На правах рукописи

ШЕВЦОВ Максим Алексеевич

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОГО

БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА HSP70 В ТЕРАПИИ

ОПУХОЛЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА

03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2013 г.

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук Научные руководители: доктор биологических наук Борис Александрович Маргулис Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург доктор медицинских наук, профессор Вильям Арамович Хачатрян ФГБУ «РНХИ им. проф. А.Л.Поленова»

Минздравсоцразвития России, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: кандидат биологических наук Наталья Алексеевна Филатова Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург доктор медицинских наук, профессор Евгений Наумович Имянитов ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова»

Минздравсоцразвития России, Санкт-Петербург

Ведущая организация: ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, Санкт-Петербург

Защита состоится «15» февраля 2013 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

Сайт института: www.cytspb.rssi.ru Адрес электронной почты института: [email protected] Факс института (812) 297-03-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан «_» января 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Иммунотерапия онкологических заболеваний привлекает внимание специалистов в особенности с развитием методов, основанных на использовании молекулярных шаперонов, в частности белка теплового шока Hsp70. Данные, полученные к настоящему времени, указывают на то, что Hsp70 способен активировать адаптивный и врождённый иммунный ответ организма [1]. В частности было установлено, что находящийся на поверхности раковых клеток Hsp70 вызывает активацию цитолитической функции NK-клеток, тем самым указывая на участие белка в стимуляции системы врожденного иммунитета [2]. Аутологичный опухолевый Hsp70, возможно благодаря своей шаперонной активности, способен доставлять опухолевые пептиды в антиген-презентирующие клетки (АПК), и в результате последующей презентации антигенов в комплексе с молекулами MHC I и II классов Т-клеткам формируется генерализованный специфический противоопухолевый ответ [3,4]. Эти открытия привели к появлению десятков конструкций противоопухолевых вакцин на базе молекулярных шаперонов, часть которых находится на разных фазах клинических испытаний [5–7]. Среди подобных технологий обращают на себя внимание способы иммунотерапии с помощью препаратов очищенного Hsp70, доставляемого непосредственно в опухоль. Так, внутриопухолевое введение препарата Hsp70 в комплексе с магнитными наночастицами с последующей локальной гипертермией приводило к задержке прогрессии меланомы [8]. В другом исследовании сочетание рекомбинантного Hsp70 с ДНК-плазмидой, блокирующей иммуносупрессорные молекулы B7-H1 на поверхности клеток меланомы, также приводило к замедлению роста опухоли in vivo [9]. Отчасти описанные эффекты объясняются способностью шаперона активировать созревание АПК, продукцию ряда провоспалительных цитокинов (TNF-, GM-CSF и другие), а также стимулировать цитолитическую и миграционную активность NK-клеток [10–12]. Однако механизмы запуска как врожденного, так и приобретенного противоопухолевого иммунитета введенным в опухоль или культуру раковых клеток шапероном пока остаются не ясными. Таким образом, учитывая актуальность исследований противоопухолевых эффектов шаперона Hsp70, необходимы работы, как по пониманию механизмов этих эффектов, так и по анализу последних на животных моделях различных онкологических патологий.

Цель исследования. Целью работы было изучение влияния иммуномодулирующих противоопухолевых свойств рекомбинантного белка теплового шока Hsp70 человека на раковые клетки in vitro с последующей оценкой таких эффектов in vivo в модели интракраниальной глиомы С6 крыс. Цель отдельной части работы состояла в оценке возможности использования препарата очищенного рекомбинантного белка теплового шока Hsp70 в качестве адьювантной противоопухолевой терапии у больных злокачественными опухолями головного мозга.

Задачи исследования. (1) Изучение механизма взаимодействия экзогенного Hsp70 с опухолевыми клеточными линиями различного происхождения (глиома крысы С6, меланома мыши В16, клетки цитотоксическую активность лимфоцитов. (2) Оценка терапевтической эффективности однократного либо непрерывного внутриопухолевого введения Hsp70 in vivo на модели интракраниальной глиомы С6 у крыс. (3) Изучение иммуномодулирующего влияния Hsp70 на развитие противоопухолевого ответа и мониторинг параметров врожденного и адаптивного иммунного ответа в динамике на модели глиомы С6. (4) Оценка возможности применения препарата очищенного рекомбинатного белка теплового шока Hsp70 в адьювантной терапии злокачественных образований головного мозга в серии ограниченных клинических исследований.

