[ «Методы общей и специальной микробиологии Учебное пособие 2006 Министерство образования и науки Российской федерации Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего ...»
Е.В. Никитина, О.А. Решетник
Методы общей и специальной микробиологии
Учебное пособие
2006
Министерство образования и науки Российской федерации
Федеральное агентство по образованию
Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Казанский государственный технологический университет»
Е.В. Никитина, О.А. Решетник
Методы общей и специальной микробиологии Учебное пособие Казань КГТУ 2006 1 УДК 57:576 ББК 22.3я7 Методы общей и специальной микробиологии: Учебное пособие. / Е.В.Никитина, О.А. Решетник; Казан. гос. технол. ун-т. Казань, 2006, 124 с.
Учебное пособие предназначено для студентов, обучающихся по специальности 260202 – «Технология хлеба, хлебобулочных и кондитерских изделий», 260301 – «Технология мяса и мясных продуктов», 260501 – «Технология продуктов общественного питания» при изучении дисциплин «Биология и микробиология», «Микробиология».
Написано в соответствии с действующими программами дисциплин «Микробиология» и «Микробиология мяса». Содержит теоретические вопросы морфологии, особенностей строения и функционирования микроорганизмов, описание методик исследования микроорганизмов, их обнаружения в пищевых продуктах. Рассмотрены практические вопросы изучение микроорганизмов с теоретическими основами. Наряду с основными методами изучения микробной клетки, специализированная часть учебного пособия включает подробные микробиологические рекомендации по методам исследования пищевых продуктов, с описанием культурально-морфологических и биохимических особенностей патогенных, условно-патогенных микроорганизмов.
Подготовлено на кафедре технологии пищевых производств.
Табл.5. Ил.26. Библиогр.: 8 назв.
Печатается по решению редакционно-издательского совета Казанского государственного технологического университета Рецензенты: В.П. Фролов, засл. деятель науки РФ и РТ д-р биол. наук, проф., зав. кафедрой ветеринарно-санитарной экспертизы КГАВМ;
В.И. Вершинина, канд. биол. наук, доцент кафедры микробиологии КГУ Е.В.Никитина, О.А. Решетник Казанский государственный технологический университет, 2006 г.
Содержание ВВЕДЕНИЕ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ И ПРАВИЛА
1.РАБОТЫ В НЕЙ 2. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ 2.1. Классификация питательных сред 3. МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ
4. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В
МИКРОБИОЛОГИИ
4.1. Морфология бактерий, структура и химический состав5. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
5.2. Техника посевов на плотные и жидкие питательные средыМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ
7. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ
7.1. Подсчет клеток в окрашенных препаратах (метод 7.2. Подсчет клеток микроорганизмов в счетных камерах 7.5. Определение количества жизнеспособных клеток путемМЕТОДЫ АНАЛИЗА ЧИСЛЕННОСТИ БАКТЕРИЙ В
РАЗЛИЧНЫХ ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
8.2. Учет численности КОЕ в воде и других жидкостях 8.3. Санитарно - микробиологический контроль оборудования, Микробиологическое исследование кисломолочных 8.8. Микробиологическое исследование колбасных изделийВВЕДЕНИЕ
В учебниках по микробиологии можно найти много интересного.Огромный мир микроскопических живых существ — вот предмет данной науки. По сравнению со взглядом любого человека на жизнь как на явление взгляд биолога, изучающего эту жизнь, будет ограничен, если не учитывать жизнь микроскопического мира. Существуют многие подходы к изучению микроорганизмов, утонченные методики, разнообразные способы анализа, схемы определителей для тех, кто интересуется выделением новых видов, и многое другое.
Объекты микробиологии объединяют между собой прежде всего их чрезвычайно малые размеры. Это создает трудности в их изучении и диктует необходимость специальных методов наблюдения, но, в то же время, позволяет микроорганизмам существовать в тонких пленочках вокруг частиц почвы, каплях воды, микроскопических щелях в горных породах, пищевых продуктах, прошедших обработку. Для исследования микроорганизмов необходимо освоение простейших методов работы с микроскопическими объектами и способов их выделения, культивирования и контроля их жизнедеятельности в различных средах.
1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ
И ПРАВИЛА РАБОТЫ В НЕЙ
Особенностью микробиологических работ является постоянное соприкосновение сотрудников лаборатории с заразным материалом, культурами патогенных микробов, зараженными животными и выделениями больных. Поэтому все сотрудники бактериологической лаборатории обязаны соблюдать правила работы, которые обеспечивают стерильность в работе и предупреждают возможность возникновения внутрилабораторных заражений.Микробиологические лаборатории обычно снабжены следующим оборудованием:
Биологические иммерсионные микроскопы с дополнительными приспособлениями и наборами необходимых красителей.
аналитические весы, аппаратура для фильтрования и др.
микробиологические шпателя, пинцеты, спиртовки и др.
Лабораторная посуда: пробирки, чашки Петри, флаконы, пипетками и др (рис.1).
Рис. 1. Посуда для культивирования микроорганизмов:
1- качалочная колба, 2- качалочная колба с отбойником, 3- коническая колба, Приборы для стерилизации оборудования, питательных сред и реактивов.
Необходимые средства пожарной и химической безопасности (огнетушителями, дезинфицирующими растворами и т. д.).
Основное правило в микробиологической лаборатории – правильная организация работы. При этом следует придерживаться следующего:
К работе в лаборатории допускаются лица после прохождения инструктажа по технике безопасности.
Все должны работать в медицинских халатах. Вход без халата воспрещен.
В лаборатории запрещается курить и принимать пищу.
Рабочее место должно содержаться в образцовом порядке, а личные вещи храниться в специально отведенных местах.
При случайном попадании биологического материала на стол и т. д.
это место необходимо тщательно вытереть дезинфицирующим раствором.
Результаты работы следует заносить в рабочий журнал.
После окончания работы следует вымыть руки.
Помещение лаборатории ежедневно до начала работы следует убирать влажным способом. Пыль с поверхностей протирают увлажненной тряпкой, смоченной дезинфицирующим раствором. После окончания работы стены, покрытые метлахскими плитками или окрашенные масляной краской, моют горячей водой с мылом или стиральным порошком. Полы моют 3-5% раствором дезинфектанта. Потолки, карнизы, верхнюю часть стен, окрашенные клеевой краской, не реже одного раза в неделю очищают от пыли пылесосом.
2. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях. Еще в 1930 году их было классифицировано не менее двух тысяч наименований, но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико, а их композиции создаются на определенных общих принципах. Для размножения любых бактерий необходимо обеспечить подходящее биофизическое окружение и биохимические питательные компоненты. Любая питательная среда должна соответствовать следующим требованиям: содержать все необходимые для роста питательные вещества в легко усвояемой форме; иметь оптимальную влажность, вязкость, рН, сбалансированной с высокой буферной емкостью и, по возможности, прозрачной.Для роста автотрофных бактерий потребности в питательных веществах довольно просты: вода, двуокись углерода и соответствующие неорганические соли. Например, бактерии рода Nitrobacter ассимилируют СО2 и получают энергию путем окисления нитритов в нитраты. Гетеротрофные бактерии получают энергию в результате окисления (диссимиляции) восстановленных углеродных соединений.
Гетеротрофные бактерии используют органические соединения в двух целях: во-первых в качестве источника энергии; при этом органическое вещество окисляется или расщепляется с высвобождением энергии и образованием ряда конечных продуктов типа СО2, органических кислот и др;
во-вторых в качестве субстратов, ассимилируемых непосредственно с образованием клеточных компонентов или для их синтеза в реакциях, требующих затрат энергии. Так, Escherichia coli способна к росту на простой среде, содержащей только глюкозу и неорганические соли. Молочнокислые же бактерии растут на сложных средах, содержащих в качестве добавок ряд органических соединений (витамины, аминокислоты и др.), которые клетки не в состоянии синтезировать самостоятельно. Такие соединения называются факторами роста. Организмы, которые нуждаются в их добавлении к ростовой среде, называются ауксотрофными по соответствующим соединениям.
Другая группа организмов, способная к росту на простых средах, содержащих источник углерода и энергии, а также набор основных биогенных элементов, получила название прототрофных. Следует учитывать и то, что в природе встречаются бактерии, которые способны размножаться в местах с низким пищевым потоком углерода – до 0,1 мг/л в день. Они получили название олиготрофных, противоположную группу для них составляют бактерии копиотрофные – способные к росту на богатых пищевых субстратах.
полусинтетические и синтетические.
растительного или животного происхождения, имеющих неопределенный химический состав. Примерами питательных сред такого типа являются среды, представляющие собой смесь продуктов распада белков (казеина, мышц млекопитающих), образующихся при их гидролизе. Кислотный (НСl) гидролиз белков используется для приготовления полных гидролизатов. Действие ферментов типа трипсина, панкреатина, папаина приводит лишь к частичному (неполному) гидролизу белков, в результате чего образуются пептоны. Как правило, на пептонных питательных средах микроорганизмы растут лучше, чем на питательных средах, приготовленных из полных гидролизатов или смесей аминокислот. При ферментативном гидролизе, вероятно, сохраняются лабильные факторы роста. Кроме того, многие микроорганизмы лучше размножаются на средах, содержащих небольшие пептиды, потому что их они могут усваивать непосредственно, а отсутствующие аминокислоты – нет.
Обычно в составе такой среды ферментативный гидролизат белка обеспечивает потребность в таких источниках азота, как аминокислоты, углеводы (глюкоза) и используется как источник углерода и энергии, соли удовлетворяют потребности бактерий в неорганических ионах, а дрожжевой экстракт неопределенного состава можно отнести и среды, полученные на основе растительного сырья: картофельный агар, томатный агар, отвары злаков, дрожжей, пивное сусло, настои сена и соломы и др. Основное назначение таких питательных сред – выделение, культивирование, получение биомассы и поддержание культур микроорганизмов.
полусинтетические. В такую среду вносят известные соединения как явно необходимые; а также добавляют небольшое количество дрожжевого или кукурузного экстракта (или любого другого природного продукта) для обеспечения неизвестных потребностей роста. Такие среды часто используются в случае промышленного культивирования биологических объектов для получения продуктов метаболизма.
представленные чистыми химическими соединениями, взятыми в точно указанных концентрациях и соотношениях отдельных элементов.
