ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«СИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И

СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ»

«СОГЛАСОВАНО» «УТВЕРЖДАЮ»

Декан медико-биологического Проректор по учебной работе факультета профессор профессор А.И. Венгеровский С.И. Карась

РАБОЧАЯ ПРОГРАММА

по молекулярной биологии и биотехнологии специальности 060112 «медицинская биохимия»

Квалификация “врач-биохимик” Курс Семестры X Кафедра биохимии и молекулярной биологии.

Учебные часы по Государственному образовательному стандарту Министерства образования и науки Российской Федерации и Министерства здравоохранения и социального развития:

Учебные часы по действующему учебному плану 179 ч:

Лекции 34 ч Практические занятия 85 ч Самостоятельная работа 60 ч Экзамен X семестр

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИЗУЧЕНИЯ

молекулярной биологии и биотехнологии Основной целью изучения дисциплины «молекулярная биология и биотехнология» студентами, обучающимися по специальности «медицинская биохимия» является формирование представлений о строении и функционировании и методах биоинженерии нуклеиновых кислот у вирусов, фагов, про- и эукариот.

В процессе изучения дисциплины «молекулярная биология и биотехнология» решаются следующие задачи:

Задачи курса:

1. Приобретение студентами современных знаний о строении нуклеиновых кислот, о строении и классификации генов в геноме.

2. Формирование современных представлений о механизмах реализации генетической информации у вирусов, фагов, про- и эукариот в ходе основных клеточных процессов –репликации, транскрипции, трансляции и регуляции этих процессов.

4. Приобретение студентами современных представлений о механизмах репарации поврежденной ДНК, проявлениях нестабильности генома при онкогенезе и молекулярно-биологические основах возникновения жизни на Земле.

5. Освоение основных методов генной инженерии и молекулярной биологии, необходимых для изучения и модификации нуклеиновых кислот, а также кодируемых ими белков.

ТЕМАТИЧЕСКИЙ ПЛАН ЛЕКЦИЙ И ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ

по молекулярной биологии и биотехнологии № п/п Тема Количество часов Количество лекций часов практических занятий 1. Введение в предмет. Структура и 2 функция белков и нуклеиновых кислот 2. Воспроизведение генетической информации принципы и механизмы репликации ДНК 3. Реализация генетической информации. Механизмы транскрипции.

4. Реализация генетической информации. Механизмы трансляции.

5. Реализация генетической информации. Механизмы регуляции активности генов.

6. Современные классификации генов в геноме. Особенности структура ядерного генома и регуляция реализации генетической информации у эукариот. Механизм сплайсинга.

7. Механизмы репарации ДНК. Системы репарации (прямая репарация, эксцизионная репарация).

8. Проявления нестабильности генома при онкогенезе. Признаки трансформированной клетки.

Молекулярно-биологические основы возникновения жизни на 9. Предмет и задачи биотехнологии. 2 применяемых в генной инженерии.

Полимеразная цепная реакция как метод генной инженерии.

Молекулярные векторы. Способы внедрения ДНК in vitro.

нуклеотидной последовательности Принципы химического синтеза олигонуклеотидов.

13. Методы оценки экспрессии генов: 4 иммунодиагностика.

Радиоиммуный анализ.

Иммуноферментный анализ.

14. Генная терапия: основные подходы 4

СОДЕРЖАНИЕ ЛЕКЦИЙ

Тема 1.

1. Определение предмета молекулярной биологии. Методы, используемые в исследованиях по молекулярной биологии. Взаимосвязи наук, создавших молекулярную биологию. Основные этапы развития и наиболее крупные открытия молекулярной биологии. Белки - основа видовой и индивидуальной специфичности. Нуклеиновые кислоты - история открытия, доказательства генетической роли нуклеиновых кислот. Открытия, предшествующие и подготовившие появление модели двуспиральной молекулы ДНК. Строение мононуклеотидов. Структура и функции ДНК и РНК, физико-химические свойства нуклеиновых кислот, процессы денатурации и ренатурации нуклеиновых кислот, их кинетика. Понятие о Соt 0,5. Феномен Томаса.

