На правах рукописи

Хахулина

Марина Александровна

Разработка и стандартизация гелей на основе сухих

экстрактов растительного сырья винограда культурного

(Vitis vinifera L)

14.04.02 – Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Москва - 2010 2 Диссертационная работа выполнена в Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова на кафедре общей химии стоматологического факультета.

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук, профессор Решетняк Владимир Юрьевич

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор Даргаева Тамара Дарижаповна Доктор фармацевтических наук, профессор Берлянд Александр Семенович

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов (РУДН)

Защита диссертации состоится « _» 2010 г. в 14. на заседании Диссертационного Совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, Автореферат разослан: «»2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 006.070.01, доктор фармацевтических наук А.И. Громакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы В настоящее время число воспалительных заболеваний слизистой оболочки полости рта среди населения заметно возросло.

Для лечения и профилактики часто используют жидкие лекарственные формы – ополаскиватели, растворы, бальзамы, существенным недостатком которых является кратковременность воздействия на пораженные участки, а значит, и увеличения кратности приема пациентами для обеспечения терапевтического эффекта. Гели, чаще используемые пациентами, обладают адгезивными свойствами и локализуются в очаге поражения, что позволяет повысить эффективность лечения и снизить кратность приема. Ассортимент гелей в настоящее время невелик и представлен гелями на основе синтетических соединений. Гели на основе растительных экстрактов составляют небольшую долю среди стоматологических гелей. Поэтому разработка и анализ лекарственной формы «гели» с растительными экстрактами является актуальной задачей для современной стоматологии.

Кроме того, доказано, что в этиологии возникновения многих заболеваний, в том числе и заболеваний полости рта, одним из факторов является нарушение антиоксидантного баланса организма, что приводит к необходимости применять антиоксиданты, среди которых предпочтительнее натуральные.

Известно, что полифенольный комплекс экстрактов винограда обладает высокой антиоксидантной активностью. Основным сырьевым источником получения полифенольного комплекса являются отходы винодельческой промышленности, включающие жом и гребни грозди винограда, которые в настоящее время достаточно изучены. Большую часть отходов составляют семена винограда, которые можно рассматривать как перспективный источник полифенольного комплекса.

Цель и задачи исследования Целью исследования является изучение химического состава экстракта из нового сырьевого источника семян винограда и рекомендованного экстракта гребней грозди для разработки и стандартизации лекарственной формы «гели» на их основе.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1.Провести предварительное фармакогностическое изучение гребней грозди и семян винограда культурного;

2.Исследовать химический состав экстрактов из гребней грозди и семян винограда в соответствии с НД и на основе проведенного анализа обосновать перечень показателей качества для стандартизации экстрактов;

3.Провести сравнительный анализ БАВ водно-спиртового извлечения из сырьевого источника и полученных экстрактов и гелей с целью оценки сохранности основных БАВ и на основе полученных данных рекомендовать показатели стандартизации экстрактов и гелей на их основе.

4. Разработать состав нового стоматологического геля;

5.Исследовать экстрактов и гелей на их основе;

6.Изучить антимикробную активность гелей;

7.Обосновать на основе проведенных исследований показатели качества для лекарственной формы «гели».

Научная новизна Впервые изучен фитохимический состав нового перспективного растительного сырья «семена винограда» и предложены показатели стандартизации исходного сырья и сухого экстракта на его основе.

Разработан оригинальный состав стоматологических гелей на основе сухих экстрактов растительного сырья винограда культурного.

Впервые показана биологическая активность сухого экстракта нового предлагаемого сырья «семена винограда».

Показана сохранность биологически активных соединений (катехинов, проантоцианидинов) сухих экстрактов семян и гребней грозди винограда в предложенной лекарственной форме, разработанной для использования в стоматологии.

Практическая значимость работы и внедрение в практику На основании проведенных исследований разработаны и предложены:

Патент РФ №2351313 «Состав для лечения заболеваний полости проект ФС на «Винограда культурного семена высушенные»;

проект ФС на «Винограда культурного семян экстракт сухой»;

проект ФС на «Гель винограда семян экстракта сухого для наружного применения 2%».

