WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:     || 2 | 3 |

«ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ АДАПТАЦИИ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ К РАЗДЕЛЬНОМУ И СОВМЕСТНОМУ ДЕЙСТВИЮ НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ И КАДМИЯ ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное учреждение наук

и

Институт биологии Карельского научного центра Российской академии наук

На правах рукописи

РЕПКИНА Наталья Сергеевна

ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

МЕХАНИЗМОВ АДАПТАЦИИ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ

К РАЗДЕЛЬНОМУ И СОВМЕСТНОМУ ДЕЙСТВИЮ

НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ И КАДМИЯ

03.02.08 – экология 03.01.05 – физиология и биохимия растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Таланова Вера Викторовна Петрозаводск –

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Влияние низких температур и кадмия на растительный организм 1.2. Механизмы адаптации растений к действию низких температур 1.3. Механизмы адаптации растений к действию тяжелых металлов

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Реакция растений пшеницы на раздельное и совместное действие низкой температуры и сульфата кадмия 3.1.1. Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на биометрические показатели растений пшеницы 3.1.2. Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на холодоустойчивость растений пшеницы 3.1.3. Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на проницаемость мембран листьев растений пшеницы 3.2. Динамика накопления транскриптов генов в листьях пшеницы при раздельном и совместном действии низкой температуры и сульфата кадмия 3.2.1. Гены транскрипционных факторов 3.2.2. Гены COR/LEA белков 3.2.3. Гены протеолитических ферментов 3.3. Роль низкомолекулярных защитных соединений в механизмах адаптации растений пшеницы к раздельному и совместному действию низкой температуры и сульфата кадмия 3.3.1 Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на содержание непротеиновыхтиолов в листьях пшеницы 3.3.2. Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на содержание свободного пролина в листьях пшеницы ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Во многих регионах мира дефицит тепла, обусловленный низкими температурами воздуха и почвы, выступает главным фактором, лимитирующим рост, развитие и продуктивность растений (Туманов, 1979;

Дроздов и др., 1984; Коровин, 1984; Xin, Browse, 2000; Sung et al., 2003; Трунова, 2007; Колупаев, Карпец, 2010; Войников, 2013). В последние годы к неблагоприятным природно-климатическим факторам добавляется возрастающее техногенное воздействие на биосферу, которое обуславливает загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами, в том числе и высокотоксичным для всех живых организмов кадмием (Титов и др., 2007; Лукаткин, Башмаков, 2009). Поэтому сохранение жизнеспособности растений в этих условиях требует мобилизации всех имеющихся у них адаптивных механизмов.

Как показывают исследования, растения обладают целым комплексом адаптационных механизмов, которые реализуются на разных уровнях организации – от молекулярного до организменного, в том числе связанных с индукцией экспрессии большого числа генов и синтеза соответствующих белков (Levitt, 1980; Шакирова, 2001; Чиркова, 2002; Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki, 2006; Ouellet, 2007; Guy et al., 2008; Кошкин, 2010; Theocharis et al., 2012). Некоторые из этих механизмов специфичны в отношении того или иного воздействующего фактора, в то время как другие являются общими (неспецифичными) для разных факторов. Последнее обуславливает способность растений при действии одного неблагоприятного фактора повышать устойчивость к факторам иной природы (явление кросс-адаптации) (Титов и др., 1983; Кузнецов и др., 1990; Gong et al., 2001; Guang, Gong, 2011; Радюкина и др., 2012). Однако, механизмы кросс-адаптации остаются все еще не ясными.

Необходимо отметить, что в большинстве случаев исследователи изучают механизмы адаптации растений к действию одного конкретного неблагоприятного фактора, а работы, посвященные изучению комбинированного (совместного или последовательного) действия факторов разной природы на растения пока единичны (Гармаш, Головко, 2009; Hu et al., 2010; Iqbal, Ashraf, 2010; Grigorova et al., 2011; Al-Issawi et al., 2013). В природных же условиях неблагоприятные факторы действуют на растения, как правило, одновременно, а их ответные реакции на совместное действие факторов, в том числе низких температур и тяжелых металлов, могут заметно отличаться от эффектов, вызываемых действием каждого из них. Однако, работы, направленные на изучение механизмов их совместного действия на растения в известной нам литературе, отсутствуют.

Учитывая это, исследование механизмов адаптации растений (на организменном и клеточном уровне) не только к раздельному, но и совместному действию низкой температуры и тяжелых металлов является весьма актуальным.

Цель работы: исследование ряда эколого-физиологических механизмов адаптации растений пшеницы к раздельному и совместному действию низкой температуры и кадмия.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:



1. Оценить реакцию растений пшеницы на действие низкой температуры, кадмия и их совместное действие по ряду физиолого-биохимических показателей (биометрические показатели, холодоустойчивость, проницаемость мембран).

2. Охарактеризовать динамику накопления транскриптов генов транскрипционных факторов в листьях растений пшеницы при раздельном и совместном действии низкой температуры и кадмия.

3. Выявить особенности накопления транскриптов генов, кодирующих COR/LEA белки и протеолитические ферменты, в листьях растений пшеницы при раздельном и совместном действии низкой температуры и кадмия.

4. Оценить роль непротеиновых тиолов (глутатиона и фитохелатинов) в механизмах адаптации растений пшеницы к раздельному и совместному действию низкой температуры и кадмия.

5. Исследовать роль низкомолекулярного осмопротектора и антиоксиданта – свободного пролина – в процессах адаптации растений к раздельному и совместному действию низкой температуры и кадмия.

Новизна работы: Впервые показано, что повышение холодоустойчивости растений пшеницы происходит не только при низкой закаливающей температуре, но и под влиянием кадмия, хотя и в меньшей степени. Впервые обнаружено, что накопление транскриптов генов транскрипционных факторов (CBF1, DREB1, MYB80), АТФ-зависимых протеолитических ферментов (Lon1, ClpP), LEA белков (WCOR15,WRAB15, WRAB18, WDHN13) происходит как при раздельном, так и совместном действии низкой температуры и кадмия. В отличие от этого, аккумуляция мРНК COR гена WCS120 более характерна для реакции растений пшеницы на воздействие низкой температуры.

Впервые полученные данные о повышении содержания низкомолекулярных антиоксидантов (глутатиона и свободного пролина) и фитохелатинов, а также о накоплении транскриптов генов, кодирующих ферменты их синтеза (GS1, WP5CS, PCS1) не только при раздельном, но и совместном действии низкой температуры и кадмия в листьях растений пшеницы, указывают на их участие в механизмах адаптации к действию этих неблагоприятных факторов.

Практическая значимость работы. Полученные данные углубляют и расширяют имеющиеся в настоящее время представления об участии генов и белков транскрипционных факторов, COR/LEA белков, протеиназ, ферментов синтеза пролина, глутатиона и его производных в механизмах адаптации растений к раздельному и совместному действию низких температур и кадмия. Полученные сведения могут быть использованы при организации дальнейших физиолого-биохимических и молекулярно-генетических исследований устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды. Результаты исследований могут быть использованы при чтении ряда спецкурсов для студентов экологических, физиологических, биохимических специальностей.

Полученные данные включены в учебное пособие "Устойчивость растений к действию тяжелых металлов и экспрессия генов".

Личный вклад автора в получении научных результатов. Автор лично принимал участие в планировании и проведении экспериментов, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов, а также в написании статей, опубликованных по результатам работы.

Связь работы с научными программами. Исследования проводились с 2011 по 2013 гг. в соответствии с планом НИР ИБ КарНЦ РАН, являясь частью плановой темы "Физиолого-биохимические и молекулярногенетические механизмы реакции растений на действие неблагоприятных температур и тяжелых металлов" (№ гос. рег. 01201166444), при поддержке грантов РФФИ № 10-04-00650-а и ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 гг. № соглашений 8050 и 14.21.132.1321.

Благодарности. Автор выражает глубокую сердечную благодарность научному руководителю д.б.н. В.В. Талановой за всестороннюю помощь, ценные советы и рекомендации. Самые теплые слова благодарности руководителю и сотрудникам лаборатории экологической физиологии растений чл.корр. РАН, проф., д.б.н. А.Ф.Титову, к.б.н. Н.М. Казниной, к.б.н. Ю.В. Батовой, к.б.н. Ю.В. Венжик, к.б.н. В.В.Лавровой, к.б.н. Е.Г. Шерудило за методическую помощь и рекомендации при обсуждении материалов, а также сотруднику лаборатории генетики к.б.н. Л.В. Топичевой за помощь в постановке экспериментов.

В естественных условиях обитания все живые организмы неотъемлемо связаны с окружающей средой. Свойства среды постоянно меняются и ее воздействие на растения воспринимается через экологические факторы, в том числе абиотические (совокупность факторов неорганической среды), биотические (связанные с влиянием живых организмов) и антропогенные (влияние на окружающую среду деятельности человека) (Маглыш, 2001; Чернова, Белова, 2004; Тягунова, Ярошенко, 2005; Коробкин, Передельский, 2007; Березина, Афанасьева, 2009; Дроздов, 2011).

Несмотря на многообразие экологических факторов и характера их воздействия на организм, выявлены некоторые общие закономерности. Для организма в целом или определенной стадии его развития существует диапазон наиболее благоприятных (оптимальных) значений действующего фактора, за пределами зоны оптимума находятся зоны толерантности, переходящие в критические точки, за которыми наступает гибель организма (Чернова, Белова, 2004; Коробкин, Передельский, 2007). Представители разных видов растений отличаются друг от друга как по положению оптимума, так и по экологической толерантности (пределы выносливости, ограниченные критическими точками) (Березина, Афанасьева, 2009).

Факторы, которые ограничивают развитие организмов из-за недостатка или избытка по сравнению с оптимальным значением относят к лимитирующим или ограничивающим (Коробкин, Передельский, 2007). Одним из таких факторов, лимитирующих распределение и продуктивность растений является низкая температура (Туманов, 1979; Удовенко, 1979; Дроздов и др., 1984;

Коровин, 1984; Чернова, Белова, 2004; Трунова, 2007; Колупаев, Карпец, 2010; Гончарова Э.А., 2011; Войников, 2013; Марковская и др., 2013).

Температура относится к абиотическим факторам среды физической природы. Колебания температуры среды могут быть значительными в зависимости как от времени суток, так и сезонна (Тягунова, Ярошенко, 2005;

Дроздов, 2011). Диапазон температур, пригодных для жизни, достаточно широк, около 150 °С (Озернюк, 2003). В частности, рост побегов растений умеренной зоны происходит при температурах 1–25 °С, тогда как для растений тропиков и субтропиков более благоприятны температуры 30–40 °С. Прорастание семян также зависит от температур, например, семена растений умеренной зоны лучше прорастают при 8–20°С, а тропических растений – при 15–30 °С (Лархер, 1978).

В зависимости от широты экологической толерантности вида по отношению к абиотическим факторам, в частности, к температурам, выделяют эвритермные виды, способные переносить значительные колебания температур и стенотермные, характеризующиеся узким диапазоном толерантности (Лархер, 1978; Дроздов, 2011). Адаптационный потенциал видов ограничен и некоторые из них не способны приспособиться к неблагоприятным температурам (Озернюк, 2003).

Растения относятся к пойкилотермным организмам, однако температура надземной части может значительно отличатся от температуры воздуха (Дроздов, 2011).

Температура, являясь одним из глобальных экологических факторов, влияет на численность, разнообразие и распределение видов в разных географических широтах и воздействует на все процессы жизнедеятельности растений (Лархер, 1978). В частности, низкие температуры вызывают торможение ростовых процессов растений, что связано с их влиянием на процессы деления и растяжения (Родченко и др., 1988; Кошкин, 2010). Наряду с этим, установлено их отрицательное воздействие и на другие физиологобиохимические процессы, в том числе реакции фотосинтеза (Pocock et al., 2001; Кошкин, 2010; Theocharis et al., 2012). Показано, что уменьшение интенсивности фотосинтеза прямо пропорционально понижению температуры и продолжительности ее действия, что связано с отрицательным влиянием холода на активность ферментов цикла Кальвина, потерей тургора, уменьшением внутриклеточной концентрации CO2, ингибированием флоэмного транспорта углеводов из листьев и нарушением биосинтеза хлорофилла (Чиркова, 2002; Кошкин, 2010). В зависимости от интенсивности и продолжительности действия низких положительных температур может происходить как стимулирование, так и ингибирование интенсивности дыхания (Чиркова, 2002; Кошкин, 2010). Действие холода также вызывает снижение активности дыхательных ферментов, нарушение электрон-транспортной цепи и активацию альтернативного пути дыхания. Низкие температуры оказывают негативное действие на водный обмен растений, связанное с довольно быстрым снижением водного и осмотического потенциала, а также тургора клетки, что приводит к снижению поглощения воды (Кошкин, 2010). Отрицательное воздействие низкие температуры оказывают и на минеральное питание, ограничивая поступление и распределение ионов по растению. Низкие температуры, влияют и на ультраструктуру клеток (Климов и др., 1997, Трунова, 2007) – вызывают структурные изменения плазмалеммы, цитоскелета хлоропластов и митохондрий (Трунова, 2007; Solanke, Sharma, 2008; Кошкин, 2010). Необходимо отметить, что действие холода приводит к изменению состояния мембран, при этом происходит повышение их проницаемости, что связано с потерей ионов кальция и растворенных веществ, обратному поступлению которых препятствует ограниченная эластичность плазмалеммы (Чиркова, 2002). Изменения происходят и в составе фосфолипидов и стеролов, возрастает уровень свободных жирных кислот (Чиркова, 2002; Трунова, 2007; Кошкин, 2010). Влияние низких температур приводит к усилению накопления свободных радикалов, что может свидетельствовать об усилении перекисного окисления липидов (Чиркова, 2002).