происхождения. Был обнаружен феномен транслокации внутриклеточного Hsp70 на поверхность опухолевых клеток под влиянием экзогенного шаперона, что, в свою очередь, приводило к повышению чувствительности клеток к цитолитической активности NK-клеток иммунной системы. Цитотоксическая активность естественных киллеров различалась в зависимости от типа раковых клеток-мишеней, концентрации вносимого в клеточную среду очищенного Hsp70 и продолжительности инкубации клеток с экзогенным белком. Результаты этих экспериментов позволили предложить оригинальную концепцию механизма действия белка Hsp70 в активации противоопухолевого ответа.

В ходе экспериментов in vivo на модели внутричерепной опухоли у крыс мы впервые доказали терапевтическую эффективность локальной, внутриопухолевой доставки препарата белка теплового шока Hsp70. Установлено, что внутриопухолевое введение шаперона Hsp продолжительности жизни животных. Причинами этого эффекта по нашим данным была последовательная активация врождённого и адаптивного иммунного ответа организма, индуцированная внутриопухолевым введением шаперона.

Впервые проведены ограниченные клинические исследования возможности локальной аппликации шаперона Hsp70 у нейроонкологических больных. Установлено, что препарат обладает приемлемым уровнем токсичности и безопасен к применению у больных со злокачественными новообразованиями головного мозга.

Личный вклад автора. Все экспериментальные процедуры и обработка результатов выполнены автором лично. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научными руководителями.

Теоретическое и практическое значение работы. Обнаруженное явление активации белком Hsp70 клеток иммунной системы за счет транслокации собственного, внутриклеточного шаперона на поверхность раковых клеток, с одной стороны, является научным обоснованием противоопухолевого действия Hsp70, а с другой – делает возможным применение препарата белка в качестве средства монотерапии либо в комбинации с другими методами в клинической онкологии.

Работа по анализу эффективности технологии с использованием Hsp70 уже начата, и её предварительные результаты указывают на безвредность очищенного Hsp70 для лабораторных животных. Следует отметить, что в Институте цитологии РАН в кооперации с ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России начата работа по подготовке препарата Hsp70 к госрегистрации как лекарственного средства, а также проводится разработка технического задания на доклинические испытания препарата. В техническое задание внесены данные, представленные в диссертации, и это также указывает на высокую практическую значимость выполненной диссертационной работы.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Шестнадцатом международном европейском междисциплинарном онкологическом конгрессе (Швеция, 2011); на Британском нейроонкологическом конгрессе (Великобритания, 2011); на Международном конгрессе педиатрической нейро-онкологии (США, 2011); на Девятом съезде общества европейской ассоциации нейро-онкологии (Румыния, 2011); на VI и VII Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых учёных (Москва, 2011, 2012); на X и XI Всероссийской научно-практической конференции «Поленовские чтения» (СанктПетербург, 2011, 2012).

По материалам диссертации опубликовано 26 работ, в том числе 6 в рецензируемых научных журналах из перечня изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на _ страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, методы, результаты, обсуждение и выводы. Материал иллюстрирован _ рисунками и _ таблицами. Библиографический указатель содержит источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии. Клетки крысиной глиомы С6, эритроидной лейкемии человека К562, мышиной меланомы В16 были получены из банка клеточных культур Института цитологии РАН.

Клетки С6 выращивались на питательной среде DMEM/F12 с 2мM L-глутамином, содержащей 10% фетальной сыворотки (FBS), антибиотики пенициллин 100 ЕД/мл и стрептомицин 100 мкг/мл в 5% СО2 при 37 °С. Для К562 и В16 применяли питательные среды DMEM и RPMI-1640, соответственно.

Очищенный человеческий рекомбинантный белок теплового шока Hsp70. Рекомбинантный Hsp70 человека, полученный совместно с ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России, очищали с помощью двухступенчатой хроматографии на геле DEAE-Sepharose и аффинной хроматографии с применением АТФ-агарозы (Sigma, USA). Примеси бактериального липополисахарида (ЛПС) удаляли при помощи хроматографии с гелем Полимиксин В-Агарозы (Sigma, USA). Оценку количества ЛПС в растворе очищенного белка осуществляли с помощью теста LAL E-Toxate (Sigma Aldrich, USA). В конечном растворе белка содержание эндотоксина было ниже 0,1 МЕ/мг.

