2.2.3. Бактериальные гомологи актина.

К актиноподобным белкам относится упоминавшийся выше FtsA, взаимодействующий с FtsZ. Один из важнейших актиноподобных белков бактерий – MreB, отвечающий за форму многих бактериальных клеток. Белок MreB и родственные ему MreC, MreD были открыты по обнаруженным мутациям в соответствующих генах, вызывающим нарушение формы клетки (продолговатые палочкообразные клетки превращаются в шарообразные). По аналогии с актином, MreB сосредоточен в основном у клеточной стенки.

Структура этого белка также подобна актину (см. рис. 2.6). Однако в отличие от актина, MreB может использовать как АТФ, так и ГТФ. Кроме того, филаменты MreB отличаются большей жесткостью. MreB вовлечен в регуляцию организации других белков, что подтверждается тем, что у клеток E. coli и C.

crescentus отсутствие данного белка приводит к нарушению организации некоторых других белков. На рис. 2.7 схематически изображена спиральная организация MreB в палочковидных клетках. Взаимодействие с клеточной стенкой, по-видимому, осуществляется посредством пенициллин-связывающих белков. Также MreB участвует в разделении хромосом в ходе клеточного деления. Дефект этого белка приводит к образованию клеток, лишенных хромосом [29].

Другой актиноподобный белок, ParM, участвует в разделении плазмид низкой копийности в ходе деления (плазмиды высокой копийности не нуждаются в активной регуляции, т.к. успешно разделяются пассивно (случайным образом)). В присутствии АТФ in vitro ParM образует структуру, подобную F-актину [22].

2.2.4. Бактериальные гомологи белков промежуточных филаментов.

К гомологам ПФ относится кресцентин бактерий C. crescentus [30].

Данный белок определяет нормальную кривизну клетки, поэтому его отсутствие приводит к образованию прямых клеток. Подобно эукариотическим белкам ПФ, кресцентин образует филаменты толщиной около 10 нм (см. рис.

2.6) без надобности в дополнительных кофакторах. По-видимому, подобные белки присутствуют и в других видах бактерий. Кроме описанных белков бактериального цитоскелета, обнаружены белки, функции которых еще не установлены [31].

2.3. Использование ЛМ для исследования бактерий.

ЛМ активно применяется для исследования белковых структур в бактериальных клетках. К примеру, работа [32] посвящена организации мембранных белков, образующих кластеры хемотаксиса в бактериях E. coli.

Хемотаксис позволяет клетке активно реагировать на изменение внешних условий: мембранные рецепторы запускают механизм, заставляющий бактерию перемещаться (за счет движения жгутиков). В хемотаксис вовлечены белки Tar, CheA, CheW, CheY. Эти белки способны образовывать комплексы, состоящие из тысяч отдельных молекул (кластеры) – вместе они образуют сложную сеть, и для понимания механизмов их формирования авторы использовали метод PALM. В работе показана справедливость теории спонтанной нуклеации и образования кластеров.

В работе [33] на примере C. crescentus изучалась внутриклеточная организация MreB, бактериального гомолога актина. Для визуализации структур, формируемых MreB клетки трансформировались плазмидой, кодирующей белок слияния MreB-YFP (Yellow Fluorescent Protein). Изучалась записывались траектории молекул, а затем полученные изображения обрабатывались с помощью локализационного алгоритма в среде MATLAB.

Для возможности локализации отдельных молекул отбирались только клетки с малой концентрацией MreB-YFP (3-4 шт./клетку). Компенсация дрейфа образца в латеральном направлении осуществлялась за счет одновременной регистрации изображений отдельных квантовых точек, закрепленных в образце неподвижно (в дальнейшем траектории квантовых точек вычитались из траекторий молекул белка). В итоге оказалось возможным локализовать отдельные молекулы MreB-YFP с точностью около 15 нм, что позволило определить параметры движения (в частности, коэффициент диффузии) для каждой молекулы.

Как и ожидалось, часть молекул демонстрировала произвольную траекторию, характерную для свободной частицы, на основании чего можно сделать вывод, что это молекулы глобулярного g-MreB (по аналогии с gактином). Другая часть молекул практически не перемещалась – молекулы fMreB (по аналогии с f-актином). Неожиданным результатом данной работы явилось то, что для «свободных» молекул g-MreB коэффициент диффузии оказался значительно ниже теоретически рассчитанного, что авторы связывают с возможным взаимодействием MreB с мембраной и/или с комплексом других белков. Кроме того, рассчитанная скорость деполимеризации MreB in vivo позволила предположить наличие дополнительного фактора деполимеризации в данных бактериях.

В работе [34] также исследовался MreB, в частности, получены изображения, отражающие организацию MreB в C. crescentus. В клетках, готовых к делению, белок локализуется в виде кольца примерно посередине бактерии, а в неделящихся клеток – в виде спирали.

В другой работе [35] исследуется пространственная организация упомянутого в п. 2.2.4 белка кресцентина методом трехмерной (3D) ЛМ.

Использовались методики SPRAI (Super-resolution by PoweR-dependent Active Intermittency) и PAINT (Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography). Обе методики являются модификациями стандартных методик ЛМ. Первая методика использовалась для детектирования молекул внутри клетки, вторая – на ее поверхности.

Для реализации 3D ЛМ использовалась аппаратная функция (АФ) в виде двойной спирали (АФДС) (см. рис. 2.8). Особенностью такого метода 3D ЛМ является то, что изображением каждой точки являются два максимума, взаимная ориентация (поворот) которых зависит от аксиального положения молекулы, что позволяет по изображению молекулы определить её аксиальное положение.

Для визуализации использовались 2 красителя: eYFP (enhanced YFP) для SPRAI и Nile Red для PAINT. Т.к. красители имеют схожий спектр возбуждения, использовался единственный лазер, и изображения с каждым из красителей получали последовательно. Вначале получали около изображений с eYFP, затем около 25000 c Nile Red.

В согласии с предшествующими исследованиями, было установлено образование кресцентином продолговатого филамента вдоль внутренней стенки бактерии. Также было получено трехмерное изображение клетки (см. рис. 2.9).

Рис. 2.9. 3D изображения клеток C. crescentus с использованием ЛМ. Красным и желтым обозначен кресцентин, серым – мембрана. Слева направо: дифракционноограниченное изображение во флуоресцентном режиме; кресцентин (ЛМ); мембрана (ЛМ);

совмещенный вид. В правом верхнем углу – изображение клеток на просвет. Шаг сетки – Достигнутое разрешение (15 нм в латеральном направлении и 27 нм – в аксиальном) позволило авторам оценить диаметр клетки (500-600 нм), а также толщину мембраны (в среднем 58 нм).

жгутиковая клетка, B – клетка со стебельком, C – клетка перед Еще одна работа посвящена изучению бактериального ДНКсвязывающего белка HU (также у C. crescentus) [36]. Данный белок неспецифично связывается как с двунитевой, так и с однонитевой ДНК и отвечает за разделение хромосом, регуляцию транскрипции и другие функции.

