1

На правах рукописи

МЕЛТОНЯН

Вардуи Вартевановна

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ

НОВОГО ГРУДНОГО СБОРА И ИЗУЧЕНИЮ

ЕГО ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Старая Купавна — 2013 2

Работа выполнена на кафедре управления и экономики фармации с курса ми ботаники, фармакогнозии, фармацевтической технологии, фармацевти ческой и токсикологической химии Государственного бюджетного образо вательного учреждения высшего профессионального образования «Тверс кая государственная медицинская академия» Министерства здравоохране ния Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Демидова Марина Александровна

Официальные оппоненты:

Кочкаров Владимир Исхакович, доктор биологических наук, профессор, Фе деральное государственное автономное образовательное учреждение выс шего профессионального образования «Белгородский государственный на циональный исследовательский университет», кафедра фармацевтической химии и фармакогнозии фармацевтического факультета, профессор;

Рожкова Елена Анатольевна, доктор биологических наук, Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Московский научно практичес кий центр медицинской реабилитации, восстановительной и спортивной медицины» Департамента здравоохранения г. Москвы, ученый секретарь

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреж дение высшего профессионального образования «Смоленская государ ственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Россий ской Федерации.

Защита состоится «_» _ 2013 года в «» часов на заседа нии диссертационного совета Д 217.004.01, созданного на базе ОАО «Все российский научный центр по безопасности биологически активных ве ществ» (ОАО «ВНЦ БАВ», 142450, Московская область, Ногинский район, г. Старая Купавна, ул. Кирова, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОАО «ВНЦ БАВ».

Автореферат разослан «_» _ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Яснецов Виктор Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Распространенность патологии дыхательных путей занимает одну из ли дирующих позиций в структуре заболеваемости населения. Увеличение числа больных с заболеваниями органов дыхания в первую очередь обус ловлено неблагоприятной экологической обстановкой, нерациональным питанием, стрессами, а также прогрессирующим ростом резистентности возбудителей патологии к широко применяемым и относительно новым антибиотикам, возрастающей этиологической ролью условно патогенной микрофлоры (Чучалин А. Г., 2004, 2007; Стрельцова Е. В., 2007).

В профилактике и комплексной терапии заболеваний органов дыхания широко применяют растительные средства с антимикробным, противовос палительным и иммуномодулирующим действием. Значительная часть та ких средств создана на основе эфирных масел, природных полифенольных соединений, терпеноидов, полисахаридов (Мирович В. М., 2010).

Несмотря на многочисленные достижения по разработке и внедрению в клиническую практику синтетических лекарств, фитотерапия по прежне му сохраняет свою актуальность благодаря оптимальному сочетанию ре зультативности и безопасности применения многих препаратов раститель ного происхождения (Мирович В. М., 2010). В настоящее время ассорти мент лекарственных средств растительного происхождения, применяемых в практическом здравоохранении, составляет около 40 % (Самылина И. Н., 2000). Одним из направлений развития фитотерапии является углубленное исследование эффектов не только мало изученных, но и часто используе мых по ограниченному числу показаний фармакопейных лекарственных растений, а также разработка новых рациональных многокомпонентных растительных сборов. Перспективность и развитие исследований в облас ти разработки рецептуры многокомпонентных сборов для лечения пациен тов с различными патологиями обеспечивается достаточной сырьевой ба зой по большинству видов лекарственных растений (Доброхотов И. В., 2011;

Пупыкина К. А., 2008; Полуэктова Е. А., 2011).

Обоснованность применения растительных препаратов для профилакти ки и лечения заболеваний органов дыхания определяется тем, что к ним прак тически не наблюдается привыкания микроорганизмов, они сочетают в себе комплексы биологически активных веществ (БАВ), которые обуславливают многопрофильное действие на основные стадии патологического процесса (Мирович В. М., 2010).

Наиболее часто фитопрепараты используют в качестве муколитических, противовоспалительных, антимикробных, мочегонных, седативных средств. Фармакологическая активность растений обусловлена наличием биологически активных веществ, таких как полисахариды, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, эфирные масла, органические кислоты, каро тиноиды, витамины, дубильные вещества (Быстрова М. Н., Демидова М. А., 2012). В разной степени данные вещества оказывают противовоспалитель ное, антимикробное, отхаркивающее, иммуностимулирующее действие (Сошникова О. В., 2006).

Комбинированное применение лекарственного растительного сырья в виде растительных сборов позволяет получить синергизм в действии и более ши рокий спектр фармакологического действия за счет влияния каждого компо нента, что способствует повышению эффективности фитотерапии (Морохи на С. Л. и соавт., 2011).

