На правах рукописи

Ульянцев

Александр Сергеевич

РАЗРАБОТКА ЛАЗЕРНОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ПОДЛИННОСТИ ЖИДКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ

Специальность 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2010

Работа выполнена на кафедре фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета Российского университета дружбы народов

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Сыроешкин Антон Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Сяткин Сергей Павлович доктор фармацевтических наук, профессор Каленикова Елена Игоревна

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение «Российский научный центр восстановительной медицины и курортологии»

Минздравсоцразвития РФ

Защита диссертации состоится 19 ноября 2010 года в 14:00 на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая д. 8/2.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. МиклухоМаклая д. 6.

Автореферат разослан 15 октября 2010 года Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Лукашева Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы В современной системе контроля качества лекарственных средств следует выделить два основных направления: первое – создание и мощное инструментальное оснащение контрольно-аналитических лабораторий, требующее больших финансовых затрат, наличие высококвалифицированного обслуживающего персонала и снабжения огромным количеством расходных материалов. Примером может служи ть хромато-масс-спектрометрия (Tolonen A. et al, 2009; Maurer H.H., 2009). Однако это возможно лишь в рамках крупных научных аналитических лабораторий. Второе направление, частично дополняющее первое – это создание и внедрение методов, позволяющих проводит ь экспресс-анализ фармацевтической продукции. Следует отметить, что подобные методы не менее сложны в исполнении, но более удобны ввиду отсутствия стадии пробоподготовки и простоты проведения анализа. Примером могут служить БИК-спектрометрия (Gowen A.A. et al, 2008; Roggo Y. et al, 2007), позволяющая определять подлинность таблетированных лекарственных форм без нарушения целостности первичной упаковки, и ЯКР -спектроскопия (Ashbrook S.E., 2009; Balchin E. et al, 2005; Watt A.P. et al, 2003), используемая для детектирования взрывчатых и наркотических веществ.

Новейшие исследования по физико -химическим свойствам водных растворов показали, что в зависимости от химического состава раствора формируются плотностные неоднородности колмогоровского масштаба (около 0, 1 мм), характеризуемые определёнными размерными спектрами и кинетикой релаксации (Фесенко Е.Е., 1999; Гончарук В.В., Сыроешкин А.В., 2006). Это открыло возможность проводить определение подлинности заявленной торговой марки с применением лазерных методов, например метод малоуглового рассеяния лазерного излучения ( LALLS) для анализа бутилированных минеральных вод (Сыроешкин А.В., Успенская Е.В., 2007). В настоящей работе предложены физико химические основы для метода определения подлинности, базирующегося на кинетике мерцания гигантских гетерофазных кластеров (ГГК) воды (Лапшин В.Б., Гончарук В.В., 2005). Метод биотестирования с применением различных клеточных биосенсоров (одноклеточных, растений, рыб, дафний и др.) хорошо зарекомендовал себя для изучения биологической активности воды и водных растворов, следовательно, он может быть применён для анализа жидких лекарственных форм и препаратов воды.

Цель и задачи исследования Целью исследования является разработка нового лазерного метода определения подлинности жидких лекарственных форм без вскрытия упаковки для внедрения его в практику экспресс-анализа. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать биологическую активность/токсичность препаратов высокоомной воды (основы жидких лекарственных форм) с различной концентрацией и размерными спектрами ГГК;

2. Определить релаксационные характеристики ГГК воды после их разрушения на субмикронных фильтрах по величинам времени спин -спиновой релаксации протонов (Т 2), разнице градиента электрохимического потенциала ( Н+), и светорассению, контролируемому методами малоуглового светорассеяния ( LALLS) и лазерной интерферометрии (LI);

3. Установить возможный механиз м формирования ГГК воды из супрамолекулярных структур нанометрового диапазона;

4. Получить статистически достоверные двумерные диаграммы светорассеяния (2 D-LS), иллюстрирующие соотношение скорости мерцания и устойчивости ГГК воды;

5. Разработать методику определения подлинности без вскрытия упаковки инфузионных растворов, минеральных вод, препаратов воды, обеднённых по тяжёлым изотопам ( ddw).

Научная новизна Впервые экспериментально показано, что на межфазной границе плотностных неоднородностей воды в субм иллиметровом диапазоне размеров формируется градиент pH, причем присутствие «примесного» дейтерия является необходимым условием для образования межфазного градиента электрохимического потенциала протонов. Показано, что фильтрование воды через субмикронные фильтры, приводящее к разрушению ГГК, сопровождается исчезновением малоуглового светорассеяния, многократным изменением спин-спиновой релаксацией протонов, изменением активности ионов гидроксония. Все значения указанных характеристик обратимо восстанавлива ются после фильтрования с часовой кинетикой.

Впервые показано, что данные по кинетике релаксации ГГК можно использовать как для оценки биологической активности образцов воды, так и для определения подлинности водных растворов неорганических веществ, и для контроля степени обеднения воды по тяжелым изотопам.