Обязательными компонентами таких сред являются неорганические соединения (соли) и углерод- и азотсодержащие вещества (типичными представителями являются глюкоза и (NH4)2SO4. Часто к таким средам добавляют буферные растворы и хелатирующие соединения. Ауксотрофные организмы растут на таких средах только при добавлении соответствующих факторов роста. Основное назначение таких питательных сред – изучение особенностей физиологии и метаболизма микроорганизмов, выделение генетических рекомбинантов и т. д.
По назначению среды разделяют на элективные и дифференциальнодиагностические. Элективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного или целой физиологической группы микроорганизмов. Например, для преимущественного выделения грамотрицательных бактерий бывает достаточным добавления в питательную среду трифенилметановых красителей (кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый и т. д.). Для выделения стафилоккоков в среду может быть добавлен хлористый натрий в концентрации 7,5 %. При этой концентрации рост других бактерий подавляется. Элективные среды применяются на первом этапе выделения чистой культуры бактерий, т. е.
при получении накопительной культуры.
Дифференциально-диагностические среды применяются для быстрой идентификации близкородственных видов микроорганизмов, для определения видовой принадлежности, в клинической бактериологии и др. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности и имеют неодинаковый набор ферментов, расщепляющих субстраты, входящие в состав питательной среды. В состав дифференциально-диагностической среды входят: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий; б) определенный химический субстрат, отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроорганизма; в) цветной индикатор, изменение окраски которого свидетельствует о биохимической микроорганизма. Например, среда Эндо позволяет отличить клоны, сбраживающие лактозу от клонов, не обладающих этим свойством. Основными компонентами этой среды являются питательный (пептонный) агар, углевод и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом (реактив Шиффа). Исходная питательная среда окрашена в розовый цвет. Микроорганизмы, не сбраживающие лактозу, образуют бесцветные колонии. При сбраживании лактозы до ацетальдегида последний реагирует с сульфитом и развивается красная окраска соответствующих колоний. Среда с эозином и метиленовым синим (среда Левина) в качестве индикаторов содержит эозин и метиленовый синий и исходно окрашена в черно-синий цвет. Клетки, осуществляющие брожение, образуют колонии, окрашенные в черный с металлическим блеском цвет, а колонии, не обладающие этим свойством, бесцветны. Подобные изменения окраски происходят потому, что красители присутствуют в среде не в виде самостоятельных соединений, а в виде комплексов с веществами питательной среды. При низких значениях рН эти комплексы выпадают в осадок, исходные же красители в этих условиях растворимы, при больших рН комплексы красителей бесцветны, тогда как метиленовый синий приобретает синюю окраску. Данная среда позволяет дифференцировать бактерии рода Escherichia от бактерий рода Proteus.
По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими, твердыми, сыпучими. Жидкие питательные среды получают при растворении в воде определенного необходимого набора питательных веществ, макро- и микроэлементов. По составу они могут быть как натуральными, так и синтетическими. Рост микроорганизмов в жидкой среде может происходить в периодической (закрытой) системе, в этом случае после инокуляции среды не происходит ни добавления, ни удаления каких-либо компонентов, кроме культивировании характерна постоянная подача свежих питательных компонентов со скоростью, равной скорости удаления среды (открытая система).
Среды в твердом состоянии в форме плотных гелей используются в бактериологии со времен Р. Коха. Наиболее важным преимуществом использования твердых сред является то, что на них можно выращивать микроорганизмы в виде колоний, образующихся из отдельных клеток популяции.
Приготовление твердых питательных сред достигается добавлением к жидким средам определенных уплотнителей, в качестве которых могут выступать агар, желатина, силикагель, каррагенан. Наиболее распространенным из уплотнителей является агар – полисахарид, выделяемый из красных морских водорослей и состоящий из двух полисахаридов – агарозы (70 %) и агаропектина. Он обладает рядом полезных свойств, в частности: 1) способен образовывать в воде гели; 2) плавится при температуре 100 °С и затвердевает при 45 °С ; 3) не расщепляется под влиянием ферментов большинства видов микроорганизмов; 4) термолабильные вещества и живые микроорганизмы не разрушаются при добавлении к нагретому до 45 °С расплавленному агару, если смесь сразу же охладить; 5) агаровые гели имеют высокую степень прозрачности; 6) обычно используемые концентрации 1,5-2,0 % являются относительно невысокими и их использование экономично.
Желатина – белок, приготовленный из кожи и костей, – в настоящее время используется для специальных целей, поскольку образуемый ею гель плавится при температурах около 25°С – 30°С. Кроме того, желатина разжижается протеолитическими ферментами многих микроорганизмов.
«Уплотняющая» концентрация желатины – 17 – 20 %.
Силикагелем называют двуокись кремния (SiO2). Его стерильный золь готовят из раствора силиката натрия и перед использованием, для того чтобы вызвать образование геля, к нему добавляют питательную среду, содержащую электролиты. Среды на основе силикагеля (1,5–2,0 %) используют для получения культур автотофных бактерий, так как при этом в среде отсутствуют органические вещества. При добавлении в такие минеральные среды различных органических веществ можно исследовать возможность использования их в качестве единственных источников углерода гетеротрофными бактериями. С помощью силикагелиевых сред также можно определять потребности бактерий в витаминах.
Каррагенан («растительная желатина») – добывается путем экстракции из определенных видов красных морских водорослей. Калиевые соли некоторых типов каррагенанов способны образовывать плотные (2 %) прозрачные гели, которые могут быть заменителями агара. Каррагенан значительно дешевле агара, не разрушается большинством видов бактерий.
Однако разливать приготовленные среды следует при высокой температуре – 55 °С – 60 °С.
Полужидкие среды содержат гелеобразующее вещество в низкой (0,3 – 0,7 %) концентрации и имеют мягкую желеподобную консистенцию. Такие среды пригодны для изучения подвижности и хемотаксиса клеток, культивирования микроаэрофилов.
Сыпучие среды представляют собой массу в той или иной степени измельченного и увлажненного сырья (чаще всего, растительного). Основное их назначение – использование в пищевой промышленности (получение соевого соуса или рисовой водки), сельском хозяйстве (силосование кормов) и т. д.
Определение состава питательной среды предполагает, что при этом будут учтены и такие биофизические факторы как рН среды, температура, подача и удаление молекулярного кислорода, являющиеся критическими для роста любой бактериальной культуры. Температура, аэрация и давление определяются условиями культивирования, окислительно-восстановительный потенциал зависит как от состава ростовой среды, так и от условий культивирования. Контроль окислительно-восстановительного потенциала особенно важен при культивировании облигатно-анаэробных бактерий.
В бактериологической практике чаще всего используются сухие питательные среды, которые получают в промышленных масштабах – триптические гидролизаты дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин) и питательный агар. Сухие среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке, имеют относительно стандартный состав.
3. МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ
уничтожении всех живых микроорганизмов и спор внутри или на поверхности предмета. Стерилизации подвергаются питательные среды, лабораторная посуда, инструменты, растворы и т. д. Можно выделить термическую и холодную стерилизацию.К методам термической стерилизации относят: прокаливание и обжигание в пламени спиртовки; кипячение; сухожаровую (горячим паром) стерилизацию; стерилизацию насыщенным паром под давлением (автоклавирование); дробную стерилизацию (тиндализацию), пастеризацию.
Прокаливание и обжигание в пламени – наиболее быстрые и доступные методы стерилизации. Однако их использование ограничивается только термоустойчивыми материалами. Такими методами стерилизуют бактериологические петли, иглы, шпатели, пинцеты, предметные и покровные стекла, фарфоровые ступки и другие инструменты.
дистиллированной воде стерилизуют мембранные фильтры. Режим стерилизации для мембранных фильтров – 30–60 мин с момента энергичного закипания воды. Металлические инструменты, мелкие стеклянные детали лучше всего кипятить в специальных закрытых приборах – стерилизаторах. В микробиологической практике таким способом стерилизации пользуются редко в связи с тем, что продолжительное кипячение может повредить обрабатываемый материал, а сокращение времени кипячения может не обеспечить стерильности.
Дробная стерилизация (тиндализация или стерилизация текучим паром) используется для стерилизации питательных сред и растворов, которые портятся при использовании температур выше 100 °С. Метод разработан в году Дж.Тиндалем и согласно этому методу жидкость доводят до 100 °С и продолжают выдерживать при этой температуре 10 мин. За это время все вегетативные клетки погибают, жизнеспособными остаются только споры.
Затем жидкость охлаждают до температуры, оптимальной для прорастания спор (30 °С) и через несколько часов снова пропускают пар. Двух-трех подобных циклов обычно бывает достаточно для уничтожения всех имеющихся спор. Эффективность этого метода особенно велика потому, что нагревание обычно приводит к активации спор. Тиндализацию проводят либо с помощью пара, подаваемого от внешнего источника, либо в специальных аппаратах.
Резервуар с кипящей водой расположен в нижней части аппарата, над ним расположена сетка с устанавливаемыми стерилизуемыми растворами.
Пастеризация заключается в однократном прогреве материала при температурах ниже 100 °С и направлена на уничтожение вегетативных клеток.
Этот метод широко используется в пищевой промышленности для обработки продуктов, которые теряют вкусовую и пищевую ценность при кипячении:
молока, ягодных и фруктовых сиропов, соков, вин, пива и т. д. В микробиологической практике пастеризацией пользуются для получения накопительных культур спорообразующих бактерий. В лабораторных условиях пастеризацию проводят либо на водяной бане либо в ультратермостате при следующих режимах: 60 – 70 °С в течение 15 – 30 мин; 80 °С - в течение 10 – 15 мин.
Сухожаровая стерилизация или стерилизация сухим горячим воздухом 160 – 170 °С на протяжении 2 часов. При этом предполагается, что погибают как клетки, так и споры. Таким способом стерилизуют стеклянную посуду, инструменты и др.
Стерилизация насыщенным паром под давлением или автоклавирование – один из наиболее эффективных методов стерилизации, так как стерилизуемый объект подвергается одновременному воздействию как высокой температуры, так и повышенному давлению пара. Погибают как вегетативные клетки, так и споры микроорганизмов. Процесс проводится в специальных приборах – автоклавах, закрывающихся герметично. Основные используемые режимы стерилизации следующие: 15 – 30 мин. при избыточном давлении 0,5 атм (температура достигает 110 – 112 °С); 15-45 мин при избыточном давлении 1, атм (температура достигает 121 °С); 10 – 30 мин при избыточном давлении 1, атм (температура достигает 126 °С). Таким способом стерилизуют питательные среды, растворы, посуду, инструменты, фильтры и т. д.