Низкие температуры могут оказывать и стимулирующее действие на растения. Например, длительное воздействие холода в зимний период, является пусковым фактором обновления фотосинтетического аппарата (Мирославов, 1994). Воздействие низких температур необходимо для прорастания семян некоторых растений и перехода ряда видов к стадии цветения и полного завершения жизненного цикла (Березина, Афанасьева, 2009).

В связи с интенсивным развитием промышленности и автотранспорта, к воздействию климатических факторов на растительные организмы добавляется и антропогенное загрязнение окружающей среды. Комплексная оценка экологической ситуации в России показала, что около 40% территории страны характеризуется высокой или средней экологической напряженностью, вызванной загрязнением окружающей среды (Гичев, 2002).

Существует достаточно много видов загрязняющих веществ, которые подразделяют на химические, физические и биологические (Коробкин, Передельский, 2007). Среди наиболее опасных загрязнителей окружающей среды, оказывающих негативное воздействие на все живые организмы выделяют:

диоксид серы, канцерогенные вещества, нефть и нефтепродукты, оксиды углерода и азота, радионуклеотиды и тяжелые металлы (в первую очередь свинец, кадмий и ртуть) (Коробкин, Передельский, 2007). К последним относятся химические элементы, имеющие плотность больше 5 г/см3 и атомную массу более 40 Да (например, Co, Cd, Pb, Hg, Sb и др.) (Кузнецов, Дмитриева, 2013), которые могут приводить к загрязнению окружающей среды в глобальном масштабе (период их полураспада составляет месяцы, года) (Мананков, 2010).

Поступление тяжелых металлов в окружающую среду может происходить как естественным путем, так и в результате деятельности человека (Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989). К природным источникам поступления тяжелых металлов относятся горные породы, вулканы и др., к техногенным источникам – интенсивное развитие металлургической, химической промышленности, транспорта, сельскохозяйственной деятельности (Титов и др., 2007).

За последние годы, площадь загрязнненых тяжелыми металлами земель, в том числе сельскохозяйственного использования, значительно возрасла во многих странах, в том числе и в России. В частности, более 11% территорий жилых поселений опасно загрязнены различными соединениями тяжелых металлов (Яблоков, 2007). Тяжелые металлы являются высокотоксичными элементами для всех живых организмов, так как они способны проникать в клетки и образовывать прочные соединения, связываясь с SH-группами белков и как следствие приводить к инактивации ферментов (Титов и др., 2007).

Из окружающей среды, тяжелые металлы могут поглощаться растениями и далее по пищевым цепям поступать в организм животных и человека, где накапливаются и способны сохранять свое токсическое действие в течение длительного времени.

По способности накапливать тяжелые металлы растения подразделяются на аккумуляторы (накапливающие тяжелые металлы главным образом в надземных органах), индикаторы (содержание металла в них отражает его концентрацию в окружающей среде), исключители (накапливающие металл в корнях, ограничивая его поступление в надземную часть) (Baker, 1981). На уровне целого растения содержание металла от корня к соцветиям уменьшается, что ограничивает их поступление в репродуктивные органы (Титов и др., 2007).

Необходимо отметить, что среди тяжелых металлов кадмий является одним из наиболее токсичных элементов, оказывающих негативное воздействие на важнейшие физиологические и биохимические процессы жизнедеятельности растений (Sanita di Toppi, Gabrielli, 1999; Gallego et al., 2012). Кадмий является высоко мобильным элементом и характеризуется высоким сродством к сере, чем обуславливается его токсическое действие на живые организмы (Paralta-Videa et al., 2009; Gallego et al., 2012). В повседневной жизни кадмий и его соединения широко используются как антикоррозийные покрытия, крепежные детали, при изготовлении батареек и производстве пластмасс, красок и др. При попадании в организм человека кадмий приводит к необратимым нарушениям дыхательной, мочеполовой и других систем, при этом он медленно выводится из организма и соханяет свое токсическое действие в течение длительного времени (Титов и др., 2012).

Тяжелые металлы поступают в растения как из почвы, так и из воздуха (Виноградов, 1985; Кошкин, 2010). Поступление металлов в корневую систему растения может происходить как пассивно (по градиенту концентрации), так и активно (против градиента концентрации) (Costa, Morel, 1994). Поглощение ионов металлов листьями включает проникновение через кутикулу (неметаболический путь) и перенос ионов через плазматические мембраны и протопласт клеток (метаболический путь) (Kannan, 1980).

Как и любой другой неблагоприятный фактор среды, тяжелые металлы негативно влияют на физиологические процессы растений, включая, рост, фотосинтез, дыхание, водный обмен, минеральное питание и др. (Титов и др., 2007; Кошкин, 2010; Кузнецов, Дмитриева, 2013). Они напрямую ингибируют деление и растяжение клеток (Sandalio et al., 1999; Sanita di Toppi, Gabbrielli, 1999; Серегин, Иванов, 2001). Показано, что при действии металла в высоких концентрациях увеличивается продолжительность митотического цикла и замедляется интенсивность клеточных делений (Бессонова, 1991, Серегин, Иванов, 2001; Титов и др., 2007). Тяжелые металлы также влияют и на эластичность клеточных стенок, что приводит к нарушению роста растяжением (Иванов и др., 2003; Галибина, Теребова, 2008). Однако, в низких концентрациях они могут стимулировать ростовые процессы растений (Титов и др., 2007). Действие тяжелых металлов на растения вызывает инактивацию многих ферментов, что приводит к нарушениям физиологических процессов (Кошкин, 2010). В частности, при действии тяжелых металлов происходит подавление биосинтеза хлорофилла (Molas,1997; Souza, Rauser, 2003). Ионы тяжелых металлов оказывают влияние и на ультраструктуру хлоропластов, что может приводить к снижению содержания пигментов и уменьшению интенсивности фотосинтеза (Molas,1997). Отрицательное действие тяжелых металлов на фотосинтез связано с их негативным действием на световые и темновые реакции фотосинтеза и структуру фотосистем (Siedleska, Krupa, 1996;

Krupa, Baszynski, 1995; Sandalio et al., 2001). В высоких концентрациях тяжелые металлы отрицательно воздействуют на процессы дыхания растений, что связано с изменением активности дыхательных ферментов (Van Asscvhe, Clijsters, 1990), нарушением проницаемости мембран митохондрий (Prasad et al., 2001) и функционирования электрон-транспортной цепи (Miller et al., 1973). При высоких концентрациях происходит нарушение водного обмена, в частности, изменение относительного содержания воды в тканях, водного потенциала и транспирации, уменьшение количества и диаметра проводящих сосудов (Kastori et al., 1992; Сазонова, 2007). Между тяжелыми металлами и другими минеральными элементами возможны как антагонистические, так и синергетические взаимодействия, что приводит к ингибированию поступления питательных веществ или повышению уровня того или иного элемента, что в целом приводит к дисбалансу минерального питания (Титов и др., 2007).

В целом, воздействие тяжелых металлов приводит к целому комплексу анатомических, морфологических и биохимических изменений в растениях (Кузнецова и др., 2008; Нестеров и др., 2009; Розенцвет и др., 2010; Теребова, Галибина, 2010).

Как отмечалось выше, все факторы среды действуют на растения, как правило, комплексно. При этом один фактор может усиливать или ослаблять действие другого (Маглыш, 2001). В частности, климатические факторы могут влиять на распространение загрязнителей окружающей среды, например, при высоких температурах газовые выбросы в атмосферу распространяются на бльшие расстояния (Мананков, 2010). В настоящее время имеются лишь единичные работы, посвященные влиянию совместного или последовательного действия разных факторов на растения. Установлено, что механические воздействия (порывы ветра, порез или касание растения и др.) способно повышать устойчивость растений к разным абиотическим и биотическим факторам (экстремальные температуры, засоление, засоление и др.) (Li, Gong, 2011). В частности, в культуре суспензии клеток растений табака оно приводило к повышению их устойчивости к низким и высоким температурам (Li, Gong, 2008; Li, Gong, 2013). Совместное неповреждающее действие высокой температуры и засухи способствовало выживанию растений кукурузы и перца в данных условиях (Liu et al., 2013; Wang, et al., 2003). Показано, что предпосевная обработка семян низкой температурой приводила в дальнейшем к повышению солеустойчивости растений пшеницы (Iqbal, Ashraf, 2010).

Предварительное действие высокой температуры на проростки риса повышало их устойчивость к последующему действию хлорида кадмия (Chao, Kao, 2010), также как и предобработка проростков пшеницы микроволновым излучением (Qiu et al., 2011). Воздействие низкой температуры на проростки пшеницы и арабидопсиса приводило к повышению их устойчивости к свинцу (Титов, Таланова, 2009; Cao et al., 2010). Такой же эффект оказывали высокие закаливающие температуры на проростки пшеницы (Таланова и др., 1996;

Титов и др., 2003). Установлено, что действие УФ-радиации способствовало поддержанию жизнедеятельности растений огурца при высоких температурах (Knigh, 2000). У ряда лекарственных растений (полыни, базилика, чернушки) предварительная обработка УФ-радиацией снижала негативный эффект засоления (Радюкина и др., 2012).

Предполагается, что в повышении устойчивости растений к последовательному или совместному действию неблагоприятных факторов среды важную роль играет активация антиоксидантных ферментов, синтез белковшаперонов или накопление низкомолекулярных аминокислот (Hu et al., 2010;

Grigorova et al., 2011; Радюкина и др., 2012; Cvikrova et al., 2013; Liu et al., 2013). Тем не менее, механизмы адаптации растений к комплексному действию неблагоприятных факторов разной природы остаются малоизученными.

В связи с этим необходимы дальнейшие исследования механизмов кросс-адаптации растений (явления, когда воздействие одного фактора приводит к повышению устойчивости к фактору иной природы).

1.2. Механизмы адаптации растений к действию низких температур Низкая температура относится к факторам, ограничивающим распределение и продуктивность растений (Туманов, 1979; Дроздов и др., 1984; Коровин, 1984; Xin, Browse, 2000; Трунова, 2007; Колупаев, Карпец, 2010). Растения ведут прикрепленный образ жизни и являются пойкилотермными организмами, в связи с чем они не могут активно избегать действие неблагоприятных температур. В ходе эволюции растения приобрели целый комплекс адаптивных реакций, проявляющихся на разных уровнях организации (Кузнецов, 2001), включая усиление экспрессии ряда генов, кодирующих протекторные белки (Sung et al., 2003; Chinnusamy et al., 2006, 2007; Gorsuch et al., 2010; Erikson, Webb, 2011; Heidarvand, Maali-Amiri, 2013), изменение ультраструктуры клеток (Мирославов, 1994; Климов и др., 1997), а также перестройку биохимических реакций (Chen, 1994; Трунова, 2007; Zhu et al., 2007;

Shulze et al., 2012), что в целом приводит и к изменениям на организменном уровне.

В настоящее время установлены адаптивные изменения ультраструктуры клеток при низкотемпературном воздействии у морозостойких растений – уменьшение объема вакуоли, разрастание цитоплазмы, увеличение мембранных элементов (Kratsch, Wise, 2000; Трунова, 2007). Хлоропласты адаптированных растений характеризуются большим количеством тилакоидов, отсутствием крахмальных зерен и увеличением пластоглобул (Трунова, 2007).

Наблюдается и изменение формы митохондрий, образование гантелевидных, чашевидных, с чем может быть связана высокая степень энергетического обмена (Чиркова, 2002).

