На правах рукописи

ЗАХАРОВА АННА МИХАЙЛОВНА

КОМПЛЕКСНОЕ РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМ ПРОБОПОДГОТОВКИ ПРИ

РАЗРАБОТКЕ МЕТОДИК ВЭЖХ АНАЛИЗА ОБЪЕКТОВ СО СЛОЖНОЙ

МАТРИЦЕЙ

Специальность 02.00.02 – АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Петербург 2013    

Работа выполнена на кафедре органической химии химического факультета СанктПетербургского государственного университета

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Карцова Людмила Алексеевна    

Официальные оппоненты: Воронцов Александр Михайлович, доктор технических наук, профессор, директор Центра экологической безопасности Балтийского института экологии, политики и права     Яшин Яков Иванович, доктор химических наук,   профессор, директор НТЦ «Хроматография» НПО «Химавтоматика»

   

Ведущая организация: Федеральное государственное унитарное предприятие "Всероссийский научноисследовательский институт метрологии им. Д.И. Менделеева (ФГУП "ВНИИМ им. Д. И. Менделеева)  

Защита состоится 21 ноября 2013 г. в 17 час 00 мин на заседании диссертационного совета Д 212.232.37 при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Россия, Санкт-Петербург, Средний проспект, дом 41/43, Большая химическая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Горького СанктПетербургского государственного университета.

Автореферат диссертации разослан _октября 2013 г.

Ученый секретарь кандидат химических наук, доцент Панчук В.В.

2     

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность Пробоподготовка является важнейшей стадией химического анализа, лимитирующей реализацию возможностей современных приборов, а следовательно, и качество результатов анализа. Надежность способа пробоподготовки может оказать решающее влияние и на выбор аналитического метода. Это особенно принципиально при анализе объектов со сложной матрицей, при низком содержании определяемых соединений и значительном количестве сопутствующих. Выбор грамотной стратегии подготовки проб при создании методик ВЭЖХ-анализа является определяющим.

Работа посвящена выявлению простых и надежных подходов к пробоподготовке при ВЭЖХ-анализе пищевых продуктов, БАДов, фармацевтических препаратов и биологических объектов, сточной и природной вод, нефти, промышленных выбросов.

Цель: Разработка методик анализа сложных матриц (пищевых продуктов, биологически активных добавок, фармацевтических препаратов, сточной воды, нефти, промышленных выбросов, почвы, биологических объектов и растительных экстрактов) с применением простой и надежной процедуры пробоподготовки для каждого типа аналитов при ВЭЖХ определении углеводов, карбоновых и аминокислот, полиароматических углеводородов, неорганических анионов, этилендиаминтетрауксусной кислоты.

В связи с поставленной целью решались задачи:

1. Оптимизация условий пробоподготовки при анализе нефти и пищевых продуктов, основанной на методах сорбционного выделения сопутствующих примесей.

2. Разработка общей схемы пробоподготовки жидкофазных и твердофазных объектов при ВЭЖХ-определении углеводов и карбоновых кислот в продуктах питания.

3. Определение углевода апиоза в БАД «Зостерин-ультра» с использованием гидролитического расщепления пектина и получением флуоресцирующего производного.

4. Выявление возможностей сочетания мембранной фильтрации и сорбции в процессе пробоподготовки при определении ПАУ в промышленных выбросах, атмосферном воздухе и почве методом ОФ ВЭЖХ и получение оценочных характеристик эффективности использования различных сорбционных материалов: сверхсшитого полистирола Purosep 200 и сополимера стирол-дивинилбензол Supelpak 20.

5. Выбор условий гидролитического расщепления компонентов матрицы в сочетании с получением производных при определении свободных и связанных аминокислот в различных объектах.

6. Поиск условий пробоподготовки селективного ВЭЖХ определения ЭДТА в майонезе.

