Санкт-Петербургский государственный политехнический университет

УТВЕРЖДАЮ

Декан ФМФ

В.К. Иванов

«_» _ _ г.

РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ

Специальный физический практикум Кафедра-разработчик Биофизика Направление (специальность) подготовки 011200 Физика Наименование ООП Квалификация (степень) выпускника Магистр Образовательный стандарт Федеральный ГОС Форма обучения очная Соответствует ФГОС ВПО.

Утверждена протоколом заседания кафедры Биофизика № 2 от 17.05. Программу в соответствии с ФГОС ВПО разработали:

д.ф-м.н. Ю.Н. Орлов 1. Цели и результаты изучения дисциплины 1.1. Цели изучения дисциплины Дисциплина «Специальный физический практикум» имеет своей целью практического ознакомления обучающихся с рядом наиболее современных физических методов исследования биологических объектов, а именно спектроскопией ядерного магнитного резонанса (ЯМР), масс-спектрометрией и оптическим пинцетом. Практикум включает в себя рассмотрение принципов, приборной базы и современных подходов к использованию указаных методов и направлен на формирование у студентов экспериментальных навыков в области молекулярной биологии клеточных процессов, протеомики и молекулярномедицинской диагностики.

1.2. Результаты обучения (компетенции) выпускника, в формирование которых вносит вклад освоение дисциплины Код Результат обучения (компетенция) выпускника ООП ОК- способностью демонстрировать углубленные знания в области математики и естественных наук ОК- способностью самостоятельно приобретать с помощью информационных технологий и использовать в практической деятельности новые знания и умения, в том числе в новых областях знаний, непосредственно не связанных со сферой деятельности, расширять и углублять свое научное мировоззрение ОК- способностью порождать новые идеи (креативность) ОК- способностью к активной социальной мобильности, способностью к организации научно-исследовательских и научно-производственных работ, способностью к управлению научным коллективом ОК- способностью использовать базовые знания и навыки управления информацией для 10 решения исследовательских профессиональных задач, соблюдать основные требования информационной безопасности, в том числе защиты государственной тайны ПК- способностью свободно владеть фундаментальными разделами физики, необходимыми для решения научно-исследовательских задач (в соответствии со своей магистерской программой) ПК- способностью использовать знания современных проблем физики, новейших достижений физики в своей научно-исследовательской деятельности ПК- способностью самостоятельно ставить конкретные задачи научных исследований в области физики (в соответствии с профилем магистерской программы) и решать их с помощью современной аппаратуры, оборудования, информационных технологий с использованием новейшего отечественного и зарубежного опыта ПК- способностью и готовностью применять на практике навыки составления и оформления научно-технической документации, научных отчетов, обзоров, докладов и статей (в соответствии с профилем магистерской программы) ПК- способностью использовать свободное владение профессиональнопрофилированными знаниями в области информационных технологий, современных компьютерных сетей, программных продуктов и ресурсов Интернет для решения задач профессиональной деятельности, в том числе находящихся за пределами профильной подготовки ПК- способностью свободно владеть профессиональными знаниями для анализа и синтеза физической информации (в соответствии с профилем подготовки) 1.3. Планируемые результаты освоения дисциплины -умение самостоятельно выполнять биофизические исследования при решении научноисследовательских задач по теме магистерской программы;

-навыки планирования и проведения экспериментальной работы по теме магистерской программы с применением современной аппаратуры, оборудования и компьютерных технологий;

-способность самостоятельно с применением современных компьютерных технологий анализировать, обобщать и систематизировать результаты биофизических работ;

-способность использовать современные методы обработки и интерпретации биофизической информации при проведении научных исследований.

2. Место дисциплины в ООП Согласно ФГОС ВПО направления 011200 «Физика» (квалификация «магистр») дисциплина «Специальный физический практикум» относится к базовым дисциплинам общенаучного цикла М.1.

Дисциплину «Специальный физический практикум» студенты изучают в 9-м и 10м семестрах (пятый год обучения).

Изучение дисциплины «Специальный физический практикум» опирается на знания в физики, теоретической физики, информатики, вычислительной математики, молекулярной и структурной биологии, физики белка, освоенные студентами на предшествующих этапах обучения.

Результаты изучения дисциплины «Специальный физический практикум»

используются при изучении дисциплин профессионального цикла М.2 и при подготовке магистерской диссертации.

Курс состоит из практических занятий.

3. Распределение трудомкости освоения дисциплины по видам учебной работы 3.1. Виды учебной работы в том числе аудиторные занятия в интерактивной – – форме ориентированная самостоятельная работа Общая трудоемкость освоения дисциплины в академических часах: 3.2. Формы контроля 4. Содержание и результаты обучения 4.1. Разделы дисциплины и виды учебной работы Опическая ловушка Принцип работы и способы подготовки образца Способы калибровки и влияние аббераций на жесткость ловушки Введение в ЯМР-спектроскопию Общие понятия и основные определения ЯМР-спектроскопии.