При действии низких температур происходят значительные биохимические преобразования. Показано, что у морозостойких растений интенсивность фотосинтеза при околонулевых температурах превышает интенсивность дыхания (Климов и др., 2003; Трунова, 2007), это приводит к накоплению сахаров (Hurry et al., 1995; Gusta, Whsniewski, 2012) и других криопротекторных соединений, таких как пролин, глицинбетаин, многоатомные спирты (Чиркова, 2002; Smallwood, Bowler, 2002; Schulze et al., 2012). У морозоустойчивых растений усиливается синтез крахмала (Чиркова, 2002). Обнаружено, что большая доля растворимых сахаров локализована в цитозоле, вакуоли и ряде органелл (Koster, Lynch, 1992; Трунова, 2007). Сахара обладают полифункциональным действием в клетке, в частности играют важную осморегуляторную, криопротекторную роль, обладают антифризными свойствами (Трунова, 2007). Сахара участвуют в стабилизации клеточных мембран разных органелл клетки, также как и в передаче низкотемпературного сигнала (Чиркова, 2002; Климов и др., 2008).

При адаптации растений к низким температурам происходит общее повышение мембранных липидов, в частности фосфатидилхолинов (Трунова, 2007). Обнаружено, что содержание фосфолипидов увеличивается по отношению к белкам (Новицкая и др., 2000). Важную роль играет повышение концентрации ненасыщенных жирных кислот мембранных липидов, что повышает текучесть липидного бислоя (Трунова, 2007).

Как отмечалось ранее, воздействие низкой температуры может приводить к накоплению активных форм кислорода, в ответ на это повышается активность антиоксидантных ферментов (каталазы, пероксидазы, супероксиддисмутазы) и содержания глутатиона (Кошкин, 2010; Xu et al., 2010; Креславский и др., 2012).

Важную роль в механизмах адаптации растений к действию низких температур играют антифризные белки, которые взаимодействуют с кристалами льда, влияя на их морфологию и размер, а также обладают термальным гистерезисом, благодаря чему температуры замерзания и таяния не совпадают (Трунова, 2007). Наряду с повышением содержания антифризных белков наблюдается накопление дегидринов, аквапоринов и белков холодового ответа (Gilmour et al., 1998; Houde et al., 1992; Choi et al., 1999; Аллагурова и др., 2004; Бужко и др., 2004; Hara, 2010). В частности, наблюдается накопление гидрофильных, осмопротекторных белков – дегидринов, принадлежащих к LEA (Late Embryogenesis Abundant) белкам (Hong-Bo et al., 2005; Колесниченко, Войников, 2003; Войников, 2013). Они предотвращают агрегацию белков (Goyal et al., 2005) и препятствуют потере воды клеткой, стабилизируя клеточные мембраны при обезвоживании (Danyluk et al., 1998; Колесниченко, Войников, 2003; Tolleter et al., 2007; Войников, 2013). При действии холода происходит также накопление гидрофильного белка холодового ответа – COR15 (Crosatti et al., 1999; Thomashow, 1999; Takumi et al., 2003; Xin, Browse, 2006; Трунова, 2007), который повышает криостабильность мембран (Колесниченко, Войников, 2003; Трунова, 2007; Кузнецов, Дмитриева, 2013), предотвращая переход из ламеллярной в гексагональную фазу (Колесниченко, Войников, 2003; Трунова, 2007).

В настоящее время активно исследуется экспрессия разных групп генов, продукты которых участвуют в адаптации растений к действию низкой температуры.

Установлено, что при низких температурах происходит повышение экспрессии генов, кодирующих многие транскрипционные факторы. Транскрипционные факторы играют ключевую роль в сигнальных путях и адаптации растений к действию неблагоприятных факторов среды, за счет наличия специфических ДНК-связывающих доменов они способны регулировать (активировать или подавлять) экспрессию генов (Saleh, Pages, 2003). На основании содержания специфических доменов, факторы транскрипции подразделяются на различные семейства.

Семейство ERF (Ethylene Responsive Factors) характеризуется наличием высококонсервативного домена AP2/ERF. При исследовании генома арабидопсиса и риса было выделено и охарактеризовано 122 и 139 генов ERF, соответственно (Nakano et al., 2006). Представители данного семейства обнаружены и у других видов растений, среди которых пшеница (Andeani et al., 2009), тополь (Zhuang et al., 2008), хлопок (Huang et al., 2008). ERF факторы транскрипции играют важную роль в развитии растений, а также в ответных реакциях растений на действие неблагоприятных факторов, в том числе низких температур (Gilmour et al., 1998; Liu et al., 1998; Park et al., 2001; Haake et al., 2002; Yang et a., 2005).

В частности, сверхэкспрессия гена DREB1A способствовала повышению устойчивости как при воздействии засухи, так и холода через активацию экспрессии гена RAB29A у трансгенных растений арабидопсиса (Sakuma et al., 2006). С использованием методов блот анализа и ДНК микрочипов было установлено, что транскрипционный фактор DREB2A способен активировать экспрессию генов, кодирующих белки холодового ответа, такие как RD29A, RD29B, COR17, KIN1, KIN2. Показано, что экспрессия гена DREB1A и его гомологов индуцируется воздействием низкой температуры, в то время как экспрессия гена DREB2A увеличивается при воздействии обезвоживания и засоления (Liu et al., 1998; Andeani et al, 2009). Несмотря на то, что оба гена относятся к одному семейству и имеют сходную структуру, возможно существование разных сигнальных путей для кодируемых ими транскрипционных факторов, поскольку, в отличие от DREB1A, DREB2A вовлечен в пост транскрипционные модификации РНК (Shakuma et al., 2006).

Обнаружено, что 4 гена риса (DREB1A, DREB1B, DREB1C, DREB1D), также экспрессировались при действии низкой температуры (Dubouzet et al., 2003). Интересно, что транскрипционный фактор OsDREBL риса, индуциоровался только воздействием холода, тогда как при засолении, обезвоживании и обработке АБК повышения его экспрессии не наблюдалось (Chen et al., 2003).

Воздействие холода также приводило к повышению экспрессии гена GmDREB3 растений сои (Chen et al., 2007). Стоит отметить, что низкая температура слабо изменяла экспрессию генов пшеницы TaDREB2 и TaDREB3, в то время как воздействие засухи заметно ее усиливало (Morran et al., 2011). C использованием нозерн-блот анализа было показано, что гены MfDREB1 и MfDREB1s растений люцерны также активировались воздействием холода (Niu et al., 2010).

Установлено, что у пшеницы экспрессия гена TaAIDFa, кодирующего транскрипционный фактор, содержащий DRE цис-элемент, активировалась воздействием низкой температуры. Кроме того, ген TaAIDFa, активировал экспрессию генов, содержащих в промоторной области CRT/DRE мотив, и при обычных условиях, что способствовало повышению засухоустойчивости растений (Xu et al., 2008). Ген GhDREB, кодирующий DRE связывающийся транскрипционный фактор, выделенный их растений хлопка способствовал повышению устойчивости к неблагоприятным факторам, в том числе к низким температурам (Gao et al., 2009). Сверхэкспрессия гена ятрофы (Jatropha curcas L) JcDREB, индуцируемая холодом, засолением и засухой, способствовала повышению устойчивости к действию холода и засухи (Tang et al., 2011).

С использованием методов, позволяющих анализировать геном в целом, у рапса были выделены гены DREB семейства (BrDREB1C1, BrDREB1C2, BrDREB1D, BrDREB1F3), которые активировались низкими температурами уже через 30 мин от начала воздействия (Lee et al., 2012). Экспрессия гена MsDREBA5, кодирующего DREB транскрипционный фактор у яблони индуцировалась холодом (Zhao et al., 2012).

Показано, что в условиях действия низких темпераур усиливается экспрессия генов транскрипционных факторов DREB, которые способны активировать гены, кодирующие белки RD/COR (responsive to dehydratation/coldresponsive) (Zhao et al., 2012).

Наиболее исследованными представителями данного семейства AP2 являются CBF транскрипционные факторы, которые характеризуются наличием CRT цис-элемента и за счет связывания со специфическими участками в промоторных областях генов способны как активировать, так и ингибировать их экспрессию. Представители данного семейства были выделены и охарактеризованы у растений арабидопсиса (Gilmour et al., 1998), ячменя (Xue, 2002), пшеницы, рапса (Shen et al., 2003), черники (Polashock et al., 2010), винограда (Takuhara et al., 2011), хлопка (Gou et al., 2011), овсяницы (Jurczyk et al., 2012) и др.

Из генома растений арабидопсиса выделено 3 гена (CBF1, CBF2, CBF3), кодирующих CBF транскрипционные факторы (Gilmour et al., 1998; Medina et al., 1999). Транскрипционные факторы данного семейства играют важную роль в устойчивости растений к воздействию холода, за счет связывания с участками CRT/DRE расположенными в промоторной области COR генов (Saleh, Pages, 2003; Galiba et al., 2009; Medina et al., 2011). Обнаружено, что CBF транскрипционные факторы способны регулировать около 12 % всех генов арабидопсиса, индуцируемых холодом (Medina et al., 2011).

Обнаружено, что экспрессия генов CBF транскрипционных факторов, активируемых холодом, зависит от времени суток и длительности воздействия низких температур (Fowler et al., 2005). Показано, что активация экспрессии генов CBF у арабидопсиса происходит уже через 15 мин от начала действия низкой температуры (Thomashow, 2010). У проростков ячменя отмечено увеличение экспрессии генов HvCBF1 и HvCBF3 уже через 2 ч от начала действия низкой температуры (Xue, 2003). Кроме того, под влиянием низких температур активируется экспрессия генов транскрипционных факторов CBF (VvCBF2, VvCBF4, VvCBFL) у винограда (Takuhara et al., 2011). Экспрессия гена CbCBF1 хлопка, усиливалась через 16 ч от начала воздействия низкой температуры и способствовала повышению холодоустойчивости (Guo et al., 2011).

Следует отметить, что экспрессия гена транскрипционного фактора CBF4 активировалась засухой и АБК, но не наблюдалась при действии холода (Haake et al., 2002). Предполагается, что сверхэкспрессия генов CBF также способствует повышению устойчивости растений не только к обезвоживанию, но и к засолению (Liu et al., 1998; Gilmour et al., 1998).

Транскрипционные факторы NAC типа были впервые обнаружены у растений петунии и названы NAM (no apical meristem) (Souer et al., 1996). В последующие годы представители семейства NAC – No apical meristem (NAM), Arabidopsis transcription activation factor (ATAF), Cup-shaped cotyledon (CUC) были выделены и охарактеризованы и у других видов растений, таких как арабидопсис, рис (Ooka et al., 2003), ячмень (Hao et al., 2011), соя (Le at al., 2011), пшеница (Mao et al., 2012), табак (Rushton et al., 2008), нут (Peng et al., 2009) и тополь (Hu et al., 2010).

NAC семейство – одно из самых многочисленных семейств транскрипционных факторов, специфичных для растений (Shen et al., 2009; Hao et al., 2011; Puranik et al., 2012).

Повышение экспрессии генов NAC наблюдалось при действии низких температур, засухи, засоления, грибковой инфекции (Yoo et al., 2007; Jensen et al., 2007; Nakashima et al., 2007). Один из возможных путей регуляции экспрессии генов, кодирующих стрессовые белки, может осуществляться через активацию DREB/CBF-COR пути. Когда NAC активирует DREB/CBF транскрипционные факторы, которые в свою очередь, активируют COR гены, кодирующие COR белки, обеспечивающие холодоустойчивость растений при воздействии низких температур (Hao et al., 2011). В частности, было показано, что сверхэкспрессия гена GmNAC20, выделенного из растений сои, приводила к повышению соле- и морозоустойчивости растений арабидопсиса (Hao et al., 2011). Обнаружено также, что уже через 2 ч от начала действия низких температур происходит увеличение экспрессии генов (ClNAC2в листьях хризантемы (Huang et al.,2012).

Установлено, что LOV1 (for long vegetative phase 1) - транскрипционный фактор содержащий NAC домен, выделенный из растений арабидопсиса, контролирует время их цветения и активируется в ответ на воздействие холода (Peng et al., 2009). У арабидопсиса было выделено 4 NAC гена (1-4), принадлежащих ATAF подсемейству, включая ATAF2 ген, который индуцируется холодом (Christanson et al., 2010).

Транскрипционные факторы семейства WRKY содержат специфические WRKY-домены, в состав которых входит консервативная последовательность аминокислот WRKYGQK на N-конце молекулы (Zhang, Wang, 2005).

Гены, кодирующие транскрипционные факторы WRKY, выделены и охарактеризованы для ряда видов растений – арабидопсиса (Eulgem et al., 2000), риса (Wu et al., 2005; Peng et al., 2011), ячменя (More et al., 2004), петрушки (Eulgem et al., 1999), пшеницы (Mingyu et al., 2012) и др.

Данный тип регуляторов транскрипции играет важную роль в регуляции развития растений, прорастании семян, а также в формировании устойчивости к абиотическим и биотическим воздействиям, в том числе к низким температурам (Eulgem et al., 2000; Euglem, Somssich, 2007; Таланова и др., 2008).