7. Разработки ВЭЖХ методик анализа объектов со сложной матрицей (пищевые продукты, растительные экстракты, атмосферный воздух, промышленные выбросы, нефть) на основе предлагаемых способов пробоподготовки.

Научная новизна Предложены общие подходы к подготовке проб при ВЭЖХ определении с УФдетектированием свободных и связанных аминокислот в пищевых продуктах, биологических матрицах и растительных экстрактах, включающие гидролитическое расщепление (6М HCl) компонентов матрицы в сочетании с получением фенилизотиоцианатных производных аналитов. Для определения серосодержащих аминокислот адаптирован вариант кислотного гидролиза с предварительным окислением этих аналитов надмуравьиной кислотой с последующей дериватизацией, а для определения триптофана, неустойчивого в кислой среде, – щелочной гидролиз насыщенным раствором гидроксида бария.

Предложена схема пробоподготовки при ВЭЖХ определении анионов (F-, Cl-, Br-, NO3-, NO2-, PO43-, SO42-) в водных вытяжках из нефти (3 последовательные экстракции горячей водой при температуре 80-90 С с последующим добавлением бензола) в сочетании с очисткой на сорбенте С18 от сопутствующих органических примесей методом ионной хроматографии с косвенным спектрофотометрическим детектированием.

Предложен способ определения этилендиаминтетрауксусной кислоты в майонезе методом ион-парной ВЭЖХ в форме комплексов с ионами Fe3+ или Cu2+, извлекаемых из матрицы фосфатным буферным раствором.

Предложен способ определения углевода апиоза в БАД «Зостерин-Ультра», включающий гидролитическое расщепление компонентов матрицы с использованием 2М раствора трифторуксусной кислоты в сочетании с получением флуоресцирующего производного с антраниловой кислотой.

Предложена комбинированная схема выделения и концентрирования всех приоритетных загрязнителей группы ПАУ, включающая фильтрацию воздушной пробы через пористый тетрафторэтилен и концентрирование на полимерном сорбенте с их последующей десорбцией органическими растворителями (гексан и диэтиловый эфир) и очисткой экстрактов на сверхсшитом полистироле Purosep 200.

Практическая значимость работы По результатам исследований разработано и аттестовано во ВНИИМ им.

Менделеева, Санкт-Петербург, пять методик: определения углеводов в напитках, пищевых продуктах, биологически активных добавках; неорганических анионов (F-, Cl-, Br-, NO3-, NO2-, PO43-, SO42-) в питьевой, природной, сточной водах и в нефти;

полициклических ароматических углеводородов в атмосферном воздухе и промышленных выбросах; бенз(а)пирена в воздухе рабочей зоны.

Две методики определения органических кислот в напитках, винах, соках и жидких БАД, а также в пищевых продуктах и твердых биологически активных добавках находятся в настоящий момент на аттестации во ВНИИМ им. Менделеева.

Положения, выносимые на защиту:

1. Обоснования общих схем пробоподготовки для ВЭЖХ определения:

- углеводов и органических кислот в жидкофазных и твердофазных пищевых продуктах с сорбционной очисткой экстрактов;

- ПАУ в атмосферном воздухе и промышленных выбросах с использованием мембранной фильтрации и сорбции на сверхсшитом полистироле Purosep 200 или сополимере стирол-дивинилбензол Supelpak 20;

- свободных аминокислот (АК) и их суммарного содержания в объектах растительного и животного происхождения с гидролитическим расщеплением компонентов матрицы, предварительным окислением надмуравьиной кислотой в случае серосодержащих АК и получением фенилизотиоцианатных производных;

- неорганических анионов (нитрит, нитрат, хлорид, фторид, бромид, сульфат и фосфат) в природных сточных водах и горячих водных вытяжках из нефти в сочетании с сорбционной очисткой;

- ЭДТА в майонезе в форме комплексов с ионами Fe3+ или Cu2+;

- апиозы в БАД с использованием гидролитического расщепления компонентов матрицы и получением флуоресцирующего производного с антраниловой кислотой.

