WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:     || 2 |

«Н.Н. АХМЕТСАДЫКОВ, Г.С. ШАБДАРБАЕВА, Д.М. ХУСАИНОВ ТЕХНОЛОГИЯ ВЕТЕРИНАРНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Допущено МОН РК ВУЗ в качестве учебника Книга 2 ТЕХНОЛОГИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ...»

-- [ Страница 1 ] --

КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Н.Н. АХМЕТСАДЫКОВ, Г.С. ШАБДАРБАЕВА,

Д.М. ХУСАИНОВ

ТЕХНОЛОГИЯ ВЕТЕРИНАРНЫХ

БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Допущено МОН РК ВУЗ в качестве учебника

Книга 2

ТЕХНОЛОГИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ,

ПРИМЕНЯЕМЫХ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЧЕНИЯ И

ПРОФИЛАКТИКИ БОЛЕЗНЕЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ВИРУСАМИ

Алматы, 2013 1 УДК 378 (075.8):576.8 ББК 48 я 7 А17 Ахметсадыков Н.Н., Шабдарбаева Г.С., Хусаинов Д.М.

А17 Технология ветеринарных биологических препаратов: Учебник – Алматы: Изд-во "Агроуниверситет", – 374 с.

ISBN 978-601-241-218- В книге 2 учебника для студентов, изучающих курс технологии производства ветеринарных биологических препаратов, приведены материалы для проведения лекционных, лабораторных и практических занятий по вопросам производства биологических препаратов, применяемых для диагностики лечения и профилактики болезней, вызываемых вирусами.

Учебник разработан на основе рабочей учебной программы, с использованием материалов отечественных и зарубежных литературных научных источников, нормативных документов, личного опыта, и отвечает требованиям высшей школы. Предназначается для студентов, бакалавров, магистрантов, аспирантов, ветеринаров, биотехнологов, медиков и практических специалистов, работающих в области производства и применения биологических ветеринарных препаратов.

УДК 378 (075.8):576. ББК 48 я Рецензенты:

Заманбеков Н.А., доктор ветеринарных наук, профессор;

Сейдахметова Р.Д., доктор биологических наук Учебник рекомендован к изданию Ученым Советом Казахского национального аграрного университета (протокол № 7 от 14.12. 2009 г.).

ISBN 978-601-241-218- © Ахметсадыков Н.Н., Шабдарбаева Г.С., Хусаинов Д.М., © Изд-во "Агроуниверситет",

ПРЕДИСЛОВИЕ

Обеспечение ветеринарной службы высокоэффективными конкурентноспособными отечественными лечебно-профилактическими препаратами - одна из главных задач в экономике и экологии страны. Выполнение данной задачи предусматривает проведение работ по технологическому и техническому переоснащению производства биопрепаратов на основе достижений биотехнологии.

Биотехнология - управляемое получение целевых продуктов полезных для народного хозяйства, медицины и ветеринарии с помощью биологических агентов: микроорганизмов, вирусов, клеток животных и растений, ферментов и антител. Она базируется на использовании современных методов исследований и технологий, разработке, новых биотехнологических процессов, способов их контроля и управления и определения путей их дальнейшего развития и оптимизации.

Программой мероприятий по развитию агробиологического комплекса, в частности биопромышленности Казахстана, является совершенствование существующих и разработка нового поколения биопрепаратов - поливалентных, комплексных, ассоциированных, субъединичных, синтетических и генно-инженерных вакцин, сывороток и диагностикумов, препаратов для экстренной защиты животных от особо опасных болезней, массовых форм применения.

Для серологической диагностики заболеваний (в реакции агглютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК), реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и др.) используются различные антигены, получение которых основано на наработке биомассы и определенной обработке: инактивации, очистке, дезинтеграции, окраске, выделении полисахаридно-полипептидной фракции и пр.

Кроме того, при диагностике и лечении заболеваний животных используются позитивные, лечебно-профилактические, антитоксические сыворотки и приготовленные из них иммуноглобулины. В последнее время все большее распространение получают комплексные диагностические тест-системы для диагностики заболеваний, в частности для иммуноферментной диагностики (ИФА).

Книга 2 посвящена изучению технологии биологических препаратов, применяемых для диагностики лечения и профилактики болезней, вызываемых вирусами.

Книга

ТЕХНОЛОГИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ

ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ, ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ БОЛЕЗНЕЙ,

ВЫЗЫВАЕМЫХ ВИРУСАМИ

Бешенство (Rabies) - остро протекающая болезнь, характеризующаяся поражением центральной нервной системы. Восприимчивы все виды домашних и диких животных, а также человек.

Болезнь регистрируется в различных странах земного шара.

Открытие возбудителя болезни принадлежит Луи Пастеру (1881-1889) им же предложен метод аттенуации вируса бешенства и возможность антирабических прививок.

В 1887 г. В.Бабеш, а в 1903 г. А.Негри обнаружили в ганглиозных клетках головного мозга погибших от бешенства животных специфические эозинофильные цитоплазматические включения.

Возбудитель болезни - вирус, относящийся к роду лиссавирусов семейства рабдовирусoв. Как и другие рабдовирусы, он имеет пулевидную форму.

Длина вирионов - 180 нм, диаметр - 75 -80 нм. Вирус удается культивировать в развивающихся куриных и утиных эмбрионах, в культурах некоторых клеток. Штаммы возбудителя бешенства, циркулирующие в природе (уличный вирус), патогенны для всех теплокровных животных. В наиболее высоких титрах вирус накапливается в центральной нервной системе зараженных животных, особенно в аммоновых рогах и коре больших полушарий головного мозга, в мозжечке и продолговатом мозге. Высокий титр возбудителя бешенства и в слюнных и слезных железах.

Вирус обладает двумя основными антигенными компонентами. Растворимый S-антиген (нуклепротеин капсиды) является общим для всей группы вирусов бешенства и ответствен за продукцию комплементсвязывающих, преципитирующих антител и антител, участвующих в реакции иммунофлюоресценции. Инфекционный V-антиген (гликопротеид наружной оболочки вириона) вызывает образование вируснейтрализующих антител, антигемагглютининов и обеспечивает формирование иммунитета. Этот антиген типоспецифический. На основе различий гликопротеидного компонента, выявляемых в реакции перекрестной защиты и реакции нейтрализации, в группе вирусов бешенства выделяют 4 серотипа. Абсолютное большинство полевых и лабораторных штаммов относится к первому серотипу. Штаммы вируса остальных серотипов пока выделены только в Африке. Биологические свойства вируса бешенства, как и других вирусов, подвержены естественной изменчивости. Установлено несколько биологических вариантов уличного вируса. Чаще всего выделяют классические штаммы, которые медленно фиксируются, вызывают типичную картину бешенства. Штаммы уличного вируса, напротив, быстро фиксируются и после короткого инкубационного периода вызывают паралитическую форму болезни, при которой не обнаруживают телец Бабеша - Негри. Имеют определенные особенности штаммы вируса, выделяемые при арктическом бешенстве («ликований») животных; «болезни безумной собаки» в Западной Африке, при бешенстве крупного рогатого скота, распространяемом летучими мышами-вампирами в Центральной и Южной Америке. Они с трудом фиксируются и вызывают болезнь с преобладанием паралитических признаков. Отклоняются от классических и биологические свойства многих штаммов «лисьего бешенства» и тем более так называемых бешенствоподобных вирусов, выделенных от мышевидных грызунов в Центральной Европе и от землеройки, летучей мыши и насекомых в Африке.

К бешенству восприимчивы все виды домашних и диких теплокровных животных, а также и человек. Повышенной восприимчивостью отличаются дикие представители семейства собачьих (лисица, волк, шакал, енотовидная собака) и куньих, летучие мыши, грызуны многих видов, а также домашняя кошка. Менее восприимчивы человек, собаки, рогатый скот, лошади, очень слабо восприимчивы птицы. Молодые животные более чувствительны к вирусу, чем взрослые.

Впервые бешенство упоминается в XXIII в. до н. э. в Кодексе законов Древнего Вавилона. В 1804 г. Цинке установил заразную природу бешенства, а Галтье (1879) сообщил о значении нервных путей в распространении возбудителя бешенства в организме животного и человека и искусственно воспроизвел болезнь у кроликов.

Луи Пастеру и его ученикам принадлежит открытие способа аттенуации вируса бешенства и антирабических прививок (1881—1885). В 1887 г.

Бабеш, а в 1903 г. Негри обнаружили в ганглиозных клетках головного мозга погибших от бешенства животных специфические эозинофильные цитоплазматические включения.

Лабораторная диагностика является главной, подтверждающей в комплексе диагностических исследований. Она заключается в исследовании головного мозга животных с целью выявления вирусного антигена в РИФ, РДП, обнаружении телец Бабеша - Негри и биопробе на белых мышах.

Быстрым и простым методом диагностики является выявление телец Бабеша—Негри. Положительный диагноз может быть поставлен через мин после доставки материала в лабораторию. Важное значение имеет обнаружение специфических телец-включений в слюнных железах.

Более длительным методом лабораторной диагностики является биологическая проба. Для заражения наиболее пригодны мыши-сосуны и кролики.

Точным экспресс-методом диагностики бешенства является метод иммунофлуоресценции. Он позволяет получить ответ в день исследования материала. Метод флуоресцирующих антител основан на микроскопии мазковотпечатков головного мозга, обработанных специфической антирабической сывороткой, меченной флуоресцирующими красителями.

Из серологических методов диагностики бешенства известны: реакция диффузионной преципитации в агаровом геле, реакция нейтрализации на мышах, реакция связывания комплемента, реакция непрямой гемагглютинации, реакция торможения гемагглютинации, реакция иммунофлуоресценции.

Технология получения высокоспецифичной гетерологичной Технология включает гипериммунизацию животных-продуцентов инактивированным, очищенным и концентрированным вирусом бешенства с адъювантом фосфатом алюминия и/или нуклеинатом натрия. Полученный на культуре перевиваемых клеток Vero и на первичной культуре клеток почек сирийского хомяка вирус концентрируют адсорбцией на геле фосфата алюминия или ультрацентрифугированием, или методами ультрафильтрации и очищают через пористые кремнеземы или ионообменной хроматографией.

Для иммунизации используют антиген с индексом иммуногенности не менее 9,5 МЕ/мл, содержанием белка менее 200 мкг/мл, бычьего сывороточного альбумина менее 0,5 мкг/мл, клеток ПСХ и Vero менее 0,5 мкг/мл, клеточной ДНК 5,0-10,0 мг/мл, концентрацией ионов алюминия в антигене 0,2-1, мкг/мл, нуклеината натрия 0,002-0,5 мг/мл. Схема грундиммунизации - 1- инъекции антигена дозой 3-15 мл с интервалом 14-30 дней, на 45-60 день основной цикл иммунизации из 10-15 инъекций с интервалом 5-15 дней дозой антигена 5-70 мл. Далее продуцентов иммунизируют один раз в месяц дозой 20-70 мл, один раз в полгода проводят укороченный цикл иммунизации из 2-4 инъекций антигена с интервалом 5-15 дней дозой 20-70 мл. Технология позволяет получать гетерологичную антирабическую сыворотку с высокой специфической активностью.

Исследования по получению антирабической сыворотки были начаты еще в 1889 г., когда Babes и Lepp обнаружили в крови иммунизированных собак нейтрализующие вирус бешенства антитела, с тех пор многие работы были направлены на получение сыворотки, обладающей высокой активностью.

Получение нативных сывороток с высокой концентрацией антител добиваются гипериммунизацией животных, т.е. применением интенсивных схем иммунизации, состоящих из многих циклов и инъекций антигена. Количество циклов, число инъекций в каждом цикле, дозы и способы введения антигенов определяются в каждом конкретном случае, исходя из особенностей антигена, его состояния, вида животных-продуцентов и целевого назначения сывороточного препарата. Существует прямая связь между силой антигенного раздражения и качеством антигена с уровнем накопления специфических антител в крови животных. В то же время качество антигена в значительной мере зависит от штамма вируса, методов его культивирования и очистки.

Технология получения № 1.

В качестве антигена используют вирус бешенства штамм Внуково- адаптированный к перевиваемым гетероплоидным клеткам Vero, который добавляют из расчета 0,1 ЛД50/кл к культуре клеток Vero в концентрации тыс. кл/мл. Зараженные вирусом клетки соединяют с ростовой средой и культивируют в биореакторе с использованием микроносителей. После смены ростовой среды на поддерживающую среду делают сборы вируссодержащей жидкости. Полученные сборы фильтруют через фильтр Кулагина с диаметром пор 0,45 мкм и инактивируют с помощью аппарата-иррадиатора ультрафиолетовых лучей.