Представление о методе молекулярной гибридизации. Генетический код, его свойства - специфичность, врожденность, триплетность, компактность, однонаправленность, универсальность, помехоустойчивость, неперекрываемость, знаки препинания. Устройство генома ФХ174, М40.

Недостатки экономичного использования генома. Информационная емкость ДНК. Синтез искусственного гена в лаборатории Корано (1970 г.).

Тема 2.

1. Доказательство способности молекул ДНК к самоудвоению. Понятие о консервативной и неконсервативной репликации. Подтверждение Полуконсервативного характера репликации в эксперименте на хромосомах, доказательство копирования матрицы. Метод "анализа ближайших соседей" в последовательности нуклеотидов, как доказательство антипараллельности расположения нитей ДНК. Ферментативная система синтеза ДНК. Первая схема прерывистой антипараллельной репликации Риджи Оказаки и доказательства её положений. Инициация репликативных цепей ДНК с помощью РНК-затравок. Репликация двуцепочечнои антипараллельнои линейной цепи ДНК (II-ая схема Оказаки). Репликация одноцепочечных ДНК содержащих фагов на примере ФХ 174, доказательство участия затравочных фрагментов РНК в их репликации. Понятие о праймазе.

Репликация двуцепочечной кольцевой ДНК. Модель разматывающего рулона и модель репликации в двух направлениях (модель Кернса). ДНКрасплетающие белки, их основные характеристики и биологические функции.

Плавящие белки Альбертса (1977) и их кооперация с ДНК полимеразой.

Понятие о ДНК геликазах, топоизомеразах (топологических релаксирующих белках). ДНК гиразы. Модели их действия и кооперация. Скорость и направление репликации у про- и эукариот. Понятие о репликонах. Схема прерывистой антипараллельной репликации Корнберга-Окаэаки. Средняя скорость репликации.

Тема 3.

1. Химическая природа ДНК-полимеразы I (фермент Корнберга). Функции фермента. Механизм действия ДНК-полимеразы I. Виды матриц-затравок по Корнбергу. Экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы 1. Схема непрерывной антипараллельной репликации по Корнбергу. Схема параллельной репликации Кернса. Обнаружение ДНК-полимеразы II и III E.Coli, их характеристика и свойства. Принцип и механизм транскрипции.

Ассиметричность считывания с цепей ДНК. Свойства и функции ДНКзависимой РНК-полимеразы E.Coli. Роль отдельных субъединиц. Понятие о корферменте, холоферменте, сборке субъединиц. Этапы транскрипции. Стадия узнавания и связывания фермента с матрицей, роль сигма-субъединицы в связывании. Понятие о двойных открытых и закрытых комплексах в цепи ДНК, тройные комплексы.

Тема 4.

1. Промоторные области, возможные механизмы узнавания их РНКполимеразой.

Изучение структуры промотора - работы по выделению и установлению первичной структуры промоторов. Бокс Прибнова. Эффективность промотора. Установление полной первичной структуры промотора гена тирозиновой РНК (Корано, 1977). Стадия элонгации транскрипции. Модель Иванова-Флорентьева. Стадия терминации транскрипции. Терминация зависимая и независимая от терминатора.

Тема 5.

1. Стадия рекогниции. Структура и состав рибосом эу- и прокариот. Роль ионов Mg2+, Mn2+, рРНК и белков отдельных субчастиц рибосом. Биосинтез и созревание рибосом у про- и эукариот. Процессинг рРНК и сборка субчастиц рибосом. Функциональные центры рибосом и их схематическое расположение, аминоациальные и пептидильные участки рибосом.

Образование пептидной связи на рибосомах. Пептидилтрансферазная реакция на рибосомах, Транслокация на рибосомах. Стадии инициации и факторы в ней участвующие.

Тема 6.

1. Понятие о регуляции активности генов у про- и эукариот. Ее роль в биологических процессах. Гистоны. как белки неспецифически регулирующие активность ДНК. Негистоновые белки как белки специфически регулирующие активность ДНК. Возможный механизм воздействия негистоновых белков на ДНК ядра клетки. Схема регуляции процессов трансляции и транскрипции по Жакобу, Моно, Львову (1961).