Химический сдвиг, дипольное взаимодействие, релаксация.

Основы методов наблюдения сигнала ЯМР Перенос поляризации РЧ импульсами.

Гомоядерные 2D -эксперименты.

Гетероядерная корреляционная спектроскопия Масс-спектрометрия Основы масс-спектрометрического анализа Масс-спектрометрический анализ биополимеров 4.2. Содержание разделов и результаты изучения дисциплины 1. Опическая ловушка 1.1. Принцип работы и способы подготовки образца Описание метода оптической ловушки и знакомство с экспериментальной установкой. образца для оптической ловушки.

Причины удержания микрообъектов в ловушке. Основные способы подготовки экспериментального образца. Основы работы с оптическим микроскопом. Удержание микросферы в оптической ловушке.

1.2. Способы калибровки и влияние аббераций на жесткость ловушки Описание способов определения положения Представление о влиянии размера объекта в ловушке и способов калибровки ловушки по силе. Подготовка экспериментального образца и проведение калибровки системы детектирования, а также калибровки ловушки по силе. Исследование зависимости жесткости ловушки от размера микросферы, материала, из которого она изготовлена, и расстояния до покровного стекла.

2. Введение в ЯМР-спектроскопию 2.1. Общие понятия и основные определения ЯМР-спектроскопии.

Химический сдвиг, дипольное взаимодействие, релаксация.

Исторический обзор. Блок-схема ЯМРспектрометра. Спектральные параметры, характеризующие спектр ЯМР. Понятие химического сдвига и константы расщепления. Характерные диапазоны изменений для различных ядер. Скалярное взаимодействие, мультиплетная структура сигнала. Слабое взаимодействие спинов, спектры первого порядка.

2.2. Основы методов наблюдения сигнала Представления о возбуждении ЯМР сигнала ЯМР 2.2.1. Медленное прохождение и импульсное и путей переноса поляризации. Понимание возбуждение А) Медленное прохождение:

линейный отклик, Б) импульсное и стохастическое возбуждение. Импульсная частотная характеристика линейной системы.

Понятие спада свободной индукции (FID) и связь со спектром. В) стохастическое возбуждение. Уравнение Блоха во вращающейся системе координат.

Эффективное магнитное поле Beff. Понятие когерентности. Идеальный импульсный эксперимент. Идеальный /2 импульс. Связь регистрируемого сигнала с поперечной намагниченностью. Регистрация сигнала, синхронный детектор (СД) и его недостатки.

Квадратурное детектирование – основной способ регистрации ЯМР, комплексный спектр. Форма линии сигнала и связь со временами релаксации T1 и T2. 2.2.2.

Импульсы в ЯМР спектроскопии:

селективные, полуселективные и не селективные Типы импульсов используемых в ЯМР спектроскопии. Селективные, полуселективные и не селективные импульсы. Преобразование когерентности под действие селективных импульсов.

Факторы, влияющие на идеальность РЧимпульсов. Составные импульсы.

Последовательности улучшающие ( и( импульсы. Циклы и суперциклы.

Последовательности WALTZ и MLEV. 2.2.3.

Алгоритм регистрации и обработки спектра ЯМР. Искажения спектров Амплитудные и фазово-частоные искажения спектров.

Природа искажений и способы коррекции искажений. Фурье-преобразование и фильтрация.

2.3. Перенос поляризации РЧ импульсами. Знание основных этапов переноса 2.3.1. INEPT-эксперимент INEPTэксперимент. Этапы переноса поляризации поляризации в двухспиновой системе.

через антифазную когерентность и Понятие о «редактировании» спектра.

двухспиновый порядок. Импульсная последовательность BIRD. Недостатки INEPT. Элементы оператора спиновой плотности в течение импульсной последовательности. Зависимость сигнала от фазы последнего импульса. 2.3.2. DEPTэксперимент Недостатки INEPT, Элементы оператора спиновой плотности в течение импульсной последовательности.

Зависимость сигнала от угла поворота последнего импульса.

2.4. Гомоядерные 2D -эксперименты.

2.4.1. Корреляционная спектроскопия COSY измерения. Освоение способов подавление и DQF-COSY Общее представление эксперимента. Подготовительный период, период эволюции, период смешения и период спектрах Дальнейшее углубление регистрации - основные этапы 2Dэксперимента. Гамильтонианы, действующие спектроскопии. Освоение способов в течение 2D-эксперимента. Корреляционная получения пиков истинного поглощения и спектроскопия COSY, простейший 2Dэксперимент. Эволюция оператора спиновой методов соотнесения сигналов в плотности в течение эксперимента.