Полученная вируссодержащая жидкость содержит белок в количестве 570 мкг/мл, бычий сывороточный альбумин - 1,6 мг/мл, индекс иммуногенности составляет - 2,01 МЕ/мл. Концентрацию и очистку вируса проводят ультрафильтрацией с последующей очисткой на колонке с пористым кремнеземом в трис-фосфатном буфере с рН=7,8. К очищенному вирусу добавляют фосфат алюминия с концентрацией ионов алюминия 0,6 мг/мл и стабилизаторы: лошадиный сывороточный альбумин в конечной концентрации 0,5%, сахарозу 7,5%, желатозу 1% и лиофильно высушивают. Перед использованием антиген разводят в воде для инъекций. В полученном антигене индекс иммуногенности составил 19,8 МЕ/мл, количество белка - 98 мкг/мл, бычий сывороточный альбумин - 0,2 мкг/мл, клеточная ДНК - 3 нг/мл. Этим антигеном иммунизируют лошадь массой (330±25) кг. Грундиммунизация состоит из двух внутрикожных и внутримышечных инъекций антигена дозой 5 и мл с интервалом 30 дней. Основной цикл начинается на 45 день и состоит из трех внутрикожных инъекций антигена дозой 5, 10, 15 мл с интервалом дней и семи инъекций с интервалом 7 дней с увеличением вводимой дозы антигена от 20 до 50 мл, который вводят внутрикожно и внутримышечно. Затем в течение полугода лошадь иммунизируют раз в месяц дозой 20-30 мл внутрикожно и внутримышечно, после чего проводят укороченный цикл иммунизации, состоящий из трех инъекций антигена дозой 20, 25, 30 мл с интервалом 14 дней внутрикожно и внутримышечно. Кровь брали на 20-й день после каждого цикла иммунизации. На 110-й день после завершения основного цикла в полученной антирабической сыворотке специфическая активность была 120,1 МЕ/мл, -фракция - 43,8%, антитела к клеткам Vero отсутствовали. На 230-й день ревакцинации, после четырех однократных ежемесячных инъекций антигена, титр специфических антител составил 172,1 МЕ/мл, фракция - 50,6%, антитела к клеткам Vero не выявлены. На 333 день иммунизации, после укороченного цикла иммунизации, специфическая активность составила 183,0 МЕ/мл, -фракция - 56,3%, антитела к клеткам Vero - около 0,2 мкг/мл.

Технология получения № 2.

Штаммом вируса бешенства Внуково-32, с множественностью заражения 0,01 ЛД50/кл заражают трипсинизированные клетки почек сирийского хомяка в концентрации 500±100 тыс. кл/мл. Зараженные вирусом клетки соединяют с ростовой средой и культивируют в биореакторе с использованием микроносителей. После смены ростовой среды на поддерживающую делают сборы вируссодержащей жидкости. Полученные сборы фильтруют и инактивируют. В исходной вируссодержащей жидкости иммуногенная активность составляет 0,55 МЕ/мл, белка - 500 мкг/мл, бычьего сывороточного альбумина - 1,8 мкг/мл. Концентрацию и очистку вируса осуществляют методом ультрафильтрации с последующей очисткой ионообменной хроматографией на анионите ДЭАЭ-целлюлозе. Добавляют нуклеинат натрия в количестве 0, мг/мл, стабилизаторы и подвергают лиофильной сушке. В полученном антигене индекс иммуногенности составил 10,3 МЕ/мл, белок - 100 мкг/мл, бычий сывороточный альбумин - 0,3 мкг/мл, клетки ПСХ - 0,1 мкг/мл. Этим антигеном, разведенным в воде для инъекций, иммунизируют быка массой (335±25) кг. Грундиммунизация состоит из трех внутрикожных и внутримышечных инъекций антигена дозой 5, 10 и 15 мл с интервалом 20 дней. На 45 день начинают основной цикл иммунизации, состоящий из 10 инъекций антигена с интервалом 7 дней с увеличением вводимой дозы от 5 до 50 мл и 5-ти инъекций антигена дозой 50 мл с интервалом 14 дней. Антиген вводят внутрикожно и/или внутримышечно, в несколько точек на шее и крупе. В течение полугода быка иммунизируют раз месяц дозой 25-45 мл внутрикожно и внутримышечно, затем проводят укороченный цикл иммунизации, состоящий из трех внутрикожных и внутримышечных инъекций антигена дозой 20, 30 и мл с интервалом 14 дней.

На 150-й день после завершения основного цикла иммунизации получили антирабическую сыворотку со специфической активностью 83,1 МЕ/мл, в которой -фракция составляла 40,8%, антитела к клеткам ПСХ не выявлялись. На 240-й день ревакцинации, после трех ежемесячных инъекций антигена, титр специфических антител составил 114,0 МЕ/мл, -фракция - 42,9%, антитела к клеткам Vero не выявлены. На 375 день иммунизации, после укороченного цикла иммунизации, специфическая активность составила 119, МЕ/мл, -фракция глобулина - 43,2%, антитела к ПСХ - менее 0,5 мкг/мл.

Полученные результаты представлены в таблице.

Таким образом, предлагаемая технология позволяет в производственных условиях получить высокоспецифичную гетерологичную антирабическую сыворотку со специфической активностью не менее 75 МЕ/мл, в которой -глобулиновая фракция составляет не менее 40%, антитела к клеткам субстрата, на котором происходил рост вируса, - менее 0,5 мкг/мл, пригодную для получения гетерологичного антирабического иммуноглобулина.

Предлагаемый способ безопасен и высокоэффективен.

Технология получения иммуноглобулина диагностического Получение иммуноглобулина диагностического антирабического преципитирующего (ИДАП) включает иммунизацию животных-продуцентов рабическим антигеном из вируссодержащей мозговой ткани, взятие крови с последующим отделением антирабической сыворотки и выделение иммуноглобулина, при этом в качестве продуцентов используют животное-самку, ее иммунизацию осуществляют рабическим антигеном, приготовленным из вируссодержашей мозговой ткани молодого животного, для иммунизации используют три вида антигена: НАФ – антиген, адъювант-депонированный и фенолизированный, а иммунизацию осуществляют комбинированием внутрикожных, подкожных и внутримышечных введений антигенов, с целью стимуляции антителогенеза вводят цитотоксическую сыворотку, полученную антирабическую сыворотку прогревают при температуре 56-58 °С в течение 30 минут, глобулиновую фракцию выделяют спиртовым методом с последующим диализом, центрифугированием и лиофильным высушиванием.

Стимуляция продуцентов антиретикулярной цитотоксической сывороткой повышает антителогенез. Использование трех видов антигенов с тремя различными путями введения способствует получению антирабической сыворотки с высоким содержанием преципитирующих антител, так как активность антирабических сывороток во многом определяется контактом рабического антигена с обширной сетью нервных окончаний, в результате этого, полученный иммуноглобулин не требует применения дорогостоящего оборудования и реагентов для дополнительной концентрации и очистки от неспецифических антител при изготовлении и применении иммунодиагностикума для реакции диффузной преципитации.

А Техника получения антигена Для получения вируссодержащей мозговой ткани используют ослят 1,5-2 - месячного возраста, матери которых не были вакцинированы против бешенства. Животных заражают интрацеребрально в дозе 0,1-0,2 см 1 %-ной суспензией вируса бешенства (штамм CVS). Суспензию готовят в стерильных условиях из вируссодержащего головного мозга лабораторного животного, на котором пассируется фиксированный вирус бешенства. Ткань тщательно растирается в ступке пестиком, и готовят 10 % суспензию на 0,85 % растворе хлорида натрия, добавляя антибиотики из расчета но 500 ЕД. пенициллина и стрептомицина на 1 мл. Суспензию экстрагируют в течение 18 часов при 4 °С и из надосадочной жидкости делают разведение 1:10, которое и используют для заражения.

На 5-6 день после заражения, когда у ослят наступает атаксия, параличи и агония, в асептических условиях извлекают головной мозг. Хранят мозг целиком в стерильной посуде при температуре минус 20 °С и используют по мере надобности.

Рабический антиген для иммунизации ослов применяют в 3-х вариантах, основу которых составляет 4%-ная суспензия вирулентного мозга осленка на физиологическом растворе хлорида натрия.

Добавление к одной части суспензии 0.25 % фенола образует фенолизированный антиген. Другой – адъювантдепонированный антиген содержит в своем составе 0,05 % сапонина, 20 % гидрата окиси алюминия и 0,1 % формалина. Третий – НАФ антиген – в пропорции 1:1 с неполным адъювантом Фрейнда.

Б Техника иммунизации животных Для получения антирабической сыворотки отбирают клинически здоровых, ослов, полученных из благополучных по инфекционным и инвазионным заболеваниям хозяйств.

Новорожденный молодняк заражают и получают антигенный материал по вышеприведенной методике.

В это время осла подвергают обработке стимулирующей дозой антиретикулярной цитотоксической сыворотки, трехкратно, с интервалом 7 дней в дозе 0,02 см на 50 кг живой массы тела.

Иммунизацию животных осуществляют чередованием внутрикожных, подкожных и внутримышечных инъекций рабических антигенов. Внутрикожные инъекции осуществляют 6 точек: слева и справа область шеи, спины, крупа; подкожные и внутримышечные - в область шеи и крупа. Первоначально осуществляют грундиммунизацию: внутрикожно вводили НАФантиген по схеме 0,26 (в 6 точек по 0,2 см), подкожно адъювантдепонированный антиген по схеме 2,02 (в 2 точки по 2,0 см в область шеи), внутримышечно фенольный антиген по схеме 1,52 (в 2 точки по 1,5 см в область крупа).. На 45-е сутки после грундиммунизации приступают к гипериммунизации, животных иммунизируют 4-8 кратно с интервалом 10-20 дней в зависимости от варианта антигена с соблюдением правил асептики и антисептики. Вначале вводят НАФ-антиген и адъювантдепонированный антиген соответственно в дозах 0,2мл10точек и 2мл2точки, инъекцию которого повторяют на 60-й (0,2мл15точек и 3 мл2 точки) и 75-й (0,2мл20точек и 4мл2 точки) и 90-й день (0,2мл30точек и 5мл2 точки). Фенольный антиген вводят в область крупа, слева и справа – на 52, 67, 82 и 97-й день в нарастающих дозах: 2мл2точки, 3мл2точки, 4мл2точки, 5мл2точки. Нарастание титра антител проверяют в пробах сыворотки крови, взятой индивидуально от каждого животного в процессе иммунизации по тестам РДП и РН.

На 10 день после последней инъекции антигена (107 день от начала иммунизации) у ослов осуществляют пробное крововзятие по норме 400 см на 100 кг живой массы.

При достижении преципитационного титра 1:32-1:128 через 14 дней (118 день от начала иммунизации) производится следующее крововзятие по полной производственной норме (1800 см3 на 100 кг живой массы). Вируснейтрализующая активность такой сыворотки, определяемая методом титрования на белых мышах, соответствует 1000-2000 ЕР. Сыворотка изготавливается стерильно, хранится при температуре 4-6°С в течение года.

Техника получения антирабического иммуноглобулина Преципитирующий иммуноглобулин выделяют спиртовым методом из высокоактивной, без следов гемолиза антирабической сыворотки, используя раствор 53%-ного этанола. Предварительно, для освобождения от термолабильных ингибиторов, сыворотка прогревается в малообъемной стеклянной посуде (1000-3000 см) в водяной бане 30 минут при температуре 56-58 С.

Сыворотка должна иметь рН 7,0-7,2 и это достигается добавлением 2М ацетатного буфера рН 4,65 в количестве 2-6 мл на 1 л. Ацетатный буфер готовится смешиванием в соотношении 1:1 отдельно приготовленных 2М растворов уксуснокислого натрия и ледяной уксусной кислоты.

Сыворотку с установленной рН охлаждают до 0 °С и одновременно охлаждают до минус 15-20 °С предназначенный для осаждения раствор 53%ного спирта на дистиллированной воде.

В условиях холодильной камеры при температуре 0 С к охлажденной сыворотке медленно, при постоянном перемешивании добавляют равный объем охлажденного спирта. Смесь продолжают перемешивать 30 минут, снижая температуру до минус 5 °С, и оставляют на 16-18 часов для формирования осадка.

Прозрачную надосадочную жидкость удаляют, выпавшие в осадок иммуноглобулины отделяют от некоторого количества надосадочной жидкости центрифугированием в рефрижераторной центрифуге при температуре минус 5 °С.

Осадок глобулина растворяют в охлажденном до 4 °С 0,15М растворе хлорида натрия, постепенно повышая температуру до комнатной (+20+25°С).

Концентрацию белка в растворе устанавливают в пределах 7-8 %.

Для коррекции солевого состава и удаления незначительного количества спирта раствор иммуноглобулина диализируют против 5М раствора хлорида натрия при четырехкратной его смене при температуре +4 °С в течение 2-х суток в целлофановых мешочках. Затем глобулин осветляют от незначительной опалесценции центрифугированием при той же температуре в течение 30 минут при 4000 об/мин.

Иммуноглобулин по фракционному составу состоит из гаммаглобулина, со следами бета-глобулина.

Раствор иммуноглобулина доводят до 5 %-ной концентрации 0,5М раствором хлористого натрия, консервируют мертиолатом 1:5000, исследуют на специфичность и преципитируюшую активность и подвергают лиофильной сушке.

Определение преципитирующей активности и моноспецифичности антирабического глобулина.

