochim. Acta Part A: Mol. Biomol. Spectrosc. 2013. V.100. P.171-175.

5. Selivanova M., Mogilnaya O., Badun G., Vydryakova G., Kuznetsov A., Kudryasheva N. Effect of tritium on luminous marine bacteria and enzyme reactions // Journal of Environmental Radioactivity. 2013. V.120. P.19-25.

Тезисы докладов наиболее значимых конференций:

1. Alexandrova M.A. (Selivanova М.A.), Kudryasheva N.S., Rojko T.V., Bondareva L.G., Bolsunovsky A.Ya. Application of bioluminescent assay systems for study detoxification of radionuclide solutions of low activity // XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Москва, 2007. С.2463.

2.Rozhko T.V. Aleksandrova M.A. (Selivanova М.А.) Bioluminescence monitoring: detoxification of alpha-radioactive solutions by humic substances // Luminescence, 2008. V. 23 (2). P.90.

3.Alexandrova M.A. (Selivanova М.А.), Bondareva L.G., Bolsunovsky A.Y.

Comparison of effects of uranium and americium on bioluminescent bacteria // Luminescence, 2008. V. 23(2). P. 59.

4.Alexandrova M. (Selivanova М.А.), Kudryasheva N., Fedorova E., Rozhko T., Mogil’naya O., Vydryakova G., Bondareva L., Stom D. Bioluminescent monitoring of detoxification processes // Proceeding of the 14th international meeting of the international humic substances society, Moscow-Saint Petersburg, 2008. P.261-264.

5.Александрова М.А. (Селиванова М.А.), Бадун Г.А., Бондарева Л.Г., Выдрякова Г.А., Кудряшева Н.С., Рожко Т.В. Изучение влияния тритий содержащих соединений на люминесцентные бактерии Photobacterium Phosphoreum // Тезисы докладов Пятой молодежной научно-практической конференции «Ядернопромышленный комплекс Урала: проблемы и перспективы», Озерск, 2009. С.104.

6.Александрова М.А. (Селиванова М.А.), Бадун Г.А., Бондарева Л.Г., Выдрякова Г.А., Кудряшева Н.С. Воздействие тритий-содержащих соединений на рост и свечение морских бактерий // Материалы международной конференции «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды», Сыктывкар, 2009. С. 303-305.

7.Kudryasheva N.S., Aleksandrova M.A. (Selivanova М.А.), Rozhko T.V.

Regularities of influence of alpha- and beta-radionuclides on bacterial assay systems // Материалы международной конференции «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды», Сыктывкар, 2009. С.

333-335.

8.Александрова М.А. (Селиванова М.А.), Бадун Г.А., Бондарева Л.Г., Выдрякова Г.А., Кудряшева Н.С. Воздействие трития на люминесцентные бактерии // Тезисы докладов Шестой Российской конференции по радиохимии. «РадиохимияМосква, 2009. С. 336.

9.Alexandrova M. (Selivanova М.), Rozhko T., Badun G., Bondareva L., Vydryakova G., Bolsunovsky A., Kudryasheva N.Effect of tritium on growth and luminescence of P. phosporeum // Luminescence, 2010. V.25. N.2(6). P. 125-126.

10.Alexandrova M. (Selivanova М.), Rozhko T., Kudryasheva N., Vydryakova G., Bolsunovsky A. Effect of Americium-241 on luminous bacteria // Luminescence, 2010.

V.25. N.3(7). P. 241-242.

11.Alexandrova M.A. (Selivanova М.А.), Badun G.A., Vydryakova G.A., Kudryasheva N.S. Effect of radionuclides on luminous bacteria // Book of abstracts of the 5th Central European Conference - Chemistry towards Biology, Croatia, 2010. P. 60.

12.Kudryasheva N.S, Alexandrova M.A. (Selivanova М.А.), Rozhko T.V., Badun G.A. Effects of ionizing radiation on bacteria cells // Abstracts of 14th International Congress of Radiation Research, Warsaw, Poland, 2011. P.1.

13.Кудряшева Н.С., Александрова М.А. (Селиванова М.А.), Рожко Т.В., Архипова В.В. Использование биолюминесценции для изучения влияния ионизирующего излучения на организмы // Материалы VI Съезда Российского фотобиологического общества, пос. Шепси, 2011. C.120.