Взаимодействие белка-репрессора с геном-оператором. Структура lас-оперона E. Coli, ее промотора. Регуляция транскрипции у прокариотических организмов - схема негативной индукции, позитивной индукции, позитивной и негативной репрессии. Аттенуация. Регуляция процессов транскрипции у фага МS 2 и ФХ 174. Классификация генов в геноме эукариотической клетки.

Представление о быстрых умеренных и уникальных повторах. Представление о генах "домашнего хозяйства" и генах "роскоши". Представление об уникальных генах, имеющих специализированную функцию. Уникальных гены, обладающих общими функциями. Представление о множественных сгруппированных генах и множественных рассеянных генах.

2. Определение и структура ядерного генома эукариот. Размер эукариотического генома по числу нуклеотидных пар. Зависимость между количеством ДНК и эволюционной продвинутостью. Причины избыточности эукариотического генома. Классификация и характеристика гистоновых белков. Последствия мутаций в гистоновых генах. Понятие о служебных последовательностях.

Первые представление Г.П. Георгиева об организации транскрипции у эукариот и его модель. Гигантская ДНК-подобная РНК (дРНК), мРНК.

Процессинг мРНК по Г.П. Георгиеву. Структура и функции информофер.

Полиаденилирование и кепирование. Представление о строении скриптона по Г.П.ГЕОРГИЕВУ. Функциональные зоны. Гипотеза Г.П.ГЕОРГИЕВА о предрасположенности к развитию рака в рамках его схемы. Варианты встраивания вируса в геном. Характеристика эукариотического генома, уровни его компактизации. Недостатки, преимущества и неопределённые следствия избыточного количества ДНК у эукариот. Качественная и количественная характеристика всех классов повторов. Сплайсинг участие интронов и экзонов. Предполагаемая роль сплайсинга в антителообразовании. Регуляция процессов транскрипции у фага МS 2 и ФХ 174.

Тема 7.

1. Причины ошибок при синтезе ДНК, их количество in vitro. Этапы проверки ДНК при репарации. Функция ферментов репарации. Типы спонтанных и индуцируемых повреждений ДНК Последствия нарушений в системе репарации. Типы повреждений в ДНК (окисление, дезаминирование, алкилирование, образование тиминовых димеров, апуринизация). Системы репарации (прямая репарация, эксцизионная репарация). Нуклеотидная эксцизионная репарация (АТР-зависимый механизм удаления повреждений из ДНК). Представление о эксинуклеазе и её протомерах (uvrA, uvr В, uvr С).

Репарационная система ДНК человека. Репарация ошибок репликации ДНК.

Рекомбинантная (пострепликативная) репарация. SOS-репарация.

Тема 8.

1. Теории рака (канцерогенная генетическая вирусная, Льва ЗИЛЬБЕРА.

Представление об обратной транскрипции. Представление о ретровирусах и провирусах, их строении. Устройство генома ретровирусов (str3, str 5, gag, env, U5, U3, pol, onc, PB, LTR). Последствия кодирования тирозиновой протеинкиназы вирусным онкогеном (oncv). Условия превращения oncc в oncv. Представление о антионкогенах (генах-супрессорах) опухолей. Гены факторов роста, рецепторов факторов роста, как онкогены. Представление о белках – циклинах и циклин - зависимых протеинкиназах. Значение процесса сканирования ДНК перед репликацией. Роль белка гена p53 в апоптозе.

Гипотезы возникновения жизни (панспермия, абиогенез, биогенез). Роль Луи Пастера, Александра Опарина и Джона Холдейна в разработке гипотез возникновения жизни. Теория биопоэза Джона Бернала и стадии биопоэза.

Доказательства первой стадии биопоэза в опытах Стенли Миллера Представление о второй стадии биопоэза. Представление о третьей стадии биопоэза. Представление о эволюции пробионтов (первичных гетеротрофов).

Тема 9.