Входящее в состав сборов лекарственное растительное сырье может кор ректировать лечебное действие друг друга. Сборы хорошо сочетаются с тра диционными методами лечения, совместимы с другими лекарственными сред ствами и друг с другом, оказывают мягкое воздействие на организм, обеспе чивая достижение стойкого лечебного эффекта (Морохина С. Л. и соавт., 2011, Иващенко Н. В. и соавт., 2013). При воспалительных заболеваниях органов дыхания в научной и народной медицине применяют различные виды лекар ственного растительного сырья (алтея корни, аниса плоды, багульника болот ного побеги, девясила корневища и корни, мать и мачехи листья, солодки кор ни, сосны почки, подорожника большого листья, синюхи корневища с кор нями, фенхеля плоды и т.д.). Многие виды лекарственного растительного сырья с муколитической активностью входят в состав многокомпонентных сборов (отхаркивающий сбор и грудные сборы №1, №2, №3, №4). Вместе с тем возможна разработка новых стандартизированных грудных сборов с точ ной дозировкой и подтвержденным в соответствии с правилами доказатель ной медицины эффектом.

Исследования по разработке состава, изучению химического состава и оценке фармакологической активности новых грудных сборов направлены на расширение ассортимента стандартизированных и эффективных лекар ственных средств растительного происхождения.

Цель работы — разработка нового грудного сбора для лечения воспали тельных бронхолегочных заболеваний и оценка его фармакологической ак тивности.

Для достижения указанной цели предстояло решить следующие задачи:

1. На основе анализа содержания биологически активных веществ и изу чения фармакологической активности лекарственного растительного сырья, обладающего муколитической и антисептической активностью, разработать состав нового грудного сбора.

2. Провести сравнительное исследование содержания основных биологичес ки активных веществ: полисахаридов, дубильных веществ, органических кислот, флавоноидов в водных извлечениях нового грудного сбора.

3. Определить значение LD50 для водных извлечений нового грудного сбо ра при внутрижелудочном введении мышам.

4. Оценить безопасность курсового применения водных извлечений но вого грудного сбора при внутрижелудочном введении мышам.

5. Оценить муколитическую, противовоспалительную, обезболивающую, противоаллергическую, антимикробную и антиоксидантную активно сти нового грудного сбора в эксперименте на лабораторных животных.

Научная новизна Впервые на основании экспериментальных исследований получен но вый грудной сбор, состоящий из растительного сырья 5 видов (тимьяна ползучего трава, солодки голой корни, алтея лекарственного корни, мать и мачехи листья, подорожника большого листья). Определено количествен ное содержание основных действующих веществ (флавоноидов, дубильных веществ, органических кислот и полисахаридов) в водных извлечениях но вого грудного сбора и отдельных его компонентов.

Проведено сравнительное исследование фармакологической активности впервые полученного нового грудного сбора с эффектами водных извлечений отдельных компонентов, грудного сбора №4 и синтетического муколитического средства ацетилцистеина. Показано, что при однократном и курсовом внут рижелудочном введении подопытным животным полученный новый грудной сбор является малотоксичным (относится к веществам IV класса токсичнос ти). Впервые установлено, что муколитическая активность разработанного грудного сбора в среднем в 1,6 раза выше, чем у наиболее часто используемо го грудного сбора №4. Полученный новый грудной сбор обладает также высокой антиоксидантной активностью. При этом суммарная антиоксидантная актив ность нового грудного сбора превышает расчетную величину антиоксидант ной емкости, полученную по результатам определения антиоксидантной актив ности отдельных компонентов сбора, что, вероятно, свидетельствует о нали чии синергизма в действии биологически активных веществ компонентов сбора.

Научно практическая значимость Результаты работы имеют как теоретическое, так и практическое значе ние. Показана перспективность получения нового грудного сбора для профи лактики и лечения хронических воспалительных заболеваний органов дыха ния, имеющих ряд преимуществ, как более эффективной лекарственной формы.

Результаты по оценке безопасности применения, изучению муколитической, противовоспалительной, противоаллергической, обезболивающей, антимик робной активностей водного извлечения нового грудного сбора позволили эк спериментально обосновать терапевтическую эффективность и могут быть использованы при разработке проекта инструкции по медицинскому приме нению в качестве муколитического средства.

Положения, выносимые на защиту 1. Наличие муколитической, противовоспалительной и обезболивающей активности у впервые полученного нового грудного сбора.

2. Более высокая муколитическая и антиоксидантная активность нового грудного сбора по сравнению с грудным сбором №4.

3. Наличие синергизма между отдельными компонентами нового грудного сбора в отношении антиоксидантной активности.