При холодной стерилизации используют химические вещества или проводят воздействие на объект факторами физической природы. Химические методы подавления жизнедеятельности микроорганизмов предполагают использование дезинфектантов и антисептиков, имеющих неспецифический эффект, либо использование антибиотиков и синтетических антимикробных препаратов с избирательным противомикробным действием.
Дезинфицирующие вещества классифицируются по группам: кислоты или щелочи, галогены, тяжелые металлы, четвертичные аммониевые основания, фенольные соединения, альдегиды, кетоны, спирты, амины и перекиси.
Устойчивость микроорганизмов к их действию может существенно меняться в зависимости от таких факторов как концентрация активного компонента, длительность контакта, рН, температура, влажность и присутствие органического вещества. Химические средства неспецифического действия используются для обработки помещений, оборудования, различных предметов.
Например, спирты используются в концентрации 60 – 70 % и эффективны в отношении вегетативных клеток. Фенолы и их производные применяются для дезинфекции помещений, дезинсекции.
Среди используемых летучих стерилизующих веществ можно указать на окись этилена, окись пропилена, озон, метилбромид, формальдегид, глютаровый альдегид. Указанные вещества могут быть использованы для стерилизации пластмассовых центрифужных пробирок, пластмассовых чашек Петри, оптических инструментов, сыворотки крови и др.
Стерилизация фильтрованием используется для веществ, которые не витаминов, углеводородов, антибиотиков, сыворотки). Способ заключается в пропускании жидкостей и газов через специальные мелкопористые фильтры (бактериальные), диаметр пор которых не превышает 0,45 – 0,2 мкм. Фильтры задерживают микроорганизмы благодаря поровой структуре их матрикса. Для пропускания раствора через фильтр требуется вакуум или давление.
Существуют два основных типа фильтров – глубинные и мембранные.
Глубинные состоят из волокнистых или гранулированных материалов, которые спрессованы, свиты или связаны в лабиринт проточных каналов. Частицы задерживаются в них в результате адсорбции и механического захвата в матриксе фильтра. Мембранные фильтры имеют непрерывную структуру и захват ими частиц определяется размером пор. Фильтры содержат различные природные (коалин, асбест, целлюлоза) или синтетические (производные целлюлозы) материалы. Различают фильтры: мембранные, получаемые на основе нитроцеллюлозы; асбестовые или фильтры Зейтца, получаемые на основе смеси асбеста и целлюлозы; фарфоровые или свечи Шамберлана, получаемые из смеси кварцевого песка и коалина, сплавленных между собой;
стеклянные, получаемых из стекла «Пирекс».
термолабильных материалов. Ультрафиолетовые лучи (250 – 270 нм) используются для стерилизации центрифужных пробирок, наконечников для пипеток, материалов из термолабильной пластмассы. Время облучения определяется мощностью лампы, временем воздействия, степенью и видовым составом микроорганизмов загрязненного материала. Вегетативные формы более чувствительны к облучению, чем споры, которые в 3 – 10 раз более устойчивы. От УФ-облучения микроорганизмы могут быть защищены органическими веществами, пылью или другими защитными оболочками.
Ограничением при использовании данного метода стерилизации является низкая проникающая способность УФ-лучей и высокая поглощающая способность воды и стекла. Рентгеновское и -облучение также эффективно для стерилизации пластмасс, пищевых продуктов, но требует строгого соблюдения правил безопасности. Наиболее чувствительны к -облучению вегетативные клетки бактерий, затем идут плесневые грибы, дрожжи, бактериальные споры и вирусы. В большинстве случаев для надежного уничтожения микроорганизмов стерилизации больничных принадлежностей, антибиотиков, витаминов, гормонов, стероидов, пластмассового разового оборудования, шовного и перевязочного материала.
На практике проводят и контроль стерилизации, при котором о работе стерилизующих агентов и аппаратов судят по: эффективности гибели спор в процессе стерилизации; прямым измерением температуры и с помощью химических индикаторов.
4. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В МИКРОБИОЛОГИИ
Основные задачи микроскопии:• выявление микроорганизмов в различных материалах.
• ориентировочная идентификация микроорганизмов в исследуемом образце.
• изучение некоторых морфологических признаков и структур микроорганизмов (например, капсул, жгутиков и т. д.).
• изучение окрашенных мазков из колоний и чистых культур.
Светлопольная микроскопия проходящем свете в светлом поле. Данный вид микроскопии предназначен для исследования морфологии, размеров клеток, их взаимного расположения, структурной организации клеток и других особенностей. Максимальная разрешающая способность светового микроскопа (рис. 2) составляет 0,2 мкм (минимальное расстояние, при котором различимы два объекта). Общее увеличение складывается из произведения увеличений объектива и окуляра.
Разрешение микроскопа можно увеличить за счет увеличения коэффициента преломления (иммерсии). В микроскопии применяют несколько иммерсионных систем: масляную, глицериновую, водную.
При работе с микроскопом Биолам производят следующие действия:
Осветитель устанавливают под конденсором в специальном гнезде в основании микроскопа. При этом необходимо снять зеркало, поднять до упора конденсор, отвести в сторону дополнительную линзу конденсора. Затем, перемещая патрон осветителя, добиваются наиболее интенсивного и равномерного осветления поля зрения. Для этого используют суховоздушный объектив малого увеличения (х8).
В центральной части столика микроскопа устанавливают препарат.
Если дальнейшие исследования проводят с суховоздушным объективом (х40), то следует прикрыть диафрагму конденсора, перевести револьвер микроскопа на данное увеличение и опустить вниз тубус микроскопа с помощью микровинта до появления в поле зрения микроскопа исследуемых объектов.
Если исследования проводятся с помощью иммерсионной системы (увеличение х90), то в центр препарата следует нанести каплю иммерсионного масла, осторожно перевести объектив микроскопа вниз таким образом, чтобы дотронуться до предметного стекла. Затем, глядя в окуляр, поднять объектив вверх с помощью макровинта до появления в поле зрения микроорганизмов. С помощью микровинта добиваются максимальной четкости изображения.
После просмотра всех препаратов следует снять масло с иммерсионного объектива, перевести микроскоп на малое увеличение, снять осветитель, опустить конденсор и тубус микроскопа вниз до упора. Хранить микроскоп следует в условиях, предотвращающих попадание пыли на линзы.
4.1. Морфология бактерий, структура и химический состав Морфологические типы бактерий, в сравнении с высшими организмами, немногочисленны. Клетки большинства бактерий имеют сферическую, цилиндрическую или извитую форму, но существует небольшая группа мицелийобразующих форм, нитчатых бактерий и бактерий, образующих выросты. В соответствии с этим все бактерии по форме разделяются на следующие группы (рис.3).
Кокки (сферические) клетки могут быть одиночными (микрококки), парными (диплококки, например, нейссерия); тетракокки, располагающиеся по 4 в форме квадратов; пакетообразные кокки, располагающиеся «этажами»
бесформенные скопления в виде виноградных гроздьев (стафилококки).
Диаметр клеток – 1 – 2 мкм.
Палочковидные бактерии – наиболее многочисленная группа, клетки представляют собой цилиндрические структуры. Размеры таких клеток сильно варьируют и могут быть от сотых долей до 5 – 10 мкм. Такие бактерии часто образуют пары или цепочки клеток (например, палочка сибирской язвы), но могут быть и одиночными (например, энтеробактерии).
Извитые бактерии могут быть трех типов: вибрионы, спириллы и спирохеты. Вибрионы – бактерии, изогнутые в виде запятой (холерный вибрион, кампилобактер); спириллы имеют несколько крупных завитков (возбудитель возвратного сыпного тифа); спирохеты имеют вид тонких спиралевидных клеток со множеством завитков и петель (возбудитель сифилиса).
Нитчатые бактерии – это цепочки (трихомы) из цилиндрических, овальных или дисковидных клеток. Типичными представителями данных бактерий являются бактерии, окисляющие серу (Beggiatoa, Thiotrix).
К бактериям, образующим выросты, относятся почкующиеся и стебельковые бактерии. Выросты – это выпячивания клеточного содержимого, окруженного клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной и не отделенные от клетки перегородкой. У некоторых бактерий выросты служат для размножения, у других – для прикрепления к субстрату или друг к другу.
Рис. 3. Разнообразие форм прокариот: 1 — кокк; 2 — диплококк; 3 — сарцина;
4 — стрептококк; 5 — колония сферической формы: 6 — палочковидные бактерии (одиночная клетка и цепочка клеток); 7 — спириллы; 8 — вибрион; — бактерии, имеющие форму замкнутого или незамкнутого кольца; 10 — бактерии, образующие выросты (простеки); 11 — бактерия червеобразной формы; 12 — бактериальная клетка в форме шестиугольной звезды; 13 — представитель актиномицетов; 14 — плодовое тело миксобактерии; 15 — нитчатая бактерия рода Caryophanon с латерально расположенными жгутиками: 16 — нитчатая цианобактерия. образующая споры (акинеты) и гетероцисты; 8, 15, 17, 18 — бактерии с разными типами жгутикования; 19 — бактерия, образующая капсулу; 20 — нитчатые бактерии группы Sphaeroillus, заключенные в чехол, инкрустированный гидратом окиси железа; 21 — Кроме выше перечисленных, известны бактерии, которые не имеют одновременно обнаружить сферические, эллипсовидные, грушевидные, дисковидные и даже разветвленные и неразветвленные нитчатые формы.
Архебактерии представляют собой группу бактерий с клеточной стенкой уникальной структуры, содержащей специфические химические соединения.
Морфологически они могут быть неправильной формы, сферическими, палочковидными.
К мицелийобразующим бактериям относятся истинные актиномицеты, которые имеют сильно разветвленный мицелий. У нокардий и микобактерий мицелий является временным и возникает на определенных стадиях роста. У коринеподобных бактерий клетки имеют только тенденцию к ветвлению, но при росте культуры наблюдается плейоморфизм клеток. Более подробная их характеристика дана ниже.
Миксобактерии, или скользящие бактерии. Это группа бактерий, стоящих на более высокой ступени эволюционного развития, чем описанные выше. У отдельных представителей миксобактерии (Sorangium, Polyangium) даже в световой микроскоп четко видно дифференцированное ядро.
Вегетативные клетки имеют палочковидную форму с заостренными или округлыми концами. По мере старения они укорачиваются и переходят в миксоспоры, соединяющиеся впоследствии слизью и образующие первичные и вторичные цисты. Из последних в дальнейшем формируются плодовые тела.
развившиеся вокруг комочков почвы на гелевых пластинах, на которых единственным источником углерода служит целлюлоза.