Для визуализации использовался белок слияния с eYFP. В результате для трёх морфологических разновидностей клетки, соответствующих различным периодам клеточного цикла, были получены изображения, характеризующие распределение в клетке белка HU (см. рис. 2.10).

Рис. 2.11. 2D проекции 3D–ЛМ изображений FtsZ в живых бактериях C. crescentus. A – в аксиальном направлении, B –в латеральном направлении.

Вверху – стационарная клетка, внизу – непосредственно перед делением. [37].

Работа [37] также посвящена исследованию бактерий C. crescentus. В данном исследовании методом ЛМ визуализировалась пространственная организация FtsZ в различные фазы клеточного цикла (см. рис. 2.11). Для реализации 3D ЛМ использовался искусственный астигматизм: помещенная между объектом и камерой цилиндрическая линза деформирует изображение таким образом, что по форме изображения молекулы можно определить аксиальное положение молекулы. Разрешение в аксиальном направлении составляет менее 100 нм. Для визуализации использовался FtsZ, эндогенномеченый при помощи фотопереключаемого флуорецентного белка Dendra2.

Исследовались как живые, так и фиксированные клетки.

возбуждающим лазером с длиной волны 561 нм «выжигались» молекулы, спонтанно переключившиеся из зеленого в красный канал флуоресценции.

Затем лазерный импульс на длине волны 407 нм (0,5 с при плотности мощности 2 kW/cm2) переключал небольшую часть молекул красителя в красное флуоресцентное состояние, после чего вновь включался возбуждающий лазер, и записывались серии изображений отдельных молекул. Затем цикл (с периодом около 15 с) повторялся. Латеральное разрешение составило 30 нм, аксиальное – менее 100 нм. Изображения, полученные в субдифракционном режиме, позволили оценить форму и размеры z-кольца: оно представляет собой тор с внешним диаметром, соответствующим толщине клетки (650 нм), и размером отверстия около 150 нм.

Рис. 2.12. Флуоресцентные изображения ParA и ParB в C. crescentus. Первое слева – дифракционно-ограниченное изображение клетки А. Второе – локализационное изображение той же клетки. Третье и четвертое изображения – соответственно, клетки C и D.

Красный цвет - ParB-mCherry, зеленый - ParA-eYFP. Масштабный прямоугольник – 1 мкм.

цитоскелета, представлена в статье [38]. В ней на примере C. crescentus исследуется система разделения хромосом в ходе клеточного деления. Эта система образована парой белков – ParA и ParB, которые конкурируют между собой за связывание с ДНК. Первый белок является АТФазой и образует протяженные филаменты, способствующие расхождению хромосом, второй – ингибирует активность первого, таким образом регулируя процесс расхождения. Наличие мутаций в генах parA и parB приводит к ошибкам в разделении хромосом. Для визуализации использовали мутантные бактерии с эндогенно-меченными ParA (ParA-eYFP) и ParB (ParB-mCherry).

В работе, в частности, было установлено, что ParA образует линейную структуру вдоль клетки толщиной около 40 нм, причем до разделения хромосом (клетка A), во время (клетка B) и после неё (клетка C) структура заметно различается (см. рис. 2.12).

В одной из последних работ по изучению белка FtsZ в бактериях C.

crescentus [39] изучалось в частности образование этим белком структур в состоянии SOS-ответа. Интересно, что в SOS-ответе в бактериях данного вида в отличие, например, от E.coli, образуется z-кольцо, однако оно обладает иной морфологией (в частности, увеличенным размером). Эта особенность объясняется, по-видимому, иными механизмами остановки клеточного деления, чем ингибирование полимеризации FtsZ (как в E.coli) или образования z-кольца (B.subtilis).

Из приведенных выше работ ясно, что метод ЛМ достаточно активно применяется для изучения организации бактериального цитоскелета. Несмотря на длительные исследования в данной области, все ещё остаются без ответа многие вопросы. В частности, не вполне понятно, каким образом регулируется формирование Z-кольца и как происходит остановка клеточного деления в ходе SOS-ответа. Кроме того, мало известно о структурах цитоскелета прокариот, которые плохо поддаются генетическим модификациям (например, микоплазм), а также митохондрий и хлоропластов. Разработанные в данной работе протоколы ЛМ с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания будут полезны при исследовании таких организмов.

3.1. Экспериментальная установка.

основанной на исследовательском моторизованном микроскопе AxioImager.Z (Carl Zeiss). Данная установка сочетает в себе возможности традиционной оптической (в т.ч. флуоресцентной) микроскопии, локализационной микроскопии и оптической ловушки.

Рис. 3.1. Схема экспериментальной установки, относящаяся к локализационной микроскопии. CD – конденсор, CL – цилиндрическая линза, CS – покровное стекло, DM – дихроическое зеркало, EM-CCD – ПЗС камера с ЭУ, FC – флуоресцентный кубик, IL – осветитель проходящего света, IRF 1 – ВЧ фильтр 830 нм, IRF 2 – НЧ фильтр 830 нм, Lлинза, M – зеркало, ML – ртутная лампа для возбуждения флуоресценции, O – объектив, PC – поляризационный кубик, PS – пьезостолик, QD – квадрантный фотодетектор, S – образец, Sh – оптический затвор, TL – тубусная линза.

вибраций, что необходимо для реализации метода ЛМ. В частности, оптическая схема смонтирована на оптическом столе с пневматической системой виброизоляции «Newport Smart Table» и расположена на независимом от здания фундаменте. Кроме того, вспомогательное оборудование (контроллеры, блоки питания и др.) смонтированы отдельно от оптического стола. Более того, в ходе модернизации установки была создана система активной стабилизации положения образца в микроскопе, описанная в пункте 3.2 и позволяющая существенно снизить дрейф образца в ходе эксперимента.

относящаяся к локализационной микроскопии. Для возбуждения флуоресценции и фотоактивации красителя использовались диодные лазеры непрерывного излучения с длиной волны 635 и 405 нм соответственно (максимальная мощность обоих - 500 мВт, поляризация линейная, производитель Meierlight). Ввод излучения лазеров в микроскоп осуществлялся через резервный боковой порт микроскопа с помощью поляризационного кубика. Использовался набор фильтров BrightLine LF635-B-000 (Semrock), входной фильтр в котором был демонтирован для одновременного возбуждения флуоресценции и фотоактивации. Оптическая схема настроена таким образом, что при работе с объективом 100х обоими лазерами освещалась область в фокальной плоскости диаметром около 40 мкм. Это позволило получать освещенность до 10 кВт/см2. Т.к. используемые диодные лазеры излучают на нескольких пространственных модах, освещенность в данной области практически однородна. Регулировка интенсивности лазеров осуществлялась дискретно при помощи нейтральных фильтров (Newport). Для отсечения лазерного излучения использовались электромеханические затворы с дистанционным управлением.