Основные положения, выносимые на защиту 1.Результаты фармакогностического изучения впервые предлагаемого растительного сырья «семена винограда»;

2. Результаты сравнительного анализа основных действующих веществ в экстрактах и гелях, определение идентичности состава и сохранности действующих веществ в лекарственной форме;

3. Результаты разработки состава геля на основе экстракта семян и гребней грозди винограда, обладающий антиоксидантной и антимикробной активностью;

4. Разработка показателей качества гелей.

Апробация работы Основные положения работы доложены на:

ХIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», г.Москва, октябрь, 2006г.;

IV Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов», г. Москва, июнь, 2007г.;

VIII международном конгрессе «Здоровье и образование в ХХI веке. Современные концепции болезней цивилизации», г.Москва, ноябрь, 2007г.

Публикации По теме диссертации опубликовано 7 работ, получен патент РФ на изобретение №2351313 «Состав для лечения заболеваний полости рта».

Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 125 страницах, содержит 30 таблиц, 25 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, библиографии из источников, из которых 62 - на иностранных языках и приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Фармакогностическое изучение гребней грозди и нового сырьевого источника «семена» винограда культурного Сырьем для исследований служил виноград сорта «Молдова», удовлетворяющий требованиям ГОСТ 25896-83, урожай 2005г.

Подготовку сырья осуществляли в лабораторных условиях. Она включала отделение гребней грозди от ягод винограда вручную, механическое отжатие сока из отделенных ягод под прессом, раздельную обработку и сушку жома и гребней грозди при температуре 40-50С в течение 10 часов, просеивание через сито.

Макроскопический анализ. В результате проведенного макроскопического анализа определены форма, размеры, характер поверхности, цвет, запах, вкус гребней грозди и семян винограда.

одревесневшие. Гребень состоит из главной оси, от которой отходят ответвления 2, 3 порядков. Ответвления высшего порядка оканчиваются плодоножками. По длине гребни грозди средние – 12см (главная ось). Ответвления длиной 2-4см. По ширине гребни грозди – широкие (ширина составляет 2/3 длины). Толщина гребней грозди составляет 3-5мм (главная ось), 2-3мм – ответвления.

Поверхность гребней грозди шероховатая, неровная, коричневатого цвета. Запах при растирании слабый, вкус вяжущий.

Семена винограда округлопочковидной формы, с выраженным заостренным клювиком с одной стороны и округлые с другой, длиной 5-7мм, шириной 3-5мм, толщиной 2-3,5мм.

Поверхность семян гладкая, матовая, коричневого цвета. Вдоль семени с одной стороны проходит ясно заметная бороздка. Кожура семени прочная. Зародыш состоит из двух семядолей и небольшого корешка. Запах слабый, вкус вяжущий.

соответствии с общими фармакопейными статьями «Методы анализа лекарственного растительного сырья», раздел «Семена» (ГФ ХI изд., вып.1, С.260) и «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» (ГФ ХI изд., вып.1, С.277) со следующими дополнениями: препараты эпидермы гребней грозди винограда готовят после кипячения в 2,5% растворе NaOH. Поперечные срезы производят лезвием от руки после предварительного размягчения сырья в растворе спирт-глицерин-вода (1:1:1).

На поперечном срезе гребней грозди винограда виден одноклеточный лигнифицированный слой мелких клеток эпидермы.

Под ним находится ассимиляционная паренхима, за которой следует 7-10 рядный слой более крупных толстостенных клеток склеренхимы.

Проводящая система представлена сросшимися проводящими пучками, образующими плотное кольцо ксилемы, в которой присутствует межпучковая паренхима. Над флоэмой обнаружены скопления склеренхимных клеток с толстыми лигнифицированными клеточными стенками. Паренхима сердцевины крупноклеточная, содержит крахмальные зерна. Поперечный срез гребней грозди винограда представлен на рис. 1.

