РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ КИНЕТИКИ И

ГОРЕНИЯ

На правах рукописи

МАЛЬЦЕВ Валерий Павлович

СКАНИРУЮЩАЯ ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ

01.04.05 - оптика

Диссертация на соискание ученой степени доктора физикоматематических наук

.

Новосибирск - 2000

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Дисперсная среда. Теоретические и экспериментальные подходы в анализе

1.2. Анализ дисперсной среды методами поштучного счета частиц........... Култер принцип

1.2.1.

Проточная цитометрия

1.2.2.

2. ГЛАВА 2. СКАНИРУЮЩАЯ ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ.

ИНСТРУМЕНТАЛЬНОЕ РЕШЕНИЕ

2.1. Введение

2.2. Проточный цитометр стандартной конфигурации

2.3. Сканирующий проточный цитометр прямой конфигурации................. Сканирующая оптическая кювета

2.3.1.

2.3.1.1. Передаточная и апертурная функции оптической кюветы

2.3.1.2. Матрица Мюллера оптической кюветы

Времяразрешенное измерение фосфоресценции

2.3.2.

2.4. Сканирующий проточный цитометр обратной конфигурации............. 2.5. Поляризационный сканирующий проточный цитометр

2.6. Электронная система сканирующего проточного цитометра............. 2.7. Программное обеспечение сканирующего проточного цитометра....... 2.8. Выводы к Главе 2

3. ГЛАВА 3. СКАНИРУЮЩАЯ ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ. ТЕОРИЯ

МЕТОДА

3.1. Введение

3.2. Обратная задача светорассеяния в цитометрии стандартной конфигурации

Метод двухуглового светорассеяния (Two Angle Light 3.2.1.

Scattering, 2ALS)

Метод тройного двухуглового светорассеяния (Triple Two 3.2.2.

Angle-Light Scattering, 32ALS)

3.3. Индикатриса одиночной частицы

Методы расчета индикатрисы

3.3.1.

3.3.1.1. Приближенные методы

3.3.1.2. Точные методы

Особенности формирования индикатрисы сферической 3.3.2.

частицы

3.3.2.1. Формирование экстремумов

3.3.2.2. Формирование контраста индикатрисы сферической частицы

Особенности формирования индикатрисы частицы 3.3.3.

произвольной формы

3.3.3.1. Формирование контраста индикатрисы несферической частицы

3.3.3.2. Функция распределения плотности набега фазы частицы

3.3.3.3. Функция распределения плотности набега фазы частиц разной формы.

3.3.3.4. Связь ширины функции распределения плотности набега фазы с контрастом индикатрисы.................. Параметризация индикатрисы

3.3.4.

Параметрическое решение обратной задачи светорассеяния 3.3.5.

3.3.5.1. Гомогенная сферическая частица

3.3.5.2. Гомогенная сферическая частица с поглощением... 3.3.5.3. Индикатриса одиночной частицы в сильно сфокусированном световом поле

Индикатриса несферической одиночной частицы................ 3.4. Несферическая частица в пуазейлевском потоке сканирующего проточного цитометра

3.5. Выводы к Главе 3

4. ГЛАВА 4. СКАНИРУЮЩАЯ ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

4.1. Сертификация латексных частиц

4.2. Исследование кинетики полимеризации с помощью сканирующего проточного цитометра

4.3. Идентификация частиц по сигналу светорассеяния сканирующего проточного цитометра

4.4. Анализ содержания жира в молоке на сканирующем проточном цитометре

4.5. Определение объёма эритроцитов и концентрации гемоглобина в них на сканирующем проточном цитометре

4.6. Исследование светорассеивающих свойств несферических частиц.... Эритроциты

Бактерии Escherichia coli и Salmonella typhimurium................ 4.7. Кинетические исследования взаимодействия лиганда с поверхностными рецепторами клетки на сканирующем проточном цитометре.......... 4.8. Выводы к главе 4

5. ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ СВЕТОРАССЕИВАЮЩИХ

ХАРАКТЕРИСТИК БАКТЕРИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

СКАНИРУЮЩЕГО ЛАЗЕРНОГО НЕФЕЛОМЕТРА

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

ВВЕДЕНИЕ

Дисперсные среды составляют значительную часть окружающей среды, участвуют и в жизнедеятельности человека, и в различных технологических процессах. Особенно важную роль дисперсные среды играют в биологии и медицине, так как в этом случае носителями дисперсности выступают клетки, микроорганизмы, вирусы и т.п. Естественно, что получение новых знаний о состоянии и развитии дисперсных систем является важной задачей научных исследований. При этом значительную роль в таких исследованиях должны играть современные физические методы, использующие последние достижения в математической обработке данных, в оптических технологиях, вычислительной технике.

