Зав. отделом биохимических и цитогенетических методов диагностики д.м.н., доцент Землянова Марина Александровна, [email protected] 5-6 октября, 2011 г. Пермь Санитарно-эпидемиологическая экспертиза Статья 42 (Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ, в ред. от 22.08.2004, 30.12.2008) ЦЕЛЬ Установление и предотвращение вредного воздействия факторов среды обитания на здоровье человека Расширение доказательной Современные направления базы причиннофундаментальных научных следственных связей в исследований системе «среда-здоровье»
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
Разработка и внедрение новых аналитических подходов к системному анализу молекулярных механизмов возникновения и развития ответных реакций организма на внешнесредовое воздействие на самых ранних стадиях их развития Целевые Система молекулярные молекулярных маркеры эффекта мишеней воздействия Новые технологии Повышение Эффективные раннего выявления и эффективности программы прогноза развития системы профилактики заболеваний биомониторинга
ПРОТЕОМ ЧЕЛОВЕКА
Международный научный проект ДНК «Протеом человека» (2008 г.) геном направлен на идентификацию
ГЕНОМИКА
совокупности белков человека РНК транскриптом
ТРАНСКРИПТОМИКА
БЕЛОК протеом
ПРОТЕОМИКА
МЕТАБОЛИТЫ
метаболом
МЕТАБОЛОМИКА
В России: Программа РАМН и РАН «Протеомика в медицине и биотехнологии» (2001-2011 гг.)
ПРОТЕОМ КАК ОПЕРАТИВНЫЙ
ИНДИКАТОР СОСТОЯНИЯ ОРГАНИЗМА
Внешнесредовые факторы воздействия Геном Транскриптом Протеом Метаболом Построение и сравнительный анализ протеомных карт нормальных, пред- и патологических состояний на уровне индивидуум – группа – популяция Обоснование белковых маркеров ответных реакций организма Формирование доказательной базы нарушений состояния здоровья в условиях воздействия внешнесредовых и производственных факторов риска www.themegallery.com
ПРИБОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ПРОТЕОМНЫХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
Комбинация высокотехнологичных методов тандемной массспектрометрии высокого разрешения и высокоэффективной жидкостной хроматографии – наиболее адекватный подход к изучению протеомного профиля • Эффективно и качественно проводить разделение белков и пептидов концентрацией (от 10-9 до 10-15 М) www.themegallery.com
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАТРИЦЫ ДЛЯ
ПРОТЕОМНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Проект Протеом человека (HPP) Проект Протеом Плазмы человека (HPPP) Проект Протеом Печени человека (HLPP) Проект Протеом Мозга человека (HBPP) Инициатива Антитела человека (HAI) Инициатива Протеомных Стандартов (PSI) Инициатива Протеом/Гликом человека Проект Протеом Почек и Мочи человека (HKUPP) Модели Заболеваний человека на мышах составе большинство Инициатива Сердечно-сосудистая система белков, Инициатива по Моделированию Протеома организма (iMOP)
ПРОТЕОМНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Отработка методических подходов к исследованию белкового профиля плазмы В качестве биологической матрицы используется плазма крови детей 3-7 лет, проживающих на территориях с хроническим внешнесредовым воздействием тяжёлых металлов (ванадий, никель, хром) и сравнительно на территориях с отсутствием воздействия тяжёлых металлов Аналитическая система хромато-масс-спектрометрии:
• ВЭЖХ система UltiMate-3000 (Dionex, США) • тандемный масс-спектрометр 4000 QTrap LC/MS/MS на базе тройного квадруполя с источником ионов типа NanoSpray (AB Sciex, США, Канада)
Этап пробоподготовки § Удаление интенсивных белков § Иммунноафинное связывание интенсивУдаление интенсивных плазмы крови (альбумина, белков плазмы крови (альбумина, глобулинов и др.) Удаление до 20 интенсивных белков,
ПРОБОПОДГОТОВКА
Этап пробоподготовки § Увеличение концентрации § Увеличение белков до низкокопийных концентрации § Концентрирование на регистрируемой белков до регистрируемой § Деструкция белков до пептидов § Восстановление, алкилирование § Деструкция белков до пептидов и трипсинолиз эффективности анализа плазмы крови
ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЕ
§Подбор таких условий §Подбор таких время (форма градиента, время колонки), при которых обеспечивается полное обеспечивается полное элюирование образца с элюирование наименьшее с колонки за колонки с за наилучшим время разрешением разрешением
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ
Этап регистрации массспектров Информационно-зависимый эксперимент, включающий 2 Информационно-зависимый эксперимент, включающий § режим расширенного масс-спектра – обзорный масс-спектр § режим образца плазмы крови пептидов расширенного масс-спектра – обзорный масс-спектр пептидов образца плазмы крови Расширенный масс-спектр пептидов образца плазмы крови
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ
Этап регистрации массспектров Информационно-зависимый эксперимент, включающий Информационно-зависимый эксперимент, включающий § режим высокого разрешения – масс-спектр пептидов высокого § режим высокого разрешения – масс-спектр пептидов высокого разрешения образца плазмы крови разрешения образца плазмы крови Масс-спектр высокого разрешения образца плазмы крови
ПРОТЕОМНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Анализ полученных данных Получен набор данных по Получен набор данных по исследуемым образцам плазмы - Статистические исследуемым образцам плазмы крови, содержащих инфороценка изменений крови, содержащих информацию о количественном содержании о и количественном составе пептидов икачественном содержании и состоящих - Базы данных из них белков www.themegallery.com
«