МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего

профессионального образования

КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ

Кафедра микробиологии, эпизоотологии и вирусологии

Государственное управление ветеринарии

Краснодарского края

Государственное учреждение Краснодарского края «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория»

А.А. ШЕВЧЕНКО, О. Ю. ЧЕРНЫХ, Л.В. ШЕВЧЕНКО, Г.А. ДЖАИЛИДИ, Д.Ю. ЗЕРКАЛЕВ. Е.А. БАЖЕНОВА, А.В. СКОРИКОВ, Е.В. ЯКУБЕНКО

ДИАГНОСТИКА ПСЕВДОМОНОЗА

ЖИВОТНЫХ

Учебное пособие г. Краснодар,

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Кафедра микробиологии, эпизоотологии и вирусологии Государственное управление ветеринарии Краснодарского края Государственное учреждение Краснодарского края «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория»

А. А. ШЕВЧЕНКО, О. Ю. ЧЕРНЫХ, Л.В. ШЕВЧЕНКО, Г.А. ДЖАИЛИДИ, Д.Ю. ЗЕРКАЛЕВ, Е.А. БАЖЕНОВА, А.В. СКОРИКОВ, Е.В. ЯКУБЕНКО

ДИАГНОСТИКА ПСЕВДОМОНОЗА

ЖИВОТНЫХ

Учебное пособие Для студентов высших учебных заведений факультета ветеринарной медицины по направлению подготовки «Ветеринария»

КРАСНОДАР, УДК 619:616.98-07:579.841.11(075) ББК 48. Д Авторы: А. А. Шевченко, О. Ю. Черных, Л.В. Шевченко, Г.А. Джаилиди, Д.Ю. Зеркалев, Е.А. Баженова, А.В. Скориков, Е.В. Якубенко Учебное пособие «Диагностика псевдомоноза животных».

Краснодар: КубГАУ, 2013. 12 с.

В учебном пособии изложены основные свойства возбудителей псевдомоноза; описаны бактериоскопические, бактериологические, биохимические, биологические и серологические методы диагностики и дифференциальной диагностики заболевания.

РЕЦЕНЗЕНТЫ:

Лысенко А.А. – доктор ветеринарных наук, профессор, декан факультета ветеринарной медицины КубГАУ.

Куриннов В.В. – доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий лабораторией Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии.

Рекомендовано методической комиссией факультета ветеринарной медицины КубГАУ протокол №3 от 19 ноября года.

© Кубанский государственный аграрный университет 350044, Краснодар, ул. Калинина, Цель занятия: изучить правила отбора патологического материала и отправки в ветеринарную лабораторию, основные свойства возбудителя псевдомоноза, методы лабораторной диагностики.

Диагностика псевдомоноза животных проводится комплексно, учитывают эпизоотологические данные, клинические признаки, патологоанатомические изменения и лабораторные исследования.

P. aeruginosa относится к категории условно патогенных бактерий, часто обнаруживается на слизистых оболочках животных, на фоне снижения резистентности макроорганизма может вызывать септицемии, бронхопневмонии, абсцессы, маститы, аборты, поражения мочевого тракта, постхирургические осложнения. P.

aeruginosa является возбудителем псевдомоноза норок, нутрий.

кроликов. Pseudomonas aeruginosa является аэробной, грамотрицательной бактерией, относящейся к семейству Pseudomonadaceae, роду Pseudomonas, который объединяет более двадцати видов.

Лабораторная диагностика основана на результатах бактериологического и серологического исследований Бактериологическое исследование Материал для исследования зависит от локализации патологического процесса, вызванного P. aeruginosa, прижизненно это может быть воспалительный экссудат, посмертно — пораженные участки легких при пневмонии, лимфатические узлы, селезенка, печень, почки и т.д. Материал желательно отбирать непосредственно из очага воспаления, отделяемого, если таковое имеется, а также до начала антибиотикотерапии или после выведения антибиотика из организма.

Микроскопическое исследование исходного материала Из исследуемого материала готовят и микроскопируют мазки, окрашенные по Граму. Клетки P. aeruginosa имеют вид прямых или изогнутых грамотрицательных палочек размером 1,5-3x0,5-1,0 мкм, располагающихся одиночно, парами, в виде коротких цепочек. Вирулентные штаммы продуцируют значительное количество капсулоподобного слизистого вещества. В мазках — отпечатках из тканевого материала клетки P. aeruginosa часто обнаруживаются внутри фагоцитов.

Выделение и идентификация культур P. аeruginosa Культивирование. Pseudomonas aeruginosa — аэроб, температурный оптимум — 35-37° С, диапазон 4-42° С, рН — 7,2, к питательным средам неприхотлив. Исследуемый материал высевают на МПА, кровяной МПА или селективную среду, содержащую цетилтриметил аммония бромид (цетримид), на которой другие псевдомонады не растут. Посевы культивируют в аэробных условиях при 35-37° С в течение 24 часов.

На МПА P. aeruginosa формирует крупные (2-5 мм), сероватые, с неровными, волнистыми распространяющимися плоскими краями, полупрозрачные, с гладкой поверхностью и приподнятым центром колонии, часто отливающие металлическим блеском, кроме того, могут быть мелкие, шероховатые колонии, напоминающие маргаритки. Штаммы, выделенные из респираторного и мочеполового тракта, могут образовывать слизистые или мукоидные колонии. На кровяном агаре колонии часто окружены зоной -гемолиза.