1. Предмет и задачи биотехнологии. Отрасли биотехнологии. Задачи медицинской биотехнологии. Молекулярно-биохимические основы генетической инженерии. Алгоритм создания генно-инженерного продукта.

Характеристика ферментов, применяемых в генной инженерии. Рестриктазы 1, дезоксирибонуклеотидилтрансфераза.

Тема 10.

1. Способы выделения ДНК из биологического материала. Количество ДНК и РНК в клетке. Выделение геномной ДНК. Получение высокомолекулярного препарата ДНК. Выделение и очистка РНК. Определение чистоты и нативности препарата ДНК. Пробоподготовка для выделения ДНК из биологического материала. Полимеразная цепная реакция как метод генной инженерии. Стадии, условия проведения. Состав реакционной смеси. Правила подбора праймеров для ПЦР. Амплификация РНК. Особенности проведения метода ПЦР и требования, предъявляемые к проведению анализа.

Чувствительность и специфичность реакции. Факторы, влияющие на чувствительность и специфичность ПЦР. Современные модификации ПЦРметода (мультипраймерная, гнездовая, количественная ПЦР). Другие амплификационные ДНК-технологии. Перспективные направления применения ДНК-диагностики (на основе ПЦР) в лабораторной службе.

Диагностика перинатальных инфекций. Онкодиагностика. Судебногенетическая экспертиза.

Тема 11.

1. Принципы конструирования гибридных молекул ДНК. Молекулярные векторы. Классификация. Плазмидные векторы, требования, предьявляемые к плазмидным векторам. Векторные молекулы на основе фага лямбда. Космиды.

Принцип клонирования в космидах. Рестриктазно-лигазный и коннекторный методы конструирования векторов. Способы внедрения ДНК in vitro.

Трансформация, трансфекция. Индукция компетентности. Методы отбора гибридных клонов.

Тема 12.

1. Методы обнаружения и исследования нуклеотидных мишеней: гибридизация с ДНК/РНК-зондами, гибридизация in situ, Саузерн- и Нозерн-блоттинг, рестрикционный анализ, биочипы и оптические сенсоры. Определение нуклеотидной последовательности ДНК путем секвенирования. Принцип секвенирования по Сэнжеру и Максаму-Гилберту. Пиросеквенирование.

Принципы химического синтеза олигонуклеотидов.

Тема 13.

1. Методы оценки экспрессии генов: иммунодиагностика. Радиоиммуный анализ.

История создания метода. Техника проведения анализа, радиоизотопные метки в РИА. Получение меченых антител. Применение РИА. Чувствительность, специфичность анализа.

2. Иммуноферментный и иммунофлуоресцентный анализ. Ферменты–метки и субстраты в ИФА. Гомогенный и гетерогенный, конкурентный и неконкурентный ИФА. Иммуноблоттинг (Вестерн-блоттинг).

Тема 14.

1. Генная терапия: основные подходы и перспективы развития. Генная терапия in vivo и in vitro. Аутологичная и неаутологичная генная терапия. Вирусные и невирусные способы доставки «терапевтического» гена в клетку.

Лекарственные средства на основе нуклеиновых кислот. Генная терапия:

антисмысловые нуклеотиды, рибозимы, интерференсные РНК – создание, способы доставки, клиническое применение в генной терапии.

2. Клонирование клеток. История клонирования. Клонирование эмбриональных и соматических клеток амфибий. Клонирование эмбриональных и соматических клеток млекопитающих. Применение продуктов клонирования (ксенотерапия, аутотрансплантация). Проблема клонирования человека и животных.

СОДЕРЖАНИЕ ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ

Тема 1. Введение в предмет. Структура и функция белков и нуклеиновых кислот 1. Вводное занятие: знакомство со структурой практикума. Обессоливание растворов фильтрованием через гель сефадекса G-25. Тест-контроли по лекциям курса МБ.

2. Ионообменная хроматография на карбоксиметилцеллюлозе. Тест-контроли по лекциям курса МБ.

3. Определение молекулярной массы белков фильтрованием через гель сефадекса G-100. Тест-контроли по лекциям курса МБ.