Рис. 1. Поперечный срез гребней грозди винограда: 1 – эпидерма, 2 – паренхима, 3 – склеренхима, 4 – скопления склеренхимных клеток, 5 – сросшиеся проводящие пучки, 6 – паренхима сердцевины с крахмальными зернами.

При рассмотрении микропрепаратов кожуры семян диагностическое значение имеют: длинные с прямыми стенками клетки экзокарпа основной части семени, клетки экзокарпа клювика семени со слабо извилистыми стенками и менее вытянуты, пучки игольчатых кристаллов – рафиды мезокарпа.

На поперечном срезе семени видны две семядоли. Под тонким слоем экзокарпа расположен толстый слой мелкоклеточного мезокарпа, клетки которого содержат рафиды. Эндокарп состоит из столбчатых каменистых клеток. Эндосперм богат маслом и алейроновыми зернами, среди клеток эндосперма встречаются друзы оксалата кальция (рис. 2).

Рис. 2. Поперечный срез семени: 1 – экзокарп, 2 – мезокарп с пучками игольчатых кристаллов, 3 – эндокарп, 4 – эндосперм с каплями жирного масла, алейроновыми зернами и друзами оксалата кальция.

Проведенные качественные реакции с изучаемым сырьем позволили обнаружить дубильные вещества (черно-зеленое окрашивание клеток паренхимы гребней грозди и водного извлечения из семян винограда при добавлении нескольких капель 1% раствора железоаммониевых квасцов), капли масла (оранжевое окрашивание порошка семян винограда при добавлениии 2-3 капель реактива Судан III). Раствор флороглюцина с 25% серной кислотой позволяют установить наличие одревесневших элементов на поперечном срезе гребней грозди винограда.

Результаты изучения числовых показателей пяти образцов исследуемого сырья позволили установить нормы содержания влажности, золы общей, золы нерастворимой в 10% HCI, других частей винограда, частиц, проходящих сквозь сито диаметром 5мм, поврежденных семян, органической и минеральной примеси.

При фармакогностическом анализе, проведенном впервые для используемого сырья, выявлены наиболее значимые диагностические признаки, обнаружен ряд веществ в растительных тканях, определены числовые показатели, которые можно рекомендовать для включения в НД при стандартизации гребней грозди и семян винограда культурного.

2. Получение и оценка качества экстрактов семян и гребней грозди винограда культурного (Vitis vinifera L) Сухие экстракты семян и гребней грозди винограда получены методом сублимационной сушки из очищенного водно-спиртового извлечения по методике, предложенной Ереминой Н.В. Экстракты представляют сыпучие порошки розоватого и темно-коричневого цвета, очень легко растворимые в 60% спирте, растворимые в воде.

Экстракты обладают специфическим приятным запахом и вяжущим вкусом. Выход готового продукта составил 38% для экстракта семян и 25% для экстракта гребней грозди.

Согласно требованиям статьи «Экстракты» в сухих экстрактах определяют содержание влаги и тяжлых металлов по методикам, указанным в ГФ ХI, вып.2, С.161. Содержание влаги в экстрактах составило 2,6% (семена) и 2,9% (гребни грозди). Содержание тяжелых металлов – менее 0,01%.

Стандартизацию экстрактов по показателям «качественные реакции» и «количественное определение» определяли в соответствии с требованиями ТУ 9176-050-46865780-04 и ТУ 9176Результаты подлинности сухих экстрактов семян и гребней грозди винограда свидетельствуют о присутствии дубильных веществ в обоих экстрактах, флавоноидов – в экстракте гребней грозди, антоцианов – в экстракте семян.

Количественное определение суммы полифенольных соединений определяли спектрофотометрически методом Фолина Чиокальтеу в пересчете на галловую кислоту согласно требованиям ТУ на спектрофотометре марки «Specord 50» фирмы Analytik Jena, Германия. Толщина кюветы 10 мм. Область максимального поглощения продуктов red/ox реакции составила 758±5 нм. В качестве стандартного образца использовали галловую кислоту «Sigma-Aldrich» 14,791-5.