Преципитирующая активность иммуноглобулина определяется методом титрования РДП в агаровом геле. Исследуют 2-кратные разведения глобулина от 1:2 до 1:256 с контрольным положительным антигеном (КПА), приготовленным из головного мозга щенят, павших от интрацеребрального заражения штаммом CVS. В качестве отрицательного контроля используют антиген, аналогично приготовленный из мозга здоровых щенят.

Положительная реакция отмечается во всех случаях образования линий преципитата любой интенсивности с КПА, причем исходное разведения 1: и 1:4 могут образовать 1-2 линии преципитации. Максимальное разведение преципитата соответствует его преципитирующему титру.

Контрольный отрицательный антиген со всеми разведениями глобулина дает отрицательный результат.

Иммуноглобулин, полученный этим способом имеет преципитирующую активность до разведения 1:32 - 1:128, что делает его пригодным для практического применения в качестве ИДАП.

На моноспецифичность иммуноглобулин проверяют в разведениях от 1:2 до 1:256 РДП в агаровом геле с головным мозгом:

- здорового осленка, жеребенка, ягненка, кролика, морской свинки;

- различных не болевших бешенством животных павших от различных вирусных и бактериальных инфекций);

- осленка, жеребенка, ягненка, кролика, морской свинки, белых мышей, павших в результате интрацеребрального заражения фиксированным вирусом бешенства (CVS).

Преципитирующий иммуноглобулин, полученный этим способом, обладает моноспецифичностью, так как образует преципитат только с антигеном из мозга животных, зараженных рабической инфекцией.

Метод РДП в агаровом геле с использованием ИДАП является экспресс методом диагностики бешенства и позволяет обнаружить рабический антиген в первичном патологическом материале в течение 24 часов в 95 и более процентах случаев, загнивание не является препятствием к использованию глобулина.

Эффективность способа заключается в получении высокоактивного специфического антирабического иммуноглобулина без использования дорогостоящего оборудования и реагентов, позволяющий изготовить сравнительно дешевый и эффективный диагностический препарат ИДАП.

Технология получения иммуноглобулина диагностического антирабического флуоресцирующего (ИДАФ) Иммуноглобулин получают путем иммунизации лошадей продуцентов по отработанной нами схеме рабическими антигенами, приготовленными из вируссодержащей мозговой ткани жеребят, получением антирабической сыворотки, выделением иммуноглобулина и мечением флуорохромом.

А. Техника иммунизации животных Для иммунизации отбирают клинически здоровых, упитанных лошадей, полученных из благополучных по инфекционным и инвазионным заболеванием хозяйств.

Иммунизацию осуществляют антигеном, приготовленным из вирусосодержащей мозговой ткани жеребят 1,5- 4 месячного возраста. Для этого предварительно жеребят интрацеребрально заражают 1% -ной суспензией вируса бешенства (штамм CVS) в 0,3-0,5 см 3. На 6-7 день в асептических условиях извлекают головной мозг, из которого готовят 4%-ную суспензию на 0,85-ном растворе хлорида натрия.

Животных иммунизируют подкожными и внутримышечными инъекциями антигенов в 2-х вариантах:

А) фенольным с добавлением 0,25% фенола Б) адъювант депонированным с содержанием 0,05% сапонина, 20% гидрата окиси алюминия и 0,1% формалина.

Инъекции выполняют в подлопаточную область, шею и круп, 4-8 кратно, с интервалом 10-20 дней в дозах 10-50 см 3 с соблюдением правил асептики и антисептики.

Нарастание титра рабических антител проверяют в пробах сыворотки крови реакции диффузной преципитации (РДП) в агаровом геле с антигеном, приготовленного из штамма СVS.

При достижении преципитационного титра 1:32-1:128 производится взятие крови с интервалом 21 день, первоначально из расчета 400 см 3, а при последующих крововзятиях- 1600 см 3 на 100 кг живой массы.

Сыворотка изготавливается стерильно и сохраняется в условиях холодильника при температуре 4-6 0 С.

Б. Техника получения антирабического иммуноглобулина.

Преципитирующий иммуноглобулин выделяют спиртовым методом из высокоактивной без следов гемолиза антирабической сыворотки, используя раствор 53%-ного этанола.

Предварительно, для освобождения от термолабильных ингибиторов сыворотка прогревается в малообъемной стеклянной посуде (1000-3000 см 3 ) в водяной бане 30 минут при температуре 56-58 С.

Сыворотка должна иметь рН 7,0-7,2 и это достигается добавлением 2М ацетатного буфера рН 4,65 в количестве 2-6 мл на 1 л. Ацетатный буфер готовится смешиванием в соотношении 1:1 отдельно приготовленных 2М растворов уксуснокислого натрия и ледяной уксусной кислоты.

Сыворотку с установленной рН охлаждают до 0 С и одновременно охлаждают до минус 15-20 0 С предназначенный для осаждения раствор %-ного спирта на дистиллированной воде.

В условиях холодильной камеры при температуре 0 С к охлажденной сыворотке медленно, при постоянном перемешивании добавляют равный объем охлажденного спирта. Смесь продолжают перемешивать 30 минут, снижая температуру до минус 5 С и оставляют на 16-18 часов для формирования осадка.

Прозрачную надосадочную жидкость удаляют, выпавшие в осадок иммуноглобулины отделяют от некоторого количества надосадочной жидкости центрифугированием в рефрижераторной центрифуге при температуре минус Осадок глобулина растворяют в охлажденном до 4 С 0,15М растворе хлорида натрия, постепенно повышая температуру до комнатной (+20С). Концентрацию белка в растворе устанавливают в пределах 7-8 %.

Для коррекции солевого состава и удаления незначительного количества спирта раствор иммуноглобулина диализируют против 0,15М раствора хлорида натрия при четырех кратной его смене и температуре +4 0 С в течение 2-х суток в целлофановых мешочках. Затем глобулин осветляют от незначительной опалесценции центрифугированием при той же температуре в течение 30 минут при 4000 об/мин.

Иммуноглобулин по фракционному составу состоит из гаммаглобулина, со следами бета-глобулина.

В. Приготовление флуорисцирующих антител.

Для конъюгации (метки) антител предпочтительнее применять не нативные сыворотки, а их глобулиновые фракции. Необходимое количество флуорохрома для конъюгации расчитывают по концентрации в препарате белка (0,5-5 мг флуорохрома на 100 мг белка).

В качестве флуорохрома используют изотиоционат флуоресцина (ФИТЦ), максимально поглощающий фиолетово-синие лучи и дающий яркозеленую флуоресценцию. Для проведения конъюгации фракцию глобулина доводят с помощью 0,01 М забуференного раствора поваренной соли до содержания белка, равного 1 %, а с помощью 0,5 М карбонатного буфера доводят рН до 9,0. Суспензию охлаждают до 4 0 С и очень медленно прибавляют к ней при постоянном перемешивании красящее вещество. ФИТЦ применяют в количестве 7,5 мг красителя на 10 мл 1 %-ного белка.

После добавления красителя смесь следует оставить на несколько часов (18-22 ч) при температуре 4 0 С для достижения полной конъюгации.

Для удаления неспецифических флуоресцирующих компонентов осуществляют фильтрацию через сефодекс G – 25. Сефодекс кладут в колонку и промывают его 0,01 М забуференным раствором поваренной соли. Предварительно отцентрифугированный конъюгат осторожно помещают на сефодекс и заливают соответствующим количеством 0,01 М забуференного раствора поваренной соли. Очищенный конъюгат собирают в соответствующий сосуд.

Раствор флуорисцирующего иммуноглобулина доводят до 5%-ной концентрации 0,15М раствором хлористого натрия, консервируют мертиолатом 1:5000, исследуют на специфичность и флуорисцирующую активность и подвергают лиофильной сушке.

Г. Определение флуорисцирующей активности и моноспецифичности антирабического глобулина.

Флуорисцирующая активность иммуноглобулина определяется прямым методом иммунолюминисцентной микроскопии (ПМИМ).

При диагностике бешенства отпечатки готовят из свежего или свежемороженного материала аммонова рога, коры полушарий, мозжечка и др., используя при этом тщательно обезжиренные эфиром или спирт-эфиром предметные стекла (лучше специальные для люминесцентной микроскопии, толщиной 1,5 мм). Отпечатки должны быть тонкими, разнослойными. Это достигается тем, что с кусочка ткани, легко прикрепляющегося к фильтровальной бумаге или тонкой деревянной досточке-шпателю, делают 1-2 грубых отпечатка на отдельном стекле (они не используются в работе), а затем с той же поверхности кусочков делают отпечатки на отдельные предметные стекла, используемые для люминесцентной микроскопии. С каждого исследуемого кусочка мозговой ткани необходимо сделать не менее 4 отпечатка на 2 стекла.

Для контроля аналогично приготавливают препараты из мозга здоровых животных (можно использовать для этого мозг всяких животных, не болевших рабической инфекцией). Препараты после высушивания на воздухе в течение 3-5 минут фиксируют в ацетоне при +12 0 С в течение 4 часов-при работе с уличным вирусом бешенства и 10 минут – при работе с вакцинным вирусом-фикс.

По мере надобности вскрывают ампулу с ДАФИ, ее содержимое растворяют в 1мл дистиллированной воды (основное разведение, рН 7,2-7,4), а затем постепенно добавляя физиологический раствор хлорида натрия, или фосфатнобуферный раствор (рН 7,2-7,4), доводят общий объем иммуноглобулина до объема, создающего «рабочее разведение». Рабочее разведение ДАФИ не должно содержать даже мельчайших количеств визуально видимого осадка или хлопьев препарата. Рабочее разведение ДАФИ годно к применению в течение 2-х недель после приготовления, при условии хранения в темном месте при температуре +4 0 С (+ - 2 0 С) в хорошо укупоренной склянке и при условии сохранения исходной полной его растворенности.

На фиксированные в ацетоне препараты-отпечатки наносят каплями приготовленный в «рабочем разведении» ДАФИ, покрывая им весь препарат (отпечаток). Затем препараты (предметные стекла) помещают во влажную камеру, например, чашку Петри или закрытый эмалированный лоток, обычный стерилизатор, с увлажненным дном и тампонами влажной ваты и выдерживают 20-30 минут при температуре от +25 до +37 0 С, затем в течение часа отмывают в 2 сменах 0,01 М фосфатно-буферного раствора (рН 7,2-7,4), осторожно ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. После такой подготовки препараты-отпечатки вполне готовы для исследования.

П р и м е ч а н и е : Указанное на этикетке «рабочее разведение» ДАФИ установлено на день выпуска препарата и определяется по мере хранения через каждые 3 месяца или при возникающей в этом надобности_ в связи с возможностью снижения препаратом активности. «Рабочее разведение» указывает во сколько раз надлежит развести 1 мл основного разведения ДАФИ, чтобы его раствор был годен к использованию в работе. Указанное на этикетке «рабочее разведение» в 2-3 раза более концентрированное, в сравнении с «красящим титром». Красящий титр - максимальное разведение исходного разведения ДАФИ, сообщающее рабическому антигену в препаратах отпечатках, специфическое свечение интенсивностью в 3-4 креста.

При установлении «красящего титра» раствора ДАФИ препаратыотпечатки из мозга животных (кроликов, морских свинок, белых мышей), павших от фиксированного вируса бешенства, красят в течение 30 минут при +37 0 С.

Микроскопия проводится с помощью люминесцентного микроскопа любого типа- МЛ-1, МЛ-2, МЛ-4 и др. с возбуждающими фильтрами ЖС- + ЖЗС-19. Препараты просматривают под иммерсией. При этом используют нелюминесцирующее масло. Учитывают результаты визуально на основе оценки интенсивности свечения и морфологических особенностей светящегося комплекса «антиген-антитело».

Обычно наблюдают следующую картину: непораженная вирусом бешенства, свежая незагнившая мозговая нервная ткань (свободная от рабического антигена) светится тусклым серовато-желтым или слегка зеленоватым цветом: интенсивно светящихся желто-зеленых гранул и «песчинок» нет. В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства, наблюдаются разной величины и формы гранулы (в нейронах и вне клеток), которые желтозеленые интенсивно светятся. Их величина колеблется от едва заметных в виде «песчинок» образований до 15 –20 микронов. Чаще отмечается обилие очень мелких «песок» ярко желто-зеленых частиц, размером до 1 микрона, реже выявляются более крупные гранулы-до 4 микронов округлой и овальной формы; и еще более крупные (6-15 микронов) округлые или овальные включения.

Интенсивность свечения оценивают в крестах:

«4+» - яркая, светящаяся желто-зеленая люминесценция гранул и мельчайших точек-песчинок;

«3+» - отчетливо выраженная достаточно яркая желто-зеленая люминесценция гранул и мельчайших точек;

«2+» - неяркая люминесценция желтого цвета;

«1+» - слабая люминесценция, обнаруживаемая только в крупных включениях, желто-серого цвета;

«-» - отсутствие специфической люминесценции.