Практическая значимость Результаты исследования использованы для выполнения государственного контракта № 154-6/337 от 24.10.08 с Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии «Создание метрологического комплекса и нормативно -методической базы для измерения параметров наночастиц в природных и технологических средах» (шифр 2008 -3-3.1Методика определения подлинности без вскрытия упаковки внедрена в Федеральном государственном учреждении «Государственный океанографический институт имени Н.Н.

Зубова» при разработке эталонных мер наночастиц природных вод по Государственному контракту № 154-6/337.

Подана патентная заявка «Способ контроля подлинности минеральных питьевых вод» на способ экспресс-определения подлинности минеральных вод и жидких лекарственных форм с использованием лазерных методов» (рег. № 2009140215, дата поступления 02.11.2009).

Результаты исследования внедрены в учебный процесс медицинского факультета РУДН специальности «Фармация» в разделе «Стандартизация и контроль качества лекарственных средств» и используются в учебном модуле «Современные физические и физико -химические методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» на кафедре фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета РУДН.

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Высоокомная вода с пониженной концентрацией ГГК, вследствие изменения изотопного состава, токсична по действию на клеточный биосенсор S. ambiguum;

2. В водных растворах формируются плотностные неоднородности колмогоровского масштаба, являющиеся дейтерий -стабилизированными гигантскими кластерами воды с межфазным градиентом рН и временами р елаксации от десятков минут и более;

3. Явление формирования межфазного градиента рН отсутствует в лёгкой и тяжёлой воде:

гомогенность по изотопному составу приводит к значительному снижению гетерогенности структуры;

4. Кинетику мерцания ГГК воды можно наблюдать с помощью лазерной интерферометрии.

Построение 2D-LS-диаграмм позволяет статистически достоверно выявить область, соответствующую конкретному водному раствору;

5. Новый лазерный метод может быть применён для анализа многокомпонентных растворов, например, минеральных вод. Разработанный метод может быть использован для определения соотношения D/H в препаратах высокоомной воды.

Апробация работы Основные результаты исследования доложены на Всероссийской научно -практической конференции, посвященной памяти професс ора Ю.М. Кубицкого «Современные проблемы медико-криминалистических, судебно -химических и химико-токсикологических экспертных исследований» (Москва, 2007), на Итоговой научно -практической конференции Российского центра судебно-медицинской экспертизы «Актуал ьные вопросы судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований» (Москва, 2008), на III Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных в еществ» (Воронеж, 2007), на I Международной выставке морских инноваций International naval and maritime innovations exhibition «Sea Future» (Ла Специя, Италия, 2009), на IV Международном симпозиуме по микроэлементам и минеральным веществам FESTEM (Санкт-Петербург, 2010), на международном симпозиуме AAAS10 (Флоренция, Италия, 2010), на совещаниях Института коллоидной химии и химии воды им. А.В. Думанского НАН Украины в 2007 -2010 годах (директор - академик-секретарь отделения химии Гончарук В.В.), н а семинарах Государственного океанографического института имени Н.Н. Зубова и межкафедральных семинарах медицинского факультета РУДН.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 5 в изданиях, рекомендуемых ВАК.

Объём и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 149 страницах и состоит из введения, четырёх глав, заключения, выводов и приложения. Библиографический указатель включает литературных источников, из которых 82 на иностранных языках. Работа содержит 15 та блиц, 48 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования В работе исследовали образцы изотонического (0,9%) раствора натрия хлорида трёх производителей: ОАО НПК «Эском» (г. Ставрополь) серии 4290708 и 3690708; ОАО «Биохимик» (г. Саранск) серии 7130708 и 6940708; ОАО «Биосинтез» (г. Пенза) серии 5220908 и 6190908, раствора Рингера (Хемофармконцерн А.Д., г. Вршац, Сербия, серия 1703983), раствора Хартмана (Хемофармконцерн А.Д., г. Вршац, Сербия, серия 1703275), «Гемодез-8000» (серия 270708), приобретённые в аптеках г. Москвы и Московской области.

Для анализа отбирали пять образцов каждой серии. Для сравнения исследовали образцы дистиллированной воды, растворы натрия хлорида концентрации 0,45% и 1,8%, приготовленные из соли марки «х.ч.» и воды для инъекций.

Исследовали три торговые марки минеральных вод: «Новотерска я целебная» (ЗАО «Кавминводы»), «Ессентуки № 20» (ОАО «Вимм -Билль-Данн Продукты питания») и «Донат Mg» (АО «Колинска», Словения). Герметичность упаковки при этом не нарушена. Для сравнения исследовали образцы «искусственной» минеральной воды, приготовленно й в лабораторных условиях путём растворения в дистиллированной воде навесок минеральных солей щелочных и щелочноземельных металлов, соответствующих минеральному составу природной дегазированной воды «Ессентуки № 20».

Объектами исследования также были препа раты высокоомной воды с различным содержанием дейтерия, предоставленные фирмой ЗАО «Легкая вода»; образцы латексных микросфер различного диаметра производства фирмы “ Invitrogen".

Оборудование и методы анализа С помощью лазерной интерферометрии исследовали стационарную устойчивость гигантских кластеров воды образцов изотонических растворов, минеральных вод, воды с различным содержанием тяжелых изотопов и образцов латексных микросфер.