Также для возбуждения флуоресценции в ряде экспериментов использовалась ртутная лампа (EXFO X-CITE 120Q, 120 Вт). Излучение лампы заводилось в микроскоп через задний порт при помощи световода. Для ослабления интенсивности света использовалась встроенная в корпус лампы диафрагма.

Используемый в работе микроскоп AxioImager.Z1 от Carl Zeiss использовался масляно-иммерсионный объектив с числовой апертурой 1. "Plan-Apochromat" производства Carl Zeiss. Для регистрации флуоресценции электронным умножением: Photometrics Cascade II 1024BL (матрица 1024x1024, физический размер пикселя 13 мкм) и Andor iXon3 897 (512x512, размер пикселя 16 мкм).

Управление микроскопом и камерой Cascade осуществлялось при помощи программного пакета AxioVision (Carl Zeiss), а камерой Andor (а также распространяемого приложения MicroManager, выпускаемого как дополнение к бесплатной программе для обработки изображений ImageJ [40]. Для управления затворами, пьезостоликом и прочим вспомогательным оборудованием использовалось программное управление, созданное в среде LabView (National Instruments).

3.2. Система активной стабилизации положения образца для ЛМ.

Локализационная микроскопия более чувствительна к нестабильности положения образца в микроскопе относительно фокуса объектива, нежели традиционная ФМ. Данный факт объясняется достаточно длительным временем регистрации изображения (от десятков секунд до минут), в сочетании с более высоким разрешением. Для минимизации влияния дрейфа используют различные приемы. Например, при обработке изображений используют компенсацию дрейфа с использованием маркерных объектов (изображения маркерных объектов записываются одновременно с изображениями целевого объекта), как, например, в работе одних из основоположников ЛМ [18]. К сожалению, данный прием позволяет компенсировать только низкочастотный дрейф. Кроме того, дрейф по оси z может привести к выходу образца из области оптимального аксиального разрешения и даже к полному выходу из области детекции. Эти недостатки методов коррекции дрейфа на этапе обработки изображений существенно затрудняют осуществление ЛМ.

стабилизацию положения образца в ходе эксперимента, например, в работе [41]. Преимущества данных систем, особенно в точности и быстродействии, мотивировали нас к созданию системы активной стабилизации положения образца в микроскопе.

В основе созданной нами системы лежит возможность с нанометровой точностью определять положение объекта (полимерного шарика размером от сотен нанометров до нескольких микрон) при помощи следящего лазера (Qioptiq iFLEX-2000, 830 нм, 50 мВт, TEM00, DPSS) (см. рис. 3.1) и квадрантного фотодетектора.

Рис. 3.2. Схема квадрантного фотодетектора. 1-4 – сегменты детектора. S1-S4 – соответствующие сигналы, снимаемые с сегментов.

Перед экспериментом на покровное стекло изучаемого препарата прикрепляются полистироловые шарики диаметром 2,35 мкм. Затем в ходе эксперимента один из шариков совмещается с центром луча следящего лазера.

Лазерный луч, сфокусированный объективом чуть выше пластикового шарика, рассеивается на нем; рассеянный луч собирается конденсором и формирует изображение шарика на квадрантном фотодетекторе (см. рис. 3.2). Данная схема изначально используется в нашей установке для определения положения шарика в оптической ловушке. Для отделения излучения следящего лазера от излучения видимого диапазона используются соответствующие фильтры.

Изображение на детекторе крайне чувствительно к изменению положения шарика относительно лазерного луча. Когда его изображение находится точно по центру детектора, сигналы (напряжения), снимаемые со всех сегментов детектора, равны. Когда шарик смещается, например, вправо, сигналы с правой половины детектора растут, а с левой – падают. Для определения пространственного положения шарика используются следующие комбинации сигналов:

В начале работы системы активной стабилизации шарик центрируется относительно луча лазера. Сигнал, снимаемый с детектора и усиливаемый низкошумящим усилителем, через интерфейс National Instruments поступает в специальную программу стабилизации, созданную в среде Labview. Данный сигнал формирует петлю обратной связи, позволяя определять положение шарика с использованием соответствующей калибровки. Для получения калибровки шарик перемещается по осям x, y и z с использованием пьезостолика (Physik Instrumente P-561.3DD), который позволяет с высокой точностью (лучше 1 нм) осуществлять перемещения объекта по трем осям.

Интерполяция зависимостей Ux(x,y,z), Uy(x,y,z) и Uz(x,y,z) трехмерными аналитичекими функциями является нетривиальной задачей, поэтому в работе системы стабилизации использована линейная аппроксимация данных зависимостей, которая оказывается достаточно точной в небольшом интервале координат шарика. Таким образом, постулируется, что сигналы Ux(x,y) и Uy(x,y) не зависят от z, а Uz(z) не зависит от x, y, что справедливо в относительно небольшом диапазоне координат, соответственно, в ходе калибровки вначале шарик перемещается в плоскости XY (снимаются зависимости Ux(x,y) и Uy(x,y)), затем – по оси Z (зависимость Uz(z)). После этого зависимости Ux(x,y) и Uy(x,y) аппроксимируются плоскостями, а Uz(z) – прямой. После окончания калибровки программа стабилизации обеспечивает стабильное положение шарика относительно луча следящего лазера, поддерживая постоянными сигналы с детектора.

сравнивались зависимости от времени сигнала с квадрантного фотодетектора, пересчитываемого затем в координаты шарика, а также координаты пьезостолика, отражающие дрейф образца. Эти данные записываются в текстовый файл в ходе работы системы стабилизации.

3.3. Бактериальные штаммы, используемые в работе.

Использовались два бактериальных штамма: первый – для изучения структур, формируемых FtsZ в нормально делящихся бактериях (E.coli с плазмидой Top-10 PGEX 4T2, далее Top-10); второй – для изучения аналогичных структур в бактериях, находящихся в состоянии SOS-ответа (E.coli KD-403).

В штамме Top-10 указанная выше плазмида несет только ген устойчивости к ампициллину. Бактерии в течение 5 часов растились при 37°C в стандартной среде LB с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) до оптической плотности OD600=0,5.

Штамм KD-403 несет в себе CRISPR систему (гены casA-E,1,2, контролируемые арабинозным промотором и ген cas3 под контролем lacпромотора), со спейспером, соответствующим сайту бактериального генома.

Индукция экспрессии генов casA-E,1,2 (добавлением арабинозы в среду) приводит к активации CRISPR системы, вносящей двунитевой разрыв в соответствующий сайт бактериального генома, в результате чего клетка входит в состояние SOS-ответа (образуются вытянутые клетки, не способные к делению). Бактерии в течении ночи растились при 37°C в стандартной среде LB, затем разводились 1 к 200 в свежей среде с добавлением арабинозы (0.2%) и растились в течении 4 часов при 37°C.

3.4. Протокол пробоподготовки.

фиксированными клетками бактерий, в которых белок цитоскелета FtsZ фотоактивируемыми красителями.

