ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧЕРЕЖДЕНИЕ

«НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ

МЕДИЦИНЫ» СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ

МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

ЯНКЕЛЕВИЧ ИРИНА АЛЕКСЕЕВНА

АНТИМИКРОБНЫЕ БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ КАК ЭНДОГЕННЫЕ

ИММУНОМОДУЛЯТОРЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ СТРЕССЕ

14.03.03– ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ ФИЗИОЛОГИЯ 03.01.04– БИОХИМИЯ

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

д.б.н., профессор В.Н. Кокряков к.б.н., доцент Г.М. Алешина

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2014 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Морфо-функциональная характеристика нейтрофильных гранулоцитов

2.2. Характеристика белков и пептидов нейтрофильных гранулоцитов.. 2.2.1. Лактоферрин

2.2.2. Антимикробные пептиды. Структура. Классификация.

Механизмы действия

2.2.2.1. Дефенсины нейтрофильных гранулоцитов крыс.................. 2.3. Антимикробные белки и пептиды в реакциях врожденного и приобретенного иммунитета

2.4. Физиология стресса

2.5. Стресс и иммунная система

2.5.1. Стресс и система крови

3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ………………..…………………….……. 3.1. Экспериментальные животные и модель исследования …...….…..... 3.2. Получение биологического материала...………..……..…….….…… 3.2.1. Получение экссудата...….…………………..……….….………… 3.3. Выделение дефенсинов из нейтрофилов экссудата крыс ……..……. 3.3.1. Экстракция катионных пептидов из лейкоцитарных клеток.…... 3.3.2. Ультрафильтрация ………..….………………………………….… 3.3.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография …………….… 3.3.4. Удаление примеси липополисахарида.……….....…………..…… 3.4. Электрофоретические методы...……………..………………..……… 3.4.1 Электрофорез в кислой буферной системе …….………...………. 3.5. Иммунохимические методы исследования..………………....……… 3.5.1. Получение антисывороток к дефенсинам..…..…………..……… 3.5.1.1. Конъюгация дефенсинов крысы с овальбумином..…..…… 3.5.1.2. Иммунизация кроликов конъюгатом дефенсинов с овальбумином ………………............………………………… 3.5.2. Выделение антител к дефенсинам крысы из антисывороток.….. 3.5.2.1. Связывание дефенсинов крысы с цианоген бромидактивированной агарозной матрицей …………………..…… 3.5.2.2. Выделение из антисыворотки фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами, методом высаливания.. 3.5.2.3. Выделение антител к дефенсинам крысы из фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами, методом аффинной хромотографии …………………………………… 3.5.3. Конъюгация антител с пероксидазой хрена ……..………………. 3.5.4. Иммуноцитохимический метод анализа сыворотки на наличие специфических антител..………………………………………...... 3.5.5. Процедура иммуноферментного анализа по определению концентрации RatNP-3 в плазме крови экспериментальных крыс 3.5.6. Иммуноферментный анализ по определению концентрации кортикостерона …………………………………..........…………… 3.6. Цитологические методы исследования …………………….…...……. 3.6.1. Подсчет лейкоцитарной формулы крови ……………….……….. 3.6.2. Подсчет количества лейкоцитов в камере Горяева …..…….…… 3.7. Определение примеси ЛПС в пробах ……………………………..…. 3.8. Метод полимеразой цепной реакции ………………………………… 3.8.1. Выделение матричной РНК из спленоцитов крыс …….……….... 3.8.2. Получение кДНК из мРНК ………………………………………... 3.8.3. Проведение полимеразной цепной реакции ……………………... 3.9. Статистическая обработка результатов …………….……………..…. 4.1. Выделение дефенсинов крыс из нейтрофильных гранулоцитов …... 4.1.1. Экстракция катионных белков и пептидов из лейкоцитов крысы 4.1.2. Очистка и разделение дефенсинов методом обращенно-фазовой 4.2. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения 4.3. Иммуномодулирующие свойства антимикробных белков и нейтрофильных гранулоцитов у крыс при экспериментальном стрессе …………………

4.3.2. Динамика изменений экспрессии генов цитокинов и TLR4 в 4.3.3. Влияние введения лактоферрина человека и дефенсина крысы RatNP-3 на лейкоцитарный состав крови, продукцию кортикостерона, экспрессию генов цитокинов и TLR4 крысы в 4.3.4. Влияние введения лактоферрина человека на развитие стрессреакции в условиях экспериментального стресса

4.3.5. Влияние введения лактоферрина и ЛПС на стрессиндуцированные изменения в экспрессии генов про- и 4.3.6. Влияние введения дефенсина крыс RatNP-3 на течение 4.3.7. Влияние введения антител к суммарной фракции дефенсинов 6. ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

серпроцидины) и пептиды (дефенсины, кателицидины) животных являются ведущими молекулярными факторами врожденного иммунитета. За два последних десятилетия активного изучения этих белково-пептидных соединений были описаны их различные структурные и функциональные антимикробная активность. В последнее время появляется все больше данных о том, что роль катионных антимикробных белков и пептидов в защитных реакциях организма не ограничивается только их антибиотическим действием. Особый интерес представляют иммуномодулирующие свойства этих соединений как эндогенных регуляторов иммунного ответа. Показано, что лактоферрин, связывая липид А, может оказывать влияние на иммунные реакции, в которые вовлечены липополисахариды, в частности, на высвобождение цитокинов клетками мононуклеарной фагоцитирующей системы [54]. Кроме того, лактоферрин может избирательно связываться с ДНК и влиять на экспрессию некоторых генов [109]. Существуют публикации, указывающие на возможное участие белков нейтрофильных гранулоцитов - лактоферрина [142] и миелопероксидазы [224] в регуляции синтеза интерлейкина 1 – одного из ключевых модуляторов защитных функций организма [13].

Описано действие антимикробных пептидов (АМП) на ряд таких процессов, как хемотаксис, апоптоз, транскрипция и продукция цитокинов [200; 202]. Кроме того, существуют данные о роли АМП в заживлении ран и ангиогенезе [1; 27; 28].

Одной из самых распространенных причин, вызывающих изменения иммунного ответа, являются стрессирующие воздействия, которые приводят к перераспределительным реакциям лейкоцитов крови, изменению гормонального уровня и продукции цитокинов [12; 235]. Несмотря на то, что нейтрофилез является давно известным и одним из классических проявлений стресс-реакции, биологический смысл этого явления остается до конца не ясным. Поиски ведутся преимущественно в направлении изучения стрессиндуцированных изменений функциональной активности этих клеток [36;

88].

В то же время можно предположить, что те антимикробные белки и пептиды, которые секретируются из нейтрофилов, обладают не только антибиотическим действием, но и в соответствии с принципами регуляции физиологических реакций могут оказывать влияние на развитие стрессреакции и иммунного ответа. Показано, что введение лактоферрина изменяет поведенческие реакции у крыс в тесте «замирания», вызванного страхом [218] иммобилизационному стрессу [87]. В свою очередь, стрессорные гормоны влияют на степень насыщения лактоферрина железом и его функциональные свойства [89].

Установлено, что дефенсины могут влиять на антителообразование [79] и на уровень кортикостероидов в условиях экспериментального стресса у животных [2; 22].

многостороннем характере взаимодействий между антимикробными белками и пептидами, цитокиновой сетью и стрессорными гормонами, многие стороны биологической значимости которых остаются в значительной степени не изученными.

Настоящая работа посвящена изучению роли антимикробных белков и пептидов как эндогенных иммуномодуляторов в регуляции иммунных и нейроэндокринных реакций при экспериментальном стрессе.

Целью работы явилось изучение иммуномодулирующего действия антимикробного белка лактоферрина и пептидов дефенсинов в условиях стрессирующего воздействия на организм экспериментальных животных.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Выделены в высокоочищенном виде дефенсины из лейкоцитов крысы, получены поликлональные антитела к ним и на их основе разработана иммуноферментная тест-система для выявления дефенсина крысы RatNP-3 в биологических жидкостях.

2. Исследована секреция содержимого гранул нейтрофильных гранулоцитов крыс, оцениваемая по динамике изменений концентрации эндогенных дефенсинов в плазме крови крыс с помощью разработанной иммуноферментной тест-системы, в условиях экспериментального стрессирующего воздействия.

противовоспалительных цитокинов в клетках селезенки крыс в условиях иммуносупрессивного стрессирующего воздействия (плавание в холодной воде), введения дефенсина крысы RatNP-3, лактоферрина человека и ЛПС.

продукции кортикостерона и перераспределения лейкоцитов крови при введении экспериментальным животным дефенсина крысы RatNP-3 и лактоферрина человека.

5. Изучена стресс-индуцированная продукция кортикостерона у крыс в использованием специфических антител.

дефенсинов крысы в биологических жидкостях. Установлено, что средняя концентрация дефенсина RatNP-3 в плазме крови у интактных животных составляет 36±6,18 нг/мл (среднее±ошибка среднего), а относительное содержание – 9,82±3,02 нг/1 млн нейтрофилов.

2. Впервые показано, что в условиях экспериментального стресса (плавание в холодной воде при температуре +2°-4°С) имеет место повышение экспрессии генов противовоспалительного цитокина IL-4 и экспериментальных животных.

3. Впервые продемонстрировано, что введение дефенсина крысы RatNP- модулирует перераспределение лейкоцитов крови, уровень экспрессии про- и противовоспалительных цитокинов в клетках селезенки крыс и снижает уровень кортикостерона при экспериментальном стрессе.

4. Впервые показано, что выведение эндогенных дефенсинов крысы из циркуляции с использованием специфических антител влияет на продукцию кортикостерона при экспериментальном стрессе.

Теоретическая и практическая значимость результатов работы компонентов системы врожденного иммунитета – антимикробных белков и взаимодействий в условиях стрессирующего воздействия на организм.

цитокиновой сети – провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, стрессорных гормонов, антимикробных пептидов дефенсинов и антимикробного белка лактоферрина в процессе регуляции защитных функций организма при экспериментальном стрессирующем воздействии. В частности, получены доказательства участия эндогенных дефенсинов в регуляции уровня глюкокортикоидов в крови. Показано, что в условиях экспериментального стресса в клетках селезенки возрастает экспрессия гена паттерн-распознающего рецептора TLR4, что говорит об активации рецепторных механизмов врожденного иммунитета в условиях, не связанных напрямую с взаимодействием организма с патогенами. Продемонстрировано, что введение дефенсинов и лактоферрина нормализует стрессиндуцированые изменения количества нейтрофильных гранулоцитов в крови и экспрессии генов цитокина IL-4 и TLR4 в клетках селезенки.

Результаты работы способствуют расширению представлений о механизмах реализации и регуляции нейроэндокриноиммунных взаимодействий у животных в условиях стрессирующего воздействия.

антимикробных белков и пептидов могут иметь важное практическое значение для разработки на их основе новых лекарственных препаратов, сочетающих в себе свойства антибиотиков и иммуномодуляторов.

1. Разработана иммуноферментная тест-система для выявления дефенсина крысы RatNP-3 в биологических жидкостях. Установлено что средняя концентрация дефенсина RatNP-3 в плазме крови у интактных животных составляет 36±6,18 нг/мл (среднее±ошибка среднего), а относительное содержание – 9,82±3,02 нг/1 млн нейтрофилов.

Эмоционально-физическое стрессирующее воздействие (плавание в холодной воде) вызывает повышенную секрецию дефенсинов, оцениваемую по концентрации дефенсина, отнесенной к абсолютному количеству нейтрофилов.

2. Введение лактоферрина человека и дефенсина крысы RatNP- снижает индуцированное стрессом повышение концентрации кортикостерона в крови крыс через 30 минут после аппликации стресса.

3. Лактоферрин человека и дефенсин RatNP-3 нормализуют стрессиндуцированный сдвиг лейкоцитарной формулы крови.