Регистрируемые на диодной матрице интерференционные картины обрабатывались с помощью трёх дескрипторов d 1, d2 и d3 (Сыроешкин А.В., Попов П.И., 2005). С течением времени интерференционная картина претерпевает изменения, зависящие от кинетики формирования/распада гигантских гетерофазных кластеров (ГГК) воды и долгоживущих плотностных неоднородностей с характеристически ми временами релаксации (Гончарук В.В.

и др., 2005). Поэтому были применены дескрипторы – аналоги топологических индексов, описывающие скорость изменения профиля рассеяния лазерного света ( Light Scattering – LS):

it – общее число элементов;

iSi>Sb – число элементов по уровню сигнала больше порогового уровня;

Si – величина различий по уровню сигнала соответствующих элементов двух интерференционных картин;

Sb – величина порогового уровня сигнала;

- сумма значений различий по уровню сигнала всех соответствующих элементов двух интерференционных картин;

S - среднее значение уровня сигнала всех элементов начальной интерференционной картины;

Smax - сумма максимально возможных значений различий по уровню сигнала всех соответствующих элементов двух интерференционных картин.

Для анализа устойчивости кинетики светорассеяния были использованы диаграммы «2 DLS», на которых нанесены значения вышеописанных дескрипторов di и скорости их изменения sdi.

Дисперсионный анализ образцов воды и наночастиц проводили с применением методов малоуглового рассеяния лазерного излучения ( LALLS) и динамического рассеяния света ( DLS) (фотонная корреляционная спектроскопия). Измерения проводили на приборах Master Sizer 2000 и ZetaSizer Nano ZS производства фирмы MALVERN Instruments. В качестве фоновой жидкости использовали высокоомную воду и воду, обеднённую по содержанию дейтерия ( ppm D/H).

Измерения рН проводили на рН -метре РР-20 фирмы «Sartorius», снабжённом термодатчиком. Кинетику изменения рН также регистрировали с помощью спектрофотометрии с применением кислотно -основного индикатора фенолового красного (рКа=7,4) в концентрации 30 мкМ. Ра створы готовили на высокоомной воде, измерения проводили на спектрофотометре СФ -203 НПФ «Аквилон».

Метод ЯМР - «спиновое эхо» применялся для измерения времени спин -спиновой релаксации протонов (Т 2) образцов воды с различным содержанием изотопа дейтерия (Николаев Г.М. и соавт., 2003).

Биологическую активность образцов воды изучали используя метод биотестирования. В качестве клеточного биосенсора использовали инфузорию Spirostomum ambiguum. Установка для исследования поведения инфузории S. ambiguum, инкубированной в водные образцы, состояла из водного термостата, 5 -луночного планшета и стереолупы МБС -10 (Сыроешкин А.В., Быканова С.Н., 2003).

Препараты высокоомной воды (не менее 16 МОм/ cм) получали на установке «Медиана фильтр». Контроль примесных неорганиче ских соединений проводили с помощью кондуктометрии и ААС с электротермической атомизацией и зеемановской коррекцией фона.

Референс-образцы для элементного анализа получены после успешных интеркалибраций в системе МАГАТЭ.

Определение концентрации дейтерия проводили с помощью масс -спектрометрии (Демихов Ю.Н., 1999) и многопроходной лазерной ИК -спектрометрии (Los Gatos Research, USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВА НИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Биологическая активность высокоомной воды и проблема стандартизации Современная фармацевтическая промышленность – огромный потребитель воды, применяющейся в качестве основного растворителя при изготовлении жидких лекарственных форм. При этом следует учитывать различную степень очистки воды в зависимости от назначения. Так, в РФ действуют две фармакопейные статьи: ФС 42-2619-97 («Вода очищенная») и ФС 42-2620-97 («Вода для инъекций»), в странах Евросоюза и США выделяют более широкий спектр типов воды. Развитие современных аналитических методов позволяет выделять целый ряд типов высокоомной воды в зависимости от назначения и степени очистки (MilliporeTM).

Более того, высокоомная вода, обеднённая по тяжелым изотопам при соотношении, например, D/Н менее 90 ppm (что соответствует антарктическому льду, т. н. стандарту SLAP) обладает значительной биологической активностью ( Somlyai G.,1993; tefnescu I., 2003;

Somlyai G., 2007).

Как уже упоминалось, гигантские кластеры воды – дейтерий-стабилизированные плотностные неоднородности с градиентом потенциала на межфазной границе с медленн ой кинетикой релаксации. Рассматривая дейтерий как основной фактор регуляции структуры воды, можно предположить, что в зависимости от его содержания кинетика гибели клеток инфузорий должна быть различна.

При внесении в среду с инфузориями S. ambiguum определенных химических веществ клетки погибают в течение интервала времени, являющегося функцией как концентрации, так и температуры (Быканова С.Н., Сыроешкин А.В., 2003). Гибели клетки предшествует формирование переходного состояния с изменением морфоме трических характеристик и специфических поведенческих реакций.

Обнаружено, что при инкубации инфузорий оптимальным соотношением D/H для существования клеток является интервал от 75 до 125 ppm (рисунок 1). В указанном диапазоне концентраций дейтерия в воде независимо от температуры инкубации, отсутствует влияние соотношения D/H на время жизни инфузорий. По -видимому, природные концентрации дейтерия в воде являются оптимальными для нормального функционирования живой клетки.