Диагноз на бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа обнаруживается достаточное количество (не менее 10) типичных гранул (мелких, средних или крупных) или – скоплений групп мельчайших точек («песок») в нервных клетках или вне их, с ярким желтозеленым свечением, при условии отсутствия в контроле подобных светящихся гранул.

При отрицательном диагнозе на бешенство, устанавливаемом методом иммунолюминесцентной микроскопии, ставят биопробу на молодых белых мышах, согласно существующих наставлений, мозг от погибших мышей исследуют методами иммунолюминесцентной микроскопии или РП в агаровом геле.

Эффективность способа заключается в получении высокоактивного флуоресцирующего антирабического иммуноглобулина без использования дорогостоящего оборудования и реагентов и позволяющий изготовить сравнительно дешевый и эффективный диагностический препарат «ИДАФ».

Иммуноферментный анализатор бешенства на мембранном сорбенте Сущность метода: на нитроцеллюлозную мембрану (НМ) диаметром 0,45нм («Sartorius») с помощью микропипетки наносят по 3-7 мкл исследуемого материала (взятого от подозреваемых в заражении бешенством животных, предположительно содержащего рабический антиген) в разведении 1:100 и выше в 0,9% физиологическим растворе, после чего высушивают при комнатной температуре. Для удаления несвязавшегося белка мембрану далее отмывают физиологическим раствором и инкубируют в блокирующем растворе (1% БСА в 0,01М трис-НСІ буферном растворе рН 7.4) в присутствии 0,05% детергента Твин-20 в течение 1 ч при 37 С. После этого НМ-у отмывают промывочным буферным раствором (ПБР), состоящим из в 0,01 трисНСІ буферного раствора с рН 7,4, 0.05% Твина-20, 5 раз по 5 мин. Затем на НМ накладывают лист хроматографической бумаги, пропитанной полученной нами гипериммунной антирабической сывороткой, разведенной буферным раствором для сыворотки (10% цельной лошадиной сыворотки в 0,01М трис буферном растворе рН 7.4, 0,05% Твин-20) и инкубируют в течение 15-60 мин. После повторной отмывки ПБР 5 раз по 5 мин на пластину накладывают лист хроматографической бумаги, пропитанной конъюгатом антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена, разведенного в буферном растворе для сыворотки (1:100-1:400) и инкубируют в течении 30-60 мин 37 С, после чего иммуносорбент отмывают ПБР от несвязавшегося конъюгата. Реакцию проявляют путем обработки иммуносорбента раствором субстрата (0,03% бензидин в 0,01М трис-НСІ буферном растворе рН 7.4) при окислении которого формируются нерастворимый хромогенный комплекс.

При этом в качестве окислителя используют 0,003 % раствор Н2О2. Результат: положительная реакция на антиген проявляется в виде четко окрашенных пятен на иммуносорбенте, отрицательная реакция на антиген не вызывает появление окрашенных пятен на иммуносорбенте.

1. Техника получения антигена.

Для получения вируссодержащей мозговой ткани используют жеребят 1,5-4-месячного возраста, матери которых не были вакцинированы против бешенства. Животных заражают интрацеребрально в дозе 0,1-0,2 см3 1 %-ной суспензией вируса бешенства (штамм «овечий» ВГНКИ). Суспензию готовят в стерильных условиях из вируссодержащего головного мозга лабораторного животного, на котором пассируется фиксированный вирус бешенства. Ткань тщательно растирается в ступке пестиком, после чего готовится 10 % суспензию на 0,85 % растворе хлорида натрия, с добавлением антибиотиков из расчета но 500 ЕД. пенициллина и стрептомицина на 1 см3. Суспензию экстрагируют в течение 18 часов при 4°С и из надосадочной жидкости делают разведение 1:10, которое и используют для заражения.

На 5-6 день, когда у жеребят наступает атаксия, параличи и агония, в асептических условиях извлекают головной мозг. Хранят мозг целиком в стерильной посуде при температуре минус 20 °С и используют по мере надобности.

Рабический антиген для иммунизации лошадей применяют в 2-х вариантах, основу которых составляет 4%-ная суспензия вирулентного мозга жеребенка на физиологическом растворе хлорида натрия.

Добавление к одной части суспензии 0.25 % фенола образует фенольный антиген. Другой - адъювант-депонированный антиген содержит в своем составе 0,05 % сапонина, 20 % гидрата окиси алюминия и 0,1 % формалина.

2. Техника иммунизации животных.

Для получения антирабической сыворотки отбирают клинически здоровых, упитанных лошадей, полученных из благополучных по инфекционным, инвазионным заболеваниям хозяйств.

Иммунизацию животных осуществляют подкожными и внутримышечными инъекциями рабических антигенов в области шеи и крупа. Объем вводимого материала делят на несколько порций и вводят в разные участки тела. Животных иммунизируют 4-8 кратно с интервалом 10-20 дней в зависимости от варианта антигена с соблюдением правил асептики и антисептики. Вначале вводят адъювант-депонированный антиген в дозе 10 см3, который повторяют ежемесячно. Фенольный антиген вводят каждые 2 недели в возрастающих дозах от 10 до 50 см.

Нарастание титра антител проверяют в пробах сыворотки крови, взятой индивидуально от каждого животного в процессе иммунизации по тестам РДП и РН.

На 10 день после последний инъекции антигена у лошадей осуществляют пробное крововзятие с забором крови из расчета 400 см с 100 кг живой массы тела.

При достижении преципитационного титра 1:32- 1:128 через 21 день производится следующее крововзятие по полной производственной норме (1800 см3 на 100 кг живой массы). Вируснейтрализующая активность такой сыворотки, определяемая методом титрования на белых мышах, соответствует 1000-2000 ЕР.

Сыворотка изготавливается стерильно, сохраняется в условиях холодильника при температуре 4-6 °С и в течение года используется для диагностических целей.

3. Постановка реакции.

На нитроцеллюлозную мембрану (НМ) диаметром 0,45нм («Sartorius») с помощью микропипетки наносят по 3-7 мкл исследуемого материала (взятого от подозреваемых в заражении бешенством животных, предположительно содержащего рабический антиген) в разведении 1:100 и выше в 0,9% физиологическом растворе, после чего высушивают при комнатной температуре. Для удаления несвязавшегося белка мембрану далее отмывают физиологическим раствором и инкубируют в блокирующем растворе (1% БСА в 0,01М трис-НСІ буферном растворе рН 7.4) в присутствии 0,05% детергента Твин-20 в течение 1 ч при 37 С. После этого НМ-у отмывали промывочным буферным раствором (ПБР), состоящим из в 0,01 трис-НСІ буферного раствора с рН 7,4, 0.05% Твина-20, 5 раз по 5 мин. Затем на НМ накладывали лист хроматографической бумаги, пропитанной полученной нами гипериммунной антирабической сывороткой, разведенной буферным раствором для сыворотки (10% цельной лошадиной сыворотки в 0,01М трис буферном растворе рН 7.4, 0,05% Твин-20) и инкубировали в течение 15-60 мин. После повторной отмывки ПБР 5 раз по 5 мин на пластину накладывали лист хроматографической бумаги, пропитанной конъюгатом антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена, разведенного в буферном растворе для сыворотки (1:100-1:400) и инкубировали в течении 30-60 мин 37 С, после чего иммуносорбент отмывали ПБР от несвязавшегося конъюгата. Реакцию проявляли путем обработки иммуносорбента раствором субстрата (0,03% бензидин в 0,01М трис-НСІ буферном растворе рН 7.4) при окислении которого формировался нерастворимый хромогенный комплекс. При этом в качестве окислителя использовали 0,003 % раствор Н2О2. Результат: положительная реакция на антиген проявлялась в виде четко окрашенных пятен на иммуносорбенте, отрицательная реакция на антиген не вызвала появление окрашенных пятен на иммуносорбенте.

4. Эффективность способа.

В ходе разработки техники постановки иммуноферментного метода установлено, что максимальный титр антирабической сыворотки составлял 1:102400 при концентрации рабического антигена -1 мкг/точка. Детекция минимального количества рабического антигена 0.0001 мкг/точка происходила при разведении антирабической сыворотки 1:400-1:800. Однако при разведении антирабической сыворотки 1:400-1: 800 появлялось неспецифическое связывание с антигенами нормальной лошадиной сыворотки в концентрации 1мкг/точка.

Таким образом, детекция специфического иммунного комплекса происходила при разведении антирабической сыворотки 1:1600-1:13200. Исходя из этого, за рабочую дозу антирабического сыворотки брали разведение сыворотки, позволяющее осуществлять детекцию рабического белка в концентрации 1нг/ точка (Табл.1).

Установлено, что через 3 минуты инкубации антигена с моноспецифической, антирабической сыворотки на НМ начинали появляться комплексно «антиген-антитело». Интенсивность окраски пятен возрастала к 60-ой минуте, далее оставалось на одном уровне.

Влияние инкубации комплекса антиген-антитело с конъюгатом на эффективность проявление пятен изучали с помощью различных концентрации антигена вируса бешенства с антирабической сыворотки и нормальной лошадиной сывороткой в разведении 1:600 (Табл.2). При 30 минутой инкубации в 37С, детекция белка составляла 0.01мкг, а при 60 минутной мкг/точка. Дальнейшее увеличение времени инкубации не влияло на чувствительность метода.

Набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации РНК Бешенство вызывается вирусом с аналогичным названием: вирус бешенства (Rabies virus), представителем рода Lyssavirus, семейства Rhabdoviridae. Род Lyssavirus объединяет семь генотипов. Генотип 1 представлен классическими штаммами вируса бешенства (rabies virus), которые циркулируют во всем мире. Генотипы 2-7 включают rabies-related (non-rabies) вирусы: Lagos bat virus (генотип 2), Mokola virus (генотип 3), Duvenhage virus (генотип 4), European bat lyssavirus 1 (EBLV1) и 2 (EBLV2) (генотипы 5 и соответственно) и Australian bat lyssavirus (генотип 7). Вирус бешенства (генотип 1) поддерживается в природе межвидовой передачей практически повсеместно (кроме Австралии и некоторых островов) среди представителей Carnivora и Microchiroptera.

Геном представлен единой 1-спиральной линейной молекулой минусРНК состоит из 11932 нуклеотидов. Вирионная РНК рабдовирусов не обладает инфекционностью. В вирионах рабдовирусов обнаружено 5 полипептидов (гликопротеин G, матриксный белок М, нуклеопротеин N, фосфопротеин NS, обратная транскриптаза L (РНК-зависимую РНК-полимераза)), 3 из которых (L, NS, N) связаны с нуклеокапсидом, а 2 (G, М) входят в состав липопротеидной оболочки. Белок G гликозилирован, образует на поверхности вириона выступы и индуцирует синтез вирус нейтрализующих антител и обеспечивает развитие иммунитета. Белки нуклеокапсида N и NS имеют группоспецифические антигенные детерминанты. Белки нуклеокапсида L и NS являются компонентами транскриптазы. Гены расположены в следующем порядке: 3'-N-NS-M-G-L-5'.

Одним из широко используемых методов детекции РНК вируса бешенства является обратнотранскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТПЦР) (Nadin-Davis SA, Huang W, Wandeler AI. The design of strain-specific polymerase chain reactions for discrimination of the racoon rabies virus strain from indigenous rabies viruses of Ontario. J Virol Methods. 1996 Mar; 57(l):l-14). С помощью ПЦР диагноз можно поставить за 8 часов. Кроме того, применение автоматического секвенирования позволяет получить характеристику изолятов в течение 16 часов.

В большинстве случаев ПЦР применяют для штаммовой дифференциации вируса бешенства. В частности, применена ПЦР для дифференциации штаммов вируса бешенства енотов от местных вирусов бешенства, циркулирующих в Онтарио. Использование праймеров к гену нуклеопротеина в мультиплексной ПЦР позволило быстро дифференцировать бешенство енотов от изолятов других видов животных из Онтарио и в соответствии с этим принимать меры борьбы. Кроме этого, возможно применение ОТ-ПЦР для прижизненного обнаружения вирусной РНК. Известна возможность выделения РНК в слюне инфицированных животных и в биоптате слюнной железы.

Создан набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации вируса бешенства в полевых и клинических образцах, имеющего следующую структуру:

Конструирование праймеров осуществлялось путем сравнения нуклеотидных последовательностей различных штаммов лиссавирусов, депонированных в международной базе данных Gene Bank.

Апробация праймеров была осуществлена с использованием большого числа изолятов вируса бешенства, выделенных от различных видов диких и домашних животных на территории Новосибирской области, Алтайского и Красноярского края. Было показано, что применение данных праймеров для индикации РНК вируса бешенства в образцах головного мозга обеспечивает синтез фрагментов ДНК рассчитанного размера (558 п.о.) в условиях ОТПЦР. Специфичность продуктов амплификации была подтверждена методом прямого секвенирования.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК Праймеры фланкируют консервативный участок гена нуклеопротеина вируса бешенства, кДНК который не имеет полиндромных повторов нуклеотидов и не образует выраженных вторичных структур, не имеет протяженных G-C участков. Для пар праймеров расчетная температура плавления была близкой и составила Tm=52°С. Специфичность образующегося фрагмента кДНК устанавливали прямым секвенированием полученного фрагмента, используя праймеры Rab134F и Rab1292R, Rab299F и Rab857R, что и было выполнено для большого количества штаммов и изолятов вируса бешенства, выделенных в Новосибирской области от больных бешенством животных.