Анализ взаимодействия шаперона Hsp70 с раковыми клетками. Для оценки распределения Hsp70 в клетках-мишенях белок конъюгировали с флуоресцентым агентом Alexa555 (Invitrogen, USA) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Далее Hsp70 вносили в клеточную среду в различных концентрациях на разные временные интервалы, и по окончании инкубации клетки отмывали от экзогенного белка, фиксировали и окрашивали антителами, узнающими конститутивную или индуцибельную форму внуктриклеточного Hsp70. В качестве первичных применяли следующие антитела: BRM-22a (Sigma, USA) (к индуцибельной Hsp70 и конститутивной Hsc70 формам шаперона) и SPA815 (Stressgen, USA) (к конститутивной форме).

Анализ проводили с помощью метода конфокальной микроскопии с использованием микроскопа Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Heidelberg, Germany).

Оценка выхода внутриклеточного Hsp70 в среду под воздействием экзогенного шаперона.

Экспорт эндогенного Hsp70 во внеклеточную среду под действием вносимого в культуру шаперона оценивали, используя клетки глиомы крысы С6 в качестве донора белка.

Предварительно Нsp70, связанный с биотином, вносили в клеточную среду на различные промежутки времени. После отмывки клеток от экзогенного белка и инкубации в бессывороточной среде в супернатант последовательно вносили Нейтравидин-Агарозу (Pierce Biotechnology, USA) и АТФ-агарозу с целью захвата сначала внесенного, биотинилированного белка и, далее, собственного шаперона, экспортированного в среду. Пробы геля наносили на полиакриламидный гель для электрофореза, а зоны Нsp70 выявляли с помощью окраски блотов поликлональными антителами RS-2 (1:500) либо авидин-пероксидазой (1:10000). В качестве контроля использовался бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma, USA).

противоопухолевой активности Hsp70 in vivo проводили в опытах на самцах крыс породы Wistar весом 290-340 грамм, полученных из питомника «Рапполово» РАМН. Изучали терапевтическую эффективность локального, внутриопухолевого введения Hsp70. Для этого на 6-е сутки от момента имплантации клеток С6 производили однократное либо длительное введение шаперона при помощи осмотической помпы Alzet®. Были выбраны следующие группы сравнения: (1) контрольная группа; (2) однократное введение Hsp70; (3) однократное введение бычьего сывороточного альбумина (БСА); (4) длительное введение Hsp70 при помощи осмотической помпы; (5) длительное введение БСА при помощи осмотической помпы. Динамику роста опухоли анализировали при помощи метода динамической магнитно-резонансной томографии (МРТ).

Мониторинг иммунологических параметров проводили в тестах определения цитолитической активности лимфоцитов, продукции цитокина интерферон гамма (INF), в иммуногистохимическом исследовании опухолевой ткани на инфильтрацию Т-лимфоцитами и естественными киллерами (NK-клетки).

Интракраниальное введение клеток С6 и имплантация осмотической помпы Alzet®. Крысы были анестезированы введением интраперитонеально раствора «Zoletyl-100» (Virbac sant Animale, France) и 2%-ного раствора «Rometar» (SPOFA, Czech Republic), 10,0 мг и 2,0 мг соответственно. После фиксации головы животного в рамке стереотаксического аппарата производили трепанацию черепа и вводили 10 мкл суспензии клеток глиомы С6 (1x106 клеток/мл).

Область введения соответствовала nucl. caudatus dexter (по стереотаксическому атласу Pellegrino L.J.). В случае имплантации осмотической помпы первым этапом устанавливали канюлю для интратуморального введения, далее в межлопаточной области подкожно имплантировали резервуар помпы, содержащий шаперон Hsp70, и герметично соединяли с канюлей. Была использована осмотическая помпа Alzet® (модель 1003D) со скоростью инфузии 1,0 мкл/час в течение 3 суток (объём резервуара 100 мкл).

Магнитно-резонансная томография головного мозга и измерение объема опухоли. Магнитнорезонансная томография выполнялась на томографе Siemens Magnetom Verio с индукцией напряженностью магнитного поля 3,0 Tл с получением изображений, взвешенных по Т1 и Т2 в корональной, сагиттальной и аксиальной плоскостях с толщиной среза 1,0 мм (TR 6000 мс, TE мс, FoV 220 мм, всего 11 срезов) на 7, 14, 21 и 28-е сутки от момента имплантации клеток С6.