2. Методики анализа различных объектов со сложной матрицей, основанные на разработанных способах пробоподготовки.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, глав обсуждения результатов эксперимента, сопоставления особенностей разработанных методик с ближайшими аналогами, выводов, списка машинописного текста, содержит 55 таблиц, 91 рисунок, список использованных источников из 177 наименований.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 3 статьях в журналах, входящих в перечень ВАК, в 7 тезисах конференций; аттестовано 5 методик.

Результаты работы докладывались на конференциях: VIII Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «ЭКОАНАЛИТИКА 2011» и школа молодых ученых, посвященные 300-летию со дня рождения М. В. Ломоносова, Архангельск, июня – 2 июля 2011 г; VI Всероссийская конференция молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012», Санкт-Петербург, 3-7 апреля 2012 г; IV Всероссийская конференция «Аналитические приборы», Санкт-Петербург, 26июня 2012 г; Всероссийский симпозиум «Кинетика и динамика обменных процессов», Краснодарский край 25 ноября-2 декабря 2012 г; 1-ая Зимняя молодежная школа-конференция с международным участием «Новые методы аналитической химии», Санкт-Петербург 17-22 февраля 2013 года; VII Всероссийская конференция молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматериалам «Менделеев-2013», Санкт-Петербург, 2-5 апреля 2013 г; II Всероссийская конференция «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез», Краснодар 26-31 мая 2013 г.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи исследования.

В Главе 1 (обзор литературных данных) представлена информация о способах пробоподготовки к ВЭЖХ-анализу пищевых продуктов и БАД при определении углеводов, органических кислот; неорганических анионов в водах различного типа и нефти; полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) в атмосферном воздухе и промышленных выбросах; свободных и связанных аминокислот в объектах растительного и животного происхождения; ЭДТА в воде и фармацевтических препаратах.

Глава 2 включает описание использованной аппаратуры, объектов и методов исследования, реагентов, построения градуировочных зависимостей, способов пробоотбора, определения коэффициентов извлечения и метрологическую обработку результатов. ВЭЖХ-анализ выполнялся на жидкостном и ионном хроматографах Shimadzu с использованием флуориметрического, кондуктометрического, спектрофотометрического, рефрактометрического детекторов и детектора на диодной матрице.

В 3-й главе описана схема пробоподготовки при исследовании образцов нефти месторождений Западной Сибири до очистки от солей и после. Контроль процессов обессоливания нефти подразумевает определение концентрации солей на различных ступенях ее очистки. Вместе с водой в нефть попадают минеральные соли, вызывающие коррозию нефтеперегонной аппаратуры. При определении массовой концентрации анионов (хлорида, бромида, фторида, нитрата, фосфата, сульфата) методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием реализован вариант пробоподготовки, сочетающий жидкостную экстракцию и сорбционную очистку (рис. 1). Установлено, что при температуре 80-100 °С извлекается максимальное количество анионов (рис.2). Для удаления органических примесей применяли сорбент С18. Достигнутый диапазон определяемых концентраций 1 - 40 мг/л.

Рис. 1. Схема пробоподготовки при определении Рис. 2. Влияние температуры воды на неорганических анионов в водных вытяжках из интенсивность сигналов хлорида и При определении массовой концентрации анионов в пробах сточных вод нефтеперерабатывающего предприятия методом ионной хроматографии использовалась процедура очистки проб на сорбенте С18 от мешающих компонентов в сочетании с суппрессионным вариантом ионной хроматографии. Применение двух режимов усиления сигнала кондуктометрического детектора обеспечило регистрацию высоких (5-2000мг/л) и низких( 0,01–5 мг/л) концентраций анионов (рис. 3а,б, табл. 1).