Обнаружено, что у арабидопсиса транскрипционый фактор AtWRKY63 способен напрямую или опосредованно, через связывание с последовательностью W-box в промоторных областях генов ABF2, регулировать экспрессию гена COR47 (Mingyu et al., 2012). У растений пшеницы повышалась экспрессия генов WRKY16 и WRKY34 при воздействии холода, при этом также усиливалась экспрессия генов WCOR518, WCOR615, WCOR120, достигая максимального значения через 1 сут от начала действия температуры 2С, что может свидетельствовать об участии транскрипционных факторов WRKY в регуляции COR генов и холодоустойчивости растений (Gaudet et al., 2011). Показано, что экспрессия гена HvWRKY38 увеличивалась в листьях ячменя через 2 ч действия низкой температуры и возвращалась на исходный уровень спустя 2 сут действия холода (More et al., 2004). Обнаружено, что у растений ячменя происходило накопление транскриптов гена дегидрина DHN8 после пика увеличения экспрессии гена HvWRKY38, что свидетельствует о регуляции экспрессии транскрипционными факторами WRKY генов дегидринов (More et al., 2004).

Важную роль в механизмах повышения устойчивости растений играют гены холодового шока, в том числе COR гены (сold responsive genes) (Thomashow, 1998; Rorat, 2001; Jan et al., 2009). COR гены выделены и охарактеризованы для таких видов растений, как арабидопсис, люцерна, шпинат, томат, ячмень и пшеница (Wanner, Junttila, 1999; Zalunskaite et al., 2008). Скорость изменения экспрессии COR генов может быть различна. В частности, существуют гены, экспрессия которых в ответ на низкие положительные температуры изменяется быстро, но кратковременно. В основном продукты таких генов накапливаются в пределах нескольких часов с момента начала низкотемпературного воздействия и сохраняются на высоком уровне до того момента, когда растение возвращается в оптимальные для роста и развития условия (Wanner, Junttila, 1999; Fowler, Thomashow, 2002; Mine et al., 2003; Zalunskaite et al., 2008).

С использованием microarray анализа в листьях растений пшеницы было идентифицировано около 200 генов, активируемых низкой температурой (С) через 1 сут действия, и около 300 генов, активность которых возрастала через 3 сут (Kang et al., 2013). В этом случае индуцировалась экспрессия 19ти COR генов, причем большинства из них – уже через 1 сут и еще более усиливалась через 3 сут воздействия. В частности, были идентифицированы гены, кодирующие COR белки: COR14b, COR719, WCOR14a, WCOR413, WCOR80 и др. (Kang et al.,2013).

Установлено, что экспрессия COR генов коррелирует с повышением морозоустойчивости растений (Uemura et al., 1996).

Показано, что у проростков табака экспрессия гена COR15b в листьях, стебле и корнях увеличивается при краткосрочном воздействии температур 0С и -4С, и не усиливается при длительном действии низких положительных температур (12С и 4С). Через 1 сут от начала воздействия холода (4С) индукция экспрессии гена COR15b в корнях более низкая по сравнению с таковой в листьях и стебле. Предполагается, что COR15b способствует стабилизации мембран и поддержанию цитоплазматического гомеостаза, запуская комплекс физиолого-биохимических изменений (Wu et al., 2012).

Экспрессия COR генов обнаружена и у других видов растений, в частности, в листьях Celtis bungeana через 1 сут от начала воздействия температуры 2С происходило накопление транскриптов гена COR15, в то время как в корнях повышения экспрессии данного гена не наблюдалось (Si et al., 2009).

Экспрессия гена COR25 у рапса повышается через 3 ч холодового воздействия (4С), затем через 6 ч снижается, повышаясь вновь через 12 ч после воздействия (Сhen et al., 1994).

Установлено, что у пшеницы СОR белки WCOR15 и WCOR14, индуцированные низкой температурой, транспортируются в хлоропласты и накапливаются в строме. Однако отсутствует прямая корреляция между уровнем морозоустойчивости и накоплением белка WCOR15. На основании этого предполагается, что морозоустойчивость достигается только совместным действием и накопительным эффектом различных COR/LEA белков, у каждого из которых в отдельности эффект действия ограничен (Shimamura et al., 2006).

У растений ячменя выделен белок COR14b, который является гомологом специфического белка листа арабидопсиса – COR15а. Однако в отличие от COR15a, COR14b – гидрофобный белок, его экспрессия наблюдалась также и при воздействии света (Crosatti et al.,1999). Показано, что у проростков озимой пшеницы транскрипты гена WCOR14 накапливались быстро – в течение 3-6 часов после начала действия температуры 4С, а максимум достигался на 3 сут. Основываясь на полученных результатах, авторы заключают, что белок WCOR14 пшеницы является гомологом белка COR 14b ячменя (Tsvetanov et al., 2000). Экспрессия гена WCOR14 специфически индуцируется низкой температурой и сохраняется на высоком уровне в течение периода холодовой акклимации (Tsvetanov et al., 2000).

Установлено, что экспрессия гена WCOR15 специфически экспрессируется при действии низкой температуры и, вероятно, стимулируется светом (Ganeshan et al., 2008). В экспериментах с проростками пшеницы установлена корреляция между уровнем накопления транскриптов и уровнем морозоустойчивости растений. В частности, у озимой пшеницы отмечен более высокий уровень морозоустойчивости и более значительное и быстрое накопление транскриптов по сравнению с яровой пшеницей (Takumi et al., 2003).

Зависимость экспрессии генов COR белков от воздействия света наблюдались и у других видов. Например, показано, что экспрессия гена COR14b при воздействии холода также зависела от спектрального состава света. При воздействии низкой температуры экспрессия гена COR14b была ниже у этиолированных проростков ячменя, чем у растений, произрастающих при нормальных условиях и фотопериоде (Crosatti et al.,1999).

Дегидрины - водорастворимые белки, которые относятся ко II группе класса LEA белков (Late Embryogenesis Abundant) (Close, 1996). Накопление дегидринов обнаружено в зародышах семян в период обезвоживания, однако увеличение экспрессии их генов наблюдается в растениях и при воздействии разных абиотических факторов, таких как засуха, засоление, низкая температура (Close., 1997; Аллагурова и др., 2004; Kosova et al., 2013).

Все дегидрины характеризуются наличием как минимум одной копии консервативного мотива K-сегмента (последовательность богатого лейцином), однако в структуре некоторых белков данного класса встречаются и другие мотивы (Kosova et al., 2007). Многие дегидрины, активируемые холодом у пшеницы, принадлежат к семейству белков WCS120, которое включают как минимум 5 представителей (WCS200, WCS180, WCS66, WCS120), тогда как у ячменя дегидрины представлены белком DHN5 (Kosova et al., 2008).

Известно, что действие температуры 5С и 10С приводит к накоплению белков WCS120 и DHN5 у пшеницы и ячменя, соответственно (Kosova et al., 2013).

В настоящее время показано, что воздействие низкой температуры приводит к индукции генов, кодирующие белки дегидрины. Установлено, что в индукции экспрессии гена TaDHN у проростков пшеницы важную роль играет эндогенная АБК, что свидетельствует о том, что экспрессия гена дегидрина TaDHN пшеницы при гипотермии находится под контролем эндогенной АБК и холода (Шакирова и др., 2009). Экспрессия генов дегидринов WCS и DHN13 у проростков пшеницы и DHN5 у ячменя отмечена как у генотипов, характеризующихся повышенной холодоустойчивостью, так и чувствительных к холоду (Kosova et al., 2011). У растений сои был выделен и охарактеризован ген GmERD14, кодирующий белок, принадлежащий к группе дегидринов, который также индуцировался холодом (Yamasaki et al., 2013). Индукция генов дегидринов при действии холода отмечена и у растений плевела (Gray et al., 1997). Холод приводил также к активации экспрессии генов дегидринов, гомологов семейства пшеницы WCS120, обнаруженных у ячменя (Fowler et al., 2001). Следует особо подчеркнуть, что ген WCS120 у пшеницы специфически индуцируется воздействием низких температур, в то время как его экспрессия не наблюдалась при действии высоких температур, засухи и АБК (Houde et al., 1992).

Исходя из вышеизложеного, можно заключить, что в последние годы активно исследуются механизмы адаптации растений к действию низких температур на разных уровнях организации. Благодаря развитию современных методов, активно изучается экспрессия генов, кодирующих белки, которые играют важную роль в устойчивости растений к холоду. Однако подобного рода исследования преимущественно проводятся на растениях арабидопсиса, и в меньшей степени на других видах растений, в связи с чем результаты зачастую трудносопоставимы между собой.

1.3. Механизмы адаптации растений к действию кадмия Тяжелые металлы, по значению для растений подразделяют на необходимые для их жизнедеятельности в незначительных концентрациях, которые становятся токсичными в очень высоких концентрациях (Zn, Cu, Mo и др.), и не участвующие в метаболизме растений, токсичные даже в низких концентрациях (Cd, Pb, Hg и др.) (Титов и др., 2007, Кузнецов, Дмитриева, 2013).

В ответ на действие тяжелых металлов в токсичных для растений концентрациях у них реализуется комплекс адаптивных механизмов на разных уровнях организации – от организменного до молекулярного (Титов и др., 2007).

Установлено, что на уровне целого растения проявляется ряд механизмов, направленных на ограничение поступления тяжелых металлов, в том числе задержка их поглощения корнями и транспорта в надземную часть, функционирование барьеров на пути транспорта металлов, а также выведение ионов тяжелых металлов из клеток с участием трихом (Косицин, Алексеева-Попова, 1983; Clemens et al., 2002). В частности, в снижении проникновения тяжелых металлов в растения из почвы важную роль играет выделяемая клетками корня слизь, которая содержит соединения, связывающие ионы токсичных металлов (Marschner, 1995; Manara, 2012). Однако данное ограничение поступления ионов тяжелых металлов не всегда оказывается достаточным и они проникают в клетки растений (Чернобровкина и др., 2012; Ветчинникова и др., 2013).

Первым барьером на пути поступления ионов тяжелых металлов в клетки корня является клеточная стенка. Предотвращение поступления ионов металлов в растения достигается за счет их иммобилизации в клеточной стенке, торможения транспорта через плазмалемму и выделения в окружающую среду. Иммобилизация тяжелых металлов может достигаться двумя путями:

накоплением ионов в свободном пространстве и их связыванием с клеточной стенкой (Феник и др., 1995). Связывание ионов тяжелых металлов с клеточной стенкой корня препятствует их дальнейшему проникновению в цитоплазму (Taylor, 1987; Davies et al., 1991; Серегин, Иванов, 2001). Однако, при высоких концентрациях ионов тяжелого металла может происходить "насыщение" клеточной стенки и она не обеспечивает полного блокирования их поступления (Ernst et al., 1992; Manara, 2012). Следующим барьером на пути их поступления в цитоплазму выступает плазмалемма. Изменение функционирования ионтранспортных систем плазматической мембраны приводит к изменению ионного баланса клетки (Bonaly et al., 1980; Hall, 2002). Предполагается, что транспортные белки плазматической мембраны могут участвовать в механизмах повышения металлоустойчивости, к ним, в частности, относятся АТФазы, NRAMP (natural resistance associated macrophage proteins), ZIP (zinc iron proteins) (Guerinot, 2000; Thomine et al., 2003; Manara, 2012) и др. Важным механизмом повышения устойчивости растений к действию тяжелых металлов выступает выведение ионов металлов из клетки (HartleyWhitaker et al., 2001).

Устойчивость растений к тяжелым металлам достигается за счет ограничения проникновения тяжелых металлов в клетку и запуска внутриклеточных механизмов устойчивости (Чиркова, 2002; Hall, 2002). Внутриклеточные механизмы устойчивости к тяжелым металлам включают механизмы их детоксикации, а также механизмы, позволяющие клетке функционировать в присутствии тяжелых металлов и механизмы репарации повреждений (Титов и др., 2007). Важным механизмом детоксикации является хелатирование (образование комплексных соединений ионов тяжелых металлов с лигандами) в цитозоле (Rauser, 1999; Clemens et al., 2002; Manara 2012). В качестве лигандов – соединений, образующих хелатные комплексы с тяжелыми металлами, могут выступать органические кислоты, аминокислоты, металлотионеины и фитохелатины (Rauser, 1999; Cobbett, 2000; Manara 2012). К органическим кислотам, образующим прочные комплексы с ионами металлов, относятся цитрат, малат и оксалат (Wagner, 1993; Rauser, 1999; Титов и др., 2007). В детоксикации тяжелых металлов также участвует гистидин (Hall, 2002; Cobbett, 2007) и никотинамид (Mari et al., 2006; Haydon, Cobbett, 2007).

Важную роль в детоксикации тяжелых металлов играют металлотионеины – низкомолекулярные металлсвязывающие белки с высоким содержанием цистеина (Robinson et al., 1993; Capdevila et al., 2012; Manara 2012). Они обнаружены у животных, растений и грибов (Kumar et al., 2012; Ryvolova et al., 2012). По распределению цистеиновых остатков и количеству ароматических аминокислот металлотионеины у растений подразделяются на 4 типа (МТ 1–4) (Kumar et al., 2012). Образование их комплексов с металлами осуществляется за счет связывания с сульфгидрильными группами цистеина (Zenk, 1996).