Внедрение в практику Результаты, полученные при исследовании фармакологической активно сти и определении основных действующих веществ нового грудного сбора, ис пользуются в учебном процессе: в лекционном курсе и на практических заня тиях по темам «Лекарственные средства, влияющие на систему органов дыха ния», «Производство настоев», «Анализ лекарственного сырья, содержащего флавоноиды, полисахариды», а также в научно исследовательской работе ка федры управления и экономики фармации Тверской государственной меди цинской академии. Результаты исследований по разработке нового грудного сбора внедрены в практику лаборатории отдела контроля качества ОАО «Твер ская фармацевтическая фабрика».

Связь темы диссертационного исследования с планом научных работ учреждения Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно исследовательских работ ГБОУ ВПО Тверская ГМА Министерства здраво охранения России. Номер государственной регистрации 01201174214.

Апробация работы Основные положения и результаты диссертации были доложены и обсуж дены на III международном медицинском конгрессе Армении «Вместе во имя здоровья» (7–9 июля 2011 г., Ереван), на международном конгрессе «Физи ческое и духовное здоровье: традиции и инновации» (15–16 ноября 2011 г., Москва), на II международном конгрессе «Физическое и духовное здоровье:

традиции и инновации» (7–9 июня 2012 г., Москва), на III научно практи ческой конференции с международным участием «Естественные науки: дос тижения нового века» (24–26 августа 2013 г., Шарджа, ОАЭ), на расширен ном заседании кафедры фармации ТГМА (02 октября 2013 г., Тверь).

Личное участие автора в получении результатов Личный вклад автора состоит в анализе отечественных и зарубежных ис точников по теме диссертационного исследования, разработке состава сбора и непосредственном выполнении всех экспериментальных исследований по оценке безопасности, фармакологической активности нового грудного сбо ра, качественного и количественного состава биологически активных веществ основных групп химическими и инструментальными методами. Исследова ния по определению антиоксидантной активности сбора и отдельных его ком понентов были проведены совместно с кандидатом химических наук, старшим научным сотрудником лаборатории химии возобновляемого природного сы рья Института органической и физической химии им. А. Е. Арбузова Казанс кого научного центра Российской академии наук, А. А. Лапиным. Исследова ния по оценке антимикробной активности сбора были проведены совместно с доктором медицинских наук, доцентом кафедры микробиологии, вирусо логии и иммунологии ТГМА Ю. В. Червинец. Автор лично участвовала в ана лизе полученных данных, их статистической обработке и интерпретации, фор мулировке выводов. Публикации по результатам работы подготовлены при ак тивном участии автора (авторский вклад составляет 85 %).

Публикации По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 — в центральных рецензируемых изданиях и журналах, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания мате риалов и методов исследования, 2 х глав результатов собственных исследо ваний, обсуждения полученных результатов, выводов, научно практичес ких рекомендаций и списка литературы, включающего 173 источника, в том числе 20 иностранных. Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц и 3 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Экспериментальные исследования выполнены на 270 мышах (белых не инбредных и линии Balb/с) обоего пола массой 20±2 г и 40 белых неинб редных крысах обоего пола массой 200±15 г. Подопытных животных содер жали в условиях вивария Тверской государственной медицинской академии (с естественным режимом освещения; при температуре 22–24 °С; относи тельной влажности воздуха 40–50 %) с использованием стандартной дие ты (ГОСТ Р 50258 92). Исследования проводили в соответствии с правила ми качественной лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ P 51000.3 96 и 1000.4 96), а также правилами и Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследова ниях (1997). Перед постановкой эксперимента животные проходили каран тин в течение 10–14 дней.

Объектом изучения являлся новый грудной сбор, в состав которого вхо дит 5 компонентов: тимьяна ползучего трава, солодки голой корни, алтея ле карственного корни, мать и мачехи листья, подорожника большого листья.

Состав сбора разрабатывали на основании проведенного информационно аналитического исследования. Из сбора и отдельных его компонентов полу чали водные вытяжки в соответствии с требованиями Государственной Фар макопеи. В работе проводили анализ химического состава и изучение фарма кологической активности впервые полученного грудного сбора. Эффекты но вого грудного сбора сравнивали с действием отдельных его компонентов и препаратов сравнения. В качестве препаратов сравнения использовали вод ное извлечение официнального грудного сбора №4 (ОАО «Красногорсклекс редства», Россия) и синтетическое муколитическое средство ацетилцистеин (АЦЦ, Нexal AG, Германия). Животные контрольной группы получали изо тонический раствор натрия хлорида.