Актиномицеты (от греч. aktis — луч, mykes — гриб) — лучистые грибы (рис. 4). Эта группа микроорганизмов занимает промежуточное положение между бактериями и грибами, поэтому ее представителей называют грибобактериями.
Они одноклеточные, как бактерии, но образуют мицелий, как грибы;
диаметр нитей у них очень мал, как у бактерий (не более 0,5— 0,8 мкм), но гифы мицелия длинные и ветвистые, как у грибов. У актиномицетов длина ветвящихся нитей достигает нескольких миллиметров, мицелий грибов в длину — нескольких сантиметров. С грибами актиномицетов объединяет также способность размножаться спорами.
Рис. 4. Актиномицеты (а); нокардии (б); микобактерии (в).
бархатистые, мучнистые, преимущественно плотные кожистые колонии, срастающиеся с субстратом, иногда имеющие характерный землистый запах. Мицелий актиномицетов на питательных средах дифференцирован:
одна часть его погружена в субстрат (субстратный мицелий), другая находится над субстратом (воздушный мицелий).
Многие представители актиномицетов продуцируют пигменты, поэтому их воздушный мицелий и особенно колонии окрашены в голубой, синий, фиолетовый, розовый, бурый, коричневый или черный цвета. Актиномицеты, образующие диффундирующие в питательную среду пигменты, окрашивают ее в соответствующие цвета.
Чтобы выявить характерные морфологические признаки колоний актиномицета, сначала следует рассмотреть их при малом увеличении непосредственно на питательной среде на чашках Петри или по краю колонии в пробирке. При этом можно видеть, что гифы мицелия частично внедряются в субстрат, частично стелются по поверхности и приподнимаются над ней. На концах нитей воздушного мицелия хорошо просматриваются спороносцы со спорами. Спороносцы по строению бывают прямыми, волнистыми, спиральными и мутовчатыми.
Затем готовят фиксированный, окрашенный фуксином, препарат. Для этого на предметное стекло наносят кусочек колонии актиномицета вместе со средой, чтобы захватить не только воздушный, но и субстратный мицелий.
Вторым предметным стеклом плотно прижимают этот кусочек к стеклу, раздавливают и размазывают по стеклу. Далее препарат сушат, фиксируют, красят. На фиксированном окрашенном препарате дифференциации мицелия не видно, как правило, не видны и споры, однако четко просматриваются мицелиальные одноклеточные нити.
Много общего с актиномицетами имеют нокардии (рис. 4), или проактиномицеты.
Нокардии - это наименее дифференцированные формы актиномицетов.
Воздушный мицелий у них отсутствует или развит слабо. На питательных средах развиваются колонии тестообразной (мягкой) консистенции с характерным мицелиальным ободком. Окраска их так же разнообразна, как и у нокардиеформных актиномицетов. В молодом возрасте проактиномицеты образуют мицелий, который вскоре начинает септироваться (в нитях образуются перегородки) и расчленяться на палочковидные фрагменты, в дальнейшем переходящие в укороченные палочки, но чаще — в кокки.
Для знакомства с проактиномицетами можно воспользоваться чистой культурой Nocardia rubra, образующей красные (от лат. ruber— красный) колонии.
Микобактерии — это палочковидные, иногда ветвящиеся, образующие подобие мицелия бактерии (рис.2, в). Настоящего мицелия микобактерии не имеют. Колонии тестообразной консистенции, продуцируют пигмент. В молодой культуре формируются палочки искривленной формы с неровным контуром — звездообразные, иногда довольно длинные, с боковыми отростками. В старых культурах ветвистые палочки часто распадаются сначала на более короткие палочки, затем — на кокки.
Объектами микробиологии служат многие виды микроскопических грибов. С некоторыми их представителями знакомятся на практических занятиях.
Грибов относят к эукариотам. Тело гриба состоит из мицелия, или грибницы, — сплетения тонких ветвящихся нитей — гиф.
Зигомицеты. Низшие грибы, имеют хорошо развитый ветвистый одноклеточный мицелий. Размножаются как половым путем, так и бесполым, т. е. при помощи спор.
Представитель класса — мукор (Мисоr mucedo) развивается в виде войлочного белого или серого налета на продуктах растительного происхождения и навозе травоядных животных.
Мицелий мукоровых грибов пронизывает субстрат и частично стелется по его поверхности. Вверх от грибницы отходят особые воздушные гифы — спорангиеносцы, вздувающиеся на концах. Вздутия представляют собой спорангии, в дальнейшем они отделяются от спорангиеносцев перегородкой.
В спорангиях бесполым путем образуются многочисленные спорангиоспоры — эндоспоры (от греч. endon — внутри).
Перегородка, отделяющая спорангий от спорангиеносца, расположена куполообразно, поэтому верхняя часть спорангиеносца оказывается внутри спорангия. Этот участок спорангиеносца называется колонкой и у разных видов мукоровых грибов имеет различную форму (грушевидную, шаровидную, цилиндрическую) (рис.5).
препаровальной иглой снять его на сухое предметное стекло. Препарат сначала рассматривают без покровного стекла при малом увеличении микроскопа.
Видны спорангиеносцы и круглые темные шарики на их концах — спорангии. Обычно они покрыты тонкими шипами из кристаллов оксалата кальция. Затем на поверхность препарата наносят каплю воды, накрывают его покровным стеклом. Оболочка спорангия при этом разрушается, и споры выпадают. Препарат рассматривают последовательно при малом и большом увеличениях (без иммерсии).
а - Мисог, б - Aspergillus; в - Penicillium; г - Fusarium, конидиеносец с конидиями: 1 - макроконидии, 2 - микроконидии; д - Trichoderma (конидиеносцы с головками конидий; е - Alternaria, конидиеносцы с Представители рода Мисоr (рис. 5) могут быть выделены из почвы при посеве пылевидных ее частиц на поверхность сусло-агара в чашках Петри или из свежего конского навоза, помещенного на 3—4 дня под стеклянный колпак на тарелку с влажной фильтровальной бумагой или сырым песком.
Аскомицеты, или сумчатые грибы Высшие грибы с многоклеточным или членистым мицелием, образующие споры в сумках — асках. Они включают представителей эуаскомицетов (истинных аскомицетов), у которых сумки со спорами формируются в результате полового процесса на поверхности или внутри плодовых тел, образуемых сплетением гиф мицелия (возможно бесполое размножение экзогенно возникающими спорами — конидиями), и гемиаскомицетов, у которых плодовые тела отсутствуют. К гемиаскомицетам относят большинство дрожжей, рассматриваемых отдельно.
Эуаскомицеты включают два важнейших рода почвенных грибов — Penicillium и Aspergillus, которые нередко называют также плесневыми грибами (рис.6). К группе плесневых относят и некоторых представителей зигомицетов и несовершенных грибов.
Пенициллы и аспергиллы имеют хорошо развитый многоклеточный мицелий. Размножаются преимущественно конидиальным спороношением.
Наблюдаются в виде налета голубого, зеленого, сизого, реже других цветов на продуктах растительного происхождения (варенье, томатная паста, лимон и апельсин), отсыревших изделиях из кожи, обоях. Распространены в верхних горизонтах почвы.
а — Ризопус: 1 — спорангий; 2 — споры; 3 — спорангиеносец; 4— ризоиды;
б — Аспергиллус: 1 — конидии; 2 — стеригмы; 3 — конидиеносец; 4 — вегетативные гифы;
в — Пенициллиум: 1 — конидии; 2 — стеригмы 3 — конидиеносец; 4 — вегетативные гифы;
г — Оидиум: 1 — оидии; 2 —гиф;
д— Ботритис: 1, 2 — конидиеносец; 3 — конидии;
е — Альтернария: 1 — конидиеносец; 2 — конидии.
Грибы рода Penicillium (рис.6, в) называют кистевиками, так как они образуют конидии на концах мутовчаторазветвленных конидиеносцев, напоминающих кисть руки. Иногда отдельный пучок конидиеносцев, выходящих из одной точки и отчленяющих конидии, напоминает рисовальные кисти.
Для рассмотрения строения конидиеносцев Penicillium glaucum препаровальной иглой вырезают кусочек мицелия (приблизительно 0,5 мм2) на границе между его зеленым и белым участками. (Гриб к занятию выращивают в чашке Петри; старые грибы с полностью зеленым мицелием не годятся для просмотра). Осторожно с помощью двух препаровальных игл кусочек мицелия снимают со среды и помещают в каплю воды на предметное стекло.
Сверху на мицелий кладут покровное стекло. Поскольку мицелиальная пленка гриба довольно толстая, может получиться так, что под покровным стеклом вода не будет целиком окружать исследуемый мицелий. В этом случае надо из капельницы добавлять воду под покровное стекло до тех пор, пока кусочек мицелия не будет со всех сторон окружен водой. Затем слегка надавливают на покровное стекло в центре стеклянной палочкой (или препаровальной иглой). Избыток воды можно удалить фильтровальной бумагой.
Препарат сначала просматривают при малом увеличении, уделяя основное внимание его краям, так как на них обычно хорошо видны кисти конидиеносцев. Когда подходящий участок найден, переходят с объектива 8х на объектив 40х и детально рассматривают кисточки. Во время просмотра при малом увеличении конденсор опускают, при переводе на объектив 40 х снова регулируют освещенность поднятием конденсора.
Aspergillus, конидиеносцы шаровидно, булавовидно или грушевидно вздутые (рис. 6).
На них располагаются параллельно друг другу короткие кеглеобразные стеригмы, каждая из которых отшнуровывает радиально цепочки конидий.
Некоторые виды аспергиллов имеют два ряда стеригм. Вся головка конидиеносца с радиально расходящимися цепочками конидий напоминает наконечник лейки со струйками воды.
Для ознакомления со строением конидиеносцев аспергилла на примере Aspergillus niger препаровальной иглой берут небольшое количество мицелия на границе между черным и коричнево-бурым участками колонии и вносят в каплю воды на предметном стекле. Далее поступают так же, как и при просмотре пеницилла. В начальной стадии спорообразования Aspergillus покрываются стеригмами, на которых развиваются споры. В результате получаются так называемые кудрявые головки. От мукора аспергилл всегда можно отличить наличием таких головок. У мукора головки гладкие — «лысые», так как споры его эндогенного происхождения (внутренние), а у аспергилла и пеницилла — экзогенные споры (внешние).