Другими важными хелатирующими агентами являются низкомолекулярные пептиды – фитохелатины (Cobbett, 2000; Серегин, 2001; Ogawa et al., 2009; Pal, Rai, 2010). Наличие тиоловых (SH) групп позволяет фитохелатинам связываться с ионами тяжелых металлов и образовывать в цитозоле хелатные комплексы с молекулярным весом 2,5–3,6 кДа (Cobbett, 2000; Серегин, 2009;

Gallego et al., 2012). Образовавшиеся низкомолекулярные комплексы транспортируются в вакуоль с помощью Cd/H+ антипортеров (Salt, Wagner, 1993) и АТФ-зависимых АВС-транспортеров тонопласта (Salt, Rauser, 1995), включая HMT1 транспортер, обнаруженный у дрожжей (Prvral et al., 2009). При этом фитохелатины участвуют не только в механизмах детоксикации тяжелых металлов (Clemens et al., 1999; Серегин, 2001; Gallego et al., 2012), но и в гомеостазе металлов, необходимых для нормального протекания физиологических процессов, например, цинка и меди (Thumann et al., 1991).

Синтез фитохелатинов индуцируется многими тяжелыми металлами, в том числе Cu, Zn, Ag, Au, Hg и Pb, но в наибольшей степени Cd (Rauser, 1995; Cobbett, 2000; Pal, Rai, 2010).

Фитохелатины, в отличие от металлотионеинов, не являются первичными генными продуктами, а синтезируются из глутатиона при участии фермента фитохелатинсинтазы (-глутамилцистеинтранспептидазы) (Robinson et al., 1993; Rauser, 1995; Clemens et al., 1999; Cobbett, 2000; Серегин, 2001; Capdevila et al., 2012).

Глутатион также способен сам образовывать комплексы с тяжелыми металлами. Глутатион представляет собой трипептид (глутамилцистеинилглицин), состоящий из остатков трех аминокислот: цистеина, глицина и глутамина (Серегин, 2001; Estrella-Gomez et al., 2012;

Gallego et al., 2012; Anjum et al., 2012). Глутатион содержит тиоловые группы, посредством которых он способен связываться с ионами металлов и металлоидов (Серегин, 2001; Anjum et al., 2012). Глутатион обнаружен у всех организмов, включая растения, однако он менее эффективно связывает тяжелые металлы, чем фитохелатины.

Железосодержащие белки ферритины связывают такие металлы как цинк, медь, кадмий, свинец у животных, тогда как у растений они способны запасать значительное количество железа (Price, Joshi, 1982; Dedman et al., 1992; Manara, 2012).

Важную роль в механизмах металлоустойчивости играет компартментация и детоксикация в вакуоли ионов тяжелых металлов (Hall, 2002). Транспорт хелатных комплексов в вакуоль происходит с участием белков транспортеров ABC (ATP-binding cassette) (Uraguchi, Fujiwara, 2012; Krmer et al., 2007) и MRP (multidrug resistance associated proteins) (Klein et al., 2007).

Действие тяжелых металлов приводит к накоплению активных форм кислорода (DalCorso et al., 2010; Gill, Tuteja, 2010). В связи с этим, важную роль в адаптации растений играют антиоксидантные ферменты (супероксиддисмутаза, пероксидаза, каталаза), активность которых значительно возрастает в ответ на действие тяжелых металлов, что приводит к нейтрализации свободных радикалов (Шевякова и др., 2003; Wu et al., 2003; Холодова и др., 2005).

Как отмечалось ранее, к внутриклеточным механизмам устойчивости к тяжелым металлам относятся и механизмы репарации повреждений. В данном случае важную роль играет синтез белков шаперонов – БТШ (белков теплового шока) (Sanita di Toppi, Gabbrielli, 1999). В частности, при действии кадмия происходит активация синтеза БТШ с молекулярными массами 20– кДа, которые защищают белки плазмалеммы от токсического действия этого металла (Prasad, 1995; Титов и др, 2007).

В настоящее время, благодаря развитию и широкому применению молекулярно-генетических методов, активно исследуется экспрессия генов, продукты которых участвуют в механизмах адаптации растений к действию тяжелых металлов.

В последние годы появляются сведения о роли транскрипционных факторов в регуляции транскрипции генов, индуцируемых действием тяжелых металлов. Например, активация генов OsDREB1A и OsDREB1B транскрипционных факторов в корнях риса происходила при действии хлорида кадмия (10 мкМ) (Ogawa et al., 2009). В отличие от этого, под влиянием CdCl2 и CuSO4 в более высокой концентрации (150 мкМ) снижалось содержание транскриптов гена LbDREB в листьях и корнях растения галофита Limonium bicolor (Ban et al., 2011).

Помимо этого, установлено, что кадмий и цинк повышают экспрессию генов MYB4, MYB10, MYB72 у растений A. thaliana (Van de Mortel et al., 2008).

Кроме того, кадмий способствовал значительному повышению экспрессии гена MYB28 у Thlaspi сaerulescens (Van de Mortel et al., 2008) и усиливал экспрессию генов MYB43, MYB48 и MYB124 в корнях A. thaliana, в то время как медь не вызывала активации их экспрессии (Weber et l., 2006).

Показано, что под влиянием кадмия и цинка в корнях и листьях A.

thaliana происходит накопление транскриптов гена bHLH100, относящегося к семейству генов, кодирующих транскрипционные факторы bHLH, тогда как у T. сaerulescens повышение экспрессии данного гена наблюдалось только под влиянием кадмия (Van de Mortel et al., 2008).

Установлено также, что кадмий индуцировал у T. сaerulescens экспрессию гена WRKY53, кодирующего транскрипционный фактор WRKY (Wei et al., 2008). Представителями еще одного семейства генов факторов транскрипции, экспрессия которых активировалась кадмием, являются гены bZIP (Liao et al., 2008; Wang et al., 2010).

Как отмечалось выше, факторы транскрипции являются регуляторными белками и способны индуцировать экспрессию других генов, в частности, кодирующих белки, участвующие как во внутриклеточном, так и в дальнем транспорте тяжелых металлов по растению, а также их детоксикации.

В настоящее время выделены и охарактеризованы гены, кодирующие белки-транспортеры, которые обеспечивают как ближний, так и дальний транспорт ионов металлов по растению. Среди основных семейств данных белков, можно выделить: ZIP семейство (Zinc related transporter / Iron related transporter – like Protein), NRAMP (natural resistance associated macrophage protein), CTR (The Copper Transporter Family), АТФаза P1B –типа, АТФаза Vтипа, АВС (ATP-binding cassette), FRD (Ferric Reductase Defective), ОРТ (The Oligopeptide Transporters Family).

У A. thaliana выделено несколько генов, кодирующих ZIP транспортеры – AtZIP1–AtZIP5, AtZIP9–AtZIP12 и AtIRT3, содержание транскриптов которых возрастает при недостатке Zn (Hanikehne, Nouet, 2011). У гипераккумуляторов Arabidopsis halleri и T. caerulescens экспрессия генов ZIP4, ZIP10, IRT3 по мере поступления цинка в растения снижается (Krmer et al., 2007). У арабидопсиса экспрессия гена AtIRT1 активировалась при воздействии никеля, что говорит о возможном участии транспортера IRT1 в аккумуляции и транспорте этого металла (Verret et al., 2004).

У A. halleri и T. caerulescens ген NRAMP3, кодирующий белки, принадлежащие к семейству белков транспортеров NRAMP, экспрессировался преимущественно в корнях, но у A. halleri экспрессия данного гена наблюдалась и в побегах. Кроме того, в корнях T. caerulescens экспрессировались гены NRAMP1 и NRAMP5 (Becher et al., 2004; Talke et al., 2006; Van de Mortel et al., 2006).

Показано, что у A. thaliana экспрессия гена COPT1, кодирующего белоктранспортер COPT, локализованный на плазмалемме, играет ключевую роль в поглощении меди (Sancenn et al. 2004).

Белки-транспортеры семейства CDF / MTP (Metal Tolerance Protein) способны переносить ионы Zn, Cd, Co, Ni и Mn из цитозоля или в вакуоль через тонопласт, или из клетки через плазмалемму (Blaudez et al., 2003; DalCorso et al., 2010). Экспрессия гена AhMTP1 у растений A. halleri повышалась в присутствии цинка преимущественно в листьях (Krmer et al., 2007). Даже незначительное увеличение экспрессии гена AhMTP1 у A. thaliana способствовало возрастанию устойчивости растений к повышенным концентрациям цинка (Krmer et al., 2007).

Белки-транспортеры АТФаз P1B –типа, принадлежащие к суперсемейству АТФаз P-типа, способны переносить катионы металлов через биологические мембраны из цитоплазмы в вакуоль или апопласт против электрохимического градиента за счет энергии гидролиза АТФ (Colangelo, Guerinot, 2006). Восемь АТФаз P1B -типа у A. thaliana и Oryza sativa были переименованы в HMA (heavy-metal ATPases) (Verret et al., 2004; Gallego et al., 2012). Установлено, что при действии высоких концентраций Zn и Cd повышалась экспрессия гена AtHMA4 у арабидопсиса и T. caerulescens, а также генов (OsHMA5, OsHMA6, OsHMA9) у риса (Verret et al., 2004; Verkleij et al., 2009). HMA белки отличаются бльшей селективностью, чем белки транспортеры других классов, в частности, белки HMA2, HMA3 и HMA4 способны транспортировать только катионы Zn и Cd (Krmer et al., 2007).

Белки АТФаз V-типа обеспечивают работу Cd2+ / H+-антипортера. В недавних исследованиях было показано, что кадмий и медь способствуют активации экспрессии генов, кодирующих АТФазы V-типа в корнях растения ячменя и огурца, соответственно (Kabaa et al., 2010; Казнина и др., 2013). В частности, у проростков ячменя под влиянием кадмия наблюдалось усиление экспрессии генов двух субъединиц вакуолярной H+-АТФазы HvVHA c и HvHVA E (Казнина и др., 2013).

Белки АВС-типа принимают участие в транспорте ионов металлов в форме хелатов в вакуоль через тонопласт (Uraguchi, Fujiwara, 2012). В данном семействе выделяют подсемейство MRP (multidrug resistance associated proteins), характерное для млекопитающих, однако гены, кодирующие MRP белки, обнаружены и у растений, в частности арабидопсиса и риса (Klein et al., 2007). Увеличение содержания транскриптов гена AtPDR8, кодирующего белок AtPDR8 АВС-типа, локализованный в плазмалемме арабидопсиса, происходило в присутствии кадмия и свинца, а трансгенные растения со сверхэкспрессией гена AtPDR8 и повышенной металлоустойчивостью не аккумулировали ионы этих металлов (Kim et al., 2007).

Белки-транспортеры FRD вовлечены в гомеостаз ионов Fe. Показано, что экспрессия гена, кодирующего транспортер FRD3, участвующего в загрузке ионов металлов в ксилему и их дальнем транспорте, возрастает в корнях гипераккумуляторов A. halleri и T. caerulescens (Krmer et al., 2007). Кроме того, уровень транскриптов гена FRD3 также повышается в листьях A. halleri в отличие от A. thaliana (Becher et al., 2004; Talke et al., 2006). Суперсемейство ОРТ включает подсемейство YSL (Yellow Stripe-Like). У A. thaliana было выделено 8 YSL белков транспортеров (Colangelo, Guerinot 2006). Показано, что ген AtYSL1 экспрессируется в листьях и пыльце арабидопсиса (Le Jean et al., 2005; Krmer et al., 2007), а ген AtYSL2 – в тканях ксилемы и флоэмы побега и корня (DiDonato et al., 2004).

В целом, белки-транспортеры играют важную роль в поглощении ионов металлов и их транспорте как внутри клетки, так и по растению. Однако наряду с необходимыми для нормальной жизнедеятельности растений металлами растения способны поглощать и ионы токсичных тяжелых металлов. В этом случае запускаются внутриклеточные механизмы детоксикации, к которым прежде всего относится хелатирование металлов (образование хелатных комплексов за счет связывания ионом металлов с различными лигандами) (Rauser, 1999).

Как отмечалось выше, к семейству низкомолекулярных металлсвязывающих белков относятся металлотионеины (Robinson et al., 1993;

Capdevila et al., 2012). Показано, что CdCl2 (2 – 40 мкМ) активировал транскрипцию гена BgMT2 в листьях проростков Bruguiera gymnorrhiza (Huang et al., 2011). В то же время содержание транскриптов гена AmMT2 в листьях Avicennia marina под влиянием ZnSO4 (80 – 1200 мкМ), CuSO4 (50 – 750 мкМ) и Pb(NO3)2 (5 – 100 мкМ) увеличивалось при более высоких концентрациях металлов (Huang, Wang, 2010).