4. Дефенсин RatNP-3 и лактоферрин человека снижают стрессиндуцированное повышение экспрессии гена противовоспалительного цитокина IL-4, а также гена паттерн-распознающего рецептора TLR4 в спленоцитах крыс на сроке 3 часа после аппликации стресса.

5. Введение ЛПС не влияет на модулирующее действие лактоферрина в отношении стресс-индуцированной экспрессии генов IL-4 и TLR4 в селезенке крыс и это иммуномодулирующее действие не связано с кортикостатической активностью лактоферрина.

6. Введение антител к дефенсинам крысы влияет на стрессиндуцированный уровень корикостерона в крови, поддерживая высокий уровень гормона через 3 часа после стрессирующего воздействия.

Материалы диссертации изложены в 9-и публикациях, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК, в том числе представлены на международных и Всероссийских конференциях:

1. III Международный Симпозиум “Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии”, 7 – 10 июня, 2011 г., иммунной систем в норме и патологии”, 18 – 21 июня, 2013 г., СанктПетербург, Россия.

3. Объединенный иммунологический форум – 2013, 30 июня – 5 июля 2013 года, Нижний Новгород, Россия 4. 38-ой Конгресс Федерации Европейских биохимических обществ, Санкт-Петербург, Россия, 6 – 11 июля, 2013 г.

5. XI Международная конференция по лактоферрину: структура, функции и применение, 6 – 10 октября, 2013 г., Рим, Италия.

Диссертация изложена на 147 страницах и включает 50 рисунков, таблицы.

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов работы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Библиографический указатель содержит 247 источников, в том числе 28 работ на русском и 219 – на иностранных языках.

Антимикробные белки и пептиды животных представляют собой ключевые молекулярные факторы врожденного иммунитета. Механизмы реагирование организма животных и человека на инфекцию, заключающееся в распознавании ее природы, дискриминации от «своего» и последующей элиминации патогенного начала. У позвоночных эта система иммунной защиты является также базовой, определяющей как резистентность к большинству инфекционных агентов, так и осуществляющей инструктивную роль в реализации иммунных реакций приобретенного типа, которые протекают с участием иммуноглобулинов и Т-лимфоцитов [11; 95].

специальных рекогносцировочных и эффекторных молекулярных факторов, которые появились и были отобраны в ходе эволюции. По современным представлениям функции эффекторных молекул выполняют антимикробные белки и пептиды (АБП). В настоящее время охарактеризовано более тысячи полипептидов и белков с антимикробными свойствами, выделенных из тканей различных видов позвоночных и беспозвоночных животных.

Некоторые из этих соединений, локализованы в гранулах фагоцитарных клеток, другие являются гуморальными факторами и выявляются в различных биологических жидкостях организма.

детектируют стереотипные и консервативные в эволюции молекулы иммунологической литературе название «патоген-ассоциированных молекулярных паттернов», а распознающие их структуры животных клеток и жидкостей получили наименование «паттерн-распознающих рецепторов паттерны представляют собой типовые макромолекулы, свойственные липополисахаридов грамотрицательных бактерий, пептидогликаны клеточной стенки бактерий, липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий, формилметиониловые пептиды как N-концевые фрагменты синтезируемых бактериями белков, белок бактериальных жгутиков микроорганизмов, двуспиральные и односпиральные РНК вирусов). Они детектируются паттерн-распознающими рецепторами клеток иммунной (нейтрализирующих и элиминирующих патогены) механизмов врожденного иммунитета. Паттерн-распознающие рецепторы (молекулы) могут быть липополисахарид-связывающий белок, пептидогликан-распознающие белки, компоненты системы комплемента, антибиотические пептиды), так и макрофагальный маннозный рецептор, Toлл-подобные рецепторы, NOD белки, скавенджер рецепторы). Рассматривая эволюционное происхождение этих молекул, необходимо отметить, что многие из них или их предковые формы имеют отношение к морфогенетическим процессам (резорбция, метаморфоз, апоптоз), а их участие в иммунных реакциях формируется в результате межмолекулярных взаимодействий в каждой конкретной ситуации, связанной с необходимостью обеспечения стерильности внутренней среды животного организма [11].

В то же время по мере расширения спектра исследованных патогенассоциированных паттернов и соответствующих рецепторов накапливалось все больше данных о том, что эта система не ограничивается только противоинфекционной защитой организма. Показано, что значительное количество эндогенных соединений, получивших название "аларминов" [241], среди которых есть и антимикробные белки и пептиды нейтрофильных гранулоцитов (лактоферрин, миелопероксидаза, дефенсины), являются лигандами паттерн-распознающих рецепторов [52; 104; 181]. Также в работах отечественных исследователей было показано, что нейтрофильные гранулоциты и их гранулярные белки и пептиды оказывают регулирующее влияние на систему мононуклеарных фагоцитов, иммунный, воспалительнорепаративный ответы, эритропоэз, противоопухолевую устойчивость [7].

В свете этих данных можно предположить, что роль нейтрофилов (и их антимикробных белков и пептидов) в системе защитных реакций организма не ограничивается только противоинфекционным действием, начало исследованиям которого положили классические морфофизиологические работы И.И. Мечникова и его учеников, изучавших феноменологию фагоцитарного процесса, осуществляемого нейтрофильными гранулоцитами (микрофагами) и макрофагами, и показавших его незаменимую роль во врожденном иммунитете животных к инфекционным агентам различной биологической природы.

2.1. Морфо-функциональная характеристика нейтрофильных до 1011 клеток, средний период полувыведения которых из циркуляции составляет 6-8 часов. Нейтрофилы - наиболее мобильные клетки организма.

Нейтрофильный гомеостаз определяется тонким балансом между гранулоцитопоэзом, нахождением в костном мозге, выходом в кровяное русло, пристеночным стоянием, клиренсом и деструкцией. Клетки маргинального пула уходят в определенные органы (селезенку, печень, костный мозг, слизистую желудочно-кишечного тракта), где они осуществляют свои функции, а потом входят в апоптоз и подвергаются перевариванию макрофагами [175].

Зрелый НГ, выходящий из костного мозга в кровь и ткани, содержит в своих гранулах в преформированном состоянии большинство белковопептидных веществ, необходимых для выполнения своей основной, наиболее изученной функции – защиты макроорганизма от инфекционных агентов путем фагоцитоза. Формирование этих структур происходит на ранних этапах гранулоцитопоэза НГ в костном мозге, где гранулоциты проходят несколько последовательных стадий созревания, каждая из которых характеризуется специфическими морфобиохимическими изменениями.

Начальная клетка – миелобласт, образующаяся в результате деления унипотентной клетки-предшественницы, имеет незернистую цитоплазму и большое овальное ядро. Миелобласт путем деления дает начало промиелоциту. Интенсивный синтез РНК, липидов, полисахаридов и белков – основная особенность обмена веществ промиелоцита. На этом этапе от внутренних цистерн пластинчатого комплекса начинают отпочковываться инициальные вакуоли. Слияние таких вакуолей уже вне зоны аппарата Гольджи приводит к формированию в промиелоцитах азурофильных (первичных) гранул [135].

В зрелых азурофильных гранулах содержатся дефенсины, кислые глюкуронидаза, -маннозидаза, катепсин D, катепсин В), нейтральнощелочные протеазы (эластаза, катепсин G), лизоцим и миелопероксидаза (МПО). Прекращение синтеза МПО совпадает с окончанием формирования азурофильных гранул и переходом клетки после одного-двух делений в следующую стадию дифференцировки – миелоцитарную [60].

На этом этапе своего созревания клетка уменьшается в размерах, ядро становится сегментированным, хроматин более конденсированным. Заметно уменьшается количество митохондрий, рибосом, начинает редуцироваться эндоплазматический ретикулум и комплекс Гольджи. Вместе с тем идет синтез новых белков и образование еще одного типа гранул – специфических (вторичных). В отличие от азурофильных в этом случае инициальные вакуоли отпочковываются от внешних цистерн аппарата Гольджи. Так же как и азурофильные, зрелые специфические гранулы образуются путем слияния инициальных вакуолей и конденсации их содержимого. Специфические электронноплотные [135].

Содержимое специфических гранул существенно отличается от такового азурофильных. Общим белком для обоих типов гранул является только лизоцим. В специфических гранулах отсутствуют кислые гидролазы, для них характерно присутствие лактоферрина, белка, связывающего витамин В12, из нейтральных протеиназ содержится только разновидность коллагеназы – желатиназа [60].

Миелоцит является последней делящейся клеткой миелоидного ряда лейкоцитов. На последующих стадиях созревания НГ (метамиелоцита, палочкоядерного и сегментоядерного НГ), не сопровождающихся делением клеток, наблюдается гетерохроматинизация ядерного материала, редукция гранулообразование продолжается вплоть до стадии палочкоядерного НГ, основным белком которых является желатиназа [60; 174].

Кроме разницы в содержимом, гранулы еще различаются по степени и последовательности их участия в экзоцитозе (дегрануляции) в ответ на секреторные везикулы [59; 116; 207]. Содержимое этих везикул составляют белки плазмы крови [116; 212]. В то же время их мембрана содержит большое количество рецепторов (табл. 2.1.1 [60]), которые при мобилизации везикул становятся частью рецепторного аппарата мембраны нейтрофила и способствуют его превращению из «пассивной» клетки, циркулирующей в способствует миграции нейтрофилов в ткани [30]. Далее выделяют свое содержимое во внеклеточную среду – желатиназные (третичные) гранулы, затем – специфические (вторичные) и в последнюю очередь – азурофильные (первичные) [164; 206; 238; 239; 240].

В очаге воспаления имеет место полная активация нейтрофилов, инициирующая окислительный взрыв и мобилизацию специфических и азурофильных гранул. Эти гранулы сливаются с фаголизосомой или высвобождают свое содержимое в ткани. Слияние специфических гранул с плазматической мембраной НГ особенно важно для реализации окислительного взрыва, так как цитохром b558, являющийся ведущим компонентом НАДФН-оксидазной системы, исходно расположен на мембране специфических гранул [233].

Хотя способность зрелых нейтрофилов к синтезу de novo очень ограничена, для активированных клеток показано увеличение экспрессии целого ряда генов, включая гены цитокинов (IL-1, IL-12, TNF и др.), хемокинов (IL-8, MIP-1, MIP-1) и транскрипционных факторов (NFB, IRF3 и др.) [103; 196].

Таблица 2.1.1 Содержимое гранул нейтрофилов гранулоцитов человека

SCAMP DAF

Азуроцидин/CAP37/гепарин Бактерицидный белок, увеличивающий проницаемость мембран Гепариназа -глицерофосфатазная кислота Лизоцим N-ацетил--глюкозаминидаза Протеиназа- Сиалидаза Убиквитин-белок 2.2 Характеристика белков и пептидов нейтрофильных гранулоцитов Необходимо отметить, что секреция содержимого гранул происходит не только во время фагоцитоза в местах воспаления. В плазме крови в норме всегда присутствуют гранулярные белки и пептиды, количество которых может меняться при некоторых заболеваниях. С точки зрения клиницистов, эти белки и пептиды прежде всего – маркеры функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, которые рассматриваются в качестве ведущих клеточных факторов врожденного иммунитета, а также как универсальные звенья гомеостаза, реагирующие на многочисленные сигналы о нарушении постоянства внутренней среды [17]. Выявление этих соединений связано, вопервых, с использованием их для оценки резервных возможностей защитных функций макроорганизма, во-вторых, для определения глубины и динамики патологических процессов, прежде всего связанных с инфекцией.