Дейтеромицеты, или несовершенные грибы имеют многоклеточный мицелий, но у них нет полового процесса и совершенной стадии спороношения. Размножаются бесполым путем при помощи конидий или вегетативно участками гифов. В природе широко распространены представители родов Fusarium, Trichoderma, Alternaria, которых формально относят к дейтеромицетам. Встречаются они на растительных остатках плодах, семенах и в почве.
Среди грибов рода Fusarium есть сапротрофы, живущие в почве и на растительных остатках, и паразиты, вызывающие заболевания многих видов растений (увядание, гнили корней, стеблей, плодов, полегание сеянцев древесных и кустарниковых пород, болезни семян, различные пигментации органов растений).
Колонии отдельных видов фузариума на питательных средах (на суслоагаре) разнообразны по структуре: они могут быть рыхлыми, ватообразными, пушистыми, паутинистыми или плотными пленчатыми. Колонии бывают белые или различных тонов розового или желтого цветов. Нередко питательная среда также окрашивается в разные цвета и оттенки от розового до коричневого.
Фузариумы характеризуются большим разнообразием ферментов, благодаря которым могут использовать в качестве источников питания различные вещества, некоторые виды даже способны усваивать клетчатку.
рассматривая его под микроскопом, можно увидеть более или менее разветвленные конидиеносцы и очень характерные для фузариума конидии, так называемые макроконидии. Они заострены на концах, продолговатые, (напоминают бананы). У многих видов фузариума образуются, кроме того, овальные мелкие бесцветные, чаще одноклеточные, микроконидии.
Грибы рода Trichoderma нередко можно обнаружить на коре, древесине, засохших листьях и стеблях, а также на семенах различных трав, кустарников и деревьев; их легко выделить из почвы на подкисленном сусло-агаре. Через 2—3 дня инкубации при 23—25 °С на поверхности среды появляется сначала белый, затем с оттенками зеленовато-желтого цвета рыхло клочковатый и войлочный налет, образованный мицелием и скоплением конидиеносцев. С микроскопа видны прямостоячие, многократно супротивно разветвленные конидиеносцев расположены шаровидные головки, каждая из которых состоит из 10—20 одноклеточных бесцветных конидий. Представители этого рода энергично разрушают белковые соединения и разнообразные углеводы.
Обладая антибиотическими свойствами в отношении других грибов, в том числе паразитических, триходерма выполняет оздоровляющую функцию в почве.
Разные виды рода Alternaria (рис.6) можно выделить с листьев, пораженных этим грибом, растений картофеля или томата, с семян капусты и (обратнобулавовидным) строением многоклеточных грушевидных конидий, соединенных цепочками. У каждой — 3—9 поперечных и одна или несколько продольных перегородок. Конидиеносцы, являясь боковыми ответвлениями мицелия, имеют вид простых или слаборазветвленных одноклеточных, иногда многоклеточных веточек. Колонии на сусло-агаре сначала светлые, пушистые, затем зеленовато-серые или оливково-черные, бархатистые или ворсистые, нередко с ясно выраженной концентрической зональностью; иногда колонии с самого начала сажисто-черные, уплощенные, во многих случаях темный пигмент диффундирует в среду.
Дрожжи По современным представлениям, дрожжи — это сборная группа одноклеточных микроскопических организмов, относящихся к разным классам грибов, преимущественно — к классу аскомицетов.
Диаметр клеток дрожжей колеблется от 8 до 15 мкм. Форма их разнообразна: эллипсовидная, грушевидная, округлая, цилиндрическая.
Размножаются вегетативным и половым путем. Вегетативные способы размножения — почкование и деление; половой способ размножения связан с образованием спор. К почкующимся дрожжам относятся представители «культурных» дрожжей рода Saccharomyces (сахаромицеты), к делящимся — виды рода Schizosaccharomyces (шизосахаромицеты). При половом процессе слияние вегетативных клеток ведет к образованию сумок со спорами или сначала могут сформироваться споры, которые в последующем копулируют друг с другом. В каждой сумке образуется от 2 до 8, иногда 12 спор. Среди дрожжей есть аспорогенные, ложные дрожжи, не способные к половому процессу и спорообразованию. Они относятся к классу несовершенных грибов.
Schizosaccharomyces pombe (schizo — рваться, делиться, saccharomyces — сахарный гриб, pombe — название африканского напитка, из которого этот организм выделен). Дрожжам размножение делением несвойственно, спорообразованием, что характерно для сумчатых грибов. Schizosaccharomyces pombe рассматривают на фиксированных, окрашенных препаратах Это цилиндрической формы крупные клетки с округлыми концами.
Размножение делением свойственно также дрожжам рода Endomyces. Из почкующихся дрожжей наиболее «одомашнены» дрожжи пекарские — Saccharomyces cerevisiaе. Форма их разнообразна. Размножаются они почкованием (вегетативный способ размножения) и аскоспорами. При почковании на материнской клетке возникает маленькая выпуклость — почка — дочерняя клетка, в которую переходит одно ядро. Клетка увеличивается в размерах и отделяется. Если условия для такого размножения благоприятны (достаточное количество сахара, соответствующая температура, аэрация), процесс идет очень быстро. У некоторых представителей рода клетки после почкования не успевают разъединяться и возникает псевдомицелий (ложный мицелий).
Для лабораторных занятий могут быть использованы пекарские дрожжи.
Небольшой кусочек дрожжевой массы за несколько часов до занятий помещают в теплую подсахаренную воду и ставят в теплое место. Образуется беловатая мутная жидкость. Каплю этой жидкости наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом, сверху наносят каплю кедрового масла и просматривают препарат с иммерсионной системой. Клетки хорошо видны и при меньших увеличениях.
В пекарских дрожжах обычно присутствуют две расы: одна представлена округло-эллипсовидными клетками, быстро разъединяющимися при почковании; другая — удлиненно-цилиндрическими, образующими при почковании ветвистые кустики (псевдомицелий). На многих клетках видны почки. В мелкозернистом содержимом живых дрожжей хорошо заметны крупные прозрачные вакуоли, занимающие иногда центральное положение.
С представителями аспорогенных дрожжей, размножающихся только почкованием и не образующих спор, можно познакомиться на примере Candida kefiri. Их клетки мелкие, диаметром около 5 мкм.
Размножение у дрожжеподобных организмов может происходить также в результате распада гиф на отдельные клетки — оидии, или артроспоры, как у Geotrichum candidum (Oidiutn lactis).
В микробиологической практике для изучения морфологии бактерий и микромицетов используют неокрашенные препараты (нативный материал) или окрашенные препараты (мазки), приготовленные из естественных образцов либо из колоний выросших микроорганизмов.
Нативные препараты готовят для исследования живых неокрашенных бактерий. Наиболее распространенными являются методы «висячей капли», «раздавленной капли», микрокамеры с плотными средами. Для прижизненного изучения бактерий часто используют фазово-контрастную и темнопольную микроскопию.
Препарат «раздавленная капля» готовят на предметном стекле, на которое наносят каплю воды или водного раствора метиленового синего 1:40. В нее стерильной бактериологической петлей вносят небольшое количество исследуемой культуры, эмульгируют и накрывают покровным стеклом.
Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Если исследуют бульонные культуры, то на предметное стекло наносят непосредственно ее каплю. Препарат микроскопируют с увеличением х40.
наблюдении за ростом и развитием микроорганизмов. Небольшая капля бактериологической петли на стерильное покровное стекло. Стекло переворачивают каплей вниз и накладывают на лунку специального предметного стекла. Капля должна свободно висеть в лунке, не затрагивая ее краев и дна. Для создания влажной камеры и предохранения от высушивания, края лунки смазывают вазелином. Микроскопируют также как и препарат «раздавленная капля».
Микрокамеры с плотными средами готовят на стерильных предметных стеклах с тонким слоем питательного агара. С помощью пастеровской пипетки наносят бактерии. Обрезают агар вокруг выбранной области, кладут сверху покровное стекло. Для предотвращения высыхания такие препараты либо инкубируют в закрытой камере, либо герметизируют щели между стеклами путем заливки парафином или воском.
Фиксированные препараты Окрашенные препараты бактерий готовят в следующей последовательности.
Приготовление мазка: на чистое и обезжиренное предметное стекло наносят культуру исследуемого микроорганизма, тщательно размешивают и распределяют полученную суспензию по поверхности стекла. Для приготовления отпечатка вырезают блок агара, помещают на покровное стекло бактериями вниз и резко прижимают блок к стеклу, после этого препарат сразу же фиксируют.
Высушивание мазка проводят при комнатной температуре.
(фламбирование), т. е. над пламенем горелки. Хотя данный метод фиксации и является достаточно грубым, но сохраняет морфологию и отношение бактерий к красителям. Препарат проносят 2 – 4 раза над пламенем спиртовки мазком вверх (стекло должно нагреться до такой степени, чтобы при прикосновении к тыльной стороне ладони вызывало легкое жжение). Фиксация мазка преследует следующие цели: а) инактивировать микроорганизмы; б) закрепить их на поверхности стекла и предотвратить их смывание при последующем окрашивании; в) повысить восприимчивость клеток к красителям.
фиксирующие растворы, бактерий и стабилизирующие макромолекулы путем химического их сшивания.
Наиболее часто применяют формалин, спирты, жидкость Карнуа, ацетон и др.
Мазки фиксируют, помещая в раствор фиксатора или нанося на мазок.
Окрашивание препаратов проводится с помощью красителей, которые можно разделить на:
• позитивные (метиленовый синий, фуксин) и негативные (нигрозин).
Позитивными называются красители, окрашивающие микроорганизмы и другие находящиеся на стекле фиксированные объекты, негативными – красители, заполняющие пространство, окружающее микроорганизмы, в результате чего последние становятся видимыми в виде силуэтов на фоне красителя;
толуидиновый синий, азур). Кислые красители связываются с веществами, имеющими щелочную реакцию (например, цитоплазматическими белками), щелочные – связываются с базофильными (кислыми) компонентами клеток (нуклеиновыми кислотами, рибосомами).
Основные цвета окрашивания могут быть следующими: красный (основной фуксин, кислый фуксин, сафранин, конго красный); фиолетовый (генциановый фиолетовый); синий (метиленовый синий, толуидиновый синий, водный синий); зеленый (малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый).
Способность клеток воспринимать различные красители отражает их тинкториальные клеточной стенки.
Методы окрашивания бактериальной клетки Выделяют простые и сложные (дифференцирующие) методы окраски.
Простыми методами окрашивания называют окрашивание препаратов каким-либо одним красителем. Чаще всего при этом используется фуксин, генциановый фиолетовый, метиленовый синий. В случае использования негативных красителей среда, в которой находятся микроорганизмы, становится полупрозрачной; в результате клетки, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частицы на равномерно окрашенном фоне.