Содержание суммы полифенольных соединений в пересчете на галловую кислоту и абсолютно сухое сырье в исследуемых образцах экстракта гребней грозди винограда составляет 3,41%; в экстракте семян – 4,61%. Ошибка единичного определения с 95% вероятностью методики количественного определения суммы полифенольных соединений в пересчете на галловую кислоту в экстрактах винограда не более 6,29% (табл. 1).

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы полифенольных соединений в пересчете на галловую кислоту в экстрактах винограда (Vitis vinifera L.) Для подтверждения отсутствия систематической ошибки были проведены опыты с добавками галловой кислоты, относительная ошибка определения не превышает ± 5,07%.

Определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин предусмотрено в ТУ, как второй показатель количественного определения БАВ гребней грозди винограда. Количественную оценку содержания флавоноидов проводили методом УФ-СФМ. В качестве рабочего стандартного образца использовали раствор ГСО рутина (ГФ XI, вып. 2, с.325) Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в исследуемых образцах экстракта гребней грозди винограда составляет 1,98%. Ошибка единичного определения с 95% вероятностью методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в экстракте гребней грозди винограда не более 2,26%. Для подтверждения отсутствия систематической ошибки были проведены опыты с добавками рутина, относительная ошибка определения не превышает ± 1,99%.

Кроме основных показателей, по которым проводилась стандартизация экстрактов гребней грозди и семян винограда согласно ТУ, мы провели дополнительно ТСХ анализ. Неподвижной фазой служила хроматографическая пластина Merk Kieselgel 2020 см, подвижной фазой – две системы растворителей: н-бутанолуксусная кислота - вода (40:12:28) и хлороформ – пропанол уксусная кислота - вода (20:20:5:5). Хроматографируют восходящим способом. В качестве детектирующего реагента использовали 5% раствор фосфорномолибденовой кислоты в 95% спирте этиловом.

Для ТСХ анализа использовали РСО растворов гиперозида, эпигенина, лютеолина, кверцетина, катехина, рутина, галловой кислоты. На хроматограммах испытуемых растворов экстрактов винограда в двух системах растворителей после проявления в УФсвете обнаружены зоны с Rf 0,90 (галловая кислота) и Rf 0, (катехин). Данные ТСХ анализа могут быть использованы для дополнительного подтверждения подлинности экстрактов винограда.

Исследование качественного и количественного состава полифенольных соединений экстрактов винограда проводили также методом ВЭЖХ на хроматографе «AGILENT 1100» с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «Agilent Сhemstation» для Windows. Колонка PHENOMENEX размером 4.6250 мм, LUNA C18, 5 мкм, подвижная фаза - 0,1% трихлоруксусная кислота (ТХУ) - ацетонитрил (ACN), рН = 2,5. Детектирование проводилось при длине волны 275 нм (катехины), 360нм (флавоноиды). Скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин. Общее время анализа составило 35 мин. Предел обнаружения 1,0 мг/кг. Оценка хроматограммы проводится по временам удерживания и площади пика в автоматическом режиме.

Результаты ВЭЖХ исследований сухих экстрактов семян и гребней грозди винограда показали, что основную долю полифенольных соединений экстрактов составляют катехины.

Суммарное содержание катехинов в экстракте гребней грозди винограда составило 1,701%, в экстракте семян винограда – 1,907%.

Экстракты гребней грозди и семян винограда отличаются по качественному и количественному составу соединений, относящихся к катехинам (табл. 2).

Флавоноиды обнаружены в экстракте гребней грозди винограда.

Содержание гиперозида составило 0,037%, рутина – 0,015%.

Витексин, астрагалин, кверцетин обнаружены в следовых количествах.

Количественное содержание катехинов в экстрактах Исследуемый показатель экстракте гребней экстракте семян Примечание. Сумма катехинов,% не включает значение показателей галловой и хлорогеновой кислот.

Результаты дополнительных исследований качественного и количественного состава катехинов и флавоноидов экстрактов винограда позволили нам рекомендовать показатели качества для стандартизации, отсутствующие в ТУ:

1. сумма катехинов не менее 1,70% (экстракт гребней грозди);

2. сумма катехинов не менее 1,90% (экстракт семян);

3. содержание гиперозида – не менее 0,037% (экстракт 4. содержание рутина – не менее 0,015%.