В работах, посвященных выявлению гранулярных белков нейтрофилов в биологических жидкостях - чаще всего миелопероксидазы, лактоферрина и дефенсинов - показано, что инфекционный процесс приводит, как правило, к первоначальному повышению содержания этих белков и пептидов в сыворотке и плазме крови [5; 9; 44; 94; 151; 183; 184; 203], которое снижается до нормы при благоприятном течении болезни. Резкое возрастание концентрации этих белков в крови особенно характерно для бактериальных инфекций: сепсиса [94; 183], муковисцидоза, бактериальной инфекции нижних дыхательных путей [44], пневмонии [9], перитонита [15].

Несколько иная картина имеет место при вирусных заболеваниях.

Показано, что при некоторых острых вирусных инфекциях содержание ЛФ в нейтрофилах и плазме крови снижается [49]. ВИЧ-инфицированные пациенты имеют уровень ЛФ в плазме крови значительно ниже нормы [122].

Установлено, что в ходе обострения хронической герпетической инфекции уровень ЛФ в сыворотке крови не превышает норму, но возрастает по мере развития ремиссии, в то время как уровень МПО остается выше нормы на всем протяжении заболевания, как при обострении, так и при ремиссии [26].

Данные, полученные при исследовании содержания МПО, ЛФ и дефенсинов в сыворотке крови при различных инфекциях позволяют сделать вывод, что такие измерения дают возможность не только прогнозировать течение болезни, но и диагностировать различные формы заболевания. Так повышение уровня МПО в сыворотке крови больных бронхиальной астмой говорит о бактериальной природе заболевания [44].

многофункционального белка, маркера специфических гранул нейтрофильных гранулоцитов и антимикробных пептидов, содержащихся в азурофильных гранулах, так как эти соединения являются объектом наших исследований.

Лактоферрин (ЛФ) – катионный белок с молекулярной массой около кДа, являющийся гликопротеином, который относится к семейству трансферриновых железосвязывающих белков. Впервые ЛФ был выделен Соренсеном и Соренсеном из коровьего молока в 1939 году. В 1960 году тремя независимыми лабораториями было установлено, что ЛФ является основным белком связывающим железо в молоке человека [105; 132; 167]. В последующих исследованиях было установлено, что основным источником ЛФ в плазме крови являются специфические гранулы нейтрофилов [46].

Кроме того, ЛФ был обнаружен в различных жидкостях организма, включая слезы, слюну, жидкости бронхоальвеолярного лаважа, вагинальные выделения и семенную плазму [158]. Лактоферрин человека состоит из одной полипептидной цепи, уложенной в две глобулярные доли [39], с Cкарбокси) и N- (амино) концевыми участками полипептидной цепи. Доли соединены между собой -спиральным участком. Каждая доля состоит из двух доменов и обладает железосвязывающим сайтом. Способность лактоферрина связывать железа на два порядка выше, чем у трансферрина, который может служить в некоторых случаях в качестве донора ионов Fe3+.

Два иона трехвалентного железа могут быть связаны одной молекулой лактоферрина [34; 48; 112]. Существуют три формы насыщения ЛФ железом:

аполактоферрин (свободная от железа), моноферрин (содержащая один ион трехвалентного железа) и хололактоферрин (связывает два иона Fe3+).

Третичные структуры у холо- и апо- форм белка отличаются. Лактоферрин способен связывать большое количество других соединений, таких как липополисахарид (ЛПС), гепарин, гликозаминогликаны, ДНК и ионы других металлов таких, как Al3+, Ga 3+ сродство к этим ионам значительно ниже, чем к железу. Одновремено со связыванием металлов лактоферрин связывает анионы, такие как карбонат, оксалаты, карбоксилаты и другие [217].

Лактоферрин является одним из ключевых молекулярных компонентов первой линии противоинфекционной защиты. Помимо железосвязывающей противомикробной активностью против широкого спектра бактерий, грибов, противовоспалительным, детоксицирующим и противоопухолевым эффектами [73], а также ферментативной активностью [170].

Лактоферрин обладает широким спектром антимикробного действия в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий.

Основной механизм антимикробного действия ЛФ связывают с его способностью связывать необходимое для метаболизма микроорганизмов железо и другие металлы переменной валентности, причем даже при низких значениях рН [152]. Другое представление о механизме действия ЛФ говорит о том, что антимикробный эффект в отношении грамположительных бактерий основан на электростатическом связывании лактоферрина с анионными молекулами на поверхности бактерий, такими как липотейхоевые кислоты, приводящем к снижению отрицательного заряда на клеточной стенке, что способствует ферментативному лизирующему действию лизоцима на пептидогликан [150].

Лактоферрин обладает противовирусной активностью в отношении широкого спектра РНК и ДНК-вирусов, инфицирующих человека и животных. Также ЛФ проявляет активность в отношение безоболочечных вирусов, таких как аденовирусы и энтеровирусы. Одна из наиболее распространенных гипотез противовирусного механизма действия ЛФ, говорит о том, что ЛФ связывает и блокирует гликозаминогликановые вирусные рецепторы, особенно гепарансульфат (HS). Связывание ЛФ и HS предотвращает первый контакт между вирусом и клеткой-хозяином и, следовательно, предотвращает инфицирование последней [42].

Было отмечено, что ЛФ оказывает антимикробное действие на Candida albicans и Candida krusei путем изменения проницаемости клеточной стенки, как это происходит при взаимодействии белка с бактериями [134]. Кроме того, показано фунгицидное действие ЛФ в отношение Aspergillus fumigatus [115] и Trichophyton mentagrophytes [139].

Апо-ЛФ обладает наибольшей амебоцидной активностью в отношении E.histolytica in vitro. Он связывает липиды на мембране, вызывая её разрушение и гибель паразитов [37].Другие лабораторные исследования показывают активность ЛФ против Toxoplasma gondii, механизм действия ЛФ в этом случае связан с ингибированием внутриклеточного роста T.gondii в клетках хозяина [228].

В некоторых реакциях ЛФ проявляет энзиматическую активность. ЛФ обладает амилазной, ДНК-азной, АТФ-азной, РНК-азной активностью и другими [81; 170]. Особенности проявления ферментативной активности могут зависеть от многих причин: наличие нескольких изоформ; степень гликозилирования; особенности третичной структуры и степень олигомеризации [99].

В то же время следует отметить, что лактоферрины разных видов животных отличаются значительной гомологией первичной и третичной структур. Так, лактоферрины человека и крысы имеют 75% гомологии (идентичны на 62%) (см. табл. 2.2.1.1).

Такая консервативность первичной структуры лактоферринов делает их удобным объектом для исследования особенностей функционирования механизмов врожденного иммунитета на экспериментальных моделях. А полифункциональность и широкая распространенность в организме служат основанием для их изучения в качестве эндогенных иммуномодулирующих молекул.

Табл 2.2.1.1 Сравнение первичных структур структур лактоферрина человека и Метод в поисковой программе BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Compositional matrix adjust. 428/687(62%) 522/687(75%)

ЛФ крысы 12 GVLGPFLA-RIDTVVRWCTISRNEAQKCFMWQEMLNKAGVPKLRCARKYFMPHCIQEIMM

ЛФ человека 12 GALGLCLAGRRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCIQAIAE

ЛФ крысы 71 RRADAMTLSGSAIFDFYF-PYKLQPIAAEVYGTKEKPRIHYYAVAVVKNSSDIRLNQLQG

ЛФ человека 72 NRADAVTLDGGFIYEAGLAPYKLRPVAAEVYGTERQPRTHYYAVAVVKKGGSFQLNELQG

ЛФ крысы 130 LKSCHAGFDTSAGWIAPLGALRPYLNWDEKSVSLEEAVSKFFSQSCVPGISKSRFPRLCS

ЛФ человека 132 LKSCHTGLRRTAGWNVPIGTLRPFLNWTGPPEPIEAAVARFFSASCVPGADKGQFPNLCR

ЛФ крысы 190 LCAGKGEHICDFSPQEPYAGYAGAFRCLRDNAGDVAFIRESTIFEELPNEAEWDQYKLLC

ЛФ человека 192 LCAGTGENKCAFSSQEPYFSYSGAFKCLRDGAGDVAFIRESTVFEDLSDEAERDEYELLC

ЛФ крысы 250 PDNTWKPVTEYKECHLAQIPSRAVVAHVRSEKDSAIWELLHLSQEMFGKNKTSKFELFGS

ЛФ человека 252 PDNTRKPVDKFKDCHLARVPSHAVVARSVNGKEDAIWNLLRQAQEKFGKDKSPKFQLFGS

ЛФ крысы 310 YLGQKDLLFKDSVIGFVRVPFTVNVWLYLTFSYIMALKSLKESKENVMALRARITWCAVG

ЛФ человека 312 PSGQKDLLFKDSAIGFSRVPPRIDSGLYLGSGYFTAIQNLRKSEEEVAARRARVVWCAVG

ЛФ крысы 370 SEEKLKCDQWSRVSVGKITCISCTTTEQCIFSITMGDADAMNLDGGYIYSAGKCGLVPVL

ЛФ человека 372 EQELRKCNQWSGLSEGSVTCSSASTTEDCIALVLKGEADAMSLDEGYVYTAGKCGLVPVL ЛФ крысы 430 AEIQKSPNSNGSD--CVDRPAEGYLAVAAVRKEDTGFTWSTVRGKKSCHTAVDRTAGWNI

AE KS S+ D CVDRP EGYLAVA VR+ DT TW++V+GKKSCHTAVDRTAGWNI

ЛФ человека 432 AENYKSQQSSDPDPNCVDRPVEGYLAVAVVRRSDTSLTWNSVKGKKSCHTAVDRTAGWNI

ЛФ крысы 488 PMGLLVNQTNSCQFKEFFNKSCAPGSFLYSNLCALCIGDENGKDKCNPNSQERYQGYVGA

PMGLL NQT SC+F E+F++SCAPGS SNLCALCIGDE G++KC PNS ERY GY GA

ЛФ человека 492 PMGLLFNQTGSCKFDEYFSQSCAPGSDPRSNLCALCIGDEQGENKCVPNSNERYYGYTGA

ЛФ крысы 548 FRCLAEKAGNVAFLKDATVLQNTDGKNADKWAKNLKLDDFELLCLDDTRKPVTEAKNCHL

FRCLAE AG+VAF+KD TVLQNTDG N + WAK+LKL DF LLCLD RKPVTEA++CHL

ЛФ человека 552 FRCLAENAGDVAFVKDVTVLQNTDGNNNEAWAKDLKLADFALLCLDGKRKPVTEARSCHL

ЛФ крысы 608 AVAPNHAVVARKDKARLVQQELLYQQVQFGRNGCRCPEEFCLFRSETKNLLFNDNTECLA

ЛФ человека 612 AMAPNHAVVSRMDKVERLKQVLLHQQAKFGRNGSDCPDKFCLFQSETKNLLFNDNTECLA ЛФ крысы 668 KLPSKITWEEYLGKEYVVAIAHLRQCS ЛФ человека 672 RLHGKTTYEKYLGPQYVAGITNLKKCS 2.2.2. Антимикробные пептиды. Структура. Классификация. Механизмы Изучение антимикробных веществ лейкоцитов было инициировано Мечниковым [18], в исследованиях школы которого была обоснована ключевая роль микрофагов (в современной терминологии нейтрофилов) и макрофагов в формировании невосприимчивости к инфекционным заболеваниям бактериальной и грибковой этиологии. Им же была сформулирована концепция о цитазах – бактерицидных соединениях переваривание фагоцитированных микроорганизмов [19].

Первые антимикробные соединения из лейкоцитов гноя человека были выделены в 1905 году А. Петтерсоном, который показал, что они представляют собой набор катионных протеинов. Непосредственное отношение к рассматриваемому вопросу имеет и открытие А.Флемингом [97] лизоцима – бактериолитического фермента, продуцируемого многими клетками организма, в том числе и лейкоцитами, и являющегося неотъемлемым компонентом многих его секретов (слюна, слезы, кишечный сок, пот).