Некоторые микроорганизмы, например спирохеты, плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями. Споры имеют вид преломляющих свет включений в вегетативной клетке.
Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки, которые лежат над кюветой. На мазок наносят 1 % водный раствор фуксина или метиленового синего на 1 – 2 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя не подсыхал. После завершения окрашивания препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем препарат высушивают, промокая его фильтровальной бумагой, наносят на окрашенный сухой мазок каплю иммерсионного масла и микроскопируют с иммерсионной системой.
При сложных методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие дополнительными. Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др. С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические вещества, включения и т. д.).
Окраска по методу Грама является самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и йода, либо терять его после обработки спиртом (рис.7). Соответственно выделяют грамположительные (Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, etc.) и грамотрицательные (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia, etc.) формы.
Рис. 7. Клеточная стенка грамположительных (А) и грамотрицательных (Б) эубактерий:1 — цитоплазматическая мембрана; 2 — пептидогликан; 3 — периплазматическое пространство; 4 — наружная мембрана: 5 — цитоплазма, в Техника окраски по Граму: 1. Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги и на него наносят карболовый раствор генцианового фиолетового. Окрашивание проводят на протяжении 1 – 2 мин.
2. Бумажку снимают, краситель сливают и, не промывая препарат водой, обрабатывают его на протяжении 1 – 2 мин раствором Люголя до почернения.
3. Сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96є этиловым спиртом (препарат несколько раз помещают в стакан со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек). Обесцвечивание проводят не более 45 с.
4. Препарат промывают водой.
5. Мазок дополнительно окрашивают на протяжении 2 – 3 мин водным раствором фуксина.
6. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной системой.
грамотрицательные – в розовый.
Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена отражает особенности некоторых микобактерий и нокардий. Эти бактерии не используются фенол, детергенты или нагревание, то окрашенные клетки получить удается. В этом случае окраска клеток сохраняется даже при последующем обесцвечивании в смеси кислота-спирт. Кислотоустойчивость обусловлена большим содержанием в клетке сложных липидов, в частности, миколовых кислот.
Техника окраски: 1. Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги и на него наносят карболовый раствор фуксина, приготовленный по Цилю.
2. Мазок с красителем 2 – 3 раза подогревают до появления паров, держа его в пламени спиртовки.
3. Препарату дают остыть, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и промывают водой.
4. Окрашенный мазок обесцвечивают 5 % раствором серной кислоты (препарат помещают 2 – 3 раза в стаканчик с кислотой, не задерживая в ней).
3 – 5 мин метиленовым синим по Леффлеру.
6. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной системой.
некислотоустойчивые – в синий.
1. Проведите окраску бактерий зубного налета с использованием простых методов.
2. Проведите окраску бактерий по методу Грама.
нескольких родов, к числу которых относятся Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desufotomaculum, etc. Обычно внутри каждой клетки образуется субтерминально или терминально, превышая диаметр материнской клетки (у клостридий). Это приводит к формированию у клостридий клеток веретеновидной формы (Clostridium perfringens), разливной ложки (Clostridium diauvoci), ракетки или барабанной палочки (Clostridium tetani). Бактериальные споры устойчивы к высокой температуре, высушиванию, воздействию токсических веществ и других неблагоприятных факторов.
1 – бациллярный, 2 – клостридиальный, 3 – плектридиальный.
Бактериальные споры могут быть выявлены с использованием как простых, так и сложных методов окраски. Например, с использованием 7 % водного раствора нигрозина микроорганизм окрашивается в зеленый цвет, споры – бесцветные, а фон – черный. Наиболее часто используемым сложным методом окрашивания эндоспор является метод Пеффера – Фултона.
Техника оксраки: 1. Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги, на который наносят 0,5 % водный раствор малахитового зеленого и 2 – 3 раза нагревают в пламени спиртовки до появления паров.
2. Фильтровальную бумагу снимают, препарат промывают водой и в течение 30 с докрашивают 0,5 % раствором сафранина.
3. Препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной системой. Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетка – в красный.
Капсула бактерий. При определенных условиях культивирования многие виды бактерий различных таксономических групп образуют слизистое вещество, формирующее вокруг клетки структуру, которая называется капсулой. Колонии капсулообразующих бактерий имеют влажную, блестящую поверхность и называются мукоидными. Среди сапрофитных бактерий капсула хорошо выражена у представителей родов Azotobacter, Leuconostoc, Rhizobium, патогенных – Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae и др.
Капсула предохраняет клетку от обезвоживания, механического повреждения, капсульное вещество создает вокруг клетки дополнительный осмотический барьер, регулирующий поступление и выделение различных веществ и ионов, а также аэрацию бактерий. Лучше всего капсулы выявляются во влажных препаратах, так как составляющие их сильно гидратированные коллоидные полимеры легко разрушаются и сокращаются в размерах при высушивании и фиксации.
Для выявления капсул пользуются различными методами, среди которых можно отметить метод Гинса – Бурри (метод негативного контрастирования).
Техника окраски капсул: 1. На предметное стекло наносят каплю водного раствора фуксина, в которую с помощью стерильной петли вносят исследуемую культуру бактерий.
2. Рядом с первой каплей помещают каплю туши. Две капли смешивают и с помощью другого предметного стекла делают мазок как мазок крови ( ребром одного стекла проводят по поверхности другого).
3. Мазок высушивают на воздухе.
4. Микроскопируют, пользуясь иммерсионной системой.
микроорганизмов, окруженные бесцветной капсулой.
Цитоплазматические включения. У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в результате обменных процессов в цитоплазме образуются отложения, которые называют включениями.
Включения — это вещества, возникающие в результате метаболизма клетки. Среди них – отложения жира, поли--гидрооксимасляной кислоты, полифосфатов, полисахаридов, серы и различных кристаллов.
Волютин — полифосфат, запасное фосфор- и азотсодержащее вещество, производное нуклеиновой кислоты. Для выявления этих включений, которые сильно преломляют свет, применяется несколько методов. Включения волютина хорошо выражены у Spirillum volutans, Bacillus subtilis, а также у возбудителей сибирской язвы и дифтерии. Гранулы волютина имеют относительно крупные размеры, окрашиваются различными красителями, изменяя цвет последних. Например, при окрашивании метиленовым синим волютин окрашивается в ярко-красный цвет. Такое явление получило название метахромазии. Гранулы волютина представлены полифосфатами – запасающимся веществом, которое служит источником фосфатных групп.
Окраска гранул волютина по Нейссеру.
Техника окраски волютина: 1. На фиксированный мазок наносят 2 – капли раствора метиленового синего по Нейссеру и окрашивают в течение 1 – мин.
2. Краситель сливают, препарат промывают водой.
3. Мазок обрабатывают раствором Люголя в течение 20 – 30 с.
4. Не промывая препарат водой, мазок дополнительно окрашивают 2 – мин 2 % раствором везувина.
5. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют, используя иммерсионную систему. Цитоплазма окрашивается в желтый цвет, а гранулы волютина – в темно-синий.
Окраска волютина (метахроматических гранул) методом Омелянского.
Характерные свойства волютина — сродство к основным красителям и метахромазия, окрашивающего вещества.
Этот метод окраски основан на плохой растворимости волютина в растворах кислот. На обезжиренное стекло наносят тонкий мазок бактерий, сушат его на воздухе, фиксируют над пламенем и окрашивают карболовым фуксином Циля. Через 0,5—1 мин промывают препарат водой, обесцвечивают 20—30 с 1% раствором H2S04, промывают, дополнительно 20—30 с окрашивают метиленовым синим (1:40), промывают, промокают, наносят масло и смотрят с иммерсионной системой. Гранулы волютина окрашены в красный цвет на фоне синей цитоплазмы.
Можно окрашивать фиксированные препараты 10—30 с метиленовым синим Леффлера или 1% раствором толуидинового синего, затем промывать препарат водой, промокать фильтровальной бумагой и смотреть под микроскопом. При окраске метиленовым синим гранулы имеют цвет от синего до фиолетового.
Гликоген - углевод, животный крахмал. Встречается у эукариот и прокариот. Впервые был обнаружен французским физиологом К. Бернаром в печени крыс при их обильном питании углеводами. Часто гликоген накапливается в клетках дрожжей, бацилл. Для обогащения дрожжевых клеток гликогеном их выращивают на солодовой среде.
На чистое предметное стекло наносят небольшую каплю суспензии микроорганизмов и к ней добавляют такую же каплю раствора 12 в KI (7 г 12 и 20 г KI на 100—300 мл дистиллированной воды). Сверху помещают покровное стекло, избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Препарат просматривают с масляной иммерсией.
На препарате Saccharomyces cerevisiae много почкующихся клеток. В образующихся (растущих) почках гликогена практически нет, поскольку углеводы расходуются в процессе активного метаболизма и гликоген не запасается. В материнских клетках окраска гликогена интенсивна — в зависимости от степени его накопления она варьирует от ярко-желтых оттенков до коричнево-желтых.
Включения гликогена хорошо исследовать в 1— 2-суточных культурах Saccharomyces cerevisiae и Bacillus mycoides.
Гранулеза — углевод, крахмалоподобное вещество. Встречается только у прокариот и только в клетках маслянокислых бактерий Clostridium butyricum перед спорообразованием. Обычно гранулезы накапливается значительное количество.
Окраска гранулезы. В небольшую каплю суспензии маслянокислых бактерий добавляют такую же каплю раствора Люголя, накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой и просматривают с масляной иммерсией.
В качестве объекта следует использовать накопительную культуру маслянокислых бактерий. Ее получают следующим образом: за 3-4 сут до занятий пробирки на 1/3 заполняют мелконарезанным неочищенным картофелем, добавляют мел на кончике ножа и доливают доверху водопроводной водой. Пробирки помещают в водяную баню и нагревают при 70 °С 10 мин, затем охлаждают и ставят в термостат при 30 оС.
Для приготовления препарата маслянокислых бактерий берут пипеткой каплю суспензии из придонного слоя жидкости. Гранулеза окрашивается в сине-фиолетовый цвет и локализуется на одном из концов клеток Clostridium butyricum, вегетативных клеток в клетки, несущие споры. Второй конец клетки (с формирующейся спорой) остается неокрашенным.
Жир содержится в клетках практически всех видов микроорганизмов, особенно много его накапливается при старении культуры.