В настоящее время роль металлотионеинов в детоксикации тяжелых металлов все еще изучена недостаточно, однако, имеются сведения о том, что экспрессия гена МТ2 в трансгенных растениях арабидопсиса вызывала повышение их устойчивости к кадмию и меди (Zhigang et al., 2006).

Установлено, что регуляция синтеза фитохелатинов, играющих ключевую роль во внутриклеточном связывании тяжелых металлов (Grill et al., 1987; Rauser, 1995; Cobbett, 2000; Серегин, 2001; Pal, Rai, 2010) осуществляется на уровне экспрессии генов, кодирующих фитохелатинсинтазу, а также генов, кодирующих ферменты синтеза глутатиона. Впервые ген СAD1, кодирующий фитохелатинсинтазу, был выделен у cad1–мутантов арабидопсиса, способных синтезировать достаточное количество глутатиона, но низкое – фитохелатинов (Ha et al., 1999). В последние годы активно исследуется экспрессия генов PCS, кодирующих фитохелатинсинтазу у разных видов растений, в том числе арабидопсиса, риса, пшеницы, горчицы (DalCorso et al., 2010). В частности у Avicennia germinans экспрессия гена AgPCS активировалась под влиянием не только кадмия, но и меди (Gonzalez-Mandoza et al., 2007). Уровень экспрессии гена SmPCS у гипераккумулятора свинца Salvinia minima при действии Pb возрастал в листьях, в то время как в корнях, наоборот, снижался. Несмотря на то, что роль фитохелатинов в механизмах детоксикации тяжелых металлов очевидна, участие фитохелатинсинтазы и самих фитохелатинов в механизмах устойчивости к тяжелым металлам изучено недостаточно полно. Например, известно, что сверхэкспрессия гена AtPCS1 и повышенный уровень фитохелатинов у трансгенных растений арабидопсиса может повышать аккумуляцию кадмия без увеличения устойчивости растений, более того, даже приводит к их гиперчувствительности к кадмию. Отметим, что экспрессия гена пшеницы TaPCS1 приводила к снижению чувствительности мутантов cad1-3 растений арабидопсиса к кадмию и кроме того способствовала дальнему транспорту кадмия, что, в свою очередь, приводило к снижению его накопления в корнях (Gong et al., 2003).

Как отмечалось выше, предшественником фитохелатинов является трипептид глутатион. Его синтез осуществляется в два этапа. Первый этап включает образование -глутамилцистеина из глутамата и цистеина. Данный этап катализируется ферментом -глутамилцистеинсинтетазой. Второй этап заключается в конъюгации -глутамилцистеина с глицином и катализируется ферментом глутатионсинтетазой (Серегин, 2001; Estrella-Gomez et al., 2012).

Установлено, что экспрессия генов, кодирующих ферменты, участвующие в биосинтезе глутатиона, способствует повышению металлоустойчивости растений. Показано, что не только кадмий, но и свинец способствует повышению экспресcии гена SmGS, активации глутатионсинтетазы и аккумуляции глутатиона как в листьях, так и в корнях растения гипераккумулятора Salvinia minima, при этом экспрессия гена SmGS в листьях была выше, чем в корнях (Estrella-Gomez et al., 2012).

Наряду с ферментами биосинтеза глутатиона, важным ферментом его метаболизма является глутатион-S-трансфераза, катализирующая конъюгацию глутатиона с алифатическими, ароматическими, эпоксидными и гетероциклическими радикалами различных ксенобиотиков, действующих на растения (Estrella-Gomez et al., 2012; Anjum et al., 2012). Суперсемейство глутатион-S-трансферазы подразделяется на 7 классов (F, U, L, Z, T, DHAR, TCHQD), из которых характерными для растений являются F и U классы (Moons, 2003; Dixon et al., 2010; Anjum et al., 2012). Известно, что у арабидопсиса семейство генов gst кодирует глутатион-S-трансферазу U класса, представителями данного семейства у риса являются гены osgtu3 и osgtu4.

Показано, что цинк (30 мкМ) и кадмий (20 мкМ) индуцируют экспрессию osgtu3 и osgtu4 генов в корнях проростков риса уже через 2 часа от начала их действия (Moons, 2003).

Таким образом, анализ литературных источников показал, что в настоящее время весьма актуальным остается изучение адаптации растений к воздействию абиотических факторов разной природы. Механизмы адаптации растений к неблагоприятным факторам среды исследуются на всех уровнях организации, однако полного понимания реализации защитных механизмов как при раздельном, а в особенности при совместном действии неблагоприятных факторов пока нет. В литературе имеются данные по изменению экспрессии разных групп генов, как при действии низких температур, так и тяжелых металлов. При этом исследования преимущественно выполнены на модельном генетическом объекте – арабидопсисе. Однако, несмотря на достаточно большое количество сведений, молекулярные механизмы устойчивости растений к абиотическим факторам разной природы, остаются не ясными. В настоящее время накопилось большое количество экспериментальных данных, подтверждающих функционирование в растениях общих систем (механизмов) устойчивости к двум или нескольким факторам различной природы, т.е. явление кросс-адаптации, однако подобные работы, посвященные механизмам устойчивости растений к действию низких температур и тяжелых металлов, единичны. Наряду с этим, отсутствуют сведения о совместном влиянии низких температур и тяжелых металлов на физиологобиохимические и молекулярно-генетические процессы растений, включая экспрессию генов.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве модельного объекта исследований использовали растения озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Московская 39. Данный сорт является среднеспелым, характеризуется высокой зимостойкостью и морозоустойчивостью, устойчив к ранневесенней засухе, твердой головне, снежной плесени и септориозу. Предназначен для получения продовольственного зерна в Центральных и Центрально-Черноземных районах России.

Растения выращивали в рулонах фильтровальной бумаги на питательном растворе (рН 6,2–6,4) с добавлением микроэлементов в климатических камерах при температуре воздуха 22С, его относительной влажности 60–70%, освещенности 10 клк и 14-часовом фотопериоде. По достижении недельного возраста проростки пшеницы подвергали действию низкой закаливающей температуры (4С) или сульфата кадмия (100 мкМ), а также их совместному действию, сохраняя прочие условия неизменными. Продолжительность воздействия составляла от 15 мин до 7 сут. В специальном опыте проростки пшеницы подвергали действию температур 4, 8, 12 С или сульфата кадмия (100–2000 мкМ) в течение 7 сут.

Для измерения биометрических показателей (высота растений, длина и площадь 1-го листа) использовались общепринятые методы.

Устойчивость растений к действию низких температур оценивали по реакции клеток высечек из листьев (площадью около 0,3 см2) на 5-минутное тестирующее промораживание в термоэлектрическом микрохолодильнике ТЖР-02/-20 («Интерм», Россия) при последовательном изменении температуры с интервалом 0,4 (Балагурова и др., 1982). Заданную температуру поддерживали с точностью ± 0,1С. Перед промораживанием высечек из листа на каждую из них наносили кристаллы льда для снятия переохлаждения. Для микроскопирования высечек применяли микроскоп Микмед 2 («ЛОМО», Россия), объектив 40х. В качестве критерия устойчивости использовали температуру гибели 50% паренхимных клеток (ЛТ50), определяемую по деструкции хлоропластов и коагуляции цитоплазмы.

Проницаемость мембран клеток при воздействии низкой температуры, сульфата кадмия и их совместного воздействия определяли по выходу электролитов из высечек листьев пшеницы (длиной 0,5 см) кондуктометрическим методом с использованием кондуктометра («HANNA», Италия). Для этого брали 3 усредненные навески (по 0,5 г) высечек листьев, тщательно промывали дистиллированной водой для удаления со срезов клеточного сока, обсушивали фильтровальной бумагой, заливали 50 мл дистиллированной воды и выдерживали при комнатной температуре 22С в течение 4 ч. Выход электролитов из тканей листа в дистиллированную воду определяли по изменению электропроводности. Полный выход электролитов определяли по электропроводности той же вытяжки после разрушения мембран кипячением. Результирующий выход электролитов рассчитывали в процентах от полного выхода (Гришенкова, Лукаткин, 2007).

Содержание кадмия в корнях и листьях растений определяли методом инверсионной вольтамперометрии с использованием полярографа АВС-1. (Вольта, Россия). Разложение растительных образцов проводили в смеси HNO3 и H2O2 в соотношении 4:1 с использованием микроволновой системы пробоподготовки МС-6 («Вольта», Россия).

Для определения содержания свободного пролина использовали метод Бейтса (Bates et al., 1973). Навеску листьев (0,5 г) гомогенизировали в ступке с 10 мл охлажденной 3%-сульфосалициловой кислоты и гомогенат центрифугировали в течение 5 мин при 5100 g. К 2 мл супернатанта добавляли 2 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл нингидринового реактива содержащего мл ледяной уксусной кислоты, 20 мл 6М H3PO4 и 1,25 г нингидрина. Пробирки, содержащие указанную смесь, помещали на 1 час в кипящую водяную баню. Затем пробы быстро охлаждали во льду. Интенсивность окрашивания комплекса пролина с нингидрином определяли спектрофотометрически при длине волны 520 нм на спектрофотометре СФ-2000. Количество пролина устанавливали по калибровочной кривой, используя стандартные растворы химически чистого L-пролина («Вектон», Россия). Содержание пролина выражали в мкМоль пролина / грамм сырой массы.

Количество глутатиона и фитохелатинов в листьях и корнях пшеницы определяли методом ВЭЖХ. После замораживания образцов корней и листьев в жидком азоте, проводили экстракцию глутатиона и фитохелатинов. Для этого 20 мг материала гомогенизировали в 2 мл раствора 6.3 мМ ледяной диэтилтриаминпентауксусной кислоты (ДТПА) («Sigma», США) и 0.1% трифторуксусной кислоты («Merck»). Гомогенат центрифугировали при об./мин и температуре 4С. Полученные экстракты подвергали предколоночной дериватизации с монобромбинаме (mBBr) («Sigma», США). К 250 мкл экстракта добавляли 450 мкл 200 мМ 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1пропансульфоновой кислоты (НEPP) («Sigma», США) в буфере, рН 8.2, содержащего 6.3 мМ ДТПА, смешивали с 10 мкл 25 мМ mBBr. Готовую смесь инкубировали в темноте при 45С в течение 30 мин. Реакцию останавливали добавлением 300 мкл 1М метансульфоновой кислоты (MСA, «Alfa Aesar»).

Образцы до анализа хранили при 4С в темноте. Разделение глутатиона и фитохелатинов проводили в аналитической колонке Phenomenex Luna 5u С при температуре колонки 37С и скорости потока 0,5 мл/мин согласно методике Е. Снеллер с соавт. (Sneller et al., 2000). Количество глутатиона и фитохелатинов определяли по стандарту глутатиона («Sigma», США). Концентрацию фитохелатинов выражали в нмоль глутатиона эквивалентного г сырого веса. Расчет площадей пиков осуществляли с помощью компьютерной программы МультиХром (Версия 1,5Х). Общее содержание фитохелатинов (ФХ) представлено суммой: ФХ2+ ФХ 3+ ФХ 4.

Накопление транскриптов генов анализировали методом ПЦР в режиме реального времени. Для этого навеску листьев пшеницы (50 мг) растирали в жидком азоте. Тотальную РНК выделяли с помощью набора РНК-Экстран («Синтол», Россия). Для удаления остатков ДНК препарат РНК обрабатывали ДНКазой (10 ед/мл) («Синтол», Россия). кДНК синтезировали, используя набор для обратной транскрипции с М-MLV обратной транскриптазой и случайными (random) гексапраймерами («Синтол», Россия). Количество и качество выделенной РНК и синтезированой кДНК проверяли спектрофотометрически (SmartSpecPlus, «Био-Рад»). Амплификацию образцов проводили в приборе iCycler с оптической приставкой iQ5 («Био-Рад»), используя наборы для амплификации с интеркалирующим красителем SYBR Green («Синтол», Россия). Смесь для ПЦР объемом 25 мкл содержала 1 мкл кДНК (100 нг), мкл реакционной смеси, по 1 мкл прямого и обратного праймеров (10 мкМ) (табл. 1), 1 мкл MgCl2 и 17 мкл деионизованной воды, свободной от нуклеаз.

В качестве референсного гена использовали актин. Протокол ПЦР: 5 мин при 95С, далее 45 циклов 15 с при 95С, 30 с при 56С. Специфичность продуктов амплификации проверяли плавлением ПЦР фрагментов: 1 мин при 95С, 1 мин при 50С, 10 с при 60С (80 циклов, повышая в каждом цикле температуру на 0.5С). Накопление транскриптов генов вычисляли по формуле:

Накопление транскриптов генов = 2Ст(контрольный) – Ст(тестовый образец), где Ст – значения пороговых циклов. В качестве контрольных образцов были выбраны кДНК, выделенные из растений, не подвергнутых воздействию низкой температуры или сульфата кадмия.