Ea, кДж/моль Рисунок 1 - Зависимость энергии активации ( A) лиганд-индуцируемой гибели S.

ambiguum и времени жизни клетки (B) от соотношения D/H при различной температуре Препараты высокоомной воды с измененным соотношением D/Н демонстрируют снижение концентрации ГГК и их «измельчение» (Сыроешкин А.В., Гончарук В.В., 2005).

Это явление позволяет предполагать, что оптимальное соотношение D/H для существования клеток S. ambiguum - интервал от 75 до 125 ppm - обусловлено стабильностью структурной организации воды. Изменение соотношения D/H за пределами этого интервала практически не влияет на энергию активации кинетики гибели клетки, так как специфические токсиканты отсутствуют. Значительное обеднение или о богащение высокоомной воды по дейтерию снижает продолжительность жизни клеточного биосенсора, по -видимому, за счет изменения активности молекулярной воды, доступной для всасывания одноклеточного организма.

2. Физико-химические основы разработки лазерного метода определения подлинности водных растворов лекарственных веществ без вскрытия упаковки Изучение структуры и организации воды и водных растворов различными оптическими методами, проведённое в различных научных группах (Гончарук В.В. и др., 2006, Фесен ко Е.Е., 1999), показало, что в воде формируются плотностные неоднородности (гетерофазные структуры) с размерами до 100 мкм, отличающиеся от объемной воды диэлектрической проницаемостью и получившие название гигантских гетерофазных кластеров (ГГК) воды.

Наличие различных по размерам популяций ГГК может быть обусловлено участием в их формировании различных частиц – Н+, OH-, включающих изотопы кислорода и водорода, ионов металлов, гидратированного электрона, наночастиц и др. (Гончарук В.В., Лапшин В.Б.

и др., 2004). Различные комбинации перечисленных частиц, как известно, влияют на структуру молекулярных кластеров воды, что, в свою очередь, должно приводить к образованию ГГК различных размеров и с различными релаксационными свойствами (Сыроешкин А.В., Успенска я Е.В., 2007). Ниже представлены результаты, описывающие возможность метода LALLS при получении размерных спектров распределения частиц классических гетерогенных лекарственных средств и плотностных неоднородностей, формирующихся в водных растворах, - гигантских кластерах воды, открытых в Институте биофизики РАН и Институте коллоидной химии и химии воды им. А.В. Думанского НАН Украины.

2.1 Светорассеяние взвесей и гомогенных водных растворов Методы, основанные на явлении светорассеяния, были применены нами д ля анализа фармацевтической продукции - различных дисперсных систем, например, сульфата бария для рентгеноскопии (Сыроешкин А.В., Ульянцев А.С., 2009), а также препаратов воды.

Результатом анализа являются размерные спектры численного или объёмного распред еления частиц, объёмная концентрация частиц ( рисунок 2). Для калибровки подобного оборудования используются монодисперсные латексные микро - и наносферы определённого диаметра, производимые фирмами “Invitrogen”, “DukeSciene”, “Thermo Scientific”.

Рисунок 2 – Размерные спектры объёмного распределения частиц препаратов сульфата бария, стандартных микросфер и воды ( A – латексные микросферы « Invitrogen» 100 мкм;

B – высокоомная вода; C – «Barium sulfate EZ-HD»). Дисперсант – высокоомная вода При анализе взвесей стандартных латексных микросфер нанометрового диапазона методом малоуглового рассеяния лазерного света были обнаружены значительные расхождения от нормативных значений. Так при анализе методом малоуглового светорассеяния гидрофобных на носфер диаметром менее 100 нм их диаметр оказывается превышенным на порядки, что объясняется инициацией наночастицами образования гигантских кластеров воды. Но при анализе более крупных частиц подобные расхождения не обнаружены: диаметр совпадает с заявлен ным значением. При использовании метода DLS явление значительного завышения кажущегося диаметра наночастицы отсутствует. Метод малоуглового светорассеяния основан на анализе индикатрисы рассеяния света плотностными неоднородностями в растворе (суспензии, э мульсии, растворы ПАВ и наночастиц, газовые пузырьки и т.п.). Метод динамического светорассеяния позволяет определить коэффициент диффузии дисперсных частиц в жидкости путем анализа характерного времени флуктуаций интенсивности рассеянного света. Оценивая время релаксации, можно определить диаметр частиц. Кинетика релаксации гигантских гетерофазных кластеров воды, индуцируемых наночастицами, значительно более медленная, чем при броуновских флуктуациях. В методе LALLS используются усредненные данные по светорассеянию ансамбля плотностных неоднородностей (не менее 10000 измерений) за 3 - минуты наблюдения, что и позволило обнаружить в водных образцах дейтерий -зависимые гигантские кластеры воды (Гончарук В.В. и соавт., 2009) с характерными размерными спектрами (рисунок 2).