Культуры P. aeruginosa имеют фруктовый запах, прозрачные среды в процессе роста окрашивают в зеленоватый или зеленоватожелтый цвет. Пигментообразование — важный таксономический признак, обнаруживаемый приблизительно у 80% штаммов. Для выявления пигмента исследуемую культуру выращивают на средах «А» и «В» в течение суток при 35° С. Пигмент пиоцианин растворим в воде и хлороформе, окрашивает питательные среды в синезеленый цвет. Цвет пигмента у культур на специальных средах для выявления псевдомонад варьирует от бледно-голубого до темносинего или зеленого на среде «А» и ярко-зеленого на среде «В». P.

aeruginosa — единственный известный вид бактерий, продуцирующий пиоцианин. В щелочной среде пиоцианин имеет голубой цвет, в кислой — розовый. Для выявления этого пигмента культуру выращивают на скошенном агаре, вносят 1-2 мл хлороформа, перемешивают, хлороформ при наличии пиоцианина синеет. Окрашенный хлороформ переносят пипеткой в пробирку и вносят 1- капли IN HC1, после чего пиоцианин розовеет (кислая среда). Пиоцианин наиболее часто образуют вирулентные штаммы P.aeruginosa. Пигмент флуоресцеин (пиовердин) — зеленый пигмент, растворим в воде, но не хлороформе, флуоресцирует при освещении культуры, выращенной на среде «В» в темноте, ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 254 мм, его вырабатывают большинство штаммов. Синтез пиовердина стимулирует среда «В», а также культивирование при 25° С. Цвет пигмента пиорубина у культур на среде «А» варьирует от розового до темно-каштанового.

Пигмент пиомеланин — темно-коричневый, синтезируют некоторые штаммы P. aeruginosa на среде «В». Часть изолированных штаммов (8-18%) может не образовывать пигменты, что затрудняет идентификацию и требует проведения дополнительных исследований свойств культуры. Спектр пигментов, образуемых P.aeruginosa и другими псевдомонадами, представлен в таблице 79. Определение наличия пигмента и его типа — важный этап в идентификации P. aeruginosa.

В МПБ рост P.aeruginosa проявляется образованием поверхностной серебристо-белой пленки, что считается характерным признаком. Позднее среда мутнеет (вначале в верхней части столбика среды, далее — в нижней), формируется серовато-белый осадок. За счет пигмента среда приобретает сине-зеленый цвет, который позднее становится бурым.

Морфология клеток P. aeruginosa в культуре. Морфология клеток в культуре идентична таковой в препаратах из патологического материала. Клетки подвижные, имеют один, иногда два полярных жгутика, способность к слизеобразованию в процессе пассирования на питательных средах быстро утрачивают, спор не образуют. Подвижность исследуют микроскопически у бульонных культур, выращенных при 18-20° С.

Идентификация P.aeruginosa с учетом температурного диапазона роста, пигментообразования и ферментативных признаков При обнаружении в материале культур, способных расти на цетримидном агаре, образующих колонии с признаками, характерными для Р. aeruginosa, проводят микроскопическое исследование мазков, окрашенных по Граму. Исследуют способность к слизеобразованию, пигмеитообразованию и тип пигмента.

Таблица 1 - Пигментообразование у P.aeruginosa и некоторых флуоресцирующие нефлуоресцирующие нефлуоресцирующие биотип I В случае выявления типичных грамотрицательных палочек проверяют их оксидазную и каталазную активность.

Для дальнейшего исследования отбирают колонии оксидазо- и каталазопозитивных бактерий. Исследуют у выделенных культур подвижность, способность к восстановлению нитратов, образованию газа из нитрата, пептонизации молока, гидролизу желатины, утилизации цитратов, синтезу пигментов (см. выше), аргининдигидролазы, способность к росту при 25° С, 35° С, 42° С, в МПБ без NaCl, образованию кислоты из D-глюкозы, D-ксилозы, D-маннита.

Для P.aeruginosa характерны свойства, отраженные в таблице 1.

Может быть использована тест-система NEFERV test 24 (PLIVALachema).

Серологическая идентификация У P. aeruginosa выявлено семнадцать О-сероваров. Существовало много различных схем их обозначения, которые объединены в одну международную на основе схемы Habs, соответствие которой прежним схемам представлено в таблице 2. Строение Оантигенов возбудителя внутри этих групп отражено в таблице 3.

Кроме О-сероваров у возбудителя идентифицированы Нсеровары, которые в отличие от сальмонелл не имеют вариаций.

По Н-антигенам P.aeruginosa подразделяют на 1 и 2-ю группы. В свою очередь, в первой группе выделяют подгруппы Н:1а и Н:lb, а во второй — 6 подгрупп. По данным многих авторов, большинство клинических штаммов P. aeruginosa при использовании коммерческих агглютинирующих сывороток удается отнести к О-сероварам 2, 3, 6, 7 и 11.

Для идентификации культур P. aeruginosa, выделенных при псевдо-монозе норок, на уровне О-серогруппы, в РФ рекомендуется использовать набор из трех поливалентных и одиннадцати моновалентных сывороток. Как антиген применяют 18 -20-часовую агаровую культуру концентрацией 3-5 млрд. микробных клеток в мл, инактивированных кипячением в водяной бане в течение 1, часов. Культуру (антиген) первоначально исследуют с поливалентными сыворотками (№ 1 — 03, 04, 05, 06, 07; № 2 — 02, 08, 09; № — 010, 011, 012) и при получении положительного результата — с моновалентными, входящими в состав той или иной поливалентной сыворотки. РА проводят в капельном варианте на стекле, результат учитывают через 3-6 минут.

Питательные среды. Цетримидный агар. Цетримид (цетилметиламмония бромид) — 0,3 г; пептон — 20,0 г; магний хлористый — 1,4 г; калий сернокислый — 10,0 г; глицерин — 10,0 г; агар — 13,0 г; вода дистиллированная — до 1000,0 мл; рН среды — 7,2.

Таблица 2 - Свойства P. aeruginosa D-глюкозы