Повторности и математическая обработка результатов. Повторность в пределах одного варианта опыта при анализе холодоустойчивости – 6кратная, при биометрических измерениях 40-кратная, при определении проницаемости мембран – 20-кратная, содержания кадмия – 3–5-кратная, содержания непротеиновых тиолов и пролина – 2–3-кратная, ПЦР-анализе – 2– 3-кратная. Каждый опыт повторяли не менее трех раз.

Нуклеотидная последовательность праймеров для проведения ПЦР в Прямой (F) Нуклеотидная последовательность праймера

F GGG ACC TCAC GGAT A ATCTAATG

Actin R AACCTCCACTGAGAACAACATTAC

F AAG CGG CTC CAT GAA CAA CT CG

MYB80 R CTA AGG TAG GTG GTG AAT GTG AAA

F CGG CAG GGC GGA CCA AGT TCA

CBF1 R AGC CAG AGC CTG TAC CCT TGC

F GAT AAG GGA GAG GCG GCG AGG GG

DREB1 R ATG GAG CGA GAA GAG GGA CGA GA

F CTC GCT GGA GAA TG CCG TGG TC

CBF4 R GCA GCA TGT AGA GG CGT CGT TG

F GGG AGC AAC CTC TTC CATAGTGT

WCOR15 R CCAACCCTCACAACCCTTCACTA

F ATT TGC TTC CTT TAC TCG TTT GG

WRAB18 R TTT TTT GTC CTC GTT ATC CAT TT

F GAA GGA ACC GCA ACG CCG ACG CC

WRAB 15 R CTT ACG ACA GAT ACA AGA TAC AC

F CAA GAT GGA GCA CCA GGG GCA

DHN13 R CGC TCA TTC CAG TGG TGT GTC

F CAC GGC ACT GGC GAG AAG AAA GG

WCS120 R TGA TGT TCT CCA TGA CGC CCT TC

F GTG GCT AAT CTC AGG AA

ClpP R GCC CGA TAA TAA GCA CAT A

F TCG CCA TAC TGC CGT TCC

F TTG CGT CTC CTC CTC CCA TCA CC

GS1 R ACG AGT CGG CTG CGG CGA GGT GC

F CCT CGC CTC CCT CTC CGT CGT GC

PCS1 R AGT CGT GGA TGG TGG TCT GGT CG

F GGA GAC AAG TCC CGT GTT GGT AG

WP5CS R GCA GCA ACA GCC ATT TCA CGG AC

Во всех случаях результаты экспериментов обработаны с использованием общепринятых статистических методов. На рисунках и в таблицах представлены средние арифметические значения по нескольким независимым опытам и их стандартные ошибки. Достоверность различий между вариантами опытов оценивали с помощью критерия Стьюдента (при P 0,05).

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Реакция растений пшеницы на раздельное и совместное действие 3.1.1. Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на биометрические показатели растений пшеницы Одним из основных неблагоприятных факторов окружающей среды, лимитирующих рост, развитие и продуктивность растений, является низкая температура (Туманов, 1979; Дроздов и др., 1984; Коровин, 1984; Xin, Browse, 2000; Sung et al., 2003; Войников, 2013). Тяжелые металлы, также как низкая температура и другие экстремальные факторы, могут приводить к торможению роста растений, что рассматривают как их неспецифическую ответную реакцию на изменение внешних условий (Чиркова, 2002; Кошкин, 2010). Нами были изучены закономерности изменения роста пшеницы не только при раздельном, но и совместном действии низкой закаливающей температуры и сульфата кадмия.

Проведенное изучение динамики изменения биометрических показателей растений пшеницы (высота, длина и площадь 1-го листа) при действии ряда пониженных температур (4, 8 и 12С) показало, что чем ниже температура, тем больше замедляются ростовые процессы (табл. 2). Так, например, у растений пшеницы контрольного варианта (при 22С) высота побега за 7 сут опыта увеличилась примерно на 70% по сравнению с исходным уровнем (табл. 3). В отличие от этого, уже в начальный период действия (1 сут) температуры 4С происходило практически полное прекращение роста побега пшеницы, через 2–3 сут начиналось частичное его восстановление, в результате к концу эксперимента (на 7-е сут) высота побега превышала исходный уровень лишь примерно на 20%.

При действии температур 8 и 12С также наблюдалось торможение роста проростков пшеницы, однако в меньшей степени, чем при температуре 4С, в результате к концу опыта высота побега увеличивалась по сравнению с исходным уровнем на 25 и 35%, соответственно.

Сходный эффект температур 4, 8 и 12С отмечен и в отношении роста 1-го листа пшеницы. Установлено, что воздействие наиболее низкой температуры (4С) оказывало самое сильное отрицательное влияние на линейные размеры 1-го листа (табл. 2, 3). В этом случае длина листа за 7 сут опыта увеличилась лишь на 24%, в то время как при температуре 22С за такой же промежуток времени – на 47% (табл. 3). Замедление роста 1-го листа наблюдали и при температурах 8 и 12С, однако в меньшей степени, чем при температуре 4С (табл. 2, 3). Так, за 7 сут воздействия температуры 8С прирост составил около 30%, а при 12С – 40% (табл. 3).

Аналогичные результаты получены и при изучении изменения площади 1-го листа растений пшеницы при воздействии низких температур. Наибольшее негативное влияние на площадь 1-го листа оказывала температура 4С (табл. 4). Прирост площади листа в этом случае за 7 сут опыта составил около 30%, в то время как в контроле – 53%. Меньшее отрицательное воздействие на площадь листа проявлялось при температурах 8 и 12С: ее прирост по отношению к исходному уровню составил 38 и 45%, соответственно.

Таким образом, выявлена прямая зависимость изменения роста растений пшеницы от воздействия на них температуры: чем ниже температура, тем более выражено ее негативное влияние на ростовые процессы. Полученные данные также показали, что хотя при действии температур 4, 8 и 12С происходит торможение роста пшеницы, однако полного его ингибирования не обнаружено. Это свидетельствует о способности растений пшеницы поддерживать процессы жизнедеятельности в изменившихся условиях и адаптироваться к ним.

Влияние низких температур на ростовые показатели растений пшеницы Относительная величина изменений показателей роста пшеницы в зависимости от интенсивности и продолжительности действия Значение показателя по отношению к исходному уровню, % Экспозиция, *Здесь и в последующих таблицах отличия от исходного уровня (22С) достоверны при Р0.05.

Влияние низких температур на площадь 1-го листа растений пшеницы Температура, Отрицательное воздействие низких температур на ростовые процессы растений связано с их влиянием на процессы деления и растяжения клеток (Родченко и др., 1988; Кошкин, 2010). Для ряда видов растений были установлены пороговые температуры, при которых возможно медленное митотическое деление или происходит полное его прекращение (Гриф, 1981). Однако отмечено, что низкая температура вызывает не столько торможение, сколько изменение характера роста у растений пшеницы, что может быть обусловлено сокращением числа делений, и одновременной стимуляцией образования митохондрий в клетках (Кислюк, 1985). Наряду с влиянием низких температур на деление клеток, воздействие на рост растений связано с изменением ряда физиолого-биохимических процессов, в том числе реакций фотосинтеза (Pocock et al., 2001; Theocharis et al., 2012), а также ультраструктуры клеток (Климов и др., 1997; Трунова, 2007).

В ходе нашей работы полное прекращение роста листа проростков озимой пшеницы наблюдали только в течение первых суток действия температур 4 и 8С. В дальнейшем отмечен медленный рост листа, и в результате к концу опыта (через 7 сут) его линейные размеры превышали исходный уровень в зависимости от температуры примерно на 25 – 40%. Эти данные подтверждают точку зрения, согласно которой поддержание активной работы фотосинтетического аппарата у озимых злаков и повышение их устойчивости в период действия пониженных температур осуществляется на фоне торможения ростовых процессов (Hurry et al., 1995; Климов, 2003; Венжик и др., 2012). Такое торможение роста можно рассматривать как защитноприспособительную реакцию растений, поскольку при действии низких температур происходит перестройка метаболизма в целом и сдвиг энергетического баланса в сторону усиления синтеза резервных, энергетических и протекторных соединений, таких как углеводы, необходимых растению для увеличения устойчивости к холоду (Чиркова, 2002; Smallwood, Bowles, 2002;

Климов, 2009; Wenifield et al., 2010).

Результатом подобного рода изменения является преобладание донорной функции (фотосинтеза) над акцепторной (рост) (Климов и др., 1997;

Трунова, 2007; Климов, 2008). Более того, считается, что торможение роста является необходимым условием повышения морозоустойчивости растений, однако только этого не достаточно, необходимы и перестройки метаболизма в целом (Туманов, 1979; Родченко и др., 1988; Войников, 2011).

Как отмечалось ранее, торможение роста является общим проявлением ответной реакции растений и на токсическое действие тяжелых металлов (Нестерова, 1989; Гуральчук, 1994; Vassilev, Iordanov, 1997; Чиркова, 2002;

Титов и др., 2007 и др.). Установлено, что существует достаточно хорошо выраженная дозовая зависимость между концентрацией тяжелого металла, продолжительностью его воздействия и ростовыми показателями (АлексееваПопова, 1991; Maksymiec, 1997; Таланова и др., 2001а; Shi, Cai, 2009; Клаус и др., 2013).

В нашей работе было проведено изучение влияния сульфата кадмия в широком диапазоне концентраций (100 – 2000 мкМ) на ростовые показатели растений пшеницы, в результате которого установлено, что он во всех указанных концентрациях приводит к торможению роста (табл. 5).

Влияние сульфата кадмия на ростовые показатели растений пшеницы Экспозиция, 16,6±0,2 16,4±0,3 16,5±0,3 16,5±0,1 15,4±0,4 16,3±0,2 15,7±0, 19,5±0,2 18,3±0,7 18,4±0,3 17,4±0,4 16,7±0,4 16,6±0,1 16,1±0, 22,0±0,2 20,7±0,4 19,9±0,3 18,3±0,4 17,6±0,3 17,5±0,3 16,6±0, 22,9±0,1 21,5±0,5 20,7±0,3 18,9±0,4 18,2±0,3 18,2±0,3 17,0±0, 26,5±0,2 22,0±0,3 21,6±0,2 19,3±0,2 18,6±0,3 18,6±0,3 17,8±0, 28,3±0,2 22,2±0,3 21,8±0,1 19,5±0,2 18,7±0,3 18,6±0,3 17,8±0, 13,4±0,2 12,9±0,3 12,9±0,2 12,7±0,3 12,2±0,4 13,0±0,3 13,0±0, 15,9±0,2 15,2±0,3 14,9±0,2 14,0±0,3 13,3±0,4 13,4±0,1 13,3±0, 18,0±0,2 17,0±0,3 16,3±0,3 14,9±0,3 14,3±0,4 14,0±0,1 13,6±0, 18,7±0,2 17,8±0,4 17,1±0,3 15,5±0,3 14,8±0,3 14,7±0,1 14,1±0, 19,3±0,3 18,5±0,3 17,9±0,1 15,9±0,2 15,3±0,3 15,1±0,9 14,5±0, 20,1±0,2 18,7±0,3 18,1±0,1 16,0±0,2 15,3±0,3 15,1±0,9 14,5±0, Относительная величина изменений ростовых показателей растений пшеницы в зависимости от концентрации и продолжительности действия Значение показателей по отношению к исходному уровню, % Экспозиция, В частности, высота растений за 7 сут в контрольном варианте увеличилась на 71%, в то время как под влиянием сульфата кадмия в концентрациях 100, 200, 500, 700, 1000 и 2000 мкМ ее прирост составил 32, 40, 18, 21, 14 и 13%, соответственно (табл. 5, 6). Аналогичное действие кадмий в исследуемом диапазоне концентраций оказывал и на размеры 1-го листа (табл. 6). В частности, в контроле длина 1-го листа увеличилась на 50%, в то время как при воздействии сульфата кадмия в концентрациях 100, 200, 500, 700, 1000 и 2000 мкМ – на 45, 40, 26, 25, 16 и 12%, соответственно (табл. 6).

Сходное действие кадмия проявлялось при оценке его влияния на площадь 1-го листа. Так, ее прирост по отношению к исходному уровню в контроле составил около 75%, а при действии сульфата кадмия в концентрациях 100, 200, 500, 700, 1000 и 2000 мкМ – 51, 41, 27, 36, 14 и 9%, соответственно (табл. 7).

Влияние сульфата кадмия на площадь 1-го листа растений пшеницы Концентрация Следует отметить, что торможение роста растений пшеницы проявлялось уже через 1 сут от начала действия кадмия, а с увеличением его продолжительности этот процесс заметно усиливался (табл. 5–7).