Содержание проантоцианидинов в экстрактах определяли методом Бейта-Смита с последующим фотометрическим определением их в пересчете на экстракт винограда с содержанием проантоцианидинов 95%. Относительная ошибка определения 10,2%.

Установлено, что суммарное содержание проантоцианидинов в экстракте семян винограда больше, чем в экстракте гребней грозди и составляет 61,5% и 54% соответственно. Данный показатель также может быть рекомендован для включения в перечень показателей стандартизации изучаемых экстрактов.

Антиоксидантую активность (АОА) экстрактов семян и гребней грозди винограда определяли методом DPPH (абревиатура метода повторяет название радикала дифенилпикрилгидразила Тролокс, водорастворимый аналог diphenylpicrylhydrazyl).

токоферола (витамина Е), в настоящее время принят за стандарт для оценки АОА, и его активность принимается за 1,0. Результаты АОА оцениваются в пересчете на тролоксовый эквивалент (ТЭ), где 1ТЭ = 1мг тролокса.

Пробоподготовка включает в себя приготовление раствора: 1 мл образца (а) переносят в колбу объемом 50 мл (V), доводят метанолом до метки.

Для приготовления стандартного образца с концентрацией 0,09 мг/мл необходимо 4,5 мг тролокса поместить в мерную колбу вместимостью 40 мл и довести объем до метки метанолом. Для приготовления рабочего раствора, стандартный раствор разбавляют в 10 раз (Ст).

Проведение анализа:

1 мл раствора DPPH в метаноле (0,025 мг/мл) смешивают с 3 мл метанола;

1 мл тролокса раствора стандартного и 1 мл раствора образца смешивают с 1 мл раствора DPPH в метаноле и 2 мл метанола;

Смеси выдерживают при комнатной температуре 10 минут и измеряют оптическую плотность полученных растворов при 517 нм (DД, DТ, DОб соответственно). В качестве раствора сравнения используют метанол.

Антиоксидантную активность рассчитывают по формуле:

АОА экстрактов семян винограда составляет 1089 ТЭ., а экстрактов гребней грозди - 498 ТЭ (результаты 5 исследований).

Высокое значение АОА, полученное в результате исследований сухих экстрактов винограда, позволяет нам предложить дополнительный показатель стандартизации «Антиоксидантная активность» для сухих экстрактов семян и гребней грозди винограда и ЛФ на их основе.

3. Разработка и исследование стоматологических гелей с экстрактом семян и гребней грозди винограда культурного При разработке и исследовании лекарственной формы «гели»

использовались вспомогательные вещества, разрешенные к медицинскому применению и отвечающие требованиям НД:

- основы для гелей – Na-КМЦ, альгинат натрия, ПЭГ-400, ПЭГ-1500;

- пластификатор – глицерин;

- консерванты – Гермаль115 и Гермаль плюс;

- вода очищенная.

Всего было приготовлено 76 композиций. Полученные гели оценивали по органолептическим свойствам, однородности, консистенции, реологическим свойствам (вязкости, пластичности, текучести), физико-химической совместимости компонентов.

Наилучшие результаты на данном этапе исследования показали 3% и 3,5% гели Na-КМЦ, 3% гели альгината натрия.

Внешний вид и цвет гелей определяют просмотром пробы, помещенной тонким, ровным слоем на предметное стекло или лист белой бумаги. Запах определяют органолептическим методом в пробе после определения внешнего вида. Однородность геля – отсутствие комков и крупинок – определяют под микроскопом (ГФ XI).

Определение водородного показателя (рН) гелей проводилось на приборе CRISON GLP 21 в 10% водном «растворе» геля. Результаты измерений показали, что значение рН гелей составляет от 5,52 до 6,4.

Определение вязкости гелей по Брукфильду определялась на программируемом вискозиметре Брукфильда, модель RTV. Гели на основе альгината натрия обладают умеренной вязкостью, которая составила 65600спз. Гели на основе Na-КМЦ обладают менее выраженной вязкостью - 33500спз.