В 1950-е годы исследования антимикробных соединений фагоцитов получили импульс для развития благодаря открытию и доказательству функциональной роли лизосом в клетках [227], в том числе и лейкоцитах гранулоцитарного ряда [72; 197]. Сначала их антибиотическое действие гипотетических «цитаз» Мечникова, но последующие работы показали, что среди антибиотических компонентов содержимого гранул присутствуют соединения, не обладающие ферментативным действием. Так, в 1963 году американские исследователи H. I. Zeya и J. K. Spitznagel выделили из гранул нейтрофилов морской свинки группу полипептидов с молекулярной массой менее 10кДа, проявляющих антимикробные свойства in vitro [246; 247].

Позже в лаборатории профессора Р. Лерера (США) пептиды данной фракции были названы «дефенсинами», от английского слова “defense” – защита. В его лаборатории впервые были расшифрованы первичные структуры дефенсинов кролика, морской свинки, крысы и человека [148].

В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что антимикробные пептиды (АМП) являются эволюционно отобранными молекулярными компонентами врожденного иммунитета – эндогенными пептидными противоинфекционной защиты животных и человека [10; 58; 148; 245]. В настоящее время, по структурно-функциональным свойствам описано более 1400 АМП, выделенных из клеток и тканей беспозвоночных (медузы, аннелиды, членистоногие, моллюски) и позвоночных (миноги, рыбы, амфибии, птицы, млекопитающие) животных, а также различных групп star.edu.sg/Templar/DB/ANTIMIC/).

Кроме фагоцитирующих клеток антимикробные пептиды найдены в эпителиальных клетках и в железистых структурах [51; 237]. Антимикробные пептиды обладают рядом общих свойств. Почти все они являются катионными (оснвными, щелочными) молекулами с суммарным зарядом от +2 до +9. В нативной третичной структуре молекул антимикробных пептидов реализован принцип пространственного разделения гидрофобных и гидрофильных (катионных) аминокислотных остатков, то есть они являются классическими амфипатическими молекулами. Большинство антимикробных пептидов являются небольшими полипептидными молекулами, содержащими, как правило, не более 50 аминокислотных остатков [107]. Все АМП синтезируются в виде молекул-предшественниц с сигнальными последовательностями, определяющими их гранулярную локализацию в клетке, и прочастью. Эти предшественники впоследствии подвергаются ограниченному протеолизу со стороны гранулярных протеаз, в результате которого отщепляются сигнальная и про- части молекулы-предшественницы с образованием зрелого, биологически активного пептида [226].

Наиболее распространенными группами АМП у млекопитающих являются дефенсины и кателицидины.

Дефенсины – это группа близкородственных коротких полипептидов, богатых цистеином и аргинином, в их состав входит от 29 до аминокислотных остатков [41; 91]. Термин «дефенсины» отражает их основное функциональное назначение, а именно способность обеспечивать защиту макроорганизма от возбудителей инфекционных заболеваний.

Существует 4 семейства дефенсинов позвоночных:

-, -, - и -дефенсины (рис. 2.2.2.1) [149].

Отличительной чертой молекул всех дефенсинов является наличие у них трех внутримолекулярных дисульфидных связей, образованных шестью остатками цистеина. Три дисульфидные связи стабилизируют доминирующую -складчатую вторичную структуру дефенсинов и повышают устойчивость пептидов к протеолизу. -, - и -Дефенсины отличаются друг от друга по паттерну формирования цистеиновых мостиков.

-Дефенсины являются макроциклическими молекулами, с замкнутыми пептидными связями С- и N-концами. Нативная третичная структура молекул дефенсинов состоит из пространственно разделенных гидрофобных и гидрофильных (положительно заряженных) областей [82; 157].

Рисунок 2.2.2.1. Примеры первичных структур дефенсинов Кателицидины – это семейство антимикробных пептидов, широко распрстраненных среди позвоночных животных, они найдены у млекопитающих, рептилий, амфибий рыб, птиц. Кателицидины были объединены в отдельное семейство антимикробных пептидов на основании содержания в их структуре N-концевого домена, гомологичного кателину (ингибитору катепсина L), и вариабельного C-концевого пептида, который при необходимости высвобождается в результате протеолиза и представляет собой активную антимикробную молекулу. В основном, они синтезируются в фагоцитах и эпителиальных клетках, где хранятся в специализированных гранулах (эндосомах) [101; 244].

По своим особенностям вторичной и третичной структуры АМП также разделяют на четыре класса, независимо от их принадлежности к дефенсиновому и кателицидиновому семейству [101]:

пептиды с -складчатой структурой и дисульфидными связями (в том числе дефенсины и протегрины);

-спиральные пептиды (такие как цекропины, меллитин);

линейные пептиды, с преобладанием в структуре одной или двух аминокислот (например, индолицидин, бактенецины, профенины и PR-39);

цикличные пептиды, имеющие одну дисульфидную связь (додекапептид, ареницин).

Стоит отметить, что среди кателицидинов встречаются представители всех четырех структурных классов АМП [244].

Основным механизмом антимикробного действия АМП является нарушение ими посредством перфорации целостности клеточных мембран микроорганизмов [57]. Однако существуют экспериментальные данные, внутриклеточные компоненты клеток-мишеней [242].

Рассмотрим более подробно один из общепринятых механизмов мембранодезорганизующих агентов.

амфипатическими, положительно заряженными молекулами. Они устроены аминокислотные остатки пространственно разобщены в нативной молекуле пептидов. Подобное пространственное строение молекулы обуславливает ее способность электростатически взаимодействовать с отрицательно липополисахариды, тейхоевые и липотейхоевые кислоты, кислые фосфолипиды (фосфатидилсерин, фосфатидилглицерол, кардиолипины).

отрицательно заряжены, то взаимодействие с ними играет очень важную роль в сорбции АМП на клетках-мишенях, так как сорбция осуществляется благодаря ион-ионному взаимодействию. О том, что электростатические взаимодействия на первом этапе играют ведущую роль, красноречиво антимикробного действия дефенсинов и других антимикробных пептидов и белков при повышении ионной силы среды взаимодействия выше 0, (например 0,14 М NaCl) и присутствии в среде полианионов (гепарин, электростатических взаимодействий в реализации антимикробной активности АМП свидетельствует проведенное моделирование и электрофизиологические измерения на мембранных везикулах при изучении кателицидинов [106]. На следующем этапе АМП внедряется в липофильную алифатическими хвостами жирных кислот в составе фосфолипидов мембран и липида А. Внедряясь в мембраны, АМП могут изменять свою конформацию и образуют такие олигомерные структуры как каналы или поры, нарушающие целостность цитоплазматической мембраны [91].

Положительный заряд молекул АМП обеспечивает относительную степень избирательности взаимодействий пептидов с отрицательно заряженными компонентами оболочек микробных клеток [162]. Однако при определенных условиях возможно причинение повреждающего эффекта эукариотическим клеткам организма, продуцирующим АМП. Таким образом, возникает вопрос, как организм минимизирует неблагоприятное воздействие (аутоповреждение) катионных пептидов на собственные клетки во время воспаления и фагоцитоза и обеспечивает действие, направленное именно против микроорганизмов. Было выяснено, что такая избирательность обусловлена структурными, а так же морфологическими факторами.

Например, одним из таких морфологических факторов является включение АМП в лизосомоподобные гранулы (азурофильные и специфические) нейтрофилов и эндосомы клеток барьерных эпителиев. Если дефенсины присутствуют в гранулах нейтрофилов в виде активных зрелых молекул в комплексе с гликозаминогликанами, то кателицидины упакованы в гранулы в форме неактивных предшественников, которые подвергаются процессингу только в случае активации нейтрофилов в ходе фагоцитоза. После высвобождения АМП в межклеточное пространство их потенциальная цитотоксичность нейтрализуется за счет взаимодействия с некоторыми плазменными белками (например, серпинами). Другим важным фактором, определяющим избирательность взаимодействия АМП с микроорганизмами, являются особенности строения поверхностных структур бактерий, грибов, вирусов и, в меньшей степени, простейших. В их клеточной стенке и мембране содержатся отрицательно заряженные молекулы, к которым АМП проявляют повышенное сродство, и которые отсутствуют на поверхности эукариотических клеток [165; 210].

Важно отметить, что микроорганизмы с трудом приобретают устойчивость к рассматриваемым катионным пептидам, являющимся эндогенными антибиотиками животного происхождения, в то время как к конвенциальным антибиотикам микроорганизмы достаточно быстро становятся резистентными [180]. Это связано с эффективностью и краткосрочностью действия АМП на микробные клетки. Однако, есть и исключения из этого правила. Некоторые бактерии приобрели в процессе эволюции механизмы избегания прямого губительного действия АМП. Один из таких механизмов сопряжен с уменьшением отрицательного заряда структурой к протеолизу, осуществляемому микробными протеазами [161;

180].

Исследованиями функциональной активности антимикробных пептидов в условиях животного организма, было показано, что ряд АМП млекопитающих (в частности, пептиды содержащиеся в гранулах нейтрофилов) обладают рядом активностей отличных от антибиотических.

Эти экспериментальные наблюдения послужили основанием рассматривать АМП как возможные регуляторные молекулы, связывающие системы врожденного и приобретенного иммунитета [199].

2.2.2.1. Дефенсины нейтрофильных гранулоцитов крыс Дефенсины составляют более 5% от общего клеточного белка в нейтрофильных гранулоцитах человека и участвуют в неокислительной инактивации фагоцитированных бактерий, грибков и вирусов [148].

Предполагаемый основной механизм действия дефенсинов связан с их встраиванием в мембрану клеток-мишеней, сопровождающимся образованием различного вида пор и каналов. Способность дефенсинов влиять на проницаемость мембран, вероятно, связана с их склонностью к образованию димеров. Кроме того, предполагается, что дефенсины способны вызывать повреждения ДНК, приводящие к гибели клеток [77; 100].

На данный момент, открыто и охарактеризовано четыре дефенсина нейтрофилов крысы (RatNP - rat neutrophil peptide), относящихся к семейству -дефенсинов. Эти пептиды обозначаются как RatNP-1, RatNP-2, RatNP-3 и RatNP- электрофорезе). Состав пептидов колеблется в пределах от 29 до аминокислотных остатков. Ниже представлены аминокислотные последовательности всех четырех изоформ -дефенсинов крысы, выделенных из нейтрофилов животного.

RatNP-1 VTCYCRRTRCGFRERLSGACGYRGRIYRLCCR

RatNP-2 VTCYCRSTRCGFRERLSGACGYRGRRIYRLCCR

RatNP-3 CSCRTSSCRFGERLSGACRLNGRIYRLCC

RatNP-4 ACYCRIGACVSGERLTGACGLNGRIYRLCCR

Аминокислотный состав пептидов обогащен цистеином и аргинином, остатки лизина и триптофана отсутствуют. В состав RatNP-4 не входит фенилаланин, присутствующий в молекулах RatNP-1, RatNP-2 и RatNP -3.

RatNP-4 имеет большое сходство с дефенсином человека HNP-1. В их молекулах совпадают позиции 17 аминокислотных остатков. Каждый из 4-х дефенсинов содержит восемь инвариантных аминокислотных остатков, которые характерны и для других - дефенсинов млекопитающих (человека, кролика). Каждый из пептидов проявляет антимикробную активность в отношении E. coli ML-35, Acinetobacter calcoaceticus HON-1, Staphylococcus aureus 502А и Candida albicans 820 в условиях in vitro. RatNP-1, наиболее катионный (основный) из дефенсинов крысы, проявляет самое мощное антимикробное действие [189; 193].

Кроме того, в опытах in vitro и in vivo было показано, что RatNP- обладает тормозящим действием на АКТГ-индуцированный стероидогенез клетками коркового слоя надпочечников [192].

2.3. Антимикробные белки и пептиды в реакциях врожденного и свидетельствующих о важной роли антимикробных белков и пептидов в биологических реакциях, имеющих отношение к воспалению, врожденному и адаптивному иммунитету [40; 96; 121; 204; 229].