Зависимость сигнала от химических сдвигов и констант взаимодействия. DQF-COSY перенос поляризации через 2QT когерентность (3-х импульсный эксперимент) 2.4.2. Корреляционная спектроскопия TOCSY RELAY эстафетный перенос поляризации. TOCSY полная корреляционная спектроскопия, спин-лок и понятие коллективные спиновые моды.

Форма пиков в 2D-спектроскопии. Способы получения пиков истинного поглощения. А) Симметризация. Б) TPPI.

2.5. Гетероядерная корреляционная спектроскопия 2.5.1. HMQC и HSQC эксперименты HMQC - соотнесения сигналов в гетероядерных перенос поляризации через 2QTкогерентность. HSQC - двухэтапный Перенос данные, содержащиеся в ЯМР-спектрах.

когерентности 2.5.2. HMBC и H2BC эксперименты H2BC гетероядерные корреляции через две химические связи.

HMBC -гетероядерные корреляции через несколько химических связей, подавления нежелательного переноса поляризации.

3. Масс-спектрометрия 3.1. Основы масс-спектрометрического Формирование ионных пучков Элементы теории транспортировки, формирования и разделения ионных пучков. Источники ионов масс-спектрометров. Элементы теории транспортировки пучков. Физический смысл понятий «эмиттанс» и «аксептанс». Источник ионов — иммерсионная ионно-оптическая система Изотопный, элементный и молекулярный МС анализ Изотопный массспектрометрический анализ. Элементный масс-спектрометрический анализ.

Молекулярный масс-спектрометрический анализ.

3.2. Масс-спектрометрический анализ биополимеров Масс-спектрометрический анализ пептидов содержащиеся в масс-спектрах. Знание Образование вторичных ионов при фрагментации пептидов. Фрагментация инертным газом. Диссоциация путем захвата электрона. Фотодиссоциация.

Классификация фрагментных пептидов, b и y ионы. Первичное разделение «родительских»

ионов и выделение ионов с единственным значением отношения массы к заряду (m/z).

Фрагментация ионов, получение вторичных, или «дочерних», ионов. Масс-анализ «дочерних ионов» во второй ступени тандема. Интерпретация фрагментных массспектров Подготовка данных, содержащихся в масс-спектрах, для биохимической интерпретации. Восстановление моноизотопной массы пептидов. Метод картирования фрагментов пептидов. Кроскорреляционный анализ. Белковые базы данных. Идентификация посттрансляционных модификаций. Проблема гомологии белков для метода картирования фрагментов. Преимущества и недостатки метода картирования пептидных фрагментов.

5. Образовательные технологии В преподавании дисциплины «Специальный физический практикум» используются преимущественно традиционные образовательные технологии - практические занятия.

Занятия в активной и интерактивной формах 6. Лабораторный практикум Практические занятия проводятся в форме лабораторного практикума в центре "Нанобиотехнологии" СпбГПУ. Студенты знакомятся с основами практической работы на трех современных приборах:

- комплекса для исследования динамики нанобиомашин « Лазерный пинцет» - FA- (Nanodinamic, США);

- ЯМР-спектрометра –NMR 700 (Varian) США;

- хроматомасс-спектрометра LC-Triple Quad-MS (Varian) США.

7. Практические занятия Практические занятия проводятся в форме лабораторного практикума (см. предыдущий раздел).

8. Организация и учебно-методическое обеспечение самостоятельной работы студентов Самостоятельная работа студентов направлена на закрепление и углубление освоения учебного материала, развитие практических умений. Самостоятельная работа студентов в рамках дисциплины «Специальный физический практикум» включает следующие виды самостоятельной работы:

- осуществление подбора и анализа литературы по теме;

- анализ и оформление результатов научно-исследовательской работе и подготовку к зачету.

Примерное распределение времени самостоятельной работы студентов подготовка к лабораторным работам, к практическим и семинарским занятиям 9. Учебно-методическое обеспечение дисциплины 9.1. Адрес сайта курса РПД размещается по адресу http://biophysics.spbstu.ru/399_01w.html.

9.2. Рекомендуемая литература Основная литература Автор, название, место издания, издательство, год Год К-во Место 2. Биофизика. учеб. для вузов по спец. "Биофизика". в 2 т.. / А. Библиотека Б. Рубин — М. Изд-во МГУ, 1. Физические основы масс-спектрометрии и ее применение в Библиотека аналитике и биофизике. / Л. Н. Галль — СПб. Изд-во Политехн. ун-та, Дополнительная литература 1. Оптическое манипулирование микрообъектами: достижения и новые возможности, порожеденные дифракционной оптикой / В. А. Сойфер — Физика элементарных частиц и атомного ядра, т. 35, вып. 6,, Ресурсы Интернета 1. ресурсы сети Интернет / http://phet.colorado.edu/en/simulation/optical-tweezers;

http://www.chem.msu.su/rus/teaching/petrosyan/welcome.html;