Оценка подлинности гелей с экстрактом семян и гребней грозди винограда основана на реакциях подлинности экстрактов семян и кистей соплодия винограда. Методика основана на растворении навески геля (1.0 г) в 10 мл воды и дальнейшем проведении качественных реакций на группы БАВ, идентичных экстрактам винограда: к 1 мл раствора геля прибавляют 1 мл соответствующего реактива. Обнаружены дубильные вещества, флавоноиды, антоцианы, катехины.

Антимикробную активность определяют с помощью методики (ГФ ХI изд., вып.2) с использованием международных штаммов Staphylococcus aureus (АТСС 6538-Р), Escherichia coli (АТСС 25922), Pseudomonas aeruginosa (АТСС 9027), Streptococcus faecalis (ATСС 8043), Candida albicans (АТСС 885-653) в разведении 1:1000. Оценка антимикробной активности проводится по величине задержки роста микроорганизмов вокруг лунки.

Установлено, что наиболее предпочтительным является консервант Гермаль плюс в концентрации 0,5%, который оказывает антибактериальное действие на все штаммы и зоны ингибирования роста тест- штаммов которого больше по сравнению с Гермаль 115.

Результаты исследования антибактериальной активности выбранных образцов гелей показали, что гели альгината натрия с применением 0,5% Гермаль плюс обладают выраженным антибактериальным действием по сравнению с Гермалем 115 в такой же концентрации, что и определило выбор консерванта, его концентрации и основы для геля. Гели Nа-КМЦ не проявили антибактериальной активности даже при концентрации 0,5% Гермаль плюс (рис.3). Гели Na-КМЦ не удовлетворяют показателю антимикробной активности.

Рис.3. Антимикробная активность гелей: 1 – гель с 0,5% гермаль 115; 2 – гель с 0,1% гермаль плюс; 3 – гель с 0,25% гермаль плюс; 4 – гель с 0,5% гермаль плюс.

АОА гелей определяли методом DPPH. Результаты оценивались в пересчете на ТЭ.

Изучены составы гелей с содержанием экстрактов винограда 1% и 2%. Установлено:

АОА 2% гелей больше АОА 1% гелей;

АОА гелей с экстрактом семян винограда превосходит АОА гелей с экстрактом гребней грозди (табл. 3).

Антиоксидантная активность гелей на основе экстрактов винограда Содержание экстракта винограда, Тролоксовый эквивалент на 1г винограда винограда Содержание суммы полифенольных соединений в пересчете на галловую кислоту в исследуемых образцах гелей на основе сухого экстракта гребней грозди винограда составляет 1,714%; в геле на основе экстракта семян – 1,705%. Ошибка единичного определения с 95% вероятностью методики количественного определения суммы полифенольных соединений в пересчете на галловую кислоту в гелях с экстрактами винограда не более 2,8% (табл. 4).

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы полифенольных соединений в пересчете на галловую кислоту в гелях с экстрактом винограда Vitis vinifera L Гель с экстрактом гребней грозди винограда Для подтверждения отсутствия систематической ошибки были проведены опыты с добавками галловой кислоты, относительная ошибка определения не превышает ± 2,35%.

Определение срока годности гелей определяли методом «ускоренного старения». Гели стабильны в течение срока, эквивалентного 2 годам хранения при температуре не выше 25С.

В результате проведенных исследований гелей на основе сухих экстрактов винограда нами предложены следующие показатели качества: внешний вид, цвет, запах, однородность, рН водной вытяжки, микробиологическая чистота, антиоксидантная активность, подлинность, количественное определение. Состав нового стоматологического геля: экстракта винограда -2,0; альгината натрия -3,0; гермаль плюс -0,5; глицерин -20,0; вода очищенная – до 100,0.