Технология иллюстрируется следующими примерами.

1. Выделение РНК вируса бешенства из образцов головного мозга больных бешенством животных.

Для оценки эффективности использования нашего изобретения было исследовано 132 образца головного мозга от различных видов диких и домашних животных. О наличии в исследуемом материале вируса бешенства судили на основании результатов МФА и биологической пробы.

В качестве положительного контроля был использован вирус бешенства штамма CVS.

Кроме этого, было проведено исследование материала от летучих мышей. Суммарно было отловлено 52 летучие мыши видов Myotis daubentonii Kuhl, 1819, Myotis brandtii Eversman, 1845, Murina leucogaster Milne-Edwards, 1872, Plecotus auritus L., 1758.

После первичного анализа мозга летучих мышей на наличие антигена лиссавируса в МФА положительные пробы исследовали методом ОТ-ПЦР.

100mg мозговой ткани гомогенизировали в 200µl 3М ацетата натрия (рН 5.2). К образцам добавляли 10 объемов RNAzol® (GibcoBRL) и инкубировали при 65°С в течение 15 мин., затем добавляли 300µl хлороформа и отделяли водную фазу, эту процедуру повторяли дважды. Добавляли 500µl охлажденного изопропанола, центрифугировали при 14000 об/мин 20 мин при 4°С (Hermle Z233 МК-2, Германия). Выделенную РНК отмывали 70% этанолом.

2. Получение кДНК методом обратной транскрипции.

К сухому осадку, содержащему выделенную РНК, добавляли следующую смесь: по 10 нмоль каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов, l,5mM MgCl2, 10mМ Трис-HCl (рН 8,3 при +25°С), 50mM NaCl, 0,01M дитиотрейтола и 25 пмоль специфической затравки. Синтез кДНК проводили при +37°С час с 50 ед. M-MulV (Boehringer Mannheim).

3. Проведение полимеразной цепной реакции.

Использовали следующие параметры ПЦР: 94°С 10 с, 56°С 30 с с понижением температуры на 1°С за цикл, 72°С 1 мин - 6 циклов, затем 94°С с, 50°С 15 с, 72°С 30 сек 35 циклов. Завершающий синтез проводили 7 мин 72°C «Eppendorf Mastercycler Gradient», Германия). Праймеры Rab134F и Rab1311R использовали для первого раунда ПЦР, праймеры Rab299F и Rab877R - для второго раунда. В качестве реакционного буфера для ОТ-ПЦР использовали: 30 мМ Tris-HCl (pH 8,5 при ±25°С); 16 мМ (NH4)2SO4; 1,5 мМ MgCl2; 0,1% Nonidet P40; по 160 µМ dATP, dCTP, dGTP, dTTP; no 0,15 µМ олигонуклеотидов; 0,35 ед. Taq-ДНК полимераза («СибЭнзим», Россия).

4. Определение нуклеотидной последовательности.

Определение нуклеотидной последовательности выделенного ПЦР фрагмента проводили на «Beckman CEQ2000XL DNA Analysis System»

(«Beckman Coulter, Inc.») по методу Sanger et al. [9] согласно инструкции к «Beckman sequencing Kit». Нуклеотидные и выведенные аминокислотные последовательности были анализированы с использованием программы MEGA (PSU, США) и DNASTAR (DNAStar Inc., США).

Результат исследований: у полученных ПЦР-продуктов (558 пар нуклеотидов) были определены нуклеотидные последовательности и выведены аминокислотные последовательности.

Специфичность набора праймеров была подтверждена при исследовании заведомо положительных образцов, прямым секвенированием полученного ПЦР-фрагмента.

В результате вакцинации происходят биохимические изменения, обусловливающие снижение чувствительности нервных клеток к вирусу. Не подлежит сомнению и защитная роль вируснейтрализующих антител, продукцию которых активно стимулирует вакцина. При заражении иммунизированных животных особенно заметна роль антител, нейтрализующих вирус в месте его внедрения.

Для создания искусственного активного иммунитета наибольшее распространение со времен Пастера приобрел метод, основанный на использовании полностью или частично инактивированного фиксированного вируса бешенства.

Пастер с учениками Ру и Шамберланом (1881—1885) установили возможность ослабления вируса бешенства пассированием его через мозг кроликов (внутримозговым заражением). При этом вирус приобрел постоянную вирулентность для кроликов при внутримозговом заражении, утратив ее при иных способах инфицирования. В отличие от эпизоотических штаммов этот вирус, вызывающий у кроликов бешенство после короткого инкубационного периода, имеющего постоянный, фиксированный срок, равный семи суткам, стали называть по предложению Пастера фиксированным вирусом бешенства. Этот штамм широко используется для изготовления вакцин во многих странах мира.

В 1885 г. Пастер впервые применил вакцину (взвесь спинного мозга кролика, заболевшего паралитическим бешенством после субдурального заражения фиксированным вирусом бешенства) для лечебной иммунизации человека.

Все известные вакцины можно разделить на вакцины из ткани мозга;

авианизированные вакцины, т. е. вакцины, приготовленные на эмбрионах кур или уток, и культуральные вакцины. По характеру изготовления различают также жидкие и лиофилизированные вакцины, а по степени жизнеспособности вируса — живые и инактивированные. Последние можно подразделить на инактивированные химическими веществами и физическими факторами или получаемые под воздействием комплексов тех и других факторов.

В США широко применяли вакцину из ткани эмбрионов уток. Предложены культуральные антирабические вакцины, которые готовят из штаммов вируса-фикс бешенства, адаптированного к культуре диплоидных клеток человека, первичным культурам клеток почек сирийского хомяка и почек эмбриона коровы.

К числу вакцин, ранее широко применяемых в мировой практике, относят вакцину Семпла, которую готовили из вируса-фикс бешенства, выращенного в мозге кролика и инактивированного фенолом при 37°С, вакцины из мозга новорожденных животных с вирусом-фикс бешенства, инактивированным ультрафиолетовыми лучами или бета-пропиолактоном, сухую фенолвакцину типа Ферми из мозга овец и некоторые другие.

Ранее широко использовали тканевую сухую антирабическую фенолвакцину (типа Ферми). Большинство антирабических вакцин не содержало инфекционного вируса, однако в некоторых препаратах типа Ферми допускалось присутствие «остаточного» вируса (до 2,0 и 3,0 lg ЛД50 в 0,03 мл), который при определенных условиях может быть причиной возникновения поствакцинальных неврологических осложнений.

В современной биотехнологии антирабических вирусных препаратов используют различные вакцинные штаммы (Внуково-32, Щелково-51, Тс-80, РВ-97 и др.), которые выращивают в первичных и перевиваемых клеточных культурах ВНК-21, ПС, Vero., и др., применяя различные методические приемы культивирования - стационарный, роллерный, суспензионный.

Приготовление вакцины. Для приготовления сухой антирабической фенолвакцины используют мозг овец, зараженных вирусом-фикс бешенства.

Производственный штамм ГНКИ представляет собой ответвление оригинального штамма Пастера, который прошел 83—85 пассажей на овцах при интрацеребральном заражении. ВГНКИ ветпрепаратов ежегодно рассылает этот штамм в сухом виде с соответствующим паспортом на биопредприятия страны, выпускающие антирабические вакцины. Во ВГНКИ штамм пассируют на овцах 1 раз в год. Штамм ГНКИ, используемый в производстве антирабических вакцин, должен обладать следующими свойствами:

- вызывать типичную картину заболевания «лабораторной» формой паралитического бешенства после инкубационного периода продолжительностью у овец не менее 80 ч и не более 120 ч, у кроликов— 80—96 ч;

- быть вирулентным при интрацеребральном заражении белых мышей массой по 10—14 г в титре не менее 5,5 lg ЛД50 в 0,03 мл; при подкожном введении в области верхней губы — не выше 2,8 lg ЛД.50в 0,5 мл;

- вызывать при подкожном введении 5 мл 10%-ной вируссодержащей мозговой суспензии заболевание не более чем у 1 кролика из 10 массой по 2—2,5 кг;

- нейтрализоваться специфической антирабической сывороткой или антирабическим гамма-глобулином.

Для заражения вирусом-фикс бешенства использовали овец от 5 месяцев до 1,5 лет, полученных из хозяйств, благополучных по заразным болезням. Овец заражали интрацеребрально через трепанационное отверстие. Зараженных животных убивали в паралитической стадии болезни и стерильно извлекали головной и спинной мозг. Его измельчали в гомогенизаторе и к полученному мозговому веществу добавляли раствор фенола, чтобы получить 30%-ную вируссодержащую взвесь. Для инактивации полученную взвесь выдерживали двое суток при тщательном перемешивании. Инактивированную взвесь вируса разбавляли средой высушивания, чтобы получить 20%-ную вируссодержащую суспензию. Затем вакцину расфасовывали по флаконам и лиофилизировали из замороженного состояния.

Контроль вакцины. Отдел биологического контроля контролирует стерильность вирусной суспензии для заражения овец, стерильность мозговой ткани овец, стерильность полуфабриката после гомогенизации мозговой суспензии. Готовую вакцину контролируют на стерильность, безвредность, иммуногенность, определяли титр остаточного вируса, качество укупорки и этикетировки флаконов, внешний вид препарата, содержание влаги в сухой вакцине и ее растворимость.

Стерильность вакцины проверяли по общепринятой методике. От каждой серии сухой вакцины контролировали по пять флаконов препарата. Вакцина должна была быть стерильной в бактериальном отношении.

Безвредность вакцины проверяли на белых мышах методом подкожного введения препарата, разведенного стерильным физиологическим раствором 1:10 в объеме по 0,2 мл. В течение 10-дневного срока наблюдения мыши должны остаться живыми и на месте инъекции не должно быть никаких патологических изменений.

Остаточную вирулентность вакцины определяли методом интрацеребрального введения белым мышам в дозе 0,03 мл. Делали четыре десятикратных разведения вакцины, первое разведение содержит 10% мозговой ткани.

За животными наблюдали 14 дней. Серию сухой вакцины считали годной к применению, если в 0,03 мл препарата содержалось не более 1000 ЛД50 вируса-фикс бешенства.

Для проверки иммуногенной активности вакцины брали 20 белых мышей, делили их на четыре группы по пяти мышей. Животных первых трех групп вакцинировали, а четвертую оставляли для контроля. Вакцину вводили внутрибрюшинно по 0,2 мл. Мышам 1-й группы вводили вакцину, разведенную в 5 раз, 2-й — в 10 раз, 3-й — в 40 раз. Через 10 дней после вакцинации всем привитым и контрольным мышам вводили по 0,1 мл 10%-ной суспензии мозговой ткани, содержащей активный вирус-фикс бешенства. Все мыши контрольной группы должны погибнуть. Вакцину считали активной, если в 1-й группе оставались живы все мыши или погибала лишь одна, из 2-й группы допускали гибель не более трех мышей, а в 3-й группе могли погибнуть все пять подопытных животных.

Недостатки имела сама вакцина и методы ее контроля. Например, в ней содержалось до 20% балластной мозговой ткани, сравнительно небольшое количество вируса, а также живого неинактивированного вируса-фикс бешенства. Ранее выпускалась жидкая антирабическая вакцина АЗВИ представляющая собой вирусвакцину, в основе которой заложена вируссодержащая ткань овец-продуцентов, зараженных интрацеребрально вирусом-фикс бешенства (штамм ГНКИ).

Несмотря на то, что предложено большое количество антирабических вакцин, до сих пор нет препарата, который бы отвечал всем современным требованиям. Опыт применения живых вакцин в ветеринарной практике свидетельствует о том, что их массовое применение в ряде случаев чревато серьезными последствиями.

В последние годы используется сухая культуральная инактивированная вакцина против бешенства из штамма, которая показала себя высокоиммуногенным и безвредным биопрепаратом.

Культуральная антирабическая вакцина Получение вакцины включает приготовление посевного материала из штамма вируса бешенства "Щелково-51", инфицирование посевным материалом культуры перевиваемых клеток ВНК-21, культивирование вируса бешенства, сбор вируссодержащей жидкости, инактивацию вируса и последующее приготовление целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме. Посевной материал получают в культуре клеток ВНК-21. При этом первично репродуцированный вирус подвергают термической обработке до сохранения в обрабатываемой популяции 0,001-0,0001% интрацеребральных мышиных ЛД50. Полученную вируссодержащую суспензию, содержащую термостабильные вирусные частицы, используют для инфицирования культуры клеток ВНК-21. Причем термическую обработку первично репродуцированного в клетках ВНК-21 штамма вируса бешенства "Щелково-51" проводят в течение 140-160 ч при температуре 37-38oС. При более производительном и технологическом способе изготовления вакцина обладает большей иммуногенной потенцией и более надежно будет защищать животных от бешенства. Этот эффект объясним тем, что в результате термообработки в популяции вируса стали преобладать наиболее устойчивые полноценные вирионы.