14.Kamnev A.A, Tugarova A.V., Alexandrova M.A. (Selivanova М.А.), Tarantilis P.A., Polissiou M.G., Kudryasheva N.S. Effects of tritium and humic substances on cells of Photobacterium phosphoreum: bioluminescence and FTIR spectroscopic studies // Spectroscopy in the Biological Sciences of the XXI Century. Intracellular Fluorescence Spectroscopy, Pcs, Hungary, 2011. P.35.

15.Kamnev A.A., Tugarova A.V., Alexandrova M.A., Tarantilis P.A., Polissiou M.G., Kudryasheva N.S. Effects of - and -emitting radionuclides on Photobacterium phosphoreum: bioluminescence and diffuse reflectance FTIR spectroscopic studies // Colloquium Spectroscopicum Internationale XXXVII, Buzios, Rio de Janeiro, Brazil, Aug.

28 – Sept. 02, 2011. Proceedings (CD). – Buzios, Rio de Janeiro, Brazil, 2011. – Abstr.

MO42.

16.Kudryasheva N., Selivanova M., Rozhko T. Bioluminescence as a Tool for study Biological Effects of Radionuclides // Abstracts of XV-th International Symposium on Luminescence Spectrometry, Barcelona. Spain, 2012. P.31.

17.Selivanova M., Badun G., Kudryasheva N. Effect of tritium on bioluminescent systems // Luminescence, 2012. V.27 (2). P.95.

18.Selivanova M., Kudryasheva N. Irradiation of luminous marine bacteria by tritium //

Abstract

book of 39th Annual Meeting of the European Radiation Research Society, Italy, 2012. P.159.

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Girotti S., Ferri E.N., Fumo M.G. et al. Monitoring of environmental pollutants by bioluminescent bacteria // Anal.Chim.Acta. 2008. V.608. N.1. Р.2-29.

2. Kudryasheva N. S. Bioluminescence and exogenous compounds. Physicochemical basis for bioluminescent assay // J.Photochem.Photobiol B. 2006. V.83. N.1.

P.77-86.

3. Bolsunovsky A., Zotina T., Bondareva L. Accumulation and release of 241Am by a macrophyte of the Yenisei River (Elodea canadensis // J. Environ. Radioactivity. 2005.

V.81. P.33-46.

4. Medvedeva S.E. Transfer of xenobiotics through cell membranes of luminous bacteria // Luminescence. 1999. V.14. N.5. P.267-270.

5. Пахомова В.М. Основные положения современной теории стресса и неспецифический адаптационный синдром у растений // Цитология. 1995. Т.37. №1.

С. 66-91.

6. Selye H. Changing distress into eustress: Hans Selye voices theories on stress // Tex. Med. 1980. V.76. P.78-80.

7. Albers R.W. Biochemical Aspects of Active Transport // Biochemistry. 1967.

V.36. P.727-756.

Абакумова В.В., Кратасюк В.А. Гелевая модель функционирования люциферазы в клетке// Биохимия. 1994. Т.59. №7. С.1020- 9. Кудряшов Ю.Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения) / Под ред. В.К. Мазурика, М.Ф. Ломанова. М.: Физматлит, 2004. 448 с.

10. Choppin G.R. Structure and Thermodynamics of Lanthanide and Actinide Complexes in Solution // Pure Appl. Chem. 1971. V.27. P.23.

11. Choppin G.R., Labonne-Wal N. Comparison of two models for metal-humic interactions // J. Radioanal. Nucl. Chem. 1997. V.221, N.1. Р.67-80.

12. Котеров А.Н. Малые дозы и малые мощности доз ионизирующей радиации:

регламентация диапазонов, критерии их формирования и реалии ХХI века // Медицинская радиология и радиационная безопасность. 2009.№3. С.5-26.

13. Kamnev A.A., Sadovnikova J.N., Tarantilis P.A. et al. Responses of Azospirillum brasilense to nitrogen deficiency and to wheat lectin: a diffuse reflectance infrared Fourier transform (DRIFT) spectroscopic study // Microb. Ecol. 2008. V.56, N.4. P.615-624.

14. Kamnev A.A., Tugarova A.V., Tarantilis P.A. et al. Comparing poly-3hydroxybutyrate accumulation in Azospirillum brasilense strains Sp7 and Sp245: The effects of copper(II) // Appl. Soil Ecol. 2012. V.61. P.213-216.

15. Rozhko T.V., Bondareva L.G., Mogilnaya O.A. et al. Detoxification of Am- Solutions by Humic Substances: Bioluminescent Monitoring // Anal.Bioanal.Chem. 2011.

V.400. P.329-334.