Содержание основных групп биологически активных веществ нового груд ного сбора и отдельных его компонентов доказывали качественными хими ческими реакциями на основные группы биологически активных веществ.

Количественное содержание органических кислот и дубильных веществ оценивали титриметрическими методами в модификации (ГФ XI), полисаха ридов — гравиметрическим методом. Содержание флавоноидов в новом груд ном сборе и водных извлечений отдельных его компонентов определяли ме тодом, основанным на спектрофотометрировании комплексов флавоноидов с ионами металлов. Количественное содержание флавоноидов в исследуемых образцах определяли в пересчете на кверцетин.

Значение LD50 для нового грудного сбора определяли при внутрижелу дочном введении мышам методом В. Б. Прозоровского и М. П. Прозоров ской (1980). Оценку класса токсичности нового грудного сбора осуществ ляли по И. В. Березовской (2003).

Токсичность сбора при курсовом применении оценивали путем трех кратного ежедневного введения экспериментальным животным водного из влечения нового грудного сбора в дозе равной 1/20 LD50 (355 мг/кг в пере счете на сухое вещество) в течение 30 дней.

Оценку муколитической активности водных извлечений нового грудно го сбора и отдельных его компонентов проводили на модели изолирован ной трахеи у крыс (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ).

Изучение противовоспалительной активности нового грудного сбора про водили в экспериментах на мышах на моделях химического раздражения брю шины и острого воспалительного отека лапы, вызванного введением форма лина (Сернов Л. Н., Гацура В. В., 2000). Химическое раздражение брюшины вызывали внутрибрюшинным введением мышам самцам 3% раствора уксус ной кислоты (300 мг/кг). Эффекты исследуемых препаратов оценивали по чис лу специфических ноцицептивных ответов у подопытных животных (харак терные движения животных, включающие сокращения брюшных мышц, че редующиеся с их расслаблением, вытягиванием задних конечностей и прогибанием спины), развивающихся после внутрибрюшинного введения ук сусной кислоты.

Острый воспалительный отек лап у мышей вызывали субплантарным введением в заднюю лапу 0,1 мл 2% водного раствора формалина. Онкомет рию лапы проводили с помощью инженерного электронного штангенцирку ля Vorel 15240 (Польша) через 1, 4, 8 и 24 часа после введения исследуемых препаратов. Активность исследуемых препаратов и эталонного препарата вы ражали в % угнетения отека.

Противоаллергическую активность препаратов изучали на моделях актив ной кожной анафилаксии и аллергической реакции замедленного типа у мы шей. Активную кожную анафилаксию у мышей моделировали по Г. Фриме лю (1987) в модификации М. А. Демидовой (Демидова М. А. и др., 2006). В качестве препарата сравнения использовали глюкокортикостероид преднизо лон (Никомед, Дания).

Оценку обезболивающей активности осуществляли с использованием мо дели «горячей пластинки» у мышей. Болевую реакцию вызывали помещени ем животного на «горячую пластинку» температурой 55 °С. Регистрировали время наступления порога болевой чувствительности. В качестве препарата сравнения в экспериментах использовали метамизол натрия (анальгин, Мик роген, Россия) в дозе 0,1 мг/кг.

Оценку антимикробной активности водных извлечений травы тимьяна ползучего, корней солодки голой и алтея лекарственного, листьев мать и ма чехи и подорожника большого и нового грудного сбора проводили в экспери ментах in vitro методом диффузии в агар (Блинкова Л. П., 2003). В исследова нии были использованы следующие тест штаммы микроорганизмов:

Staphylococcus aureus 209 из коллекции ГИСК им. А. А. Тарасевича, Streptococcus faecalis 775 из коллекции ГИСК им. А. А. Тарасевича, Candida albicans ATCC 885 653 из коллекции ГИСК им. А. А. Тарасевича.

Антиоксидантную емкость водных извлечений нового грудного сбора и отдельных его компонентов определяли кулонометрическим методом с по мощью электрогенерированного брома. Пробы анализировали на кулоно метре «Эксперт 006» (ООО «Эконикс Эксперт», Россия). Антиоксидант ную емкость выражали в мг рутина на 100 мл извлечения.

Результаты исследования обработаны статистически с применением стандартного пакета программ Microsoft Office Excel 2003. Для ряда выбо рок вычисляли среднюю арифметическую и среднюю квадратическую ошибку. Определение нормальности распределения переменных проводили на основании гистограмм распределения, величины асимметрии и эксцес сы. Для оценки достоверности различий выборок, имеющих нормальное распределение, применяли параметрический t критерий Стьюдента (пар ный и непарный). За достоверное принимали различие при уровне вероят