2.2 Концентрационные градиенты рН и формирование межфазных границ у дейтерий-стабилизированных гигантских гетерофазных кластеров воды Как известно из физической химии сопряжённых необратимых процессов, под влиянием градиента температуры может возникнуть поток вещества (эффект Соре). В процессе переноса вещества определяющую роль играет турбулентная диффузия, характер которой зависит от структуры пульсационного поля скоростей и распределения энергии турбулентности между пульсациями различных масштабов. В случае крупномасштабной турбулентности для моделирования диффузионного переноса применяется общий статистический подход, использующий две ключевые величины диссипативной гидродинамической системы (определяющие передачу энергии от более крупных вихрей к более мелким) – скорость вязкой диссипации энергии и масштаб турбулентности. А.Н.

Колмогоровым в 1949 году установлено на примере дробления турбулентной струи, что переход энергии в тепло для воды осуществляется на масштабе 0,1 мкм, что соответствует максимальному размеру гигантских кластеров воды. Следует отметить, что порядок размеров ГГК не случайно совпадает с колмогоровским масштабом пере хода кинетической энергии в тепловую: в воде уже существует структура, обеспечивающая сопряжение этих процессов.

Термодинамической и кинетической стабилизации образовавшегося ГГК воды способствует образование (за счет различия в рН между фазой ГГК и объёмн ой воды) градиента электрохимического потенциала до 10 9 В/cм. Электрическая составляющая этого градиента приводит к эффекту более плотной упаковки диполей воды (Лапшин В.Б. и соавт., 2002).

Измерение времен спин-спиновой релаксации протонов водных образцов до и после пропускания через субмикронные нейтральные фильтры позволило определить кинетику сборки гигантских кластеров воды. При выдерживании образца после фильтрования в течение небольшого времени значения Т 2 возвращаются к исходным, что хорошо совпада ет с результатами по рН-метрии. Изменение рН при разрушении ГГК высокоомной воды с обычным содержанием дейтерия приводит к обратимому закислению (защелачиванию) среды в пределах 0,1 единицы рН ( таблица 1). Следует подчеркнуть, что изменения значения рН после фильтрования тяжелой и «легкой» воды не превышают уровня шума после пятой минуты.

При многократном проведении циклов «филь трования-отстаивания» высокоомной воды параметры LALLS, pH, T2 и «2D-LS» диаграмм возвращались к исходному состоянию. Такая обратимость релаксационных процессов формирования ГГК воды позволяет утверждать, что образование ГГК в большей степени детерминируется химическим составом воды, чем условиями турбулентной диффузии и колморгоровским «белым» каскадом диссипации энергии (Гончарук В.В., 2007). Подтверждением этого положения является вырождение всех физико-химических характеристик, связанных с формированием в водных растворах плотностных неоднородностей колмогоровского масштаба, при удалении из воды дейтерия и тяжелых изотопов кислорода или использовании D2O. В гомогенных по изотопам водорода препаратах воды (в легкой и тяжелой воде) описанное явление возникновения концентрационных неоднородностей по содержанию H+ (OH-) практически отсутствует (рисунок 3). Это объясняется резким снижением концентрации гигантских гетерофазных кластеров (Гончарук В.В., 2006), выявляемых методом LALLS.

Рисунок 3 – Динамика изменения значений рН водных образцов после фильтрования (D2O – тяжёлая вода; ddw – лёгкая вода; H2O – высокоомная вода) Таблица 1 – Динамика изменения величины рН водных образцов ( bd – высокоомная вода;

dist – дистиллированная вода) 3. Новый лазерный метод определения подлинности без вскрытия упаковки Метод когерентной микроскопии, комбинированный с интерферометрией, позволяет визуализировать кинетику мерцания гигантских гетерофазных кластеров воды в реальном времени. Результатом математической обработки получаемых изображений явля ются двумерные диаграммы sdi-di, схожие с фазовыми диаграммами в классической физической химии, характеризующие устойчивость стационарного процесса образования/распада ГГК воды при светорассеянии (2 D-LS-диаграммы).

Принцип метода состоит в следующем : луч от красного лазера пропускали через систему линз, на определенном расстоянии от которой располагали образец. Оптическую картину проецировали на экран монитора с помощью цифровой камеры, соединённой посредством USB-кабеля с персональным компьютером. Поскольку показатели преломления света воды, заключённой в гигантский кластер, и «континуальной» (объёмной) воды различаются, то при прохождении пучка лазерного света возникает оптическая разность хода, интерференционная картина приобретает вид чередования тёмных и светлых пятен. Схема прибора представлена на рисунке 4.

Рисунок 4 - Схема прибора для исследования кинетики релаксации гигантских гетерофазных кластеров воды методом лазерной интерферометрии 3.1 Определение чувствительности, повторяемости и воспроизводимости разрабатываемого метода на примере инфузионных растворов Для апробации нового метода нами выбраны классические инфузионные растворы, часто применяемые в медицинской практике. Новый метод отличается экспрессн остью и возможностью проводить анализ без нарушения целостности упаковки.

Для анализа на воспроизводимость и повторяемость выбирали по пять образцов инфузионных растворов каждой серии одного производителя. Чувствительность и селективность метода определял и на образцах раствора натрия хлорида различной концентрации, дистиллированной воде и образцах готовой продукции. Измерения проводились при температуре 21±1 °С.