4. Сравнительный анализ катехинов водно-спиртового извлечения, сухих экстрактов винограда и гелей на их основе Результаты сравнительного анализа водно-спиртового извлечения и свежеполученных сухих экстрактов позволяют сделать предположение, что в процессе экстракции и концентрирования происходит изомеризация эпикатехина в катехин и частичный гидролиз эпигаллокатехина галлата и галокатехина галлата, что косвенно подтверждается заметным содержанием галловой кислоты в сухом экстракте. Характерным отличием водно-спиртового извлечения от полученного сухого экстракта является отсутствие хлорогеновой кислоты, наличие не идентифицированного соединения с временем удерживания 11 мин.

Результаты сравнительного анализа свежеполученных сухих экстрактов и после естественного двухгодичного хранения показывают, что происходит изомеризация катехина в эпикатехин, при этом суммарное количество эпикатехина и катехина сопоставимо с количеством катехина в свежеполученном (исходном) экстракте. На хроматограммах экстрактов, хранившихся в течение двух лет, не наблюдается пиков с временем удерживания 11 мин, т.е. не идентифицированное соединение, содержащиеся в водно-спиртовом извлечении, не сохраняется в сухом экстракте, оно разрушается в процессе концентрирования. Остальной качественный состав катехинов, галловой и хлорогеновой кислот в процессе хранения изменяется незначительно.

В гелях после двухгодичного естественного хранения суммарное содержание катехинов снизилось в 10 раз. Наблюдается значительное понижение содержания эпикатехина (в 40-50 раз), тогда как содержание катехина уменьшается всего в 2 раза. Галловая и хлорогеновая кислоты в гелях не обнаружены.

Результаты сравнительного анализа содержания полифенольных соединений на различных этапах получения и хранения сухих экстрактов винограда и гелей на его основе, позволяют утверждать:

катехин является доминирующим соединением в изученных образцах экстрактов и гелей даже спустя два года хранения, в то время как галловая кислота содержится в меньшем количестве и в процессе хранения в гелях не обнаружена;

катехин в меньшей степени разрушается в процессе хранения, чем другие полифенольные соединения.

На основе полученных экспериментальных данных мы сочли целесообразным предложить методику количественного определения суммы полифенольных соединений в пересчете на катехин.

В процессе проведенного исследования нами определены условия СФМ анализа - приготовление испытуемого раствора по схеме (раствор исследуемого образца вода очищенная реактив Фолина-Чиокальтеу 20% раствор карбоната натриявода очищенная, оставшееся количество до метки); использование раствора карбоната натрия в 20% концентрации; время развития устойчивой окраски два часа; область максимального поглощения – 756±5 нм.

При сравнении максимума поглощения ГСО катехина и галловой кислоты, находящегося в одинаковой области спектра, спустя два часа наблюдается смещение пиков у обоих стандартов, а через сутки – только у галловой кислоты (рис. 4, 5).

Рис. 4. Спектр ГСО катехина во времени: 1 – спектр, снятый сразу после получения окрашенного раствора; 2 – спектр, снятый через два часа; 3 –спектр, снятый через сутки.

Рис.5. Спектр ГСО галловой кислоты во времени: 1 – спектр, снятый сразу после получения окрашенного раствора; 2 – спектр, снятый через два часа; 3 –спектр, снятый через сутки Смещение пика у катехина не наблюдается, по-прежнему максимум поглощения составляет 756 нм, что дает преимущество использовать катехин в качестве ГСО.

Содержание суммы полифенольных соединений в пересчете на катехин в исследуемых образцах экстрактов семян винограда составляет 4,81%; в экстракте гребней грозди – 3,61%; в образцах гелей с экстрактом семян 1,911%, с экстрактом гребней грозди – 1,903%. Ошибка единичного определения с 95% вероятностью методики количественного определения суммы полифенольных соединений в пересчете на катехин в экстрактах винограда не более 5,14%, в гелях - не более 2,64% (табл. 5).

Для подтверждения отсутствия систематической ошибки были проведены опыты с добавками катехина, относительная ошибка определения не превышает ± 4,0%.