Лактоферрин может поддерживать пролиферацию, дифференцировку и активацию клеток иммунной системы и модулировать некоторые иммунные противовоспалительный фактор. Благодаря его антимикробной активности и способности связывать компоненты бактериальных клеток (ЛПС) или их рецепторов (CD14), лактоферрин может предотвращать развитие воспаления и связанное с ним повреждение тканей, подавлять высвобождение провоспалительных цитокинов и активных форм кислорода [143].

Противовоспалительный эффект лактоферрина проявляется также в способности снижать продукцию некоторых провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли и интерлейкинов IL-1 и IL-6 [138; 153]. В некоторых исследованиях продемонстрирована способность ЛФ повышать продукцию противовоспалительного интерлейкина IL-10 клетками [124], что противовоспалительного действия лактоферринов.

Ионы железа необходимы в качестве катализаторов генерации активных форм кислорода. Поэтому лактоферрин, связывая Fe3+, может уменьшить продукцию активных форм кислорода лейкоцитами в очагах воспаления [234]. Существуют противоречивые мнения относительно влияния лактоферрина на пролиферацию лимфоцитов. Так Эседжи с соавторами [29] сообщают о его стимулирующем действии на этот процесс, тогда как Эшорн [43] и Ричи [113] установили противоположный эффект. На клеточном уровне ЛФ увеличивает число натуральных киллеров (NK) [144], повышает мобилизацию нейтрофилов в кровь [187], индуцирует фагоцитоз [220] и может модулировать миелопоэз [63].

Поскольку молекула ЛФ положительно заряжена, она способна связываться с отрицательно заряженными соединениями на поверхности различных клеток иммунной системы [47]. Можно предположить, что такое взаимодействие может инициировать сигнальные пути, приводящие к дифференцировка и пролиферация. Также было показано, что ЛФ транспортируется в ядро, где он может связываться с ДНК и активировать экспрессию отдельных групп генов [50; 219].

АМП влияют на клетки врожденного иммунитета (нейтрофилы, моноциты, дендритные клетки) и эпителиальные клетки, определяя отдельные стороны взаимодействия врожденной и адаптивной иммунной систем. Для млекопитающих была показана роль АМП в реализации таких клеточных функций, как хемотаксис, апоптоз, транскрипция генов и свидетельствующие о том, что пептиды подавляют индуцированную бактериями продукцию цитокинов, стимулируют заживление ран и ангиогенез [1; 28].

Некоторые кателицидины и дефенсины являются хемокинами для клеток иммунной системы, индуцируют синтез и секрецию цитокинов, а также высвобождение гистамина из тучных клеток [92; 173]. В совокупности это способствует мобилизации клеток врожденного и адаптивного иммунитета. -Дефенсины, а также -дефенсины человека хемотаксичны для моноцитов, Т-клеток и незрелых дендритных клеток [166; 117; 114].

Индуцированная дефенсинами дегрануляция тучных клеток и повышение продукции ИЛ-8 при воспалительных процессах способствуют привлечению и накоплению нейтрофилов. Дефенсины человека усиливают активность фагоцитоза макрофагами [108]. В условиях in vivo дефенсины могут участвовать в регуляции активности системы комплемента [125].

Продемонстрировано, что дефенсины в условиях in vitro способны увеличивать клеточную пролиферацию и цитокиновый ответ CD4+ T клеток через индукцию IFN-, IL-10 и IL-6, а также посредством модуляции экспрессии костимулирующих молекул [160]. Кателицидины коровы, свиньи, человека и мыши являются хемоаттрактантами практически для всех лейкоцитов периферической крови [62]. Кроме того, кателицидин человека LL-37 может влиять на дифференцировку незрелых дендритных клеток и Тклеточную поляризацию в пользу Th1 ответов [221], в то время как дефенсины человека оказывают влияние в противоположном направлении [79], что указывает на способность АМП быть связующим звеном врожденного и адаптивного иммунитета.

В исследованиях in vivo с использованием совместного введения дефенсина человека с антигенами у мышей наблюдалась повышенная продукция специфических сывороточных антител. Этот факт свидетельствует о том, что АМП участвуют и в гуморальном (Th2зависимом) ответе, и дает основания предполагать, что АМП могут обладать адъювант-подобными свойствами [79]. Аналогично -дефенсины человека и -дефенсины мыши могут способствовать индукции антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, тем самым поддерживая Th1-зависимый клеточный ответ и потенциально противоопухолевый иммунитет [160]. В целом, эти данные свидетельствуют о том, что катионные пептиды являются молекулами, которые играют важную роль во взаимодействии врожденного и адаптивного иммунитета, функционируя в качестве сигнальных молекул (аларминов), влияющих на инициацию, поляризацию и развитие адаптивного иммунного ответа. Задача понимания механизмов иммуномодулирующих функций катионных пептидов становится все более актуальной [199].

Как уже упоминалось ранее, в опытах in vitro и in vivo было показано, что некоторые -дефенсины обладают ингибирующим действием на АКТГиндуцированный стероидогенез клетками коркового слоя надпочечников, в связи с чем они получили также название «кортикостатины». Впервые кортикостатическая активность дефенсинов была установлена для дефенсинов кролика с использованием биологического теста in vitro, основанного на измерении секретированного культурой клеток надпочечников крыс кортикостерона. [128]. Позже кортикостатическая активность была выявлена у дефенсинов человека, крысы и морской свинки [209]. В работах сотрудников Отдела общей патологии и патофизиологии ФГБУ НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН было показано, что введение дефенсинов животным (мыши, крысы), подвергнутым экспериментальному стрессу, снижает уровень кортикостерона в крови и отменяет стресс-индуцированную иммуносупрессию [2; 22].

Полученные данные открывают перспективы в изучении роли нейтрофилов и их антимикробных соединений в регуляции защитных функций при различных неблагоприятных воздействиях, включая стрессирующие воздействия.

Термин «стресс» в своем медицинском значении вошел в научный обиход в середине двадцатого века. Основоположником данного термина был канадский врач-патолог австро-венгерского происхождения Ганс Селье.

На протяжении многих лет, в ходе разработки своей концепции, Селье редактировал формулировки данного термина, и по сей день в биологии и медицине не существует четкого определения понятия «стресс». Одно из наиболее часто встречающихся определений звучит следующим образом:

«Стрессом называется неспецифическая реакция организма на любое предъявленное к нему требование» [4].

В своих работах Селье показал, что физиологическая направленность стресса заключается в усилении адаптивных реакций организма, обеспечивающих поддержание его гомеостаза и сохранение здоровья (отсюда и еще одно название стресс-реакции - общий адаптационный синдром).

Такой эффект Селье и его сотрудники объединяли под понятием «эустресса».

В ситуациях, когда стресс-реакция приобретает роль патогенного (патогенетического) фактора говорят о «дистрессе» [205]. Развитие общего адаптационного синдрома (ОАС) включает в себя три фазы. Первую фазу Селье назвал стадией тревоги, представляющую собой процесс начала мобилизации защитных механизмов организма. Вторая фаза – «стадия резистентности». На этом этапе ОАС снижается интенсивность процессов стадии тревоги и организм борется за восстановление и поддержание гомеостаза. Если стрессирующее воздействие сохраняется и организм исчерпывает все свои адаптивные резервы, наступает конечная «стадия истощения», на которой наблюдается угнетение активности гипоталамогипофизарно-надпочечниковой и симпатоадреналовой систем, что приводит к подавлению многих защитно-приспособительных реакций организма.

Появляются изменения, характерные для «стадии тревоги», однако, если там они носили обратимый характер, то на «стадии истощения» эти изменения носят стойкий характер и могут в ряде случаев привести к гибели организма [93].

Ведущую роль в реализации интегрированного ответа организма на стрессирующие воздействия играет активация гипоталамо-гипофизарнонадпочечниковой системы (ГГНС). Активация передних и средних ядер гипоталамуса ведет к высвобождению кортикотропин-рилизинг фактора (КРФ), или кортиколиберина, - основного регулятора ГГНС [156].

Связывание КРФ с его рецепторами на клетках гипофиза индуцирует высвобождение адренокортикотропного гормона (АКТГ) в системный кровоток. Основной мишенью для циркулирующего АКТГ является кора надпочечников, где он стимулируют синтез глюкокортикоидов (ГК) клетками пучковой зоны [208]. Секреция глюкокортикоидов (кортизол, кортикостерон) надпочечниками является стереотипным ответом на стресс, это наблюдение впервые было сделано еще Селье [205].

К эффектам ГК относят мобилизацию энергетических ресурсов организма путем усиления гликонеогенеза, увеличение сердечно-сосудистого тонуса, противовоспалительное действие, сдерживание долгосрочных реакций, протекание которых не является необходимым во время преодоления кризиса (питание, пищеварение, рост и размножение). Также ГК оказывают влияние на водно-солевой обмен, способствуют сохранению натрия внутри клеток, что препятствует выходу воды из них [201].

иммунносупрессивное (противовоспалительное) действие, угнетая продукцию многих цитокинов и медиаторов воспаления, таких как IL-1, ILIL-3, IL-6, IL-8, TNF, IFN, IFN [55], что может рассматриваться как вариант регуляции синтеза АКТГ по принципу обратной связи, так как активаторами функций ГГНС являются не только адреналин и норадреналин, но и провоспалительные цитокины IL-1, IL-6, TNF [231]. ГК также влияют на экспрессию рецепторов к цитокинам [225]. Вторым важным путем реализации стресс-реакций является путь активации заднего гипоталамуса.

Он приводит к запуску симпатоадреналовой системы (САС). Под влиянием стимулов симпатической нервной системы возрастает секреция норадреналина из симпатических нервных окончаний и происходит выделение в кровоток адреналина из мозгового слоя надпочечников.

Катехоламины усиливают и повышают частоту сердечных сокращений, повышают кровяное давление, улучшают кровоснабжение мышц, снижают пищеварительную активность, активируют гликогенолиз и поступление глюкозы в кровь. Под действием адреналина происходит расширение бронхов и увеличение бронхиальной проходимости [3; 137].

Важно отметить, что одновременно с развертыванием стресс-реакции происходит также и активация «стресс-лимитирующих систем», к ним относят систему нейронов, продуцирующих гамма-аминомасляную кислоту, а так же систему нейронов гипоталамуса и секретирующих клеток гипофиза, продуцирующих опиоидные пептиды [24].

Исследования, связанные со стрессом и иммунной регуляцией организма, фокусируются на взаимодействии между центральной нервной, эндокринной и иммунной системами. Регуляция иммунного ответа ЦНС опосредована сетью сложных сигналов, которые функционируют двунаправлено. Гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая (ГГНС) и симпато-адреналовая системы (САС) – это два основных пути регуляции иммунного ответа при стрессе [12; 70; 177; 235].

гранулоциты имеют рецепторы для многих медиаторов ГГНС и САС [56;

190], взаимодействие которых с этими рецепторами влияет на клеточную миграцию, пролиферацию, секрецию цитокинов, антителообразование и цитолитическую активность клеток иммунной системы [154]. Было показано, что стрессорные воздействия повышают восприимчивость к бактериальным инфекциям на стадии тревоги [45; 53; 163]. Также неоднократно было показано, что стресс влияет на выработку антител [32; 71; 102; 133].

Стресс-индуцированные изменения в работе иммунной системы исследуются как на экспериментальных моделях, так и в клинической практике у пациентов после психоэмоциональных переживаний. Имеется большое количество работ, отражающих возможность позитивного и негативного эффектов действия стресса на защитные функции организма [171], причем направленность их влияния зависит как от интенсивности и функционального состояния организма [68].