Для получения посевного материала полностью исключаются овцы. В результате термообработки в термостабильной популяции вируса стали преобладать наиболее устойчивые полноценные вирионы. Кроме того, эффективность культивирования вируса, прошедшего термическую стадию обработки, значительно выше по сравнению с контролем, что проявляется как в динамике накопления вируса, так и в повышении выхода вируса в целом (увеличивается количество сборов вируса).

Вакцины, приготовленные таким образом, при более производительном и технологичном способе изготовления обладают большей иммуногенной потенцией и более надежно будут защищать животных от бешенства.

Изготовление вакцины. Для приготовления вакцины используют культуру перевиваемых клеток ВНК-21, которую получают роллерным способом в виде кругового монослоя в бутылях. В качестве ростовой и поддерживающей питательной среды используют среду на основе среды 199, среды Игла и 10%-ной нативной сыворотки крупного рогатого скота. 2-3-суточный монослой клеток отделяют от поверхности стекла бутылей общепринятым способом, например с помощью версена и трипсина, и ресуспендируют в ростовой среде.

Полученную клеточную взвесь заражают посевным материалом, подготовленным следующим образом: исходный производственный штамм вируса бешенства "Щелково-51" подвергают термообработке до сохранения им инфекционной активности от 0,0001 до 0,001% интрацеребральных мышиных ЛД50.

Для этого первично репродуцированный вирус пассируют в культуре клеток ВНК-21 при температуре 37,5oС в течение 140-160 ч. Далее вируссодержащую суспензию, содержащую термостабильные вирусные частицы, используют в качестве посевного материала для инфицирования и репродуцирования в культуре клеток ВНК-21.

Культивирование осуществляют роллерным способом при температуре 37 С. Затем проводят сбор вируссодержащей жидкости на 2, 3, 4, 5 и 6 сутки культивирования. Замену ростовой питательной среды проводят после каждого сбора вируса. Начиная с 4-х суток культивирования включение сыворотки крупного рогатого скота в состав питательной среды не требуется. Полученные сборы инактивируют известным способом, например бетапропиолактоном или ДЭИ.

Для изготовления сухих антирабических вакцин к 2-м частям инактивированной вируссодержащей жидкости добавляют 1 часть среды высушивания.

Для изготовления жидкой антирабической вакцины к инактивированной вируссодержащей жидкости добавляют адъювант - 6%-ную гидроокись алюминия.

Технология получения антирабической вакцины Технология включает приготовление посевного материала из штамма вируса бешенства "Щелково-51", инфицирование посевным материалом культуры перевиваемых клеток ВНК-21, культивирование вируса бешенства, сбор вируссодержащей жидкости, инактивацию вируса и последующее приготовление целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме. Посевной материал получают в культуре клеток ВНК-21. При этом первично репродуцированный вирус подвергают термической обработке до сохранения в обрабатываемой популяции 0,001-0,0001% интрацеребральных мышиных ЛД50. Полученную вируссодержащую суспензию, содержащую термостабильные вирусные частицы, используют для инфицирования культуры клеток ВНК-21. Причем термическую обработку первично репродуцированного в клетках ВНК-21 штамма вируса бешенства "Щелково-51" проводят в течение 140-160 ч при температуре 37-38oС.

Для получения посевного материала полностью исключаются овцы. В результате термообработки в термостабильной популяции вируса стали преобладать наиболее устойчивые полноценные вирионы. Кроме того, эффективность культивирования вируса, прошедшего термическую стадию обработки, значительно выше по сравнению с контролем, что проявляется как в динамике накопления вируса, так и в повышении выхода вируса в целом (увеличивается количество сборов вируса).

Вакцина при более производительном и технологичном способе изготовления обладает большей иммуногенной потенцией и более надежно будут защищать животных от бешенства.

Для приготовления вакцины используют культуру перевиваемых клеток ВНК-21, которую получают роллерным способом в виде кругового монослоя в бутылях. В качестве ростовой и поддерживающей питательной среды используют среду на основе среды 199, среды Игла и 10%-ной нативной сыворотки крупного рогатого скота. 2-3-суточный монослой клеток отделяют от поверхности стекла бутылей общепринятым способом, например с помощью версена и трипсина, и ресуспендируют в ростовой среде.

Полученную клеточную взвесь заражают посевным материалом, подготовленным следующим образом: исходный производственный штамм вируса бешенства "Щелково-51" подвергают термообработке до сохранения им инфекционной активности от 0,0001 до 0,001% интрацеребральных мышиных ЛД50.

Для этого первично репродуцированный вирус пассируют в культуре клеток ВНК-21 при температуре 37,5oС в течение 140-160 ч. Далее вируссодержащую суспензию, содержащую термостабильные вирусные частицы, используют в качестве посевного материала для инфицирования и репродуцирования в культуре клеток ВНК-21.

Культивирование осуществляют роллерным способом при температуре 37 С. Затем проводят сбор вируссодержащей жидкости на 2, 3, 4, 5 и 6 сутки культивирования. Замену ростовой питательной среды проводят после каждого сбора вируса. Начиная с 4-х суток культивирования включение сыворотки крупного рогатого скота в состав питательной среды не требуется. Полученные сборы инактивируют известным способом, например бетапропиолактоном или ДЭИ.

Для изготовления сухих антирабических вакцин к 2-м частям инактивированной вируссодержащей жидкости добавляют 1 часть среды высушивания.

Для изготовления жидкой антирабической вакцины к инактивированной вируссодержащей жидкости добавляют адъювант - 6%-ную гидроокись алюминия.

Готовые вакцины проходят биологический контроль на белых мышах по методу NIH (Института здравоохранения США).

Антирабическая инактивированная вакцина для Используют штамм РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ) вируса бешенства, который вносят в культуральный сосуд (0.1-0.01 МЛД50/клетку) одновременно с катками ВНК-21 с исходной концентрацией клеток (0.5-0.6 млн. кл/мл) и выращивают в суспензии. Культивирование проводят в суспензионной среде ФГМ при 37°С в течение 5-6 суток при постоянном перемешивании и поддержании рН 7.2-7.4. Полученное вирусное сырье с инфекционной 6.5-6.8 lg МЛД50/мл и антигенной активностью 1:90-270 инактивируют 1,8,36диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодеканом 0.01% при 37°С 3 суток. Готовый вакцинный препарат соответствует требованием стандарта для ветеринарных препаратов и обладает активностью 1.5-2.0 ME.

Штамм РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ) получен из исходного “овечий” ВГНКИ - 80 пассаж в мозге овец и адаптирован к культуре клеток почки кролика и культуре клеток куриных фибробластов. Инфекционная активность штамма 4,5-5,5 lg МДД50/мл. Вирус вызывает образование антител у домашних и диких животных при оральном и парантеральном введении. Патогенен для лабораторных животных мышей и кроликов при внутримозговом заражении (Ковалев Н.А и др. Авторское свидетельство №1091393 от 08.01. г.). Вирус вносят в культуральный сосуд одновременно с клетками ВНК-21 с исходной концентрацией клеток 0.5-0.6 млн. кл/мл и выращивают в суспензии.

Культивирование проводят в суспензионной среде 0,25% ФГМ при 37°С в течение 5-6 суток при постоянном перемешивании содержимого. Полученное вирусное сырье имеет инфекционную (6.5-6.8 lg МЛД50/мл) и антигенную активность (1.5-2.0 ME), достаточную для использования его в вакцине без дополнительных технологических приемов (сепарирование, концентрирование).

Инактивацию вируса проводят безопасным и устойчивым препаратом 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетриазациклодекан - (А-24) в концентрации 0.01-0.1% при 37°С в течение 3 суток.

В качестве адъюванта добавляют 10-20% 6% ГОА до конечной концентрации сухого остатка 0,6-0,9%.

Пример конкретного выполнения.

Выращивание вируса бешенства штамм РБ-71 (БелНИИЭВ-ВГНКИ) проводят в культуре ВНК-21 с концентрацией 0.5-0.6 млн. кл/мл с одновременным внесением вируса в дозе 0.1-0.01 МЛД50/кл в суспензионной среде 0,25% ФГМ в ферментерах реакторного типа при температуре 37°С и постоянном перемешивании содержимого, и автоматическом поддержанием рН среды в пределах 7.2-7.6. В течение первых трех суток наблюдается повышение концентрации инфицированных клеток до 1.5-2.5 млн. кл/мл, затем постепенная их гибель. Культивирование прекращают, когда жизнеспособных клеток во взвеси остается 18-20%. Время культивирования - 6 суток. Инфекционная активность вируса бешенства штамма РБ-71 к этому времени составляет 6.5-6.8 lg МДЦ50/мл. Антигенная активность вирусного сырья из штамма РБ-71 составляет 1:90-1:270 в реакции ИФА. Полученное вирусное сырье инактивировали А-24 в концентрации 0.01-0.1% в течение 3 суток при 37°С, затем добавляли 6% 10-20% гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 0.6% Использование предлагаемой технологии изготовления инактивированной вакцины против бешенства по сравнению с существующим способом имеет следующие преимущества.

1. Сокращает время получения вирусного сырья на 1-2 суток за счет одновременного внесения клеток и вируса в реактор.

2. Уменьшает расход дорогостоящей питательной среды в 2 раза за счет исключения этапа смены среды.

3. Снижает расход вирусного сырья в 5-10 раз и повышает накопление антигенной активности в вирусном сырье, достаточной для использования его для изготовления эффективного инактивированного препарата.

4. Исключает использование дополнительных технологических приемов - осаждение клеток, сепарирование, концентрирование без снижения характеристик получаемой вакцины.

5. Позволяет заменить импортную среду Игла MEM на не менее эффективную отечественную питательную среду из ферментативного гидролизата мышц (ФГМ).

Вирусвакцина против бешенства для пероральной Вакцинный вирус бешенства, штамм ТС-80, выращивают в перевиваемой культуре клеток почки сайги и смешивают его с защитными компонентами (пептон, лактоза, пектин), смешивание проводят в соотношении 14:5: (вирусная суспензия: стабилизирующая среда, состоящая из 40% раствора пептона с 8% раствором лактозы: 4% раствор пектина соответственно), полученный после смешивания полуфабрикат наносят на приманку (пористый брикет), замораживают и высушивают сублимацией в течение 24-30 часов.

Пример получения вакцины. 1,4±0,1 дм3 вируссодержащего материала, штамм ТС-80 вируса бешенства с инфекционной активностью 7,2±0,15 lg МЛД50/см3, выращенного в перевиваемой культуре клеток почки сайги, смешивают с 0,5 дм3 стабилизирующей среды, содержащей 40±2% пептона и 8±0,4% лактозы, и с 0,1 дм3 4±0,1% раствора пектина в соотношении 14:5: (вирусная суспензия стабилизатор пектин соответственно). Полученный полуфабрикат наносят на пористый брикет-приманку (изготовленный из муки) размером 5,5/3,5/1,5 см, массой 10-12 г с помощью дозатора “Контур”, нанося последовательно 2, а затем 3 см3 материала. Брикеты-приманки замораживают при минус 40°С и высушивают в аппарате для сублимационного высушивания в течение 24-30 часов. Готовые брикеты-приманки оценивают на контаминацию грибной и бактериальной микрофлорой, безвредность, инфекционную активность и иммуногенность. Вакцина была стерильной, безвредной, с инфекционной активностью 6,5±0,3 lg МЛД50/приманку. Для определения иммуногенности вакцину, ароматизированную рыбьим жиром, скармливали 5-месячным щенкам из расчета одна приманка (одна доза) на голову двукратно с интервалом 12 суток. В сыворотках крови вакцинированных щенков титры вируснейтрализующих антител составили от 1:8 до 1: через 30 суток после вакцинации, что свидетельствует об иммуногенности вакцины. Вакцина сохраняла иммуногенные свойства не менее 5 суток при температуре окружающей среды до 20°С и при хранении в течение 6 месяцев при температуре 6-8°С.

Вакцина содержит сублимационно высушенную суспензию штамма вируса ТС-80 и стабилизатор. В качестве стабилизатора, защищающего вирус от инактивирующего воздействия желудочного сока и факторов внешней среды, она содержит пептон, лактозу и пектин. После двукратной с интервалом в 12 - 14 суток прививки вакцина стимулирует у вакцинированных животных выработку вируснейтрализующих антител в пределах 1 : 16 - 1 : 32.

Положительный эффект достигается при следующем соотношении компонентов, мас. %:

суспензия вируса бешенства, штамм ТС-80 - 5- пектин – остальное Пример получения вакцины. 1000±10 см суспензии вируса бешенства, штамм ТС-80, выращенного в перевиваемой культуре клеток почки сайги, смешивают с равным объемом стабилизирующей среды, содержащей 40±2% пептона и 8,0±1,0% лактозы, к смеси добавляют равный объем 4,0±0,5%-ного пектина, полученную техническую жидкость подвергают сублимационному высушиванию. Сухую вакцину размалывают в шаровой мельнице, определяют биологическую активность, стерильность и безвредность, затем заполняют брикеты-приманки, которые до момента применения хранят при температуре 6-8oC.