Рис. 3а. Хроматограмма пробы сточной воды, Рис. 3б. Хроматограмма пробы сточной усиление детектора 0,01 воды, усиление детектора 0, Условия: ионный хроматограф Shimadzu, кондуктометрический детектор, колонка для суппрессорного метода определения анионов (250 х 4.0 mm ID) IC SI-904E с предколонкой IC SIG (Shodex), подвижная фаза раствор 1,0 ммоль/л Na2СО3 + 1,4 ммоль/л NaHCO3 в деионизованной воде, Vпотока 1 мл/мин; tколонки 40С, температура ячейки детектора 43С Таблица 1. Результаты определения массовой концентрации анионов в пробах сточной воды нефтеперерабатывающего предприятия, n=3.

Сорбционная очистка экстрактов от мешающих ВЭЖХ анализу примесей потребовалось и при определении углеводов (глюкозы, лактозы, мальтозы, маннозы, сахарозы, фруктозы, ксилита, сорбита) и органических кислот (щавелевой, винной, муравьиной, яблочной, молочной, уксусной, лимонной, янтарной, фумаровой, пропионовой) в напитках, овощах, фруктах, продуктах переработки плодов, биологически активных добавках; процедура пробоподготовки включала жидкостную экстракцию, разбавление или растворение пробы, очистку экстрактов и определялась лишь агрегатным состоянием анализируемых образцов. При подготовке твердых образцов (печенье, конфеты, овощи, фрукты, твердые биологически активные добавки) пробы гомогенизировали, проводили экстракцию целевых компонентов водой в ультразвуковой ванне и центрифугировали. Примесные органические компоненты (красители, консерванты) удаляли с использованием картриджей С18; углеводы и органические кислоты этим сорбентом не удерживались. Поскольку концентрация сахаров в пищевых продуктах довольно высокая (>1%), для их регистрации использовали рефрактометрический детектор, а для органических кислот, содержание которых в пищевых продуктах заметно ниже (0,5-100 мг/кг) - спектрофотометрический ( 210 нм) (рис. 4).

Рис. 4. Схема пробоподготовки твердых проб пищевых продуктов и БАД при ВЭЖХ определении углеводов и карбоновых кислот Жидкие пробы, содержащие углекислый газ, выдерживали в ультразвуковой ванне в течение 15 мин; при анализе соков с мякотью или молочных продуктов центрифугировали со скоростью 5000-8000 об/мин в течение 10 мин, подвергали сорбционной очистке и ВЭЖХ анализу (рис. 5 и табл. 2). При определении низких концентрации углеводов потребовалась предварительная дериватизация.

Так, при количественном определении моносахарида апиозы в биологически активной добавке «Зостерин-ультра» (апиоза - разветвлённый моносахарид, входящий в состав галактоуроновой кислоты) получали производное с антраниловой кислотой (Рис. 6) для последующего флуориметрического детектирования.

Рис. 5а. Хроматограмма образца красного сухого Рис. 5б. Хроматограмма образца красного вина «Каберне Совиньон», определение сухого вина «Каберне Совиньон», 1 – винная кислота, 2 – яблочная кислота, 3 – 1 – фруктоза, 2 – глюкоза;

молочная кислота, 4 – уксусная кислота, 5 – жидкостный хроматограф Shimadzu с лимонная кислота, 6 – янтарная кислота; рефрактометрическим детектором, колонка жидкостный хроматограф Shimadzu, колонка Zorbax Carbohydrate 250 х 4,6 мм, 5 мкм, Genesis AQ (150х4.6 мм, 4 мкм), градиентный изократический режим подвижная фаза режим элюирования, подвижная фаза: компонент ацетонитрил : вода (82:18, объемн.), А - 98% (0,1% H3PO4+10мМ КН2РО4), 2% Vпотока 2 мл/мин.

ацетонитрил, компонент Б – ацетонитрил, УФдетектирование (=210 нм).

Таблица 2. Результаты количественного определения органических кислот и углеводов в пробе красного сухого вина «Каберне Совиньон»