Метрологические характеристики метода количественного определения суммы полифенольных соединений в пересчете на катехин в сухих экстрактах Vitis vinifera L и гелях

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведен фармакогностический анализ сырья гребней грозди и семян винограда культурного, в результате которого выявлены наиболее значимые диагностические признаки, рекомендованные для включения в НД. Проведены качественные реакции. Определены числовые показатели.

2. Исследован химический состав сухих экстрактов семян и гребней грозди винограда. Экстракты удовлетворяют показателям качества, предусмотренным НД. В результате проведенного анализа обоснованы и предложены показатели качества экстракта нового растительного сырья «семена винограда» и предложены дополнительные показатели качества для экстракта гребней грозди винограда.

3. Проведен сравнительный анализ содержания катехинов в водноспиртовом извлечении из сырья винограда и полученных экстрактов и гелей методом ВЭЖХ. Показано, что катехин является доминирующим соединением в изученных образцах даже после двух лет естественного хранения, в то время как галловая кислота является продуктом гидролиза и может разрушаться в ЛФ. Показана целесообразность и предложена методика количественного определения суммы полифенольных соединений в экстрактах семян и гребней грозди винограда и в гелях на их основе в пересчете на ГСО катехин.

4. Впервые разработан состав нового стоматологического геля на основе сухих экстрактов семян и гребней грозди винограда (Vitis vinifera L). Экспериментальным путем установлены концентрации всех компонентов геля, позволяющие проявлять заявленные свойства.

5. Исследована антиоксидантная активность экстрактов и гелей на их основе. Установлено, что экстракты обладают антиоксидантной активностью, которая в 2,1 раза больше у семян, чем у гребней грозди винограда. Антиоксидантная активность 2% гелей с экстрактом семян винограда несколько больше, чем 2% гелей с экстрактом гребней грозди винограда.

6. Изучена антимикробная активность гелей. Гели на основе альгината натрия с концентрацией консерванта Гермаль плюс 0,5 % обладают выраженным антибактериальным действием в отношении штаммов: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus faecalis, Candida albicans.

7. На основе проведенных исследований обоснованы и предложены показатели качества гелей: внешний вид, цвет, запах, однородность, рН водной вытяжки, микробиологическая чистота, антиоксидантная активность, реакции подлинности и количественное определение.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Получение и стандартизация экстракта семян винограда / М.А.

Хахулина, В.Ю. Решетняк, О.В. Нестерова // ХIV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Тезисы докладов. – М., 2007. – С.236.

2. Гребни винограда культурного (Vitis vinifera) – новый источник полифенольных соединений / М.А. Хахулина, О.В. Нестерова, Е.А.

Абизов // IV Российская научно-практическая конференция «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов»: Тезисы докладов. – М., 2007. – С.104.

3. Экстракт винограда как источник полезных полифенолов для организма человека / М.А. Хахулина, О.В. Нестерова // Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты: сборник науч. трудов. – 2007. -№15. – С.126-134.

4. Изучение антимикробной активности стоматологического геля / М.А. Хахулина // VIII международный конгресс «Здоровье и образование в ХXI веке. Современные концепции болезней цивилизации»: Тезисы докладов. – М., 2007. С. 98.

5. Использование экстракта винограда в стоматологических средствах / М.А. Хахулина // VIII международный конгресс «Здоровье и образование в ХХI веке. Современные концепции болезней цивилизации»: Тезисы докладов. – М., 2007. С.99.

6. Оценка качества сухого экстракта гребней Vitis vinifera – винограда культурного как перспективной субстанции для средств профилактического и лечебного назначения / М.А. Хахулина, В.Ю.

Решетняк, О.В. Нестерова, А.А. Маркарян // Химическая технология.т.9. №12.-С.654- 7. Новый стоматологический растительный препарат местного действия / М.А. Хахулина, О.В. Нестерова, В.Ю. Решетняк, А.А.

Маркарян // Химическая технология.-2009.-т.10. №1.-С.36- 8. Патент РФ №2351313. РФ A61 K8/97, A61 K36/87, A61 Q11/00.

Состав для лечения заболеваний полости рта. // Хахулина М.А., Нестерова О.В., Решетняк В.Ю., Таланова С.А. (Россия) – 6с.