Серологические исследования проб сывороток крови плотоядных, иммунизированных двукратно с интервалом 12 суток, выявили титры вируснейтрализующих антител у лис и енотовидных собак от 1:16 до 1:32 через месяца после вакцинации. Титры предиммунных проб сывороток не превышали 1:2.

Представленные данные свидетельствуют о высокой иммунологической эффективности сухой вирусвакцины из штамма ТС-80 при пероральной иммунизации плотоядных.

Ящур (Aphtae epizooticae) – инфекционное, остро протекающее, чрезвычайно контагиозное инфекционное заболевание, поражающее все виды домашних и диких парнокопытных животных. Ящуром болеет и человек.

Болезнь вызывается фильтрующимся РНК-содержащим вирусом из семейства пикорновирусов, характеризуется лихорадкой и развитием афтозных поражений на слизистой оболочке ротовой и носовой полостей, коже конечностей и вымени.

Вирусную этиологию ящура в 1887 г. установили немецкие ученые Леффлер и Фрош. Это открытие дало толчок к дальнейшему более детальному и всестороннему исследованию этой весьма сложной инфекции.

Возбудитель. Вирус ящура относится к роду aphtovirus, семейство Picornaviridae. По своим антигенным свойствам, вирус ящура подразделяется на семь серотипов: А, О, С, САТ-1, САТ-2, САТ-3 и Азия-1. Типы А, О и С выявлены на всех неблагополучных континентах, тип Азия-1 только в странах Азии, а типы САТ-1, САТ-2, САТ-3 на африканском континенте. Антигенные различия между типами настолько велики, что предложено считать их самостоятельными видами афтовирусов. Серотипы в свою очередь включают в себя около 80-ти субтипов.

Вирион вируса ящура имеет сферическую форму и относится к наиболее мелким вирусам. Диаметр вирусных частиц по данным В. Л. Узюмова и В. А. Перевозчикова, составляет в пределах 20 - 25 нм.

С учетом степени воздействия на то или иное звено эпизоотической цепи меры борьбы с ящуром можно разделить на четыре направления:

1) «чистый» метод борьбы с ящуром, носящий за рубежом название «Stamping out», заключается в немедленном убое всех больных и подозреваемых в заражении восприимчивых животных. Данный метод преследует цель разрыва эпизоотической цепи путем ликвидации источника инфекции — первого звена цепи. Его применяют в США, Канаде, Японии, Норвегии и Англии — странах, границы которых представлены значительными водными преградами. Этот метод оказался достаточно эффективным, позволившим полностью ликвидировать ящур и способствовал длительному их благополучию;

2) санитарно-карантинный метод, по которому все мероприятия направлены на разрыв эпизоотической цепи воздействием на факторы передачи — второго звена цепи. По этому методу восприимчивых животных не иммунизируют, а больных - не уничтожают. На недостаточную эффективность метода указывает довольно длительное неблагополучие некоторых стран по ящуру;

3) биологический метод борьбы предусматривает систематическую массовую профилактическую иммунизацию восприимчивых животных, т. е.

внимание уделяется главным образом третьему звену эпизоотической цепи.

Метод стал возможен благодаря многолетним исследованиям ученых разных стран по созданию средств специфической профилактики. Для применения метода в ряде стран изданы специальные законы об обязательной иммунизации животных. В этих странах при появлении ящура также проводят санитарно-ограничительные мероприятия, а иногда убой заболевших сельскохозяйственных животных;

4) комплексный метод борьбы с ящуром заключается в сочетании метода убоя заболевших и подозреваемых в заражении животных с активной иммунизацией восприимчивых животных, при одновременном проведении санитарно-карантинных мероприятий. Комплексный метод применяют в зонах, ранее неблагополучных по ящуру, в пограничных зонах, особенно при угрозе заноса ящура, в зонах действия институтов и предприятий, занятых изготовлением противоящурных биопрепаратов. В случае возникновения ящура больных и подозреваемых в заражении животных изолируют или убивают. Неблагополучную зону карантинируют, всех животных в угрожаемой зоне иммунизируют.

Этот метод следует считать наиболее эффективным, так как мероприятия направлены на все звенья эпизоотической цепи.

Технология изготовления противоящурной вакцины из инактивированного вируса начинается с подбора производственных штаммов на основе эпизоотологического анализа динамики ящура в стране и сопредельных государствах. При создании препаратов для специфической профилактики используют соответствующие типы вируса ящура и подбирают штаммы с широким антигенным спектром внутри типа с выраженной перекрестной иммуногенностью. Штамм с широким спектром иммуногенности и удовлетворяющий требованиям региона выбирают с помощью его испытания в реакции перекрестной защиты или чаще - в реакции перекрестной нейтрализации.

Как правило, в качестве производственного штамма используется популяция вируса, которая в совокупности с системой и условиями промышленного культивирования обеспечивает гарантированное и высокое накопление 146S и 75S компонентов вируса и получение иммуногенной вакцины. Кроме того, производственному штамму предъявляются требования стабильности вируса в процессе очистки и концентрирования от тканевых компонентов, а также сохранения компонентов вируса при инактивации и длительном его хранении.

Хорошо известной особенностью возбудителя ящура является антигенная изменчивость штаммов в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки, на разных территориях, зависящая от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других факторов. Считается, что основной причиной антигенной изменчивости является изменение аминокислотной последовательности в полипептидах вирусных белков, составляющих капсид вириона. Практически такие антигенные изменения могут выражаться от незначительных отличий между штаммами, улавливаемых только с помощью тонких методов молекулярного анализа, до появления совершенно отличающихся штаммов, требующих использования новых средств специфической профилактики болезни, вызываемой этими штаммами.

В настоящее время для диагностики ящура разработаны различные методы серологических реакций: реакция диффузионной преципитации (РДП), реакция радиальной иммунодиффузии (РРИД), реакция связывания комплемента (РСК), реакция нейтрализации (РН), реакция иммунофлуоресценции (РИФ), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) и ELISA-метод.

Наиболее простым для постановки диагноза и типизации вируса методом является РСК. Реакцию ставятся согласно существующим методикам в ветеринарных лабораториях.

В 30-х годах для подтверждения ящура ставили специальные опыты на крупном рогатом скоте, свиньях и морских свинках с последующим перекрестным заражением их для установления типа (вида) вируса ящура. Затем появились количественные методы постановки РСК для характеристики антигенных свойств разных штаммов вируса ящура.

В настоящее время арсенал средств для постановки диагноза на ящур, идентификации штаммов вируса и дифференциальной диагностики ящура от других ящуроподобных болезней (везикулярного стоматита, везикулярной болезни свиней и везикулярной экзантемы свиней) расширен и включает реакцию связывания комплемента, реакцию диффузионной преципитации, реакцию пассивной темагглютинации, реакцию серозащиты, реакцию нейтрализации с использованием в качестве индикаторной системы культур клеток, иммуноферментный анализ и ПЦР.

Для постановки диагноза на ящур, определения типовой и вариантной принадлежности вируса и дифференциальной диагностики ящура от других заразных болезней выпускают специфические диагностические ящурные сыворотки и в качестве контроля к ним ящурные антигены.

Приготовление антигенов. Для изготовления ящурных антигенов используют штаммы вируса, адаптированные к организму новорожденных крольчат или к культурам клеток и прошедшие не более 20 пассажей в этих биологических системах. Вируссодержащие суспензии концентрируют и инакивируют гексаметафосфатом натрия.

Контроль антигенов. Изготовленные антигены проверяют на авирулентность для мышат-сосунов, активность с гомологичной сывороткой и специфичность с сыворотками других типов и гетерологичных вариантов ют путем 2—3 инъекций вируса внутримышечно. В вируссодержащую суспензию при гипериммунизации добавляют сапонин в оптимальной дозе, которую устанавливают предварительно для каждой партии. Через 7—10 дней после последней иммунизации морских свинок обескровливают и отделяют сыворотку, которую инактивируют.

Контроль сыворотки. Каждую пробу сыворотки проверяют в РСК на активность с гомологичным антигеном и специфичность с антигенами других типов и гетерологичных вариантов гомологичного типа. Активные и специфичные сыворотки консервируют мертиолатом или высушивают. Срок годности нативной сыворотки 18 месяцев, а высушенной — 3 года.

Сыворотка для диагностики ящура животных типа А Получение сыворотки для диагностики ящура животных, включает иммунизацию кроликов вируссодержащей суспензией, с последующим забором крови и отделением сыворотки, при этом иммунизируют кроликов антигеном путем введения подкожно шестикратно с ревакцинацией на 7, 14, 21, 28 и 35 сутки суспензии вируса ящура типа А, вирулентного штамма А IRAQ, выращенного в культурах клеток ВНК-21, инактивированного и сконцентрированного, с использованием в качестве адъюванта гидроокиси алюминия, сапонина и тималина.

1. Техника получения сыворотки.

В качестве продуцентов отбирают здоровых кроликов любой породы 10-12 месячного возраста, живой массой 2,5-3,0 кг, свободных от противоящурных комплементсвязывающих антител. Животных предварительно выдерживают в карантине и исследуют на инфекционные заболевания согласно действующим «Основным ветеринарным правилам при заготовке животных в биологической промышленности». Кроликов, оказавшихся здоровыми, переводят из карантина для эксплуатации.

Далее кроликов иммунизируют инактивированным концентрированным ящурным антигеном типа А22 IRAQ, разведенным 1:200 физиологическим раствором и комплементсвязывающей активностью не менее 1:128. Количество общего вирусного белка составляло 4,7 мкг/см3, количество гидроокиси алюминия в конечной концентрации - 1,0 %, сапонина - 0,05 %, тималина - 0,5 %.

Иммунизацию кроликов осуществляют шестикратно с ревакцинацией на 7, 14, 21, 28 и 35 сутки суспензии вируса путем введения подкожно в области внутренней поверхности бедра в дозе 1,0 см3.

Для определения уровня образования антител еженедельно (перед очередной иммунизацией) отбирали пробы крови, с последующим исследованием их в реакции связывания комплемента.

На 60-е сутки проводят эксфузию крови, отделяют сыворотку. После крововзятия цилиндры с кровью ставят в термостат на 1-2 часа при температуре 37°С, потом при комнатной температуре на 3-4 часа (для отделения сыворотки), затем помещают в наклонном положении в холодильник при температуре 2-8°С.

На 2-е сутки, производят 1-й слив сыворотки, на 3-и сутки – 2-ой слив.

Сыворотку от каждого кролика отдельно инактивируют прогреванием при 56 0 С в течение 30 минут, консервируют 5%-ным раствором фенола на физиологическом растворе в соотношении 1:10 (10,0 см3 5%-ного раствора фенола и 90,0 см3 сыворотки) и ставят на 10 дней при температуре 2-8°С, для отстоя. Затем берут пробу сыворотки из каждой бутыли и подвергают проверке на стерильность путем высевов на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро и на активность в РСК и РУСК.

Через 10 суток при условии стерильности и получении положительных результатов в РСК и РУСК сыворотку смешивают для составления серии.

Под серией диагностической типо-, штаммоспецифической противоящурной сыворотки следует понимать количество препарата, смешанное в одной емкости, подвергнутое дальнейшей обработке в одних производственных условиях, расфасованное в ампулы или флаконы, получившее свой номер, номер госконтроля и оформленное одним документом о качестве.

Полученная сыворотка – желтоватая, слегка опалесцирующая жидкость, при стоянии с образованием незначительного беловатого осадка, легко разбивающегося при встряхивании.

Изготовленная серия сыворотки должна быть стерильной, не обладать антикомплементарными свойствами в разведениях выше 1:8, и при проверке в РСК по ГОСТ 29312-92 должна давать задержку лизиса 90-100 % эритроцитов в разведении не ниже 1:64. При использовании сыворотки в учетверенном титре, задержка лизиса эритроцитов в РСК с антигенами гетерологичных типов вируса не должна превышать 10%. При этом во всех разведениях сыворотки с антигенами гетерологичных вариантов ящурных вирусов сыворотка в предельном титре может дать задержку лизиса до 50 % эритроцитов.

Специфический титр полученной по предлагаемой методике сыворотки составляет в среднем 1:128, тогда как по старой методике в среднем 1:32Ящурные диагностические и вакцинные биопрепараты на основе штамма Азия-1/Таджикистан/2004(1960) Предложен штамм вируса ящура типа Азия-1/Таджикистан/2004(1960).

Штамм получен путем пассировании эпизоотического изолята на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Депонирован 11.08. г. в коллекции штаммов микроорганизмов ФГУ ВГНКИ под регистрационным номером Азия-1/Таджикистан/2004(1960)-ДЕП. Вирус штамма репродуцируется в чувствительных культурах клеток и в течение 18-24 часов инкубирования накапливается от 6,0 до 7,66 lg ТЦД50/мл. При массированном заражении вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в культурах клеток в течение 10 пассажей. Штамм обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью.