Перед началом эксперимента подготавливались микроскопические покрывались поли-L-лизином (Sigma-Aldrich), для чего 20 мкл 0,1 % раствора инкубировалось между 2 покровными стеклами в течение 30 минут. Поли-Lлизин использовался для надежного закрепления бактерий на поверхности покровного стекла. Затем собирались промываемые камеры, образованные покровным и предметным стеклами и двусторонним скотчем межу ними, обработанная сторона покровного стекла была обращена внутрь камеры. Для образцов, используемых в дальнейшем для ЛМ, в каждую камеру вмывались шарики из ПММА, необходимые для работы системы активной стабилизации, в разведении 1:500 (2,35 мкм в диаметре, Bangs laboratories). Промываемые камеры переворачивались на 15 минут для осаждения и неспецифического закрепления шариков на поверхности покровного стекла. Эта и последующие операции выполнялись в затемненной и увлажненной коробке (влажность уменьшает испарение жидкости из камеры, затемнение необходимо на дальнейших этапах пробоподготовки для минимизации фотообесцвечивания флуоресцентных красителей).

культуральной среде, вмывались в камеру и инкубировались 10 минут в положении покровным стеклом вниз. Затем следовала фиксация бактерий, для этого промываемая камера наполнялась раствором метанола и уксусной кислоты в воде (объемное соотношение 3:1:4) на 10 минут, после чего камера раза промывалась фосфатно-солевым буфером. Далее клеточные стенки бактерий обрабатывались лизоцимом в течение 5 минут (пермеабилизация) ( мкг/мл лизоцима (Sigma-Aldrich) в буфере GTE (Tris 32.5 мМ(pH = 7,5), глюкоза 50 мМ, ЭДТА 10 мМ)). Затем камеры однократно промывались PBS, и вмыванием БСА-PBS (бычий сывороточный альбумин в концентрации 20 мг/мл в PBS) на 30 минут осуществлялось блокирование последующего неспецифического связывания антител.

Инкубация с первичными антителами осуществлялась в течение ночи в холодильнике (+4°C). Антитела кролика против FtsZ E.coli (Agrisera) разводились в соотношении 1:200 в БСА-PBS. На следующий день производилось промывание бактерий 0,05 % раствором детергента Tween в PBS (5 раз, каждый через 5 минут), а затем – инкубирование со вторичными антителами (флуоресцентно меченые антитела козы против кролика, для традиционной ФМ использовались антитела Active Motif Atto 532, в случае ЛМ – Abberior Cage 635) в разведении 1:100 в течение часа, после чего бактерии вновь промывались, как описано выше. В ходе подготовки образца для традиционной ФМ в камеру дополнительно вмывался флуоресцентный краситель YOYO-1 (для визуализации ДНК). Затем промываемая камера заполнялась PBS и герметизировалась бесцветным лаком.

3.5. Флуоресцентная микроскопия белка FtsZ E.coli.

Оптимизация протоколов пробоподготовки и их предварительное тестирование осуществлялось стандартными методами ФМ. Для этого использовались образцы с FtsZ, флуоресцентно меченым красителем Atto-532, и ДНК, меченой YOYO-1.

Помещенный под микроскоп образец последовательно снимался в трёх режимах освещения: в проходящем свете, в канале YOYO-1 (Filter Set 10), в канале Atto-532 (набор фильтров mCherry BrightLine 40LP ZERO, Semrock), причем в последних двух каналах производилась последовательная съемка кадров с экспозицией 100 мс, в дальнейшем кадры усреднялись для увеличения соотношения сигнал-шум. Для возбуждения флуоресценции использовалась ртутная лампа. Дальнейшая обработка изображений осуществлялась в программе ImageJ (сборка Fiji).

3.6. Локализационная микроскопия белка FtsZ E.coli.

микроскопа. После нахождения подходящей области для наблюдения один из пластиковых шариков совмещался с центром луча следящего лазера, для чего использовалась программа, позволяющая посредством нахождения локального максимума суммарного сигнала с квадрантного детектора осуществлять центрирование шарика относительно луча. Затем включалась программа, осуществляющая активную стабилизацию положения образца. Для получения реконструированного изображения в ЛМ, использовалась регистрация флуоресценции одновременно с фотоактивацией красителя. Для этого из оптического пути коротковолнового лазера (405 нм), используемого для фотоактивации, был удален входной фильтр флуоресцентного кубика. Т.к.

спектральная линия диодного лазера, используемого для возбуждения флуоресценции (635 нм), относительно широкая и частично пропускается эмиссионным фильтром, что снижает соотношение сигнал-шум при регистрации флуоресценции, входной фильтр был переставлен в путь красного лазера (до объединения с фиолетовым). Использовалось излучение лазера нм (около 10 кВт/см2 в плоскости образца) и ослабленное на 2 порядка излучение лазера 405 нм (100 Вт/см2). В результате камерой фиксировались «мерцания» одиночных молекул красителя, причем их изображения практически не перекрывались между собой. Данные изображения записывались с экспозицией 100 мс камерами Cascade или Andor (от 1000 до 10000 кадров в различных экспериментах). Затем полученные изображения обрабатывались при помощи алгоритма QuickPALM программы Fiji с PixSizeofRendIm=30 нм. Затем изображения окончательно обрабатывались фильтром Gaussian Blur с Sigma=1 пиксель.

Следует отметить, что в проведенных экспериментах не оценивалось достигнутое разрешение, т.к. для достаточно сложных структур, формируемых FtsZ, получение данных оценок затруднено. Ранее было показано [42], что для экспериментальной установки, используемой в данной работе, справедливы следующие значения аппаратной функции: во флуоресцентном режиме – нм, в режиме ЛМ – 50 нм. Данные значения были получены на модельных объектах (единичные молекулы ДНК, флуоресцентные шарики и др.).

Рис. 3.3. Измерение диаметра и толщины z-кольца. а, в – Измерение диаметра и толщины кольца, профиль интенсивности измеряется вдоль желтой линии. б – измерение внешнего диаметра Z-кольца, измерение полной ширины профиля интенсивности, г – профиль интенсивности при измерении толщина Z-кольца, аппроксимация гауссианом.

Для измерения размеров визуализируемых структур на изображениях использовалась функция ImageJ Plot Profile, применяемая к линии заданной толщины. Внешний диаметр Z-кольца измерялся с использованием линии толщиной 90 нм, проведенной параллельно плоскости z-кольца (см. рис. 3.3а,б);

толщина – с использованием линии толщиной 300 нм, проведенной перпендикулярно этой плоскости (рис. 3.3.в,г). Для оценки диаметра измерялась полная ширина профиля интенсивности, как описано в работе [43].

Для оценки толщины профиль интенсивности аппроксимировался гауссианом, за толщину принималась ширина на полувысоте (FWHM).

4.1. Результаты исследования работы системы активной стабилизации положения микроскопического образца.