пластиковую трубку, сковывающую все их движения, но имеющую отверстия для дыхания. В серии исследований на данной модели с использованием вируса гриппа было показано, что стресс изменял реакции врожденного и адаптивного иммунного ответа на вирус. Эти изменения включали в себя понижение уровня антител, продуцируемых к вирусу, и противовоспалительных цитокинов [102; 154]. Другой распространенной моделью стресса является холодовой стресс. На разных вариациях данной модели было показано снижение иммунного ответа на различные виды инфекционных агентов [120; 146]. Коэн и др. показали дозозависимое соотношение между психологическим стрессом и клиническим проявлением симптомов инфекции на добровольцах, которым инокулировали пять различных штаммов респираторных вирусов [188].

Поскольку ГК являются липофильными, они легко проходят через плазматическую мембрану всех клеток в организме. Если клетка обладает рецептором к ГК, то она может оказаться мишенью для дальнейшего глюкокортикоидные рецепторы (ГР) и минералокортикоидные рецепторы (МР). Поскольку кортикостерон имеет более высокое сродство к МР, чем к ГР [169], при низких концентрациях циркулирующих глюкокортикоидных гормонов связывание происходит преимущественно с МР. Только при высоких циркулирующих или тканевых уровнях (то есть во время стресса) ГК связываются с ГР [80]. В иммунных клетках, таких как макрофаги и Тлимфоциты, главный рецептор глюкокортикоидов – ГР. Влияние глюкокортикоидных гормонов на иммунные клетки опосредуется главным образом ГР [213].

Катехоламины опосредуют свое влияние на иммунную систему через адренорецепторы. Многочисленные клетки иммунной системы, в том числе адренорецепторы. Адренорецепторы можно разделить на две подгруппы - и -адренорецепторы. По-видимому, наиболее важную роль для иммунной системы имеют -адренергические рецепторы [90; 155].

Иммуномодулирующий эффект гормонов может реализовываться не только прямым путем, через связывание гормона со своим рецептором, но и опосредованно, например, вызывая нарушения в регуляции продукции цитокинов, таких как интерферон- (IFN-), интерлейкин-1 (IL-1), IL-2, IL- (глюкокортикоиды, катехоламины) системно подавляют продукцию IL-12, TNF- и IFN-, но усиливают продукцию IL-10, IL-4, а также TGF- [65].

Баланс между клеточно-опосредованным (КОИ) и гуморальным адаптивным иммунитетом в значительной степени регулируется цитокинами, продуцируемыми субпопуляциями CD4 Т-хелперов, Th1и Th2 [232]. Th1цитокины (IFN- и IL-12) участвуют в реализации механизмов защиты, направленных против внутриклеточных паразитов, таких как вирусы и микобактерии, а Th2-цитокины (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13) поддерживают гуморальный ответ в защите от внеклеточных паразитов [168]. В настоящее время очевидно, что другие популяции иммунных клеток – цитотоксические Т-лимфоциты и дендритные клетки – выделяют цитокины в подобном режиме, поэтому номенклатура иммунного ответа по типу 1 (Th1-подобный) и типу 2 (Th2-подобные) широко используется для обозначения системного реагирования на антигенную стимуляцию [33].

Как уже было сказано, связь между ЦНС и иммунной системой является двунаправленной [55]. Например, IL-1 влияет на производство кортикотропин-рилизинг-гормона. В свою очередь, КРФ активирует ГГНС, увеличивая уровень стрессорных гормонов, что вновь приводит к регуляции иммунных реакций. Кроме того, лимфоциты могут синтезировать гормоны, такие как АКТГ, пролактин и гормон роста [236]. Роль гормонов лимфоцитарного происхождения не совсем ясна, хотя они могут иметь важное значение в модуляции функции клеток лимфоидных органов [190].

Показано, что иммобилизационный стресс вызывает у мышей повышенную продукцию рецептора КРФ первого типа в нейтрофильных гранулоцитах селезенки на фоне нейтрофилеза, что, по мнению авторов, может свидетельствовать о вовлеченности активированных нейтрофильных гранулоцитов селезенки в реализацию стресс-реакции [191].

Впервые такие изменения в системе крови в ответ на действия стрессоров, как лимфопения, эозинопения и нейтрофилез были описаны Гансом Селье в 1936 году. Эти изменения регистрировались на сроках 6- часов после аппликации стрессорного воздействия [205]. В 80-х годах прошлого века фундаментальными исследованиями в этом направлении занималась отечественная группа во главе с П.Д. Горизонтовым. Ими впервые были применены методы количественного анализа, а также были изучены реакции клеток крови на различные стрессирующие воздействия [21].

Несмотря на то, что наблюдаемые изменения в реакциях крови при действии различных стрессоров являются во многом стереотипными, конкретная реакция системы крови определяется природой и интенсивностью раздражителя.

Было показано, что иммобилизация мышей в течение 6-и часов приводит к увеличению количества нейтрофилов периферической крови в 6раз на сроках в 6-9 часов после стрессирующего воздействия. В то же время число лимфоцитов резко падало. В течение 3-4 часов после стресса падало до нуля содержание эозинофилов в крови. При этом в костном мозге содержание лимфоцитов значительно увеличивалось и уменьшалось количество зрелых гранулоцитов. Через 24 часа все показатели возвращались к норме. Содержание клеток в тимусе и селезенке значительно падало на сроках от 12-и часов, и начинало нормализоваться лишь после 48-и часов [3;

214].

Уменьшение числа зрелых гранулоцитов в костном мозге, а также общее уменьшение клеток в лимфоидных органах, объясняется переходом их в периферическую кровь, т.е. происходит стресс-индуцированная мобилизация и перераспределение костно-мозгового и лимфоидного резервов лейкоцитов.

стрессированию, в костном мозге наблюдалось значительное понижение эритро- и лимфопоэза, сопровождающееся соответствующими изменениями в периферической крови. На ранних сроках эксперимента наблюдалось увеличение выхода эритроидных предшественников [195]. С первых суток эксперимента выявлялось усиление гранулоцитарно-макрофагального колониеобразования. Кроме того, наблюдалась значительная инволюция тимуса в отсутствии повышения количества Т-лимфоцитов в костном мозге [8].

разбалансировка пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток.

воздействия позволяют сделать вывод о том, что данные изменения направлены на быструю адаптацию организма к предъявленным к нему требованиям. При хроническом же действии стрессоров наблюдается угнетение адаптивных реакций, что часто ведет к дальнейшему развитию патологий, в том числе иммунопатологии.

Анализ возможных механизмов реакции системы крови на стресс показал, что наиболее значимое действие на гемопоэз при стрессе имеют нейроэндокринные реакции [25; 84]. Показано, что лимфатические узлы, а также другие лимфоидные органы, имеют симпатическую иннервацию [126].

Активация САС и ГГНС ведет к развитию гиперплазии кроветворной ткани красного костного мозга и увеличению числа клеток периферической крови.

В основе данного эффекта лежит усиленная миграция регуляторных Тлимфоцитов, происходящая под действием КА и ГК. Данная регуляция реализуется двумя путями: прямым – рецепторным, а также опосредованным, через Т-лимфоциты, макрофаги и стромальные механоциты. От соотношения активностей стресс-реализующей и стресс-лимитирующей систем зависит степень адаптивного ответа кроветворной ткани [8; 75]. Показано, что нейтрофилез в периферической крови, а также увеличение числа зрелых гранулоцитов в костном мозге регулируются КА. ГК не оказывают на эти реакции заметного влияния. При этом лимфоидный пик в костном мозге регулируется через -адренорецепторы [98].

Таким образом, существует множество путей, через которые стресс может влиять на иммунные реакции, однако в понимании механизмов этой регуляции остается еще много пробелов. Одним из недостаточно изученных направлений в данной области исследований является оценка роли молекулярных факторов нейтрофильных гранулоцитов при стрессе, а именно их антимикробных белков и пептидов как эндогенных модуляторов, участвующих в регуляции иммунных и нейроэндокринных реакций при стрессирующих воздействиях.

3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Экспериментальные животные и модель исследования Эксперименты выполнены на 220 крысах-самцах гетерозиготного штамма линии Wistar массой 120-150 г и 6-и кроликах-самцах породы «шиншилла», полученных из питомника «Рапполово» (Санкт-Петербург).

Животных содержали в условиях вивария при комнатной температуре с 12часовым циклом свет/темнота, свободным доступом к воде и пище, на стандартной диете в соответствии с нормами содержания лабораторных животных.

В качестве экспериментальной модели стресса использовали комбинированный эмоционально-физиологический стресс - плавание в холодной воде (1°-4° С) в течение 2х минут. Данная модель ранее была апробирована в отделе общей патологии и патологической физиологии НИИ ИЭМ РАМН [22]. Исследуемые препараты и контрольные вещества вводились животным непосредственно перед стрессирующим воздействием и разводились в воде для инъекций, объемом 500 мкл. Препараты вводились в следующей концентрации: лактоферрин человека – 200 мкг/кг веса животного, дефенсин крысы RatNP-3 – 100 мкг/кг веса животного, ЛПС – мкг/кг веса животного. Забор крови и селезенки осуществляли через минут и 3 часа после окончания стрессирующего воздействия, после быстрой декапитации.

Пробы дополнительно оценивали на содержание примесей липосахарида с помощью Лимулюс теста (см. раздел 3.7).

Для удаления примесей ЛПС использовали инкубацию с полимиксинагарозой (“Sigma”). Конечная концентрация ЛПС в пробах не превышала 0, UE/мл (см. раздел 3.3.4).

Экссудат у крыс был инициирован внутрибрюшинным введением 0,5% крахмала в 0,85% растворе NaCl. Через 16-18 часов после введения производился забор экссудатной жидкости путем промывания брюшной полости животных 0,85% раствором NaCl, с добавлением 0,17% ЭДТА. Далее экссудат центрифугировали при 10 000g в течение 10 мин на центрифуге PCОсадок ресуспендировали в дистиллированной воде. Около 90% клеток составляли нейтрофилы (контролировали микроскопированием). Суспензию клеток хранили при -20°С.

3.3. Выделение дефенсинов из нейтрофилов экссудата крыс 3.3.1. Экстракция катионных пептидов из лейкоцитарных клеток Лейкоциты разморозили при +4°С, центрифугировали в течение минут (600 g) при +4°С, слили надосадочную жидкость. Осадок ресуспендировали в 4-х объемах (по сравнению с объемом осадка) 10% уксусной кислоты и провели гомогенизацию на электрогомогенизаторе стекло-тефлон. Полученную суспензию инкубировали при +4°С 120 минут для прохождения процесса экстракции. Затем суспензию центрифугировали, на центрифуге РС-6 30 минут при 5000 об/мин (3000 g). Отобрали супернатант и назвали «экстракт 1». Оставшийся осадок вновь ресуспендировали в 10% уксусной кислоте и повторили процессы гомогенизации, инкубации гомогенизата и центрифугирования. Супернатант назвали «экстракт 2». Таким же образом были получены «экстракт 3» и «экстракт 4».

ультрафильтрации на камере “Amicon”, через фильтр «Миллипор» YM-10 мембрана, состоящая из полых волокон, пропускающая молекулы с молекулярной массой не более 10 кДа, то есть с номинально отсекаемой ультрафильтраты «экстракта 1», и «экстракта 2» сконцентрировали на камере для ультрафильтрации “Amicon” через фильтр «Миллипор» YM-1 (НОММ 1кДа).

3.3.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография центрифуге Speed Vac CS-18 и далее фракционировали с помощью обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) на установке Gold System фирмы Beckman, США. Разделение проводили на колонке Vydac C-18 (25 x 0,46 см; диаметр частиц сорбента мкм) с использованием линейного градиента: 0 – 60% (за 60 мин)-100% (за мин). Скорость потока: 1 мл/мин. Фазы: вода (с 0,1% трифторуксусной кислотой) – ацетонитрил [186].