ФГУ ВНИИЗЖ лабораторными исследованиями афтозного материала, выделенного от больных животных в Горно-Бадахшанской автономной области Республики Таджикистан, был установлен вирус щура типа Азия -1, имеющий антигенные отличия от производственного штамма Азия -1 №48 в РСК (R=27%).

Это свидетельствует о несоответствии применяемых средств специфической профилактики и диагностики ящура типа Азия - 1, используемых Россией и странами СНГ, эпизоотическому вирусу, циркулирующему в Республике Таджикистан в 2004 году. В связи с этим назрела необходимость получить новый производственный штамм из эпизоотического вируса ящура серологического типа Азия - 1 для обеспечения безопасности территории России, Казахстана и сопредельных государств от этого возбудителя.

Штамм Азия - 1/Таджикистан/2004 (1960) вируса ящура типа Азия - характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства Штамм Азия -1/Таджикистан/2004 (1960) вируса ящура типа Азия - относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу Азия-1 и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства По своим антигенным свойствам штамм Азия - 1/Таджикистан/ (1960) относится к серотипу Азия - 1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотках крови образуются антитела, выявляемые в реакции диффузионной преципитации (РДП), иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции нейтрализации (РН). При вакцинации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА, РДП и РН. При гипериммунизации морских свинок концентрированным инактивированным антигеном индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в реакции связывании комплемента (РСК) в разведениях 1:128-1:180 и в ИФА в разведениях 1:4000-1:6000.

Штамм Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) отличается от производственного штамма Азия-1 №48 (R=27%), от штамма Азия-1 №1737/Грузия/ (R=42%), а также от ранее выделенных эпизоотических штаммов вируса ящура типа Азия-1. В то же время он является антигеннородственным штаммам Азия-1 №1238/Грузия/84 и Азия-1/Пакистан 1/54.

Молекулярно-генетическая характеристика Методом нуклеотидного секвенирования определена первичная структура гена VP1 (SEQ ID N 0:1) штамма Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) и из нее выведена аминокислотная последовательность белка VP1 (SEQ ID N 0:2).

Биотехнологические характеристики Штамм Азия-1/Таджикистан/2004 (1960) вируса ящура типа Азия- проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации.



Pages:     || 2 |
Похожие работы:

«УТВЕРЖДАЮ Директор ГАОУ СПО ЛНТ _ И.С. Врублевский приказ № _ 20 г. ПРАВИЛА ПРИЕМА ГОСУДАРСТВЕННОГО АВТОНОМНОГО ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ СРЕДНЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ЛЕНИНОГОРСКИЙ НЕФТЯНОЙ ТЕХНИКУМ 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 1.1. Настоящий порядок регламентирует прием граждан Российской Федерации, иностранных граждан, лиц без гражданства, в том числе соотечественников, проживающих за рубежом (далее – граждане, лица, поступающие)в Государственное автономное образовательное учреждение...»

«1 Восточное окружное управление образования. Государственное Образовательное Учреждение Центр образования № 1637 Рабочая интегративная программа Музыка. Мировая художественная культура 5-8 классы Учитель Дмитренко М.А. Москва 2008 2 Редакция 2012 г. для Детской художественной школы История изобразительного искусства 1 – 4 классы 3 Пояснительная записка Искусство – это окно в мир. Своеобразие нации создается общением, а не замкнутостью; добротой к другим, а не злостью. надо возродить у молодежи...»

«Министерство образования и науки Волгоградской области Региональное отделение общероссийского общественного Движения творческих педагогов Исследователь Волгоградский государственный социально - педагогический университет Волгоградская государственная академия повышения квалификации и переподготовки работников образования Муниципальное общеобразовательное учреждение лицей № 8 Олимпия приглашают Вас принять участие в IV РЕГИОНАЛЬНОМ КОНКУРСЕ ЮНОШЕСКИХ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ РАБОТ им. В. И. ВЕРНАДСКОГО...»

«14.1. Принятие решений в условиях определенности — метод анализа иерархий 549 ГЛАВА 14 ТЕОРИЯ ИГР И ПРИНЯТИЯ РЕШЕНИЙ В теории принятия решений используются ‘‘разумные’’ процедуры выбора наи лучшей из нескольких возможных альтернатив. Насколько правильным будет вы бор, зависит от качества данных, используемых при описании ситуации, в которой принимается решение. С этой точки зрения процесс принятия решений может при надлежать к одному из трех возможных условий. 1. Принятие решений в условиях...»

«Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) Федеральный Университет Сервис виртуальных конференций Pax Grid Медицина в XXI веке: традиции и перспективы Сборник трудов I Международной Интернет-Конференции Казань, 12-15 марта 2012г. Казань 2012 УДК 611+613/618(082) ББК 53 М42 МЕДИЦИНА В XXI ВЕКЕ: ТРАДИЦИИ И M42 ПЕРСПЕКТИВЫ cборник трудов международной Интернет-конференции. Казань, 12-15 Марта 2012 г. /Отв. редактор...»

«ПОРТФОЛИО КОЦЕРУБА АЛЕНА Живопись — искусство, на которое можно смотреть; скульптура — искусство, вокруг которого можно обойти; архитектура — искусство, сквозь которое можно пройти. Дэн Райс СИБИРСКИЙ ФЕДЕР АЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Институт архитектуры и дизайна Кафедра: Архитектурное проектирование Специальность Архитектура Коцеруба Алена ПОРТФОЛИО КОЦЕРУБА АЛЕНА Красноярск 2012 Коцеруба Алена Date of Birth: May 20, 1991. Hometown: Republic of Khakassia Abakan Phone: 8-923-360-10- Дата рождения: 20...»

«Министерство образования Российской Федерации СОГЛАСОВАНО: УТВЕРЖДАЮ: Заместитель Министра Заместитель Министра сельского хозяйства и образования Российской продовольствия Российской Федерации Федерации Н.К. Долгушкин В.Д.Шадриков 08.02.2000 г. 10.03.2000 г. Регистрационный №33 с/сп ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ СТАНДАРТ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ Специальность 111201 Ветеринария Квалификация – Ветеринарный врач Вводится с момента утверждения Москва, 2000 г. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ЭКОНОМИКИ И УПРАВЛЕНИЯ НИНХ БИЗНЕС- КОЛЛЕДЖ РАБОЧАЯ ПРОГРАММА ПРАКТИКИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРВИЧНЫХ ПРОФЕССИОНАЛЬНЫХ НАВЫКОВ ПО СПЕЦИАЛЬНОСТИ 080110 ЭКОНОМИКА И БУХГАЛТЕРСКИЙ УЧЕТ (ПО ОТРАСЛЯМ) (БАЗОВЫЙ УРОВЕНЬ) 2011 г. Пояснительная записка Практика для получения первичных профессиональных навыков является составной частью образовательной программы...»

«ОГБОУ СПО Боханский педагогический колледж им.Д.Банзарова ПОЛОЖЕНИЕ Об учебной и производственной практике студентов Боханского педагогического колледжа им. Д.Банзарова 2011 г. 2 I. Основные положения 1. Настоящее положение разработано в соответствии с Законом РФ Об образовании, Типовым положением об образовательном учреждении среднего профессионального образования (среднем специальном учебном заведении), утвержденным постановлением Правительства Российской Федерации от 18 июля 2008 г. N 543...»

«МИНИСТЕРСТВО ТРАНСПОРТА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ЖЕЛЕЗНОДОРОЖНОГО ТРАНСПОРТА федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПУТЕЙ СООБЩЕНИЯ ИрГУПС (ИрИИТ) УТВЕРЖДАЮ: Декан ЭМФ Пыхалов А.А. 2011 г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ПРАКТИКИ C5. У Учебная практик, 1 курс Специальность 190300.65 Подвижной состав железных дорог Специализация 2. Вагоны Квалификация выпускника специалист...»

«http://www.tech-biblio.ru А.И. Перчик ТРУБОПРОВОДНОЕ ПРАВО Под редакцией И.Г. Ларина Москва 2002 УДК 622.691.4 Перчик А.И. Трубопроводное право. – М.: Нефть и газ, 2002. – 368 с. В книге впервые в систематизированном виде изложены нормы и институты трубопроводного права, которое рассматривается в качестве подотрасли комплексной отрасли – транспортное право. Дано определение предмета, метода и источников трубопроводного права, большое место уделено вопросам государственного регулирования...»

«1 Министерство образования и науки РФ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Владимирский государственный университет имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых УТВЕРЖДАЮ Первый проректор _ В.Г. Прокошев _2011 г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА ДИСЦИПЛИНЫ СВЯЗИ С ОБЩЕСТВЕННОСТЬЮ Направление подготовки Философия Профиль подготовки Квалификация (степень) выпускника бакалавр Форма обучения очная Трудоем- Лек- Практич. Лаборат....»

«Промоакция (Промоакция) с розыгрышем призов — дисков Seagate® Backup Plus объемом 1 ТБ — в рамках опроса по облачным технологиям Официальные правила Принимая участие в этой Промоакции, участники соглашаются руководствоваться настоящими Официальными правилами. [Примечание. Не все те люди, которые предпринимают попытку пройти опрос, получают право на участие в розыгрыше и автоматически включаются в состав участников.] ДЛЯ УЧАСТИЯ ИЛИ ПОБЕДЫ ПРИОБРЕТАТЬ КАКИЕ-ЛИБО ПРОДУКТЫ НЕ ТРЕБУЕТСЯ. ФАКТ...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АЭРОКОСМИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ имени академика С.П. КОРОЛЁВА (НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ) МЕЖДУНАРОДНАЯ МОЛОДЁЖНАЯ НАУЧНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ XII КОРОЛЁВСКИЕ ЧТЕНИЯ СБОРНИК ТРУДОВ Том 2 1 – 3 октября 2013 г. САМАРА XII Королёвские чтения: Международная молодёжная научная конференция, Самара, 1-3 октября 2013 года: Тезисы докладов. Самара: Издательство СГАУ, 2013, 272 с. ISBN 978-5-7883-0952- В сборнике...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ    ГОУ ВПО РОССИЙСКОАРМЯНСКИЙ (СЛАВЯНСКИЙ)  УНИВЕРСИТЕТ      Составлена в соответствии с федеральными  государственными  требованиями к структуре основной профессиональной  образовательной программы послевузовского   УТВЕРЖДАЮ:  профессионального образования (аспирантура)             Проректор по научной работе    _ П.С. Аветисян      2011г. ...»

«Белорусский государственный университет Географический факультет УТВЕРЖДАЮ Ректор С.В.Абламейко Регистрационный № УД-_ ПРОГРАММА дополнительного вступительного испытания по Общему землеведению для поступающих в магистратуру по специальностям 1-31 80 16 Гидрология суши, водные ресурсы, гидрохимия 1-31 80 17 Метеорология, климатология, агрометеорология Минск 2014 2    СОСТАВИТЕЛИ: Лопух П.С. – заведующий кафедрой общего землеведения и гидрометеорологии, профессор, доктор географических наук,...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ УТВЕРЖДАЮ Декан факультета плодоовощеводства и виноградарства, доцент С.М. Горлов _ 2010 г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА дисциплины ГСЭ.Ф.07 ИСТОРИЯ САДОВОДСТВА для бакалавров 110202.65 Плодоовощеводство и вин-во Факультет Плодоовощеводства и виноградарства Кафедра Плодоводства Дневная форма обучения Вид...»

«МИНИСТЕРСТВО СПОРТА, ТУРИЗМА И МОЛОДЕЖНОЙ ПОЛИТИКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное бюджетное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный университет физической культуры, спорта, молодежи и туризма (ГЦОЛИФК) ПРОГРАММА ДИСЦИПЛИНЫ ТЕОРИЯ И МЕТОДИКА ПЛАВАНИЯ федеральный компонент цикла СД ГОС по специальности 032101 Физическая культура и спорт Москва – 2011 1 УДК 796.71(073) П 37 Программа утверждена и рекомендована...»

«Официальное периодическое печатное издание администрации муниципального образования Каневской район Ноябрь, 2012, № 19 (19) www.kanevskadm.ru Постановление от 31.10.2012 г. № 1637 Об утверждении долгосрочной муниципальной целевой 1. программы поддержки и развития кубанского казачества в муниципальном образовании Каневской район на 2013-2015 годы – стр. 2. Постановление от 31.10.2012 г. № 1638 Об утверждении долгосрочной муниципальной целевой 2. программы Комплексные меры противодействия...»

«БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ФАКУЛЬТЕТ ФИЛОСОФИИ И СОЦИАЛЬНЫХ НАУК Кафедра социологии Л.Г.Титаренко ГЕНДЕРНАЯ СОЦИОЛОГИЯ Учебно-методический комплекс Для студентов факультета философии и социальных наук по специальности “Социология” Минск 2002 УДК 316.346.2 (075.5) ББК 60.54 p Т34 Рецензенты: Доктор социологических наук, профессор Д. Г. Ротман; Доктор социологических наук И. А. Сосунова Рекомендовано Ученым советом факультета философии и социальных наук, 26 декабря 2002 года,...»




























 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.