Тема 2. Название 1. Семинар «Молекулярная биология» № Тема 9. Предмет и задачи биотехнологии. Алгоритм создания генноинженерного продукта (рекомбинантного белка). Характеристика ферментов, применяемых в генной инженерии.

1. Вводное занятие. Организация и оборудование молекулярно-биологической лаборатории. Этапы получения рекомбинантного белка. Подбор праймеров для дизайна экспрессирующего вектора с использованием компьютерной программы (Oligo 6 и др.) Тема 10. Способы выделения ДНК из биологического материала.

Полимеразная цепная реакция как метод генной инженерии.

1. Структура и физико-химические свойства ДНК и РНК. Молекулярный анализ нуклеиновых кислот и изучение болезней человека. Основные приемы выделения нуклеиновых кислот: лизис мембран, депротеинизация, экстракция. Анализ нуклеиновых кислот: гель-электрофорез, спектрофотометрический и колориметрический методы. Хранение нуклеиновых кислот. Выделение нативной ДНК. Качественный и количественный анализ выделенной ДНК.

2. Полимеразная цепная реакция. Этапы, выбор условий амплификации.

Особенности амплификации ДНК ретровирусов. Амплификация с использованием «внешних» и «гнездовых» праймеров, мультипраймерная ПЦР, ПЦР в реальном времени. Клинико-диагностическое значение ПЦР.

Электрофорез в агарозном геле.

Тема 11. Принципы конструирования гибридных молекул ДНК.

Молекулярные векторы. Способы внедрения ДНК in vitro.

1. Молекулярные векторы: клонирующие, экспрессирующие. Принципы конструирования векторов. Способы индукции компетентности. Принципы культивирования клеток, культуральные среды. Подготовка компетентных клеток и трансформация. Подготовка селективной среды для отбора трансформантов.

Посев трансформированных клеток на селективную среду. Селекция гибридных клонов.

Тема 12. Методы обнаружения и исследования нуклеотидных мишеней.

Определение нуклеотидной последовательности ДНК путем секвенирования. Принципы химического синтеза олигонуклеотидов.

1. Анализ рестрицированных и амплифицированных фрагментов ДНК с использованием гель-электрофореза. Дизайн молекулярного вектора, подбор рестриктаз. Решение ситуационных задач по рестрикционному анализу и секвенированию. Химический синтез олигонуклеотидов для научных исследований (демонстрация).

Тема 13. Методы оценки экспрессии генов: иммунодиагностика.

Радиоиммуный анализ. Иммуноферментный анализ.

1. Определение титра иммуноглобулинов методом ИФА. Иммуноферментный анализ - молекулярные основы, принцип метода.

Тема 14. Генная терапия: основные подходы и перспективы развития.

Клонирование Проблема клонирования человека и животных.

1. Семинар: Генная терапия: современные подходы, перспективы развития.

Клонирование клеток.

2. Зачетное занятие. Доклады по актуальным вопросам биотехнологии (генная терапия, клеточные технологии, политические, этические, конфессиональные, юридические и методологические проблемы клонирования и др).

ПЕРЕЧЕНЬ ПРАКТИЧЕСКИХ УМЕНИЙ

по молекулярной биологии и биотехнологии После окончания изучения дисциплины «молекулярная биология и биотехнология» студент должен:

1. Иметь представления:

О строении и функционировании и способах регуляции генома про- и эукариот, методах их изучения, о методах генной инженерии и их использовании в медицинской биотехнологии, о остри развития молекулярной биологии и генной инженерии.