3.3.4. Удаление примеси липополисахарида Примеси бактериального липополисахарида из проб белков и пептидов удаляли при помощи инкубации с гелем полимиксин В-Агарозы (Sigma, USA).

К 150 мкл геля добавляли 1 мл воды, интенсивно перемешивали, осаждали частички геля на микроцентрифуге Vortex, сливали надосадочную жидкость. Затем к промытому гелю добавляли 300 мкл раствора с пробой, которую необходимо очистить, и инкубировали при постоянном перемешивании 24 часа при 4°С. Затем гель осаждали, а очищенную пробу переносили в новую пробирку.

3.4.1. Электрофорез в кислой буферной системе Спектр катионных пептидов в экстрактах из лейкоцитов крыс, во фракциях, полученных после экстракции, ультрафильтрации высокоэффективной жидкостной хроматографии, оценивали методом электрофореза в кислой буферной системе в присутствии мочевины [178] в пластинах полиакриламидного геля на приборе фирмы Hoefer (США).

Состав раствора для приготовления геля:

N,N-метилен-бис-акриламид (Amresco, США) 0,325% N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин (Amresco, США) 0,025% Персульфат аммония (Amresco, США) 0,025% Уксусная кислота (Вектон, Россия) 7,8% Время полимеризации геля составляло около 40 минут.

В качестве электродного буфера использовали 5% раствор уксусной кислоты (pH 2,2). Длительность как преэлектрофореза, так и электрофореза составляла около 1 часа. Разделение проводили в пластинах геля длиной мм и толщиной 0,75 мм при напряженности 20 вольт на 1 см длины пластины геля. В качестве раствора для проб использовали 3М мочевину в 5% растворе уксусной кислоты. На дорожку наносили 1-5 мкг пептидов в 10 мкл указанного раствора для проб. За ходом электрофореза следили по движению красителя метилового зеленого, который наносили на дорожку одновременно с препаратом белка.

После проведения электрофореза белки на пластинах геля окрашивали Кумасси бриллиантовым голубым. Для приготовления окрашивающего раствора 1 г Кумасси бриллиантового голубого G-250 (Sigma, США) растворяли в 270 мл метанола, раствор фильтровали и добавляли в него мл дистиллированной воды и 150 мл 37% раствора формальдегида. Для окрашивания белков гель помещали в окрашивающий раствор на 15-30 мин.

Избыток красителя отмывали 5% раствором уксусной кислоты.

3.5. Иммунохимические методы исследования 3.5.1. Получение антисывороток к дефенсинам 3.5.1.1. Конъюгация дефенсинов крысы с овальбумином 1 мг дефенсина (или смеси дефенсинов) разводили в 500 мкл 0,1 М натрий-фосфатного буфера с pH 7,0. К полученному раствору добавили 5 мг яичного овальбумина, предварительно разведенного в 500 мкл 0,1 М натрийфосфатного буфера с pH 7,0. К полученной смеси добавляли 1 мл свежеприготовленного 0,02% раствора глутаральдегида в 0,1 М натрийфосфатном буфере с pH 7,0. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа.

Добавляли 500 мкл 0,1 М натрий-фосфатного буфера с pH 7,0 и удаляли глутаральдегид на колонке согласно инструкции, приложенной к колонкам.

электроспектрофотометре Beckman Coulter DU 720 при длине волны = нм, и определяли содержание коньюгата в пробах с учетом коэффициента экстинкции овальбумина E1%280 = 7, 3.5.1.2. Иммунизация кроликов конъюгатом дефенсинов с овальбумином Иммунизация кроликов коньюгатом овальбумина с дефенсинами проводилась по следующей схеме (из расчета на одно животное):

- 1-ая иммунизация в подушечки задних лап: 200 мкл конъюгата с концентрацией 1,2-1,5 мг/мл смешивали и суспендировали с 250 мкл полного адъюванта Фрейнда - 2-ая иммунизация на 29-31 день после 1-ой иммунизации, подкожно вдоль линии позвоночника: 200 мкл конъюгата с концентрацией 1,2-1,5 мг/мл смешивали и суспендировали с 250 мкл неполного адъюванта Фрейнда - 3-я иммунизация на 29-31 день после 2-ой иммунизации, подкожно вдоль линии позвоночника: 200 мкл конъюгата с концентрацией 1,2-1,5 мг/мл смешивали и суспендировали с 250 мкл неполного адъюванта Фрейнда Через 10 дней после 3-ей иммунизации, производился забор крови из ушной вены в стеклянные пробирки, общим объемом 20-30 мл. Кровь ставили в термостат на 60 минут при 37°С для образования сгустка, затем обводили сгусток стеклянной палочкой и ставили на ночь на 4°С. Сгусток отделяли, а сыворотку консервировали мертиолатом натрия до концентрации 0,01 %, и хранили при 4°С.

При необходимости иммунизацию с последующим забором крови повторяли, но не ранее 14 дней с последней иммунизации.

3.5.2. Выделение антител к дефенсинам крысы из антисывороток 3.5.2.1. Связывание дефенсинов крысы с цианоген бромидактивированной агарозной матрицей Для создания аффинной колонки было взято 700 мкг суммарной фракции крысиных дефенсинов и 0,5 г цианоген бромид-активированной агарозной матрицы фирмы Sigma. Связывание антигена с матрицей проводили согласно протоколу, приложенному к матрице:

- 0,5 г активированной агарозы смешивали с 30 мл охлажденной 1 мМ HCl - Поместили полученную смесь в пластиковую пробирку–колонку, промыли смесь 200 мл охлажденной 1 мМ HCl.

- Далее колонку промывали 30 мл дистиллированной воды, затем 3 мл 0,2 М буфера бура-борная кислота с pH 8.0, содержащего 1 М NaCl.

- К 2 мл смеси дефенсинов (1,2 мг) добавили 2 мл 0,2 М буфера бураборная кислота с pH 8.0 и содержащего 1 М NaCl (замерили оптическую плотность при 280 нм).

- Нанесли смесь дефенсинов на колонку.

- Колонку инкубировали на качалке 3 часа при комнатной температуре.

- Удалили жидкость из колонки, померили в ней оптическую плотность при 280 нм, и по разнице с предыдущим измерением определили количество не связавшихся дефенсинов.

Полученную колонку со связанными дефенсинами уравновесили раствором 0,2 М глицина и оставили на ночь при 4 °С.

- Промыли колонку 4 раза поочередно 0,2 М буфером бура-борная кислота с pH 8.0 и 0,1 М натрий-ацетатным буфером, содержащим 1 М NaCl.

- Уравновесили колонку 1 М NaCl и хранили при 4°С до использования.

3.5.2.2. Выделение из антисыворотки фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами, методом высаливания К 10 мл иммунной сыворотки добавляли 5 мл насыщенного (4 М) раствора (NH4)2SO4. Полученный осадок отделяли центрифугированием на центрифуге К-24 3000 об/мин (600 g) в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливали. Осадок растворяли в 5 мл дистиллированной воды, к полученному раствору добавляли 4 мл 4 М раствора (NH4)2SO4. Осадок вновь отделяли центрифугированием. Процедуру высаливания повторяли еще раза. Полученный осадок, содержащий иммуноглобулины, растворяли в воде и ставили на ночь на диализ при +4°С. Для диализа использовали мембрану фирмы Sigma, с порами пропускающими молекулы до 12 кДа. Диализ проводили против 0,01 М натрий-фосфатного буфера, с pH 7,2, содержащего 0,15 М NaCl.

3.5.2.3. Выделение антител к дефенсинам крысы из фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами, методом аффинной хроматографии - Аффинную колонку со связанными дефенсинами промывали 0,01 М натрий-фосфатным буфером с pH 7,2, содержащим 0,15 М NaCl (исходный буфер), в объеме 3 мл.

- На колонку наносили 5 мл полученной после диализа фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами.

- Промывали колонку 3 мл исходного буфера. Затем промывали натрий-фосфатным буфером с pH 7,2, содержащим 0,3 М NaCl.

- Связавшиеся иммуноглобулины элюировали 0,1 М глицин-HCl буфером с pH 3,0, содержащим 0,1 М NaCl.

- Элюат ставили на диализ против исходного буфера на ночь при температуре 4°С. В качестве консерванта к полученному раствору антител добавляли мертиолат натрия до 0,01%. Колонку уравновешивали 1 М раствором NaCl и хранили при 4°С.

3.5.3. Конъюгация антител с пероксидазой хрена Конъюгаты получали периодатным методом [14]. 0,8 мг пероксидазы хрена растворили в 100 мкл воды. К полученному раствору добавили 200 мкл свежеприготовленного 0,1 М раствора периодата натрия (NaIO4). Далее смесь перемешивали в течение 20 мин в стеклянном флаконе. В полученной смеси произвели замену раствора на 1 мМ натрий-ацетатный буфер с pH 4,4, путем фильтрации на фильтрующих колонках Millipore Centrifugal Filtr Units 100 000 MWGO. Довели pH смеси до 9-9,5, добавлением 2 мкл 0,2 М Na2Co3, и сразу добавили 100 мкл раствора иммуноглобулинов в концентрации 10 мг/мл в 0,05 М карбонат-бикарбонатный буфере pH 9,5.

Смесь перемешивали 2 часа при комнатной температуре. Затем к смеси добавили 10 мкл свежеприготовленного раствора боргидрида натрия (NaBH4), в концентрации 4 мг/мл. Перемешивали 2 часа при температуре 4°С. Полученный конъюгат перевели в 0,1 М боратный буфер с pH 7,4. К мкл конъюгата добавили 20 мкл глицерина и хранили при температуре -20°С.

3.5.4. Иммуноцитохимический метод анализа сыворотки на наличие 1) Мазки крови интактных крыс высушивали в течение 15-30 минут.

Фиксировали охлажденным ацетоном 5 минут. Затем мазки промывали в трех сменах забуференного физраствора. Процедуру промывки производили после каждой инкубации.

2) Проводили блокировку эндогенной пероксидазы, в растворе метанол-перекись в течение 20 мин. Раствор готовили смешиванием 29 мл метанола и 1 мл 30% перекиси водорода.

3) Наносили на мазки иммунные и неиммунные (в качестве контроля) сыворотки в разведении 1:4 (растворитель физиологический раствор.) и инкубировали их 40 мин во влажных камерах при 37 °С.

4) Инкубировали мазки с конъюгатом антител к иммуноглобулинам кролика с пероксидазой хрена (разведение 1:2000), при 37°С 40 мин.

5) Затем нанесли на мазки раствор диаминобензидина (ДАБ) и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Мазки еще раз тщательно промыли.

Раствор ДАБ готовили следующим образом: к 6 мг диаминобензидина добавили 10 мл 0,05 М трисового буфера с pH 7,6 и 100 мкл 1% перекиси.

Результат наблюдали визуально микроскопированием, сравнивая иммунные и неимунные сыворотки. Отдельно контролировали этап блокирования эндогенной пероксидазы.

3.5.5. Процедура иммуноферментного анализа по определению концентрации RatNP-3 в плазме крови экспериментальных крыс Антитела к RatNP-3 разводили до концентрации 10 мкг/мл в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере pH 9,0. Вносили полученный раствор в количестве 100 мкл в каждую лунку планшета, предназначенную для дальнейшего анализа. Инкубировали в течение ночи при 4 °С.

После инкубации провели четырехкратную промывку лунок планшета 0,01 М натрий-фосфатным буфером c pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,05% ТВИН-20 (промывочный раствор) согласно следующей схеме. В каждую лунку нанесли промывочный раствор в объеме 150 мкл, выдерживали 20 сек. Затем резко опорожняли планшет переворачиванием, и дополнительно осушали лунки опрокидыванием планшета на фильтровальную бумагу. Затем следовал следующий промывочный цикл.