Тестирование работы системы активной стабилизации показало, что при помощи нее дрейф образца удается сократить примерно на порядок (см рис. 4.1).

Рис. 4.1. Тестирование системы активной стабилизации. Представлен характерный пример изменения координат от времени в ходе эксперимента. Графики «x», «y» и «z» отражают координаты образца, рассчитанные из сигнала квадрантного фотодетектора, «stage x», «stage y» и «stage z» – соответствующие перемещения пьезостолика в ходе работы системы.

Рис. 4.2. Аппроксимация зависимости координаты x пьезостолика (stage x) от времени На рисунке 4.1 представлены зависимости от времени координат пьезостолика и сигнала с квадрантного детектора. Зависимости от времени координат пьезостолика (кривые «stage x», «stage y» и «stage z») соответствуют дрейфу образца в ходе эксперимента, имитируя таким образом случай выключенной системы стабилизации. Зависимости от времени координат шарика (на рис. 4.1 это кривые «x», «y» и «z»), полученные из снимаемого сигнала квадрантного детектора, отражают флуктуации положения образца в ходе эксперимента.

Анализ данных зависимостей производился следующим образом. Для совокупной оценки нестабильности положения образца находилось стандартное отклонение зависимостей, приведенных на рис. 4.1. Для оценки дрейфа образца данные зависимости аппроксимировались линейными функциями. В качестве примера на рис. 4.2. приведена зависимость от времени координаты x пьезостолика («stage x») и соответствующая ей линейная аппроксимация («fit»). Для вычисления дрейфа находилась разность между значениями линейной зависимости в начальной и конечной точках. В таблице приведены стандартные отклонения (Sx, Sy и Sz) и дрейф (x, y и z) координат, полученные из зависимостей рис. 4.1.

Таблица 1. Стабильность положения образца со стабилизацией и без нее.

Из таблицы видно, что система активной стабилизации значительно уменьшает колебания образца: стандартное отклонение для координаты x уменьшилось в 10 раз, координаты y – в 7 раз, координаты z – в 5 раз. Также видно, что дрейф образца в отсутствие системы активной стабилизации доходит до 200 нм за 1,5 минуты (типичное время съемки в режиме ЛМ), что совершенно неприемлемо даже для съемки в режиме ЛМ. В то же время, система активной стабилизации практически исключает низкочастотный дрейф.

Рис. 4.3. Амплитудно-частотные характеристики, полученные из зависимостей, Используя преобразование Фурье, были найдены соответствующие спектры (амплитудно-частотные характеристики (АЧХ)) колебаний образца со стабилизацией и без неё (рис. 4.3).

Видно, что система активной стабилизации эффективно снижает низкочастотный шум ( примерно до 5 Гц).

Таким образом, отклонения координат образца уменьшены примерно на порядок, до уровня около 10 нм, что существенно меньше типичного разрешения ЛМ (около 30 нм), что повышает надежность работы алгоритма, а также обеспечивает возможность увеличения точности локализации в перспективе.

4.2. Флуоресцентная микроскопия белка FtsZ.

В ходе работы были оптимизированы протоколы пробоподготовки, что позволило получить адекватные изображения структур, формируемых целевым белком, что свидетельствует о пригодности разработанного протокола.

В ходе оптимизации протокола были опробованы различные методики фиксации, пермеабилизации и иммунофлуоресцентного окрашивания. Были опробованы различные растворы для фиксации (2,5% формальдегид; 2,5% параформальдегид с 0,04% глутаральдегида; раствор метанола и уксусной кислоты в воде), наилучшие результаты получены с использованием последнего раствора. Для пермеабилизации опробованы различные концентрации лизоцима и детергента Тритон х100. Разведение первичных и вторичных тел также изменялось в широких пределах, а также были выполнены контрольные эксперименты без добавления тех или иных антител. Результаты одного из контрольных экспериментов представлены на рис. 4.4.

Рис. 4.4. Влияние добавления первичных антител и концентрации лизоцима на результаты окрашивания. а – контрольный образец: первичные антитела и лизоцим добавлены как описано в п. 3.4. б – без инкубации с первичными антителами. в – без добавления лизоцима.

На рисунке 4.4а показано изображение бактерий во флуоресцентном режиме, полученное при оптимальных концентрациях лизоцима и первичных антител. В отсутствие первичных антител (рисунок б) сигнал практически отсутствует, что говорит о высокой специфичности вторичных антител.

Отсутствие обработки лизоцимом (на рисунке в) также приводит к некоторому уменьшению уровня сигнала, т.к. необработанная клеточная стенка затрудняет (но не прекращает совсем) прохождение антител внутрь клетки. Увеличенная в 1000 раз концентрация лизоцима (рисунок г) приводит, по-видимому, к значительному повреждению бактериальной клетки, в результате полезный сигнал значительно снижен.

На рис. 4.5а представлены изображения бактерий, полученные с использованием разработанного протокола, в трёх режимах: в канале Atto- (а), в канале YOYO-1 (б) и их наложение (в). На рисунке а видны яркие полоски, расположенные примерно посередине большинства бактерий. Данные полоски напоминают кольцевые структуры (z-кольца), образующиеся в бактериях в ходе бинарного деления, что полностью соответствует литературным данным.

Рис. 4.5. Изображения белка FtsZ, меченого красителем Atto-532, и ДНК (краситель YOYOв бактериях E.coli во флуоресцентном режиме. а). Изображения FtsZ в канале Atto-532. б).

ДНК в канале YOYO-1. в). Наложение а и б, красный цвет соответствует FtsZ, зеленый – ДНК. Стрелкой показана бактерия, в которой FtsZ образует структуру, напоминающую Из сравнения рисунков 4.5а и 4.5б видно, что z-кольца образуются в бактериях, генетический материал которых уже разделен между будущими дочерними клетками. Кроме z-колец, на одной из клеток видна спиралевидная структура (на рис. 4.5 она показана белой стрелкой), образование подобных структур также описано в литературе. Таким образом, разработанный нами протокол пробоподготовки позволяет на должном уровне сохранять структуры, образуемые целевым белком, и обеспечивает достаточное соотношение сигналшум в получаемых изображениях, что позволяет его использовать в сочетании с ЛМ.

4.3. Локализационная микроскопия белка FtsZ в нормально делящихся клетках E.coli.

Рис. 4.6. Локализация одиночных молекул флуорофора и их реконструкция в экспериментах с FtsZ в бактериях E.coli. а-д: последовательные кадры, демонстрирующие изображения одиночных молекул флуорофора до локализации; з-м: соответствующие им изображения, полученные после обработки алгоритмом QuickPALM (ЛМ изображения); е и ж - результат сложения дифракционно-ограниченных изображений из 5 и 1000 кадров соответственно; н и о – ЛМ изображения, полученные из 5 и 1000 кадров соответственно.