2. Знать:

• Принципы работы с геномными библиотеками, компьютерными программами по подбору праймеров и рестриктаз;

• способы получения и пробоподготовки биологического материала (кровь, сыворотка, мокрота, браш-биоптаты и др.) для молекулярно-биологических исследований;

• ферменты, используемые в генной инженерии (номенклатура, классификация, субстратная специфичность, условия функционирования);

• принцип чтения радиоавтографов при секвенировании ДНК по методам Сэнжера и Максама-Гилберта;

• способы выделения, разделения и очистки высокомолекулярных соединений (белков, нуклеиновых кислот);

3. Уметь:

• Приготовить инкубационную смесь для ПЦР и провести реакцию амплификации;

• Выделять нативную ДНК из биологического материала одним из известных методов, провести соответствующую пробоподготовку;

спектрофотометрическим методом;

• Приготовить агарозный гель и провести электрофорез в агарозном геле ПЦРамплифицированной ДНК;

• Выполнить рестрикционный анализ ДНК и оценить результаты;

• Читать радиоавтографы при секвенировании ДНК по методам Сэнжера и Максама-Гилберта;

• Подготовить компетентные клетки для трансформации, выполнить посев трансформированных клеток E.Coli на селективную среду и выделить гибридные клоны;

• Подготовить хроматографические колонки с сефадексом, провести хроматографию и обессоливание, оценить эффективность очистки и разделения белков;

• Выбрать рестриктазы и праймеры, необходимые для конструирования гибридной ДНК (вектора);

• Провести исследование сыворотки крови методом ИФА с использованием диагностической тест-системы;

4. Овладеть навыками:

• Расчета и приготовления концентрированных и рабочих растворов ?

• Расчета и построения калибровочных кривых • Выделения субклеточных органелл и определения активности маркерных ферментов субклеточных органелл

ЛИТЕРАТУРА

по дисциплине «Молекулярная биология и биотехнология»

1. Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. / Б. Глик, Д.

Пастернак. - М..: Мир, 2002. - 589 с.

2. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. / С.Н. Щелкунов. //?, 2005.-?.

3. Эллиот В., Эллиот Д. Биохимия и молекулярная биология.- Москва:

Издательство НИИ биомедицинской химии РАМН.- 2000.- 366 с.

4. Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярная биология.- Москва Медицинское информационное агенство. - 2003.- 544 с.

5. Коничев А.С., Севастьянова Г.А. Молекулярная биология. 2-ое издание учебник для студентов вузов. Москва, Издательcкий центр “академия” 388 C.

1. Сассон А. Биотехнология – Свершения и надежды. М., Мир. –1987, 411 с.

2. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. / Под редакцией С.Херрингтона, Дж.Макги. – М.: Мир.-1999. - 558 с.

3. Момыналиев К.Т. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе. Часть 1. / К.Т. Момыналиев, В.М. Говорун. // Клиническая лабораторная диагностика.-2000. - №4.- С.25-31.

4. Момыналиев К.Т. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе. Часть 2. / К.Т. Момыналиев, В.М. Говорун. // Клиническая лабораторная диагностика.-2000. - №5. - С.25-32.

5. Покровский В.В. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. / В.В. Покровский, Н.А. Федоров, Г.А. Шипулин, В.М. Безруков, Т.А.

Бектимиров, В.В. Блоха, А.Н. Куличенко.// Государственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации. Москва, 6. Спирина А.С., Гаврилова А.П. "Рибосомы. Общие разделы". М.: "Наука", 1978.

7. "Молекулы и клетки" (Вып.5)- "Мир"- 8. Зенгбуш П "Молекулярная и клеточная биология" - М.- 9. Волькенштейн А."Молекулы и жизнь" -М.- "Медицина"- 10. Инге-Вечтомов Т. "Введение в молекулярную генетику" - М.- "Высшая школа" - 1983.- 369 с.

МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ

«Молекулярная биология и биотехнология»

1. Учебные лаборатории кафедры биохимии и молекулярной биологии, лаборатория молекулярной биологии ЦНИЛ СибГМУ 2. Компьютерная программа «Oligo 6»

3. Учебный видеоролик «Полимеразная ценная реакция», слайд-ппроектор для лекционного сопровождения 4. Учебные пособия «Практикум по биотехнологии», «Практикум по молекулярной биологии», изданные сотрудниками кафедры Рабочая программа обсуждена и утверждена на заседании кафедры биохимии и молекулярной биологии «»2006 г.

Заведующий кафедрой профессор, доктор медицинских наук Серебров В.Ю.