Высокой эффективности анализа дисперсных сред можно достичь с использованием оптических методов исследования. Важным преимуществом таких методов является безконтактный способ контроля [1]. Наряду с традиционным оптическим контролем с помощью светового микроскопа, все большое распространение получают методы, использующие всё многообразие эффектов рассеяния света и флуоресценции в дисперсной среде. Существует два подхода к исследованию состава дисперсной среды, а именно: методы, базирующиеся на измерения отклика дисперсной системы как целого и методы, которые изучают отдельные элементы дисперсной среды. Оба подхода имеют свои преимущества и недостатки. Так достаточно легко построить эксперимент по измерению рассеяния света на ансамбле частиц, однако, извлечение полезной информации о дисперсности системы представляется довольно сложной задачей. С другой стороны, экспериментально достаточно сложно изучать отдельные элементы дисперсности, с другой стороны, определить параметры элемента по оптическим измерениям гораздо легче, чем в первом случае.

Фактически перед исследователем стоит задача выбора наиболее эффективного способа решения своих задач с использованием одного из этих двух подходов. В данной работе мы рассмотрим в деталях подход, связанный с оптическими исследованиями отдельных элементов дисперсной среды.

Современное состояние теории и эксперимента, связанными с анализом одиночных частиц можно характеризовать следующим: экспериментальные системы, позволяющие измерять свойства одиночных частиц все еще достаточно сложны; теоретические разработки, связанные с определением параметров одиночных частиц, малочисленны и малоэффективны.

В последнее время, в связи с бурным развитием лазерной техники, средств автоматизации измерений и обработки данных и появлением на мировом рынке диагностической аппаратуры, в научных исследованиях и при технологическом контроле получили широкое распространение оптические анализаторы одиночных частиц. Светорассеяние является одним из измеряемых параметров в таких анализаторах.

Наиболее перспективна для анализа одиночных частиц техника проточной цитометрии (см., например, обзоры [2, 3, 4, 5]). Создание и применение проточных цитометрических систем для автоматического анализа и разделения частиц в гидрозолях открыло новые возможности для исследований в области биологии и медицины. Цитометрия в потоке представляет собой большой шаг вперед по сравнению с обычными микроскопическими методами, при использовании которых анализ нескольких частиц занимает несколько часов. В проточных цитометрических системах частицы анализируются со скоростью до 300 тысяч в минуту. Измерение светорассеивающих свойств частиц в таких системах позволяет получать информацию об их морфологических характеристиках (размер, форма, особенности внутренней структуры, коэффициент поглощения и т. п.). Уникальность методики цитометрии в потоке состоит в том, что измерения выполняются на отдельных частицах с большой скоростью. Это обеспечивает высокую статистическую точность и позволяет надежно выявлять малые популяции. При этом анализаторы подобного типа обладают достаточно высокой производительностью (время анализа 2 мин) и надежностью результатов анализа.

Все более жесткие требования предъявляются к времени обработки измеряемых величин светорассеяния на одиночных частицах при одновременном сохранении точности измерений.

Описанные в научной литературе работы, связанные с разработкой методов анализа одиночных частиц, демонстрируют некоторые возможности использования светорассеяния при определении морфологических характеристик одиночных частиц. Однако используемый в большинстве из них метод подгонки теоретических расчетов к экспериментальным результатам требует больших затрат времени и вряд ли найдет широкое применение при высокоскоростном анализе частиц. Поэтому представляется важным дальнейшее совершенствование методов расчета параметров частиц по данным светорассеяния (обратная задача светорассеяния). При этом новые методы должны характеризоваться малым временем оценки параметров (1-10 мс в проточной цитометрии) и достаточной точностью. Особенно широкое распространение такие экспресс-методы могут получить с дальнейшим развитием цитометрических систем при проведении иммуноанализа и анализа элементов крови в медицине [6], при контроле качества продукции сельского хозяйства (например, определении жирности и наличия бактерий в молоке), при экологическом контроле и т. д.

В диссертационной работе:

1. Предложены принципы нового направления, связанного с анализом одиночных частиц по светорассеянию и флуоресценции. Разработаны основы сканирующего проточного цитометра в двух конфигурациях.

2. Предложен цитометр следующего поколения – поляризационный сканирующий проточный цитометр, позволяющий измерять комбинации элементов матрицы рассеяния одиночных частиц.

3. Проведен анализ формирования индикатрисы одиночной частицы.

Выявлены основные параметры индикатрисы наиболее чувствительные к изменениям параметров частицы.

4. Введены понятия расстояния между минимумами после граничного угла, переднего и заднего контраста индикатрисы, функции распределения плотности набега фазы частицы, которые используются в разработанном параметрическом решении обратной задачи светорассеяния для одиночных частиц.

5. Продемонстрированы возможности практического использования сканирующей проточной цитометрии при сертификации частиц, при определении параметров биологических частиц.