фотоактивации, а также плотность молекул флуорофора в образцах позволяют получать изображения одиночных молекул флуорофора. В первый момент включения лазеров наблюдается высокая интенсивность флуоресценции, которая затем быстро спадает и спустя несколько секунд выходит на практически постоянный уровень. Каждая молекула флуорофора имеет время жизни в среднем не более одного кадра. При этом изображения одиночных молекул не перекрываются, что необходимо для возможности локализации.

Параметры алгоритма QuickPALM подобраны таким образом, что большинство «спорных» изображений молекул отсеиваются и не используются в ходе дальнейшей реконструкции.

Примеры изображений одиночных молекул флуорофора, а также результаты обработки данных изображений алгоритмом QuickPALM, полученные нами в ходе изучения белка FtsZ кишечной палочки, приведены на рис. 4.6.

Верхний ряд изображений (а-д) на данном рисунке демонстрирует дифракционно-ограниченные изображения молекул флуорофора. В ходе обработки часть молекул, удовлетворяющая установленным условиям, локализуется с желаемой точностью, формируя таким образом изображения, представленные в нижнем ряду (з-м). В ходе реконструкции локализованные изображения молекул объединяются, формируя таким образом целое изображение (н и о). С другой стороны, если из алгоритма обработки исключить локализацию, несложно получить соответствующие дифракционноограниченные изображения (е и ж), аналогичные которым получают в «обычной» ФМ. Сравнение изображений ж и о показывает разницу между изображениями, полученными соответственно «традиционной» ФМ и ЛМ, в частности, на последнем изображении отчетливо видны структуры, напоминающие спираль и кольцо, что невозможно увидеть на изображении ж.

Изображения структур, формируемых бактериальным белком FtsZ в клетках линии Top10, полученные методом ЛМ, позволяют более уверенно, чем традиционная ФМ, сделать вывод о формировании данным белком кольцевых и спиральных структур и, кроме того, оценить характерные размеры данных структур.

полученные в различных режимах микроскопа. Изображения «на просвет» (а) позволяют заключить, что данные клетки еще не образует перетяжку (септу), тем не менее, z-кольцо, которое отчетливо видно в режиме ЛМ (б), уже образовано. Сравнение рисунков б и г позволяет отметить, что изображение в режиме ЛМ является существенно более информативным, чем изображение в режиме «обычной» ФМ. Интересно отметить наличие на верхнем изображении напоминающей Z-кольцо, в области септы. Интересно, что последняя структура видна как дуга, как будто ось Z-кольца не совпадает с осью бактерии.

Визуализация подобных структур при помощи 3D-ЛМ позволит нам лучше понять, как интерпретировать данные результаты.

Рис. 4.7. z-кольца, формируемые посередине делящихся клеток кишечной палочки. а – изображение в проходящем свете; б – ЛМ изображение; в – наложение изображений а и б; г – изображение во флуоресцентном режиме. Шкала – 1 мкм.

Нижний ряд демонстрирует похожую клетку, но с более широким кольцом. Ряд изображений ЛМ позволили оценить характерные размеры кольца (см. табл. 2). В таблице M обозначено математическое ожидание, SD – стандартное отклонение.

Оценка внешнего диаметра (0,8±0,2 мкм) и толщины (130±30 нм) zкольца позволяют отметить сходство с литературными данными для E.coli [43, 44]. Очевидно, что Z-кольцо локализовано у мембраны, т.к. его внешний диаметр совпадает с характерной толщиной бактерии кишечной палочки (0,8 – 1,0 мкм).

Рис. 4.8. Спиралевидная структура, формируемая в неделящейся клетке кишечной палочки. а – изображение в проходящем свете; б – изображение во флуоресцентном режиме; в – ЛМ На рис. 4.8 и 4.9 приведены примеры бактерий, в которых FtsZ образует спиралевидные структуры. На рис. 4.8 изображена бактерия, по какойто причине переставшая делиться. Данный вывод можно сделать по ее морфологическим особенностям, в частности по увеличенной длине, а также по отсутствию z-кольца. Интересно отметить, что спираль из FtsZ расплывчато видна и на ФМ изображении, однако лишь в режиме ЛМ удается в подробностях изучить особенности этой структуры, в частности, измерить шаг и диаметр спирали. Шаг составил около 1 мкм, диаметр – 900 нм. К сожалению, фрагментарный характер изображения не позволил оценить толщину спирали.

На рис. 4.9 изображена бактерия, завершающая процесс деления (отчетливо видна септа посередине клетки в проходящем свете (а)). В данной бактерии также видна спиралевидная структура, в особенности в области септы. Образование спирали посередине бактерии в конце процесса деления может свидетельствовать в пользу гипотезы о том, что z-кольцо является частным случаем спиралей, образуемых FtsZ, сильно скрученных в области септы. Если исходить из данной гипотезы, то на изображении мы видим процесс разборки Z-кольца на завершающей стадии деления.

Рис. 4.9. Спиралевидная структура, образованная в клетке, заканчивающей процесс деления.

а – изображение в проходящем свете; б – ЛМ изображение; в – наложение а и б. Шкала – Таким образом, при помощи метода ЛМ нами были исследованы структуры, формирующиеся в клетках E.coli в ходе клеточного деления.

Полученные результаты находятся в согласии с ранее описанными в литературе, что позволяет говорить об адекватности реализации метода, что позволило применить ЛМ для изучения клеток в состоянии SOS-ответа, к которым ранее данный метод не применялся.

4.4. Локализационная микроскопия белка FtsZ в клетках E.coli, находящихся в состоянии SOS-ответа.

Также в ходе данной работы изучались структуры, формируемые FtsZ в клетках кишечной палочки в состоянии SOS-ответа. Литературные данные [28] свидетельствуют об ингибировании образования FtsZ филаментов под действием белка SulA в ходе SOS-ответа, на основании чего можно предположить, что в SOS-ответе FtsZ находится в клетках в основном в виде мономера, т.е. не образует упорядоченных структур. Тем не менее, что в ходе работы мы обнаружили образование FtsZ достаточно протяженных спиралевидных структур (см. рис. 4.10).

Следует отметить, что данные структуры имеют фрагментарный, прерывистый характер, однако образуются по всей клетке и в длину могут достигать нескольких микрон, что сравнимо с длиной типичной бактерии кишечной палочки. Кроме того, следует отметить достаточно длинный (порядка 1 мкм) шаг спиралей, который варьирует в различных фрагментах спиралей. На основании данного наблюдения можно предположить, что в исследуемых клетках происходит лишь частичное ингибирование образование FtsZ филаментов, предотвращающее в первую очередь образование z-колец.

Возможно, наряду с ингибированием полимеризации FtsZ, в остановке клеточного деления E.coli значительную роль играет ингибирование сборки zкольца, как это происходит в B.subtilis [45] и C. crescentus [39]. Большую ясность касательно природы структур, формируемых FtsZ в бактериях, находящихся в состоянии SOS-ответа, способно дать применение к ним метода 3D-ЛМ.