Известно, что отрицательное воздействие тяжелых металлов на рост растений обусловлено их влиянием на деление и растяжение клеток, с одной стороны, и нарушением метаболизма, с другой стороны (Ваулина и др., 1978;

Бессонова, 1991; Кошкин, 2010). Установлено, что изменение скорости деления и растяжения клеток при действии тяжелых металлов обусловлено их способностью напрямую связываться с ДНК, влиянием на продолжительность митотического цикла, нарушением формирования микротрубочек и снижением пластичности клеточных стенок (Кошкин, 2010). Известно также, что тяжелые металлы оказывают неблагоприятное воздействие на рост опосредованно через другие физиологические процессы, в том числе фотосинтез, дыхание и минеральное питание (Титов и др., 2007).

На основании полученных данных можно заключить, что кадмий оказывает негативное воздействие на рост растений пшеницы, однако полностью его ингибирует только при высоких концентрациях. Нами не выявлено значительной разницы в степени воздействия сульфата кадмия в концентрациях 100 – 200 мкМ на рост растений. Несмотря на большее торможение роста, при действии сульфата кадмия в концентрациях 500 – 700 мкМ высота растений и размеры 1-го листа продолжают увеличиваться. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что сульфат кадмия в концентрациях 100 – 700 мкМ оказывает негативное воздействие на рост, полностью его не ингибируя, на основании чего можно заключить, что повреждения растений в данном случае не происходит.

Однако при действии сульфата кадмия в концентрациях 1000 – мкМ наблюдалось резкое торможение и даже остановка роста, что может свидетельствовать о повреждающем эффекте этих концентраций на рост пшеницы.

На основании результатов этих исследований с использованием широкого диапазона концентраций сульфата кадмия (100 – 2000 мкМ) и пониженных температур (4, 8 и 12С) для дальнейших экспериментов нами были выбраны температура 4С и сульфат кадмия в концентрации 100 мкМ, при которых происходило заметное замедление роста, однако полного его ингибирования не обнаружено.

В наших опытах низкая температура (4С) действует на все растение, в том числе на надземную часть, а кадмий первоначально поступает в корневую систему и только по истечении некоторого времени транспортируется в побег. В связи с этим нами было исследовано поступление кадмия в корни растений пшеницы.

Рис. 1. Динамика содержания кадмия в корнях растений пшеницы при действии сульфта кадмия (100 мкМ) (а) и совместном действии сульфата Установлено, что уже через 1 час от начала действия сульфата кадмия наблюдалось его поступление в корни пшеницы (рис. 1а). По мере увеличения продолжительности воздействия кадмия, его содержание продолжало повышаться. Значительное накопление ионов кадмия в корнях проростков пшеницы также наблюдалось на 7-е сут эксперимента (32,46 мкг/г сырой массы). При совместном действии кадмия и низкой температуры накопление кадмия в корнях пшеницы наблюдалось через 1 ч от его начала, однако его уровень в данном случае был ниже, чем при действии только кадмия (рис.

1б). При более длительном совместном действии кадмия и низкой температуры его содержание продолжало увеличиваться, достигая максимума (6, мкг/г сырой массы) на 7-е сут опыта, однако и в данном случае оно было меньшим, чем действие только кадмия.

Таким образом, выявлено, что накопление кадмия в корнях растений пшеницы находится в прямой зависимости от продолжительности действия сульфата кадмия как при его раздельном, так и совместном действии с низкой температурой. Отметим, что в случае совместного действия двух факторов содержание кадмия в корнях пшеницы было значительно меньше, чем при обработке сульфатом кадмия в условиях обычной температуры. Поскольку низкие температуры негативно влияют на поглощение и транспорт воды и ионов в растении (Трунова, 2007; Медведев, 2013), то совместное действие двух факторов приводит к меньшему поглощению тяжелого металла и его накоплению в побеге пшеницы.

Учитывая, что в последующих опытах все изменения физиологобиохимических показателей проводились на 1-ом листе, нами было изучено содержание кадмия в листьях проростков пшеницы. Установлено, что через сут от начала действия сульфата кадмия на корни пшеницы происходит значительное поступление и накопление ионов кадмия в листьях (0,67 мкг/г сырой массы) (рис. 2а). С увеличением продолжительности воздействия (2 – сут) его содержание продолжало нарастать, достигая максимума (4,05 мкг/г сырой массы) на 7-е сут (рис. 2а).

В случае совместного действия низкой температуры и кадмия его накопление в надземной части отмечено лишь через 2 сут, причем в меньшей степени, чем при действии только сульфата кадмия (рис. 2б). При более длительных экспозициях (2 – 7 сут) его уровень в листьях повышался, достигая максимума (0,6 мкг/г сырой массы) на 7-е сут эксперимента.



Pages:     || 2 | 3 |


Похожие работы:

«Федорова Ольга Анатольевна Формирование ценностного отношения к природе у младших школьников на основе проектной деятельности 13.00.01 – общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель – Морозова Елена Евгеньевна...»

«Никитенко Андрей Владимирович Активизация познавательной деятельности студентов образовательной организации высшего образования как фактор их личностнопрофессионального становления Специальность: 13.00.08 – Теория и методика профессионального образования ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель : доктор педагогических наук, профессор Поличка А. Е. Красноярск – ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«НОСАЧ Екатерина Сергеевна Микробиологические аспекты диагностики хламидийных и микоплазменных пневмоний у лиц молодого возраста в закрытых коллективах. 03.02.03 – микробиология АВ ТОР ЕФЕР АТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Владивосток 2014 Диссертация выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Тихоокеанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения...»

«ШКАРУПА ЕЛЕНА ВАСИЛЬЕВНА УДК 332.142.6:502.131.1 (043.3) ЭКОЛОГО-ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ РЕГИОНА В КОНТЕКСТЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИ УСТОЙЧИВОГО РАЗВИТИЯ Специальность 08.00.06 – экономика природопользования и охраны окружающей среды ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата экономических наук Научный руководитель Каринцева Александра Ивановна, кандидат экономических наук, доцент Сумы - СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. РАЗДЕЛ 1 ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ...»

«Тригуб Георгий Яковлевич ФОРМИРОВАНИЕ СИСТЕМЫ МЕСТНОГО САМОУПРАВЛЕНИЯ НА ДАЛЬНЕМ ВОСТОКЕ РОССИИ И ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ЕЕ ОРГАНОВ С ГОСУДАРСТВЕННОЙ ВЛАСТЬЮ (вторая половина XIX – первая четверть XX в.) Специальность 07.00.02 – отечественная история Диссертация на соискание ученой степени кандидата исторических наук Научный руководитель кандидат исторических наук...»

«Фомин Алексей Владимирович Динамическая модель равновесия фармацевтического рынка 08.00.13 - Математические и инструментальные методы экономики Диссертация на соискание ученой степени кандидата экономических наук Научный руководитель д.т.н, к.э.н. Акопов Андраник Сумбатович Москва – 2013 Содержание Введение Глава 1....»

«Михалва Наталья Сергеевна МОДЕЛИРОВАНИЕ СОРБЦИИ И ДИФФУЗИИ ЛИТИЯ В МАТЕРИАЛАХ НА ОСНОВЕ -ПЛОСКОСТИ БОРА, ВС3 И КРЕМНИЯ 01.04.07 – Физика конденсированного состояния Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научные руководители: доктор химических наук, профессор Денисов Виктор Михайлович кандидат...»

«Бобынцев Денис Олегович Методы и средства планирования размещения параллельных подпрограмм в матричных мультипроцессорах Специальность 05.13.05 – Элементы и устройства вычислительной техники и систем управления Диссертация на соискание учёной степени кандидата технических наук Научный руководитель : доктор технических наук, профессор...»

«Федотова Наталья Анатольевна УДК 621.65 ВЗАИМОСВЯЗЬ ФОРМЫ МЕРИДИАННОЙ ПРОЕКЦИИ РАБОЧЕГО КОЛЕСА ЛОПАСТНОГО НАСОСА И МОМЕНТА СКОРОСТИ ПОТОКА ПЕРЕД НИМ 05.05.17 – Гидравлические машины и гидропневмоагрегаты Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель Гусак Александр Григорьевич кандидат технических наук Сумы СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ РАЗДЕЛ 1 СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА, АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1.1. Обзор...»

«АДЕЛЬБАЕВА НУРИЯ АДЕЛЬЖАНОВНА Исторический опыт становления и развития школьного образования в Казахстане в XIX - начале XX веков 07.00.02 – Отечественная история (История Республики Казахстан) Диссертация на соискание ученой степени доктора исторических наук Научный консультант доктор исторических наук, профессор Шинтимирова Б.Г Республика Казахстан Уральск, 2 СОДЕРЖАНИЕ...»

«ЗАЙЦЕВ Дмитрий Викторович ФИЗИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РЕЛАКСАЦИИ НАПРЯЖЕНИЙ В ПРИРОДНЫХ МАТЕРИАЛАХ С ИЕРАРХИЧЕСКОЙ СТРУКТУРОЙ Специальность 01.04.07 – Физика конденсированного состояния ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель :...»

«Краева Юлия Валерьевна РАЗРАБОТКА НАУЧНО-ОРГАНИЗАЦИОННЫХ ПОДХОДОВ К ОПТИМИЗАЦИИ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ С ОСТРЫМИ ОТРАВЛЕНИЯМИ НА ДОГОСПИТАЛЬНОМ ЭТАПЕ 14.03.04 – токсикология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : Доктор медицинских наук Брусин...»

«ОСЬМАК Наталья Андреевна ЛЕКСИЧЕСКИЕ ЕДИНИЦЫ ПОВСЕДНЕВНОЙ РАЗГОВОРНОЙ РЕЧИ: ПУТИ ЛЕКСИКОГРАФИЧЕСКОГО ОПИСАНИЯ ИХ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ Специальность 10.02.01 – русский язык ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата филологических наук Санкт-Петербург 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1 РУССКАЯ РАЗГОВОРНАЯ РЕЧЬ КАК ОБЪЕКТ ЛЕКСИКОГРАФИЧЕСКОГО ОПИСАНИЯ: ИСТОРИЯ, ИСТОЧНИКИ...»

«Ульянова Марина Олеговна УГЛЕВОДОРОДНЫЕ ГАЗЫ В ПОВЕРХНОСТНЫХ ДОННЫХ ОСАДКАХ ЮГО-ВОСТОЧНОЙ ЧАСТИ БАЛТИЙСКОГО МОРЯ Специальность 25.00.28 – океанология Диссертация на соискание ученой степени кандидата географических наук Научный руководитель : кандидат геолого-минералогических наук Сивков Вадим Валерьевич Научный консультант : доктор...»

«Аткарская Агата Сергеевна Изоморфизмы линейных групп над ассоциативными кольцами. 01.01.06 математическая логика, алгебра и теория чисел Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научные руководители: д. ф.-м. н. Бунина Елена Игоревна д. ф.-м. н., профессор Михалв Александр Васильевич е Москва Оглавление Введение 1 Основные понятия 1.1 Основные...»

«ХИСАМОВ РАИЛЬ ЗАГИТОВИЧ ПРОЯВЛЕНИЕ МЯСНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ И МОРФОБИОХИМИЧЕСКИЙ СТАТУС ЖЕРЕБЯТ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ В РАЦИОНАХ АДАПТИРОВАННЫХ К УСЛОВИЯМ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН МИКРОМИНЕРАЛЬНЫХ ПРЕМИКСОВ 06.02.08 – кормопроизводство, кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Якимов О.А....»

«Потехин Денис Владимирович ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ МНОГОВАРИАНТНОГО ТРЕХМЕРНОГО ГЕОЛОГИЧЕСКОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ ЗАЛЕЖЕЙ НЕФТИ И ГАЗА 25.00.12 - Геология, поиски и разведка нефтяных и газовых месторождений Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель : Заслуженный...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Смолин, Андрей Геннадьевич Особый порядок судебного разбирательства, предусмотренный главой 40 УПК РФ: проблемы нормативного регулирования и дальнейшего развития Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Смолин, Андрей Геннадьевич Особый порядок судебного разбирательства, предусмотренный главой 40 УПК РФ: проблемы нормативного регулирования и дальнейшего развития : [Электронный ресурс] : Дис. . канд. юрид. наук  : 12.00.09. ­...»

«АФОНИНА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА ФОРМИРОВАНИЕ ГОТОВНОСТИ СТАРШКЛАССНИКОВ К САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ПРИ ПРОФИЛЬНОМ ОБУЧЕНИИ 13.00.01 – Общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация На соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель – доктор...»

«ТУРУК ЮРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СИЛОВЫХ И КОНСТРУКТИВНЫХ ПАРАМЕТРОВ МЕХАНИЗИРОВАННЫХ КРЕПЕЙ СТРУГОВЫХ КОМПЛЕКСОВ Специальность 05.05.06 - Горные машины Диссертация на соискание ученой степени доктора технических наук Научные консультанты:...»






 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.