http://www.xumuk.ru/encyklopedia/2448.html 9.3. Технические средства обеспечения дисциплины http://univertv.ru/, разделы Физика, Химия;

http://www.bio.fizteh.ru/student/files/biology/biolections/ Интернет-портал «Легендарный Физтех».htm 10. Материально-техническое обеспечение дисциплины 1. Комплекс для исследования динамики нанобиомашин « Лазерный пинцет» - FA- (Nanodinamic, США) 2. Хромато-масс-спектрометр: LC-Triple Quad-MS (Varian) США 3. Ионно циклотронный Фурье масс спектрометр FTMS 9.4 Tesla (Varian,) США 4. ЯМР спектрометр –NMR 700 (Varian) США.

5. Хромато-масс-спектрометра: LC-IT-TOF-MS, (Shimadzu ) Япония.

6.Высокоэффективныйого жидкостного хроматографа Agilent 1200 ( США) со спектрофотометрическим и амперометрическим детекторами.

7. Системы капиллярного электрофореза с диодной матрицей и масс-спектрометрическим детектором «Agilent 1100 CE-ESI-MS» ( США) 8. Масс-спектрометра MALDI TOF «Voyager DE» ( США) с лазерной десорбцией и ионизацией пробы с помощью матрицы.

11. Критерии оценивания и оценочные средства 11.1. Критерии оценивания Критерием при выставлении зачета является посещаемость всех практических работ, предоставление отчетов по каждой проведенной работе, а также ответ на зачете на вопросы по трем темам практических занятий 11.2. Оценочные средства 11.2. Оценочные средства Примерные контрольные вопросы:

Пинцет:

1. Причины удержания микрообъекта в оптической ловушке.

2. Способы детектирования положения объекта в оптической ловушке.

3. Способы калибровки оптической ловушки по силе.

4. Основные узлы оптической ловушки.

5. Примеры экспериментов с использованием оптической ловушки.

6. Способы формирования объекта исследования в оптической ловушке.

ЯМР Примерные вопросы для зачета:

Уравнение движения изолированного спина в магнитном поле.

Уравнения Блоха.

Ларморова частота прецессии. Вращающаяся система координат (ВСК).

Взаимодействие с радиочастотным полем (РЧ). Поворота вокруг РЧ поля.

Xимический сдвиг и константы расщепления синхронный детектор (СД) и его недостатки.

Квадратурное детектирование – основной способ регистрации ЯМР, комплексный спектр.

Форма линии сигнала и связь со временами релаксации T1 и T2.

Нерезонансные эффекты.

Заселенность спиновых состояний, Насыщение РЧ полем. Средний магнитный момент и объемная парамагнитная восприимчивость Условия регистрации спектра и спектральные параметры Амплитудные и фазово-частоные искажения спектров. Природа искажений и способы коррекции искажений.

INEPT-эксперимент DEPT-эксперимент.

Эффекты Оверхаузера Циклирование фазы 2D-спектроскопия.

2D-Фурье преобразование.

Корреляционная спектроскопия COSY DQF-COSY RELAY эстафетный перенос поляризации TOCSY полная корреляционная спектроскопия 1. Основные понятия протеомики.

2. Жизненный цикл белка в клетке 3. Модульная структура белков и белковые семейства.

4. Методы и подходы аналитической протеомики.

5. MALDI-TOF масс-спектромет 6. Калибровка TOF- анализатора.

7. Разрешающая способность MALDI-TOF спектрометра.

8. Метод электроспрей.

9. Принцип деления ионов в квадрупольном масс-анализаторе.

10. Ионные ловушки и многостадийный масс-спектрометр.

11. Сканирующий и тандемный режимы работы масс-спектрометров 12. Идентификация белков по массе пептидных фрагментов.

13. Определение аминокислотной последовательности пептидов с помощью тандемной масс-мпектрометрии.

14. Измерение уровня экспрессии белков c помощью тандемной масс-спектроскопии 15. Белок-белковые взаимодействия и белковые сети.

16. Метод дву-гибридного анализа.

17. База данных белкового взаимодействия 12. Методические рекомендации по организации изучения дисциплины Успешное освоение курса "Специальный физический практикум" зависит от подготовки студента по другим дисциплинам, таким как физика, неорганическая и органическая химия, молекулярная биология, которые студенты получают на ранних курсах обучения.

Трудности в освоении курса связаны прежде всего с ограниченным количеством учебной литературы. Поэтому преподавание курса "Специальный физический практикум" рекомендуется начинать вводными лекциями по основам тех методов, которые студентам предстоит осваивать в ходе занятий. В качестве учебных материалов по технологии единичных молекул (оптический пинцет) рекомендуется использовать указанные в п. 9. интернет-ресурсы, дающие наглядное представление об основах и особенностях осваиваемых методов.