Рис. 4.10. Структуры, формируемые FtsZ в клетках кишечной палочки в состоянии SOSответа. а – изображение в проходящем свете; б – во флуоресцентном режиме; в – в режиме ЛМ, стрелками указаны спиралевидные структуры; г – объединение а и в. Шкала – 1 мкм.

5.1. Выводы из проделанной работы.

Таким образом, в данной работе метод локализационной микроскопии был успешно применен для изучения организации белка цитоскелета кишечной палочки FtsZ. Метод позволил изучать организацию данного белка на уровне, недоступном для традиционной флуоресцентной микроскопии. Получены следующие результаты:

Показано, что в нормально делящихся клетках FtsZ формирует кольцевые и спиральные структуры.

Проведены измерения характерных размеров данных структур (в частности, диаметр Z-кольца составил 0,8±0,2 мкм а толщина – 130±30 нм, что находится в согласии с литературными данными [44]).

В работе были изучены бактерии, находящиеся в состоянии SOS-ответа.

Было обнаружено, что в клетках данного штамма целевой белок способен формировать фрагментарные спиралевидные структуры с различным шагом (порядка 1 мкм), что может свидетельствовать об ингибировании не только полимеризации FtsZ, связанной со взаимодействием его с белком SulA, но и об ингибировании образования z-кольца.

Наличие спиралевидных структур из FtsZ в неделящихся клетках, а также длинный шаг спиралей (сравнимый с длиной бактерии) позволяют предположить, что при выходе клеток из состояния sos-ответа может иметь место перестройка спиральных структур в кольцевые (z-кольца).

В ход эксперимента была внедрена система активной стабилизации положения образца, которая позволила увеличить стабильность положения образца. Низкочастотный дрейф образца практически устранён (продемонстрировано его уменьшение на 3 порядка). Высокочастотные колебания образца также значительно снижены. Так, стандартное отклонение координат образца в ходе работы системы стабилизации не превышает 10 нм в трёх измерениях, что даже выше точности локализации алгоритма обработки изображений QuickPALM (около 30 нм в данной работе). Высокая стабильность образца дает принципиальную возможность увеличения точности локализации алгоритма за счет более длительной съемки.

5.2. Дальнейшие планы.

продолжены, в особенности с привлечением 3D-ЛМ. Для реализации этого метода требуется дальнейшее развитие протоколов пробоподготовки, регистрации и обработки изображений. 3D-ЛМ позволит на более высоком уровне изучить структуру Z-колец, в особенности перспективной представляется возможность с помощью этого метода разрешить, каким образом протофиламенты FtsZ организованы в составе Z-кольца. Для этого потребуется, по-видимому, увеличить точность локализации, для чего нужно значительно увеличить скорость съемки изображений. По-видимому, именно на данном этапе окажется критически важной система активной стабилизации.

Также трёхмерные изображения позволят нам лучше понять природу спиралевидных структур, наблюдаемых в клетках, находящихся в состоянии SOS-ответа.

Автор выражает искреннюю благодарность своим родителям, родным и близким людям, друзьям и товарищам за поддержку и заботу.

Коллективу средней школы № 423 г. Кронштадта за знания и умения, в особенности классному руководителю Щемелёвой Наталье Викторовне за любовь к физике, главной среди наук, а также за терпение… И за ночные ориентирования!

Коллективу кафедры «Физическая электроника» и всего Политеха за ценные знания и отличную подготовку.

Всему коллективу НИК «Нанобиотехнологии» за тепло и заботу, а также за радость приходить на работу.

Антону Сабанцеву за живой интерес к науке, за помощь во всех начинаниях, за уважительное отношение к чужому мнению (даже когда оно ошибочно).

Ходорковскому Михаилу Алексеевичу за возможность заниматься любимым делом, за терпение и всестороннюю помощь.

Мельникову Алексею Сергеевичу за плодотворные обсуждения.

Скворцову Алексею Николаевичу за ценные знания и за экскурсию в конце III курса.

Морозовой Наталии за любовь, за искренность, за поддержку и безмерное терпение. А ещё за то что ты есть!

1. C. Coltharp, J. Xiao. Superresolution microscopy for microbiology // Cell Microbiol, 2012. 14(12): p. 1808-18.

2. M.T. Cabeen, C. Jacobs-Wagner. The bacterial cytoskeleton // Annu Rev Genet, 2010. 44: p. 365-92.

3. А.Д. Ведяйкин, А.В. Сабанцев, И.Е. Вишняков, Я.В. Федорова, А.С.

Мельников, П.Ю. Сердобинцев, М.А. Ходорковский. Localization microscopy study of FtsZ structures in E. coli cells during SOS-response (тезисы, стендовый доклад), 1st International School and Conference "SaintPetersburg OPEN 2014" (в редакции) // Journal of Physics: Conference Series, 2014.

4. А.В. Сабанцев, А.Д. Ведяйкин, Г.Е. Побегалов, М.А. Ходорковский, С.Н.

Борхсениус, И.Е. Вишняков. Исследование надмолекулярных белковых структур, формируемых в клетках микоплазм, методом локализационной микроскопии // Биология - наука ХХI века: 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 21 - апреля 2013 г.), 2013: p. 185.

5. А.В. Сабанцев, И.Е. Вишняков, А.Д. Ведяйкин, Г.Е. Побегалов, С.Н.

Борхсениус, М.А. Ходорковский. Study of structures formed by FtsZ in Escherichia coli and Mycoplasma hominis cells (Тезисы, стендовый доклад), 38-й конгресс FEBS // FEBS JOURNAL, 2013. 280: p. 469-470.

6. D.E. Wolf. The optics of microscope image formation // Methods Cell Biol, 2007. 81: p. 11-42.

7. S.W. Hell, J. Wichmann. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy // Opt Lett, 1994. 19(11): p. 780-2.

8. P.C. Jennings, G.C. Cox, L.G. Monahan, E.J. Harry. Super-resolution imaging of the bacterial cytokinetic protein FtsZ // Micron, 2010.

9. T. Grotjohann, I. Testa, M. Leutenegger, H. Bock, N.T. Urban, F. LavoieCardinal, K.I. Willig, C. Eggeling, S. Jakobs, S.W. Hell. Diffraction-unlimited all-optical imaging and writing with a photochromic GFP // Nature, 2011.

478(7368): p. 204-8.

10. J.T. Frohn, H.F. Knapp, A. Stemmer. True optical resolution beyond the Rayleigh limit achieved by standing wave illumination // Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(13): p. 7232-6.

11. M.G. Gustafsson. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy // J Microsc, 2000. 198(Pt 2): p. 82-7.

12. R. Heintzmann, C.G. Cremer. Laterally modulated excitation microscopy:

improvement of resolution by using a diffraction grating // 1999: p. 185-196.

13. M.G. Gustafsson, L. Shao, P.M. Carlton, C.J. Wang, I.N. Golubovskaya, W.Z.

Cande, D.A. Agard, J.W. Sedat. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination // Biophys J, 2008. 94(12): p. 4957-70.