Для образцов инфузионных растворов получали 2 D-LS диаграммы и проводили их статистический анализ (рисунок 5, A,B). Результаты анализа изотонического раствора натрия хлорида свидетельствуют о том, что независимо от производителя или серии, устойчивость и кинетика мерцания гигантских кластеров воды одинаковы. От серии к серии выраженных различий не наблюдается, как и при различной длительности хранения ( рисунок 5, D).

Показана температурная зависимость – при снижении температуры значения дескрипторов снижаются и их разброс уменьшается, что объясняется температурно -зависимой стабилизацией ГГК воды ( рисунок 5, С).

При сравнении с результатами анализа дистиллированной воды и раствора натрия хлорида неизотонической концентрации наблюдаются выраженные изменения, что позволяет быстро выявить грубую ошибку при выпуске готовых изотонических растворов.

sd Рисунок 5 – Результаты статистической обработки данных по лазерной интерферометрии образцов воды и растворов натрия хлорида ( n=400) (A – 2D-LS диаграммы; B – частотный спектр d3; C – вариабельность значений d 1 в зависимости от температуры; D – вариабельность значений d 1 в зависимости от времени хранения образца) 3.2 Анализ бутилированных лечебно -столовых и лечебных минеральных вод Минеральные воды широко представлены в ассортименте как оптово -розничных сетей, так и аптечных учреждений. Следует отметить, что питьевые лечебно -столовые и лечебные воды, которые следует назначать и применять под контролем врача, свободно продаются без каких-либо предупреждений и ограничений. Известны случаи подделки торговых марок минеральных вод. В связи с этим возникает необходимость экспресс -контроля подлинности продаваемых в магазинах минеральных вод.

Минеральная вода каждой из трёх исследуемых торговых марок, имеющая индивидуальный физико-химический состав, характеризовалась оп ределенным, отличным от других вод, расположением облаков рассеяния на диаграмме. Для каждой марки минеральной воды облака имеют характерную форму и расположение ( рисунок 6).

sd Рисунок 6 – 2D-LS-Диаграмма (A) и частотный спектр (B) sd1 образцов минеральных вод (n=900) Различие между исследуемыми образцами удобно оценивать после статистической обработки диаграмм по частотному спектру. Предлагаемый метод позволяет различить не только однокомпонентные системы, такие как раствор хлорида на трия, но и сложные многокомпонентные растворы, включающие в себя наночастицы, такие как природные минеральные воды.

3.3 Лёгкая вода (ddw) Большой интерес к воде с пониженным содержанием дейтерия ( ddw) возникает в связи с обнаруженным противоопухолевым эффектом (Somlyai G., Jancso G., 1993). Лёгкая вода не только улучшает обменные процессы, но и способствует увеличению защитных сил организма. Реализовано массовое внедрение воды с пониженным содержанием дейтерия: в странах Евросоюза лёгкая вода выпускаетс я и используется в комплексном лечении опухолевых заболеваний (Preventa TM); в США лёгкая вода позиционируется как профилактическое противоопухолевое средство. В России фирмой OOO «МТК Айсберг»

выпускается лёгкая вода «Лангвей». В связи с распространением лёгкой воды в продаже становится актуальным экспресс -определение её подлинности, так как изотопный анализ высокоомной воды доступен лишь в немногочисленных научно -исследовательских лабораториях.

Метод лазерной интерферометрии позволил различить не только раствор ы различного химического состава, но и разного изотопного состава ( рисунок 7). Статистический анализ 2D-LS-диаграмм позволил различить легкую ( ddw, 4 ppm D/H), дистиллированную (H2O, ppm D/H) и тяжёлую воду (D2O). Для воды, обеднённой и насыщенной по с одержанию дейтерия, вариабельность значений стандартного отклонения лежат в значительном интервале, что свидетельствует о высокой неупорядоченности структуры ввиду изотопного эффекта. Данное явление связано с нестабильностью гигантских кластеров воды и их малочисленностью, о чём свидетельствуют меньшие, по сравнению с дистиллированной водой, значения дескриптора. Образец дистиллированной воды, в свою очередь, характеризуется высокой устойчивостью ГГК воды.

sd Рисунок 7 – 2D-LS-Диаграмма (A) и частотный спектр (B) образцов воды (n=400)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате исследований в рамках настоящей диссертационной работы показана возможность сочетания методов лазерного светорассеяния и биотестирования для оценки степени обеднённости воды по изотопам водорода. Результаты анализа образцов лекарственных средств и минеральных вод с помощью комбинированного метода лазерной интерферометрии и когерентной микроскопии демонстрируют возможность применения данного метода для определения подлинности готовой продукции лекарственных средств в простейшей лекарственной фор ме и минеральных вод без вскрытия упаковки. Известный уже несколько десятилетий метод исследования гетерогенных систем – LALLS – требует прецизионного оптического оборудования по схеме спектрофотометра. Разработанный нами метод использует кинетику «мерцани я» дейтерий-стабилизированных плотностных неоднородностей в воде – гигантских гетерофазных кластеров, поэтому независим при приборостроении от геометрии кюветы и искажениях при рассеянии света. Это подтверждает многолетний опыт эксплуатации трех лабораторн ых образцов нового прибора в РУДН, ФГУ «ГОИН» и ИКХХВ им. А.В. Думанского.