Плазму крови экспериментальных крыс разводили в 100 раз 0,01 М натрий-фосфатном буфером pH 7.4 содержащим 0,15 М NaCl, 0.05% ТВИНи 1% БСА (раствор для проб). В этом же растворе развели контроли RatNP-3 в концентрациях 0, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 2 и 4 нг/мл. Перед нанесением проб, проводили предварительную инкубацию планшета с буфером для разведения (100 мкл в лунке) в течение часа при комнатной температуре. Затем планшет полностью опорожняли и наносили пробы и стандарты по 100 мкл в каждую лунку планшета, согласно заранее заготовленной для эксперимента схеме. Инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем лунки промывали по схеме описанной ранее.

Конъюгат антител к RatNP-3 с пероксидазой хрена разводили в раз и наносили по 100 мкл в лунку. Инкубировали в течение 6 часов при температуре 4°С, затем лунки пятикратно промывали.

Далее готовили субстратную смесь:

- 10 мл 0,05 М фосфатно-цитратного буфера pH 5. - 2 мг о-фенилендиамина - 10 мкл 15% перекиси водорода Добавили субстратную смесь во все лунки в объеме 100 мкл.

Инкубировали 15-20 мин в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 5 н серной кислоты.

Имеряли оптическую плотность на спектрофотометре Labsystems Multiskan MS при длине волны 492 нм. Результаты оценивали строя калибровочную кривую по 10-и точкам.

3.5.6. Иммуноферментный анализ по определению концентрации Анализ проводили на коммерческом наборе Corticosterone ELISA EIA – 4164 фирмы DRG.

В стандартный набор входит:

1. Пластиковый планшет на 96 лунок 2. Стандарты. 7 пробирок по 1 мл, готовых к использованию с концентрациями 0, 5, 15, 30, 60, 120, 240 нмоль/л 3. Конъюгат, 250 кратный. 1 пробирка, 150 мкл.

4. Раствор для разбавления коньюгата. 1 пробирка, 25 мл. Готовая к использованию.

5. Субстратный раствор. 1 пробирка, 25 мл, готовый к использованию.

6. Стоп-раствор. 1 пробирка, 14 мл, готовый к использованию.

7. Промывочный раствор, 1 пробирка, 30 мл, 40-кратный раствор.

Приготовление рабочих растворов:

Промывочный раствор. 30 мл концентрированного промывочного раствора разводят в 1170 мл деионизированной воды.

Конъюгат. Концентрированный конъюгат разводят 1:250, в растворе для разбавления.

Все пробы разводили в 10 раз в «стандарте 0».

Процедура проведения анализа:

1. Составляется схема заполнения планшета.

2. Вносится по 20 мкл стандартов и образцов в соответствующие лунки.

3. Затем в каждую лунку добавляют 200 мкл конъюгата.

4. Интенсивно перемешивали в течение 10 секунд.

5. Инкубировали 60 мин при комнатной температуре.

6. Опорожнили все ячейки и промывали их 3 раза промывочным раствором (по 400 мкл).

7. Добавляли 100 мкл субстрата в каждую лунку.

8. Инкубировали при комнатной температуре 15 мин.

9. Останавливали энзиматическую реакцию добавлением 50 мкл стопраствора в каждую лунку.

10. Замеряли оптическую плотность в лунках на приборе Labsystems Multiskan MS при длине волны 450 нм не более чем через 10 минут после добавления стоп-реагента.

Результаты оценивали, строя калибровочную кривую по оптическим плотностям стандартных растворов.

3.6.1. Подсчет лейкоцитарной формулы крови Свежеприготовленный мазок крови высушивали в течение 20- минут. Затем окрашивали комбинированной краской Май-Грюнвальда с докрашиванием по Романовскому. На высушенный мазок пипеткой нанесли готовый краситель — фиксатор Май-Грюнвальда на 4-6 мин. Промывали мазок и наносили разбавленный вдвое краситель Май-Грюнвальда, на минут. После этого мазок промывали и высушивали. Высушенный мазок подкрашивали свежеприготовленным водным раствором краски Романовского в течение 20 минут. На полученном мазке под микроскопом вели подсчет лейкоцитарной формулы крови.

3.6.2. Подсчет количества лейкоцитов в камере Горяева 20 мкл крови разводили в 400 мкл 3% уксусной кислоты, подкрашенной метиленовым синим, тщательно взбалтывали. Затем полученной суспензией клеток заполняли камеру Горяева. Подсчет клеток велся визуально при микроскопировании приготовленного препарата по большим квадратам. Общее количество лейкоцитов в 1 мкл крови рассчитывалась по следующей формуле (1) Где Х – число лейкоцитов в 1 мкл крови, а – число лейкоцитов, сосчитанных в 100 больших квадратах счетной камеры Наличие примесей липополисахарида в исследуемых пробах проверяли с помощью количественного хромогенного Лимулюс теста (quantitative chromogenic limulus amebocyte lysate (LAL); Lonza Walkersvile, USA).

В состав набора входят следующие реактивы:

Limulus Amebocyte Lysate (LAL) - 5 пробирок E. coli эндотоксин - 2 пробирки, содержащие от 14-40 Ед лиофилизированного эндотоксина каждая Chromogenic Substrate - 5 пробирок, содержащих около 7 мг лиофилизированнго субстрата каждая Приготовление рабочих растворов:

1 пробирка Limulus Amebocyte Lysate разводится непосредственно перед использованием в 3 мл апирогенной воды E. coli Endotoxin разводится в 1 мл апирогенной воды. Точное количество эндотоксина определяется по сертификату, приложенному к каждому набору. Разведенный эндотоксин тщательно перемешивается перед использованием.

1 пробирка Chromogenic Substrate разводится в 6,5 мл апирогенной воды Дополнительные материалы и реактивы, не предоставленные в наборе:

Апирогенная вода Стоп-реагент. 25% уксусная кислота Планшет Сostar Процедура проведения теста:

1. Планшет преинкубировали при 37°С на нагревательном блоке «БисН» 206.

2. Стандарт, предварительно разведенный в воде до концентраций 0, 0,25, 0,5 и 1 Ед/мл и исследуемые пробы (в объеме 50 мкл), нанесли в соответствующие ячейки.

3. Далее в каждую лунку добавили по 50 мкл LAL, не убирая планшет с нагревательного блока.

4. Через 10 минут добавили 100 мкл Chromogenic Substrate, заранее подогретого до 37°С.

5. Еще через 6 минут в лунки добавили по 50 мкл Стоп-реагента. Сняли планшет с нагревательного элемента и замерили оптическую плотность в лунках на приборе Labsystems Multiskan MS при длине волны 405 нм.

Подсчет результатов:

Определение концентрации эндотоксина велось графическим методом, путем построения калибровочной кривой по средним значениям оптической плотности 4-х стандартов.

3.8.1. Выделение матричной РНК из спленоцитов крыс Для выделения РНК использовали набор Gene Elute Mammalian total RNA mini prepаration kit (Sigma-Aldrich).

В состав набора входит:

- лизирующий раствор - 2-меркаптоэтанол (2МЕ) - синие фильтрующие колонки - промывочный раствор - сменные пробирки под колонки - промывочный раствор - элюирующий раствор Выделение РНК проводили по схеме, указанной в инструкции к набору.

Краткое описание:

1. Полученные после опыта in vivo кусочки селезенки в растворе RNAlater гомогенизировали до однородности.

2. К 20 мкл каждой пробы (гомогенизированной ткани) добавляли мкл лизирующего раствора, к которому добавлен 2 МЕ (из расчета 10 мкл МЕ на 500 мкл лизирующего раствора).

3. Полученную суспензию наносили на синюю фильтрующую колонку, после чего центрифугировали колонки на центрифуге Beckman Coulter Microfuge 22r 2 мин при 14000 g.

4. В полученный фильтрат добавляли эквивалентное (500 мкл) количество 70% этанола.

5. Далее смесь наносили на красную фильтрующую колонку в 2 этапа (по 500 мкл), каждый раз центрифугируя 15 сек при 14000 g и сливая фильтрат.

6. Далее каждую пробирку промывали 250 мкл промывочного раствора 1, центрифугировали 15 сек при 14000 g 7. Лизировали ДНК на колонке при помощи набора On-column DNAse/ digestion set (Sigma-Aldrich) по следующей схеме:

а) готовили лизирующую смесь из расчета на 1 пробу:

10 мкл ДНКазы + 70 мкл буфера для ДНКазы б) на каждую пробирку наносили по 80 мкл приготовленной лизирующей смеси и инкубировали при комнатной температуре 15 мин.

центрифугировали 15 секунд при 14000 g 9. Промыли колонки 500 мкл промывочного раствора 2 (перед первым использованием в раствор добавляли 96% этанол, согласно инструкции), центрифугировали колонки 15 сек при 14000 g.

центрифугировали колонки 3 мин при 14000 g.

11. Наносили на каждую колонку по 50 мкл элюирующего раствора, центрифугировали 1 мин при 14000 g.

Полученную РНК хранили при -80 °С.

При получении кДНК использовали набор для синтеза кДНК фирмы BioRad (iScript cDNA Synthesis Kit).

Процедуру проводили согласно инструкции, приложенной к набору, а именно:

К 4 мкл реакционной смеси добавляли 1 мкл обратной транскриптазы, 13 мкл воды, свободной от нуклеаз, и 2 мкл раствора РНК.

Инкубировали полученную смесь в следующем режиме:

Полученную кДНК хранили при -20°С.

3.8.3. Проведение полимеразной цепной реакции Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени проводилась на приборе с оптическим блоком Bio Rad CFX 96 Real-time system с базой C1000 Touch Thermal Cycler.

Использовалась готовая смесь для ПЦР Thermo Scientific Maxima SYBR Green qPCR Master mix (2X).

Праймеры для IL-1, IL-10 и GAPDH подбирали с использованием компьютерной программы Primer3, доступной в Интернете по адресу http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/ (Primer3, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge).

праймеров для IL-4, IL-6 и TLR4 разработаны немецкой и ирландской группами ученых [31; 86]. Синтез праймеров осуществляла фирма «Beagle»

(Санкт-Петербург).

Последовательности праймеров 5-3:

IL-1 sense GACCTGTTCTTTGAGGCTGACA IL-1 antisense CTCATCTGGACAGCCCAAGTC IL-10 sense GCTGACAGATTCCTTACTGC IL-10 antisense ATTCATGGCCTTGTAGACAC IL-4 sense CGGTGAACTGAGGAAACTCTGTAGA IL-4 antisense TCAGTGTTGTGTGAGCGTGGACTC IL-6 sense TCAACTCCATCTGCCCTTCAG IL-6 antisense AAGGCAACTGGCTGGAAGTCT TLR4 sense CCTGAAGATCTTAAGAAGCTAT TLR4 antisense CCTTGTCTTCAATTGTCTCAAT GAPDH sense CCTGCACCACCAACTGCTTAGC GAPDH antisense GCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC Состав пробы для ПЦР включал:

10 мкл Scientific Maxima SYBR Green qPCR Master mix 1 мкл 10 пмоль/мкл прямого (sense) праймера 1 мкл 10 пмоль/мкл обратного (antisence) праймера 6 мкл свободной от нуклеаз воды Протокол проведения полимеразной цепной реакции:

4. 72,0°C – 1 сек (считывание уровня флюоресценции) 5. Считывание кривой плавления от 60,0°C до 95,0°C, через 0,5°C.

Шаги 2-4 повторяются в течение 40 циклов.

Специфичность продуктов реакции оценивали по кривым плавления.

Обработка результатов проводилась в программном обеспечении CFX Manager Version: 2.1.1022.0523.

3.9. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica 10.0. Достоверность различий между группами оценивали методом однофакторного дисперсионного анализа по post-hoc t-критериям по методам Бонферрони или Шеффе, по сравнению разностей средних по методу Тьюки, а также по U-критерию Манна–Уитни. Уровень значимости, а также критерий сравнения указывали в каждом случае сравнения. За