14. P. Eswaramoorthy, M.L. Erb, J.A. Gregory, J. Silverman, K. Pogliano, J.

Pogliano, K.S. Ramamurthi. Cellular architecture mediates DivIVA ultrastructure and regulates min activity in Bacillus subtilis // MBio, 2011.

15. M.G. Gustafsson. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution // Proc Natl Acad Sci U S A, 2005. 102(37): p. 13081-6.

16. E.H. Rego, L. Shao, J.J. Macklin, L. Winoto, G.A. Johansson, N. KampsHughes, M.W. Davidson, M.G. Gustafsson. Nonlinear structured-illumination microscopy with a photoswitchable protein reveals cellular structures at 50-nm resolution // Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109(3): p. E135-43.

17. E. Betzig, G.H. Patterson, R. Sougrat, O.W. Lindwasser, S. Olenych, J.S.

Bonifacino, M.W. Davidson, J. Lippincott-Schwartz, H.F. Hess. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution // Science, 2006.

313(5793): p. 1642-5.

18. M.J. Rust, M. Bates, X. Zhuang. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) // Nat Methods, 2006. 3(10): p.

19. S.T. Hess, T.P. Girirajan, M.D. Mason. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy // Biophys J, 2006.

91(11): p. 4258-72.

20. J. Vogelsang, C. Steinhauer, C. Forthmann, I.H. Stein, B. Person-Skegro, T.

Cordes, P. Tinnefeld. Make them blink: probes for super-resolution microscopy // Chemphyschem, 2010. 11(12): p. 2475-90.

B. Alberts, J.H. Wilson, T. Hunt, Molecular biology of the cell. 2008, Garland 21.

Science: New York. p. 1-1601.

22. P.L. Graumann. Cytoskeletal elements in bacteria // Annu Rev Microbiol, 2007. 61: p. 589-618.

23. J.F. Lutkenhaus, H. Wolf-Watz, W.D. Donachie. Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ) // J Bacteriol, 1980. 142(2): p. 615-20.

24. S.G. Addinall, J. Lutkenhaus. FtsZ-spirals and -arcs determine the shape of the invaginating septa in some mutants of Escherichia coli // Mol Microbiol, 1996.

22(2): p. 231-7.

25. E.F. Bi, J. Lutkenhaus. FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli // Nature, 1991. 354(6349): p. 161-4.

26. R. Strepp, S. Scholz, S. Kruse, V. Speth, R. Reski. Plant nuclear gene knockout reveals a role in plastid division for the homolog of the bacterial cell division protein FtsZ, an ancestral tubulin // Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(8): p.

27. H.P. Erickson, D.E. Anderson, M. Osawa. FtsZ in bacterial cytokinesis:

cytoskeleton and force generator all in one // Microbiol Mol Biol Rev, 2010.

74(4): p. 504-28.

28. I. Erill, S. Campoy, J. Barbe. Aeons of distress: an evolutionary perspective on the bacterial SOS response // FEMS Microbiol Rev, 2007. 31(6): p. 637-56.

29. E. Ozyamak, J.M. Kollman, A. Komeili. Bacterial actins and their diversity // Biochemistry, 2013. 52(40): p. 6928-39.

30. N. Ausmees, J.R. Kuhn, C. Jacobs-Wagner. The bacterial cytoskeleton: an intermediate filament-like function in cell shape // Cell, 2003. 115(6): p. 705A. Briegel, D.P. Dias, Z. Li, R.B. Jensen, A.S. Frangakis, G.J. Jensen. Multiple large filament bundles observed in Caulobacter crescentus by electron cryotomography // Mol Microbiol, 2006. 62(1): p. 5-14.

32. D. Greenfield, A.L. McEvoy, H. Shroff, G.E. Crooks, N.S. Wingreen, E.

Betzig, J. Liphardt. Self-organization of the Escherichia coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy // PLoS Biol, 2009.

7(6): p. e1000137.

33. S.Y. Kim, Z. Gitai, A. Kinkhabwala, L. Shapiro, W.E. Moerner. Single molecules of the bacterial actin MreB undergo directed treadmilling motion in Caulobacter crescentus // Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(29): p. 10929J.S. Biteen, L. Shapiro, W.E. Moerner. Exploring protein superstructures and dynamics in live bacterial cells using single-molecule and superresolution imaging // Methods Mol Biol, 2011. 783: p. 139-58.

35. M.D. Lew, S.F. Lee, J.L. Ptacin, M.K. Lee, R.J. Twieg, L. Shapiro, W.E.

Moerner. Three-dimensional superresolution colocalization of intracellular protein superstructures and the cell surface in live Caulobacter crescentus // Proc Natl Acad Sci U S A, 2011. 108(46): p. E1102-10.

36. S.F. Lee, M.A. Thompson, M.A. Schwartz, L. Shapiro, W.E. Moerner. Superresolution imaging of the nucleoid-associated protein HU in Caulobacter crescentus // Biophys J, 2011. 100(7): p. L31-3.

37. J.S. Biteen, E.D. Goley, L. Shapiro, W.E. Moerner. Three-dimensional superresolution imaging of the midplane protein FtsZ in live Caulobacter crescentus cells using astigmatism // Chemphyschem, 2012. 13(4): p. 1007-12.

38. J.L. Ptacin, S.F. Lee, E.C. Garner, E. Toro, M. Eckart, L.R. Comolli, W.E.

Moerner, L. Shapiro. A spindle-like apparatus guides bacterial chromosome segregation // Nat Cell Biol, 2010. 12(8): p. 791-8.

39. S.J. Holden, T. Pengo, K.L. Meibom, C. Fernandez Fernandez, J. Collier, S.

Manley. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentus in vivo Z-ring organization // Proc Natl Acad Sci U S A, 2014.

111(12): p. 4566-71.

40. C.A. Schneider, W.S. Rasband, K.W. Eliceiri. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis // Nat Methods, 2012. 9(7): p. 671-5.

41. A.R. Carter, G.M. King, T.A. Ulrich, W. Halsey, D. Alchenberger, T.T.

Perkins. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions // Appl Opt, 2007. 46(3): p. 421-7.

42. А.В. Сабанцев, Г.Е. Побегалов, С.В. Мурашов, А.С. Мельников, М.А.

Ходорковский. Модернизация флуоресцентного микроскопа для разрешением // Научно-технические ведомости СПбГПУ. Физикоматематические науки, 2012. 2(146): p. 94-99.

43. J. Buss, C. Coltharp, J. Xiao. Super-resolution imaging of the bacterial division machinery // J Vis Exp, 2013(71).

44. G. Fu, T. Huang, J. Buss, C. Coltharp, Z. Hensel, J. Xiao. In vivo structure of the E. coli FtsZ-ring revealed by photoactivated localization microscopy (PALM) // PLoS One, 2010. 5(9): p. e12682.

45. L.W. Hamoen. Cell division blockage: but this time by a surprisingly conserved protein // Mol Microbiol, 2011. 81(1): p. 1-3.