Возможность создания нового метода определения подлинности лекарственных средств обусловлена и применением новых достижений хемометрики, развитых нами из теоретического аппарата си стемы ККСА (QSAR, количественных корреляций структура активность лекарственных веществ) и достижений метода БИК -спектрометрии, использующих анализ многомерных множеств. Программно -аппаратный комплекс нового метода определения подлинности без вскрытия упако вки позволяет быстро получать и обрабатывать значительные массивы данных (до 50000 результатов измерений, что соответствует измерению в течение десяти минут). Представленные на рисунках 5 и результаты спектрального анализа имеют значительно большую стати стическую значимость, чем, например, стандартные хроматографические профили, так как дублируются результатами многих 2D-LS диаграмм - в настоящей работе в основном использованы дескрипторов. Расширенный мультидескрипторный анализ позволяет получать идентификационные «портреты» кинетики релаксации препаратов воды с очень незначительными различиями по стандартным физико -химическим характеристикам (препараты «легкой» воды, с различным содержданием дейтерия), с точки зрения математической обработки идентичные данным «finger-print» анализа в молекулярной биологии.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что оптимальным соотношением D/H для существования клеток S.

ambigua является интервал от 75 до 125 ppm, обеднение или обогащение высокоомной воды по дейтерию снижает продолжител ьность жизни клеточного биосенсора, практически не влияя на энергию активации кинетики гибели;

2. Экспериментально показано, что после разрушения ГГК воды восстанавливаются в течение 30-60 минут по данным величин Т 2, рН и результатам малоуглового рассеяния лазерного света (LALLS);

3. Установлено участие дисперсионных взаимодействий в «сборке» ГГК воды из нанокластеров при стабилизации образующихся субмиллиметровых образований за счёт HOD и формирования межфазного градиента Н +;

4. Разработана методика определения п одлинности инфузионных растворов и бутилированных минеральных вод, позволяющая выявлять бракованную продукцию без вскрытия упаковки;

5. Предложен метод определения степени обеднения воды по тяжёлым изотопам с применением множественного дескрипторного анализа кинетики релаксации дейтерий зависимых плотностных неоднородностей водных растворов субмиллиметрового диапазона.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ddw – Deuterium depleted water – Обеднённая по дейтерию вода (лёгкая вода) DLS – Dynamic Light Scattering – Динамическое рассеяние света LALLS – Low Angle Laser Light Scattering – Малоугловое рассеяние лазерного излучения БИК – Ближняя инфракрасная область ГГК – Гигантские гетерофазные кластеры ЯКР – Ядерный квадрупольный резонанс ЯМР – Ядерный магнитный резонанс

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ульянцев А.С. Разработка метода определения подлинности природных бутилированных минеральных лечебных и лечебно -столовых вод без вскрытия упаковки с применением лазерной интерферометрии / Итоговая конференция студенческого научного общества медицинского факультета РУДН «Клинические и теоретические аспекты современной медицины», 2007. - С. 80-81.

2. Успенская Е.В., Попов П.И., Ульянцев А.С. Применение метода лазерной интерферометрии для определения подлинности бутилированных минеральных лечебных и лечебно-столовых вод без вскрытия упаковки / Материалы 3 -й всероссийской научнометодической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиоло гически активных веществ», 2007. - С. 375-376.

3. А.С. Ульянцев, Е.В. Успенская, Т.В. Плетенева, А.В. Сыроешкин Оценка качества питьевых вод методом лазерной интерферометрии// Современные проблемы медико криминалистических, судебно - химических и химико-токсикологических экспертных исследований. Сборник материалов Всероссийской научно -практической конференции, посвященной памяти профессора Ю.М.Кубицкого (31 октября – 01 ноября 2007 г., Москва).

//Под редакцией профессора В.А. Клевно – М.: РИО ФГУ «РЦСМЭ Росздрава», 2007. - С.

286-288.

4. Ульянцев А.С., Успенская Е.В., Сыроешкин А.В. О возможности применения метода лазерной интерферометрии при определении подлинности водных растворо в лекарственных средств без вскрытия упаковки / Вестник РУДН, серия медицина, 2008. - № 7, С. 572-574.

5. Ульянцев А.С., Успенская Е.В., Сыроешкин А.В., Гончарук В.В. Применение лазерных экспресс-методов анализа как путь решения проблемы обеспечения населени я качественной водой / Материалы Всероссийского совещания судебно -медицинских экспертов по применению правил и медицинских критериев определения тяжести вреда, причиняемого здоровью человека и Итоговой научно -практической конференции Российского центра судебно-медицинской экспертизы. 30 -31 октября. 2008. – М.: РИО ФГУ РЦСМЭ Минздрасоцразвития России. – с. 254-256. - С. 254-256.

6. Сазонова Н.Н., Джавахян М.А., Сёмкина О.А., Ульянцев А.С. Дисперсионный анализ экстракта гипорамина / Материалы VII Международног о симпозиума по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты, 2009. – С. 240-241.