Разработана оригинальная технология по оптическому детектированию одиночных частиц - Сканирующая проточная цитометрия. Данная технология является существенным шагом вперед по сравнению с существующими методами определения параметров микронных и суб-микронных частиц по светорассеянию. К настоящему времени разработан, создан и испытан уникальный сканирующий проточный цитометр, обладающий в диагностики отдельных клеток возможностями превосходящими проточные цитометры стандартной конфигурации. Проведенная работа в создании новых подходов в проточной цитометрии позволила превзойти достигнутый в мире рубеж.

Практическая ценность настоящей работы определяется использованием результатов при:

- разработке экспресс-методов определения концентрации и параметров частиц в дисперсных средах;

- проведении экспериментальной проверке применимости теоретических разработок для одиночных частиц.

базирующийся на сканирующем проточном цитометре, может быть использован для диагностики водных систем, содержащих частицы, при многопараметрическом иммуноанализе, использующем латексные частицы в качестве носителя специфических антигенов.

Диссертация состоит из литературного обзора и четырех глав, каждой из которых предпослан краткий обзор литературы.

Вторая глава диссертации посвящена рассмотрению основных принципов сканирующей проточной цитометрии.

Во втором разделе рассматривается вопросы использования проточного цитометра стандартной конфигурации для измерения латексной агглютинации и определения концентрации бактерий и соматических клеток в молоке.

В третьем разделе дается полное описание работы сканирующего проточного цитометра прямой конфигурации. Рассматривается оптическая функция сканирующей кюветы при измерении индикатрисы одиночной частицы, а так же при времяразрешенном измерении флуоресценции.

В четвертом разделе описывается особенности оптической схемы сканирующего проточного цитометра обратной конфигурации.

В пятом разделе рассматривается общая схема поляризационного сканирующего проточного цитометра, приводятся расчеты индикатрис рассеяния для несферических частиц.

В шестом разделе описаны основы электронного управления сбором данных сканирующего проточного цитометра.

В седьмом разделе обсуждается программное обеспечение сканирующего проточного цитометра.

Третья глава посвящена теоретическим основам светорассеяния на одиночных частицах.

Во втором разделе рассматриваются вопросы решения обратной задачи светорассеяния при работе с цитометром стандартной конфигурации.

Представляются метод двухуглового светорассеяния и метод тройного двухуглового светорассеяния.

Представляются приближенные и точные методы расчета индикатрисы.

Рассматриваются основы формирования индикатрисы сферической частицы и частицы произвольной формы. Приведено параметрическое решение обратной задачи светорассеяния для сферических частиц и сферических частиц с поглощением. Рассматривается влияние глубины фокусировки падающего луча на индикатрису частицы. Рассматриваются вопросы измерения индикатрисы несферической частицы на сканирующем проточном цитометре на примере сфероида.

В четвертом разделе приведены результаты моделирования вращения сфероидальной частицы в пуазейлевском потоке проточного канала цитометра.

сканирующей проточной цитометрии.

В первом разделе описаны возможности сканирующего цитометра при сертификации полимерных частиц.

Во втором разделе приводятся данные по использованию сканирующей проточной цитометрии при исследовании дисперсионной полимеризации частиц.

В третьем разделе рассмотрены вопросы идентификации различных частиц по индикатрисам и исходному сигналу сканирующего проточного цитометра.

В четвертом разделе представлен метод определения концентрации жира в молоке на базе сканирующей проточной цитометрии.

светорассеивающих свойств эритроцитов, бактерий E.coli и Salmonella.

В шестом разделе представлен метод по определению объёма эритроцитов и содержанию гемоглобина в них с использованием сканирующего проточного цитометра.

В седьмом разделе приведены результаты использования сканирующей проточной цитометрии при исследовании взаимодействия антиген-антитело на поверхности клеток.

Пятая глава посвящена исследованиям индикатрис рассеяния некоторых типов микроорганизмов на лазерном нефелометре.

диссертационной работы.

Основные результаты диссертации представлены в 21 публикации, включенных в прилагаемый перечень. Содержание диссертации докладывалось на Международной конференции “Современные и лазерные технологии” (ALT'92, Москва, 8-11 сентября 1992), Всероссийской конференции по лазерной химии (Лазаревское, 30 сентября - 5 октября, 1992 г), Межреспубликанской конференции "Оптические методы исследования потоков" (Новосибирск, 2- июня 1993 г.), Международной конференции “Биомедицинская оптика” (Сан Хосе (США), 4-9 февраля 1995 г.), Межреспубликанском симпозиуме “Оптика атмосферы и океана” (Томск, 20-23 июня 1995 г.), на XVIII конгрессе международного общества по аналитической цитологии. Римини, Италия, 15- апреля 1996 г. на конференции по электромагнитизму и светорассеянию: теория и приложения, 27-28 мая 1997, Москва, Россия, на конференции по светорассеянию несферическими частицами, 9-11 июня 1997, Хельсинки, Финляндия, на 7-ом европейском симпозиуме по характеризации частиц, 