Определение объёма опухолевого узла проводили по Т1-взвешенным постконтрастным (1,0 мл 1,0 ммоль/мл, Gadovist, Germany) и Т2-взвешенным снимкам во фронтальной плоскости на каждом снимке с последующим умножением на количество выполненных срезов.

Определение цитотоксической активности лимфоцитов. Для определения цитолитической активности лимфоцитов на 7, 14 и 21-е сутки от момента введения белка производили забор селезёнок крыс. Спленоциты (клетки-эффекторы) контрольной группы, групп однократного введения БСА или Hsp70 добавляли к клеткам глиомы С6 (клетки-мишени) в соотношениях 25:1, 50:1, 100:1. Цитотоксический эффект определяли по активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), вышедшего в культуральную среду в результате лизиса опухолевых клеток. Измерение проводили с помощью диагностического набора CytoTox 96® non-radioactive cytotoxicity assay (Promega Inc., USA) по протоколам фирмы-производителя.

Определение концентрации INF. Уровень INF определяли в (1) сыворотке, (2) в среде со спленоцитами животного (спонтанная продукция) и (3) при стимуляции облученных (300 Гр) клеток глиомы С6 или рабдомиосаркомы крысы RA-2 (индуцированная продукция). Клетки RA- использовали в качестве отрицательного контроля специфической продукции интерферона в ответ на стимуляцию Нsp70.

клеток/мл) добавляли к раковым клеткам (0,2106 клеток/мл) и инкубировали в течение 48 ч.

Уровень INF измеряли с помощью готового набора для анализа крысиного INF ELISA Set (BD Biosciences, USA) в соответствии с протоколами фирмы-производителя.

Иммуногистохимическое исследование инфильтрации опухолевой ткани лимфоцитами.

Анализ инфильтрации опухоли лимфоцитами проводили на криосрезах при помощи метода иммунофлуоресценции. Для оценки степени инфильтрации опухоли использовали моноклональные антитела к следующим маркерам: Т-лимфоциты, CD3+ (клон G4.18, 1:100, FITC, зеленый), CD4+ (клон OX-35, 1:100, Alexa567, красный) и CD8+ (клон OX-8, 1:100, FITC, зеленый); NK-клетки (CD56+) (1:100, Alexa567, красный), и макрофаги (CD11b+) (клон М1/70, 1:100, Alexa567, красный).

Ограниченное клиническое исследование Hsp70 у нейроонкологических больных. Дизайн исследования. В пилотное исследование были включены пациенты (4,5–14 лет) с первично выявленными злокачественными опухолями головного мозга без предшествующего лечения (n=12). Курс введения препарата Hsp70 проводили с информированного согласия родителей пациента и решения Этического комитета Российского научно-исследовательского нейрохирургического института им. проф. А.Л. Поленова. После резекции опухоли в резидуальную полость имплантировали силиконовый катетер. На 1, 3, 5, 7 и 9-е сутки после операции в ложе удаленной опухоли вводился препарат рекомбинантного белка Hsp70 в физиологическом растворе (500 мкг на 1 введение, 0,5 мл раствора; общая доза на курс 2,5 мг). Во время прохождения курса введения шаперона пациенты не получали терапии (за исключением симптоматической). До начала курса шаперона и по его окончании проводили оценку иммунологических изменений (иммунологическое исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, анализ продукции цитокинов (IL-4, IL-6, IL-10, INF, TNF), тест гиперчувствительности замедленного типа (DTH)). Токсичность оценивали в соответствии с критериями National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events (NCICTCAE), version 3.0. Для мониторинга динамики изменения опухолевой ткани во время терапии Hsp70 проводили МРТ (Т1-взвешенные постконтрастные снимки). Клинический ответ оценивали согласно критериям Macdonald et al. По окончании введения Hsp70 пациенты получали стандартное лечение (радио- и(или) химиотерапия) в соответствии с гистологическим диагнозом.

Период наблюдения составил 12 мес.

Статистическая обработка экспериментальных данных. Полученные в процессе исследования медико-биологические данные обрабатывали c использованием программы STATISTICA for