7. Сыроешкин А.В., Гребенникова Т.В., Плетенева Т.В., Ульянцев А.С. и др. Наночастицы в природных водах / Труды ВНИИФТРИ «Наночастицы в природных и технологическ их средах. Методы и средства измерений», 2009. – вып. 56 (148). - С. 91-101.

8. Ульянцев А.С., Успенская Е.В., Сыроешкин А.В. Современные представления о качестве питьевой воды как показателе качества жизни / Материалы XIV международного симпозиума «Эколого-физиологические проблемы адаптации», 2009. – С. 415-416.

9. Ульянцев А.С., Успенская Е.В., Сорокина Н.С., Плетенева Т.В., Сыроешкин А.В.

Применение метода малоуглового рассеяния лазерного излучения для контроля качества порошков и суспензий лекарственных сре дств. Сообщение 2. Бария сульфат / Химико фармацевтический журнал, 2009. – том 43, № 7. – С. 48-50.

10. Ульянцев А.С., Успенская Е.В., Плетенева Т.В., Попов П.И., Самсони -Тодоров А.О., Гончарук В.В., Сыроешкин А.В. Экспресс -метод определения подлинности водны х растворов лекарственных средств / Химико -фармацевтический журнал, 2009. – том 43, № 12. – С. 47-51.

11. Джавахян М.А., Ульянцев А.С., Хомик А.С., Сёмкина О.А., Сазонова Н.Н. Использование метода дисперсионного анализа с целью изучения аппликационной лекарств енной формы гипорамина / Сборник материалов XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», 2010. – С. 604.

12. Ulyantsev A.S., Lesnikov E.V., Matveeva I.S., Karpov O.V., Lapshin V.B., Syroeshkin A.V.

Laser technologies for detection nanoparticle s in environmental media // Chemical Engineering Transactions, 2010. – V. 22, Р. 221-225.

13. Ulyantsev A.S., Maveeva I.S., Uspenskaya E.V., Pleteneva T.V., Syroeshkin A.V. Nanoparticles in natural waters // Микроэлементы в медицине, 2010. – Т. 11, Вып. 2. – С. 18.

14. Цисанова Е.С., Сыроешкин А.В., Ульянцев А.С., Успенская Е.В., Плетенева Т.В., Климова Э.В., Берсенева Е.А. Изучение биологической активности и соотношения дейтерий/протий (d/h) в воде с помощью клеточного биосенсора S. ambiguum // Электронный журнал «Исследовано в россии», 2010. – том 13, С. 588-593.

15. Красовский П.А., Карпов О.В., Балаханов Д.М., Лесников Е.В., Данькин Д.А., Матвеева И.С., Ульянцев А.С., Плетенева Т.В., Сыроешкин А.В., Чиквиладзе Г.Н., Лапшин В.Б.

Наночастицы в природных минеральных водах. Методика и результаты измерений // Измерительная техника, 2010. - №8. – С.16-20.

Ульянцев Александр Сергеевич «Разработка лазерного метода определения подлинности жидких лекарственных форм»

В работе представлены результаты по исследованию ре лаксационных свойств гигантских гетерофазных кластеров (ГГК) воды, изучена биологическая активность образцов высокоомной воды с различной концентрацией и размерными спектрами ГГК воды с применением биотестирования.

Установлен возможный механизм формирован ия ГГК воды из супрамолекулярных структур нанометрового диапазона. Было установлено, что оптимальным соотношением D/H для существования клеток S. ambigua является интервал от 75 до 125 ppm, обеднение или обогащение высокоомной воды по дейтерию снижает прод олжительность жизни клеточного биосенсора, практически не влияя на энергию активации кинетики гибели. Экспериментально показано, что после разрушения ГГК воды восстанавливаются в течение 30 -60 минут по данным величин Т 2, рН и результатам малоуглового рассе яния лазерного света (LALLS).

Разработана методика определения подлинности инфузионных растворов и бутилированных минеральных вод, позволяющая выявлять бракованную продукцию без вскрытия упаковки. Предложен метод определения степени обеднения воды по тяжёл ым изотопам с применением множественного дескрипторного анализа кинетики релаксации дейтерий-зависимых плотностных неоднородностей водных растворов субмиллиметрового диапазона.

Alexander S. Ulyantsev “Design of laser authenticating technique for liquid pharmaceutical forms” In this paper the results on researching of giant heterophase clusters (GHC) of water relaxation characteristics are offered. Biol ogical activity of samples of water with different D/H ratio and GHC size spectra is estimated by Spirotox test.

Potential mechanism of GHC formation of nanostructures is offered. The optimum of D/H ratio for normal cell activity is in a range from 75 to 125 ppm. Deuterium depletion or saturation of this range leads to decreasing of protozoa cells life time without changing values of cell death energy of activation. GHC of water restruct after their destruction during 30 -60 minutes that follows from results of LALLS, NMR and potentiometry.

Methodology of establishing authenticity of infusion medicines and bottled mineral waters without unpacking has been developed. A new method for deuterium depletion on multiple descriptor analysis of densitive heterogen eities relaxation kinetics in the water has been suggested.