На предметное стекло наносят небольшую каплю 40% раствора формалина. Петлей в нее вносят культуру микроорганизма. Формалин убивает клетки и разрыхляет их оболочки. Через 5 мин в эту же каплю добавляют небольшую каплю метиленового синего, а спустя 10 мин — каплю судана III (растворимого в жире красителя, индикатора жиро-подобных веществ). Образовавшуюся общую каплю накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют препарат с иммерсией.
Цитоплазма клеток окрашивается в синий цвет, включения жира — в розово-оранжевый.
Объекты для исследования — старые культуры дрожжей, Bacillus mycoides, Bacillus megaterium.
Многие гранулы жира, окрашивающиеся Суданом III или Суданом черным В (0,3% раствором в 70% этиленовом спирте), состоят из полиоксимасляной кислоты. Для выявления поли-оксимасляной кислоты готовят препарат клеток 24-часовой культуры. Мазок подсушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки, окрашивают Суданом черным 5— 15 мин (краситель может при этом высохнуть, но это не имеет значения). Затем краситель смывают, препарат подсушивают фильтровальной бумагой и обрабатывают ксилолом, несколько раз погружая в него стекло.
Время обесцвечивания не должно превышать 1 мин. Дополнительное окрашивание препарата проводят 0,5% водным раствором сафранина в течение 5-10 с. Включения поли-3-оксимасляной кислоты выглядят как черно-синие гранулы в розовой цитоплазме клеток.
Приготовление Судана III. 0,1 г судана III растворяют в 200 мл 96% спирта или концентрированной молочной кислоты.
Подвижность бактерий. Поступательное движение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя в большинстве случаев светлопольный микроскоп. Наиболее эффективно наблюдение за подвижностью в темнопольном микроскопе. Чтобы убедиться, что жгутики действительно присущи данным микроорганизмам, а также определить их расположение (полярное, перитрихиальное, латеральное), требуются методы с применением окрашивания.
1 - монотрихиальное, 2 - лофотрихиальное, 3 - латеральное, 4 - амфотрихиальное, 5 - перитрихиальное, 6 - «смешанное» полярнотрихиальное.
Для окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание препарата (обычно растворами таннина, KAl(SO4)2, HgCl2 ) и последующая окраска (чаще карболовым раствором фуксина). В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности. Одним из предложенных методов окрашивания жгутиков является метод Лейфзона.
Техника окраски жгутиков: 1. Выращенные на скошенном агаре, бактерии осторожно ресуспендируют в пептонной воде. Бактериальной петлей суспензию наносят на предметное стекло и высушивают на воздухе.
2. Восковым стеклографом очерчивают вокруг бактериальной пленки прямоугольник.
3. Наносят на предметное стекло 1 мл раствора красителя таким образом, чтобы он не вытекал за пределы восковой линии. Оставляют краситель на определенное время (до 1 часа). В состав красителя входят 1,5 % хлористого натрия, 3 % таннина (дубильной кислоты) и 0,03 % фуксина.
4. Как только на поверхности красителя образуется золотистая пленка, а по всему мазку выпадет осадок, краситель удаляют под струей воды, а препарат высушивают на воздухе.
5. Препарат микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки бактерий окрашиваются в красный цвет, жгутики принимают вид толстых нитей, отходящих от клетки.
Подвижность бактерий может быть выявлена с использованием техники посева в столбик агара. При этом культуру бактерий засевают уколом в столбик 0,3 % питательной среды в пробирке. Пробирки помещают в термостат для инкубирования. Результаты учитывают через 24 – 48 часов. Подвижные бактерии растут по всей толще агара, вызывая диффузное помутнение среды, неподвижные – только по линии укола.
Приготовьте окрашенный препарат спорообразующих бактерий и промикроскопировать его.
Проведите окраску капсулообразующих бактерий.
промикроскопировать его.
4. Определите подвижность бактерий методом укола в столбик 0,3 % питательного агара.
5. Используя полученные результаты и данные литературы, заполните табл. 2.
Характеристика морфологических и тинкториальных микроорганизма Escherichia coli Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis Sarcina lutea Mycobacterium rubrum Streptococcus lactis Bacillus subtilis Lactobacillus lactis Saccharomyces cerevisia
5. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
Условия культивирования микроорганизмов. Как уже отмечалось, при приготовлении сред нужно учитывать требования микроорганизмов к кислотности среды. Кроме того, при культивировании микроорганизмов следует учитывать отношение микроорганизмов к температуре (большинство микроорганизмов хорошо развиваются при температуре 25-37 оС) и свету (большинству использующие в процессах обмена солнечную энергию (т.е. фототрофные), необходимо выращивать при освещении.Важно также учитывать потребности микроорганизмов в свободном кислороде. Неодинаковые потребности в свободном кислороде определяют различия в способах культивирования микроорганизмов.
поверхностном культивировании на плотных и жидких питательных средах микроорганизмы развиваются на поверхности питательной среды и получают культивировании необходимо увеличить площадь соприкосновения среды с воздухом (среда тонким слоем наливается в посуду с плоским дном: чашки Петри, колбу Виноградского, матрацы). При поверхностном культивировании на жидких средах аэробные микроорганизмы растут в виде плотных пленок.
бактериологической петли (методом штриха), или с помощью шпателя (на поверхность среды пипеткой вносят каплю посевного материала и растирают по поверхности эту каплю стерильным шпателем). Посев на жидкую бактериологической петли.
Глубокое культивирование в жидких средах. При использовании интенсивность роста культуры определяется интенсивностью доставки кислорода к клеткам. Наиболее простой способ глубинного культивирования культивирование аэробных микроорганизмов с продуванием стерильного воздуха через культуральную жидкость.
культивирования анаэробов заключается в защите их от кислорода воздуха. Для этого применяют следующие приемы: 1) жидкую среду перед посевом подогревают в кипящей водяной бане, быстро охлаждают и заливают в сосуды культивирования высоким слоем до пробки; 2) сосуды закрывают стерильными резиновыми пробками; 3) откачивают воздух из сосудов для культивирования и заполняют их инертным газом; 4) выращивают культуру в толще агаризованной среды и т.д. Последним приемом пользуются для получения изолированных колоний при выделении чистых культур и при необходимости количественного учета факультативно-анаэробных организмов. Засев питательной среды факультативно-анаэробными микроорганизмами осуществляют глубинным способом: посевной материал вносят в расплавленную и остуженную до 48- С агаризованную среду, перемешивают, переливают в стерильные сосуды для культивирования до пробки, сосуды плотно закрывают пробкой и заливают расплавленным парафином.
При выделении чистых культур и количественном учете анаэробных микроорганизмов анаэробные условия создаются с помощью химических реагентов, либо путем физического удаления воздуха из емкостей, в которых проводится выращивание микроорганизмов.
Новейшими приемами культивирования анаэробных микроорганизмов являются:
1) культивирование в анаэробных камерах с перчатками (камера заполняется газами, освобожденными от примесей кислорода, все манипуляции в камере проводят, одевая вмонтированные в камеру газонепроницаемые перчатки);
2) культивирование в анаэробных камерах типа анаэростатов с использованием палладиевого катализатора, поглощающего кислород и т.д.
Приготовите 100 мл мясопептонного бульона (МПБ).
Приготовите 100 мл мясопептонного агара (МПА).
Приготовите 100 мл агара Эндо.
Простерилизуйте питательные среды в автоклаве при 120 оС в течение мин.
Бактериологический метод — выделение чистых культур микробов и их последующая идентификация — имеет большое значение в диагностике инфекционных заболеваний, при изучении санитарно-гигиенического состояния объектов внешней среды (вода, воздух, почва, продукты питания) и исследовании их на зараженность патогенными видами микробов. Однако первым этапом этой методики является посев или пересев бактериальной культуры на различные типы питательной среды.
Материалом для посева могут быть пересеваемые культуры бактерий, различные выделения животных и человека, ткани трупа, вода, почва, продукты питания.
Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой (рис.10). При взятии петлей жидкость должна образовать в кольце петли тонкую прозрачную пленку — «зеркало». Пипетками пользуются в том случае, когда материал засевают в большом или точно отмеряемом объеме.
Рис. 10. Схема пересева культуры микробов из пробирки в пробирку.
Способ взятия плотного материала определяется его консистенцией. При посевах чаще всего пользуются бактериальной петлей. Все манипуляции, связанные с посевом и выделением микробных культур, производят над пламенем горелки. Бактериальную петлю прокаливают над пламенем непосредственно перед взятием материала, затем петлю остужают. Для этого при пересеве микробной культуры с пробирки горячую петлю погружают в конденсационную жидкость, а при пересеве с чашек Петри прикасаются к поверхности питательной среды, свободной от микробного роста. Достаточно остуженная петля не вызывает шипения конденсационной жидкости и не растапливает агар при соприкосновении со средой. После окончания посева петлю прожигают повторно для уничтожения находящейся на ней микробной культуры или инфицированного микроорганизмами материала.
Пипетки и шпатели, используемые для посевов, так же как и бактериальные петли, перед посевом прожигают, а после посевов опускают в дезинфицирующий раствор.
Перед посевом вся посуда проверяется на целостность, далее на чашках Петри со стороны дна, на пробирках в верхней трети надписывают название засеянного материала или ставят номер анализа и дату посева.
5.2. Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды 1. При посеве в жидкую питательную среду петлю, с находящимся на ней материалом, погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду.
2. При посеве на скошенный мясо-пептонный агар пробирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают правой рукой V и IV пальцами, не прикасаясь к той части пробки, которая входит внутрь пробирки. Остальные 3 пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериальной петли, посредством которой производится посев. Петлю держат, как писчее перо. После вынимания пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее посторонних микроорганизмов из воздуха.
Петлю, с находящимся на ней пересеваемым материалом, вводят в пробирку до дна, опускают плашмя на поверхность питательной среды и скользящими движениями наносят штрих снизу вверх, от одной стенки пробирки к другой (рис. 11).
3. При посеве на поверхность плотной питательной среды в чашки Петри чашку держат в левой руке. Дно ее с одной стороны придерживают I и II пальцами, а с другой — IV и V пальцами. Крышку, приоткрытую настолько, чтобы в образовавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель, фиксируют I и III или I и II пальцами (рис. 11). Небольшое количество исследуемого материала втирают бактериальной петлей в поверхность питательной среды у края чашки. Затем петлю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала. Линию посева начинают с того места, в котором находится материал. Бактериальную петлю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать ее поверхности, и проводят штрихи по всей среде или по секторам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на несколько равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микроорганизмов.
Рис. 11. Посев на плотную питательную среду в чашки Петри.
Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользоваться вместо петли тампоном или шпателем (рис. 12).
Рис. 12. Рассев культуры микроорганизмов на плотную питательную среду шпателем: А – шпатель Дригальского, Б – рассев, В – рост культуры При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной среды. Такой характер микробного роста получил название сплошного, или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одного вида.
4. Из материала, подлежащего посеву, в толщу плотной питательной среды, готовят взвесь в стерильной водопроводной воде или в изотоническом растворе. Набирают 0,1—1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного загрязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15—20 мл мясо-пептонного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40—45°С (при такой температуре пробирка со средой, приложенная к щеке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распределения исследуемого материала в питательной среде закрытую чашку с содержимым слегка вращают по поверхности стола.
5. Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку, как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней материалом.
Существует много методов посева штрихом в чашки с твердыми средами («штрихованные чашки») (рис. 13), но лишь некоторые из них почти всегда дает хорошо изолированные колонии даже при отсутствии навыков у экспериментатора. Кроме того, можно наливать разведенные растворы смешанной культуры на поверхность твердых сред в чашках. При работе с анаэробами «штрихованные чашки» или чашки с внесенной в них жидкой культурой в атмосфере воздуха инкубируют затем в анаэростате. Для анаэробов необходимы свежеприготовленные среды, а посев штрихом следует проводить в течение первых 4 ч после их автоклавирования, чтобы избежать накопления растворенного кислорода.
Рис. 13. Удобный метод посева штрихом в чашки для получения А) Для маркировки на обратной стороне чашки Петри карандашом наносят букву Т, разделяющую дно на 3 сектора.
Б) Петлей с культурой зигзагом наносят штрихи на поверхности агара в секторе 1, как показано на рисунке. Для этого крышку чашки сначала стерилизуют в пламени и дают ей остыть (15 с).
В) Проводят петлей по поверхности среды в секторе 1, как показано на рисунке, и затем немедленно наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 2. Прогревают петлю в пламени и дают ей остыть.
Г) Проводят петлей по поверхности среды в секторе 2, как показано, и затем наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 3.
Д) Инкубируют опрокинутые вверх дном чашки, как показано на рисунке, для того чтобы конденсирующаяся вода с крышки не попала на поверхность агара. В секторе 1 вырастает большое число колоний, тогда как в секторах 2 и появляются отдельные хорошо изолированные колонии.
6. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ
МИКРООРГАНИЗМОВ
Культуральные признаки микробов определяются характером роста их на питательных средах. Будучи постоянными для каждого вида микроба, они являются важным диагностическим признаком.Для изучения свойств колоний микробы культивируют на плотных питательных средах в чашках Петри. При посеве материала стараются получить изолированный рост колоний. Чашки с посевом просматривают сначала невооруженным глазом или через лупу, затем помещают их на столик микроскопа вверх дном и просматривают колонии в проходящем свете с объективом малого увеличения и с суженой диафрагмой.
Колонии характеризуют по величине, форме, контуру края, рельефу, поверхности, цвету, структуре и консистенции.
Величина колонии определяется ее диаметром. В зависимости от диаметра различают колонии точечные (диаметр меньше 1 мм), мелкие (диаметр 1—2 мм), средние (диаметр 2—4 мм) и крупные (диаметр 4—6 мм и более).
Форма колонии бывает правильная — круглая, неправильная — амебовидная, ризоидная — корневидная, напоминающая переплетающиеся корни деревьев.
На последующих рисунках отображено разнообразие формы колоний и клеток видов микроорганизмов, относящихся к одному роду Bacillus (рис. 14Рис. 14. Вас. mycoides:
а — клетки в начале образования спор; б — колонии на агаре а — палочковидные клетки; б — колонии а — палочки и овальные споры; б — колонии Характер контура края определяют при рассмотрении колонии под лупой или микроскопом с малым увеличением. Различают ровные края в виде четко выраженной линии и неровные. Последние делят на:
фестончатый край, состоящий из крупных, слегка округлых или уплощенных зубцов правильной формы;
волнистый край, который несколько отличается от фестончатого тем, что крупные зубцы его выражены нечетко;
эрозированный, или зазубренный, край, состоящий из острых зубцов различной величины и формы;
бахромчатый край, имеющий нежные ворсинки. В некоторых случаях четко выраженная линия, отграничивающая колонию от поверхности среды, отсутствует. Такой край колонии называется расплывчатым.
Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Определяется рельеф колонии невооруженным глазом или с лупой при рассматривании сверху и сбоку. Различают:
• каплеобразные и куполообразные колонии правильной круглой формы с различно выраженной степенью выпуклости, которые в вертикальном разрезе представляют собой сегмент шара и отличаются только длиной радиуса. Колонии слабовыпуклые имеют большую длину радиуса; куполообразные — меньшую;
• колонии плоско-выпуклые с плоским верхом, пологими или круто обрывающимися краями; имеют в вертикальном разрезе форму • колонии конусообразные, имеющие в вертикальном разрезе форму треугольника:
• колонии с приподнятой в виде соска серединой и валиком по • колонии с вдавленным центром;
• колонии плоские, стелющиеся по поверхности среды.
Поверхность колонии изучают с помощью лупы или под микроскопом при малом увеличении. Поверхность колоний бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие колонии обозначают буквой S (smooth), шероховатые — буквой R (rough), что означает соответственно «гладкий» и «шероховатый». Механизм формирования гладких и шероховатых форм колоний обусловлен различием процессов клеточного деления. Микробные клетки в колониях S-форм располагаются, соприкасаясь своими боковыми поверхностями, клетки R-форм, сохраняя при делении цитоплазматические мостики, образуют цепочки, которые, накладываясь друг на друга, обусловливают шероховатую поверхность и неровный край колонии.
Переход S-форм в R-формы наблюдается при диссоциации. Явление диссоциации у патогенных микробов наблюдается под действием антибиотикои химиотерапии, факторов специфического иммунитета, формирующихся в течение инфекционного процесса, а также факторов внешней среды. Среди шероховатых форм колоний различают: складчатые, гирозные, по виду напоминающие исчерченную извилинами поверхность мозга; бородавчатые, концентрически или радиально исчерченные; шагреневые, т. е.
мелкозернистые.
Цвет колонии определяется пигментом, который продуцирует культура микробов. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образует, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета, похожи на опал. В проходящем свете такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны. Пигментообразующие виды микробов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и др.
Структура колоний определяется в проходящем свете при слабом увеличении микроскопа, суженой диафрагме или при несколько опущенном конденсоре. У пигментированных колоний и колоний, не пропускающих света, она не определяется.
По характеру структуры различают следующие виды колоний:
• гиалиновые — бесцветные, прозрачные, без видимой определенной • зернистые, которые в зависимости от величины зерен разделяются длинных, густо переплетающихся нитей в толще колонии.
Колонии бывают однородные и неоднородные. Строение первых одинаково во всех частях, у вторых центральная часть отличается от периферической или отдельные сектора имеют строение, неодинаковое с остальной массой.
Консистенцию колонии, определяющую ее физическое состояние, исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериальной петлей. По характеру консистенции колонии бывают:
поверхности питательной среды наподобие сливочного масла;
• вязкие или слизистые, прилипающие и тянущиеся за петлей;
• волокнистые или кожистые, плотные, снимающиеся с поверхности питательной среды в виде упругой пленки, соответствующей • хрупкие, сухие, рассыпающиеся при прикосновении петли.
Особенности микробного роста на жидких питательных средах На жидких питательных средах характер роста микробов менее разнообразен, чем на плотных питательных средах. Однако и здесь выявлены следующие формы роста бактерий.
Рост бактерий с равномерным помутнением среды, цвет которой остается неизмененным или изменяется в соответствии с цветом водорастворимого пигмента, образующегося в культуре микроба. Такой рост характерен для многих патогенных бактерий, относящихся к группе факультативных анаэробов.
Придонный рост бактерий характеризуется образованием осадка на дне пробирки с жидкой питательной средой. Осадок может быть скудным или обильным, крошковидным, гомогенным, волокнистым или в виде крупных рыхлых хлопьев, по консистенции вязким, слизистым, хрупким или пастообразным. Питательная среда над осадком может быть прозрачной или мутной. Цвет осадка и среды, находящейся над ним, определяется наличием пигмента, продуцируемого культурой микробов. Если культура пигмента не образует, цвет среды не изменяется, а осадок приобретает, как правило, серовато-белый или желтоватый цвет. Придонный рост специфичен для бактерий с анаэробным типом дыхания.
Пристеночный рост бактерий выражается в том, что питательная среда, находящаяся в пробирке, остается совершенно прозрачной. Бактерии растут, образуя более или менее крупные рыхлые хлопья или, наоборот, компактные зерна, прикрепленные к внутренней поверхности стенок сосуда, с которых, в зависимости от вида бактерий, снимаются легко или с трудом.
поверхности жидкой питательной среды пленки, внешний вид и характер которой могут быть различны:
• пленка тонкая, нежная, бесцветная, имеет вид едва заметного налета, исчезающего при встряхивании пробирки и взбалтывании среды;
• пленка влажная, толстая, хорошо видимая простым глазом, вязкой, слизистой консистенции, прилипает к петле и тянется за ней;
• пленка плотная, сухая, внешним видом напоминает кусочки кожи и при попытке взятия из нее материала снимается целиком в виде круглого диска, соответствующего диаметру пробирки;
• пленка плотная, сухая, со сморщенной, а иногда бородавчатой поверхностью, краями прикрепленная к стенкам сосуда; при взбалтывании жидкости или прикосновении бактериальной петли разбивается на кусочки, погружающиеся в глубь жидкости.
Цвет пленки, как и питательной среды, зависит от пигмента, вырабатываемого растущей культурой микробов. Рост бактерий в виде поверхностной пленки характерен для микробов-аэрофилов.
Рост на полужидкой питательной среде Для выявления особенностей микробного роста на полужидкой питательной среде исследуемую культуру засевают в столбик 0,2—0,5% полужидкого агара. Для того чтобы особенности роста проявлялись наиболее четко, прокол среды делают в непосредственной близости к стенке пробирки. Посев, произведенный таким образом, дает возможность выявить подвижные расы микробов и дифференцировать их от неподвижных.
выраженное помутнение, распространяющееся более или менее равномерно по всей толщине среды.
Неподвижные формы микробов растут только по ходу прокола среды, напоминая сосульки цилиндрической или конической формы. При этом окружающая среда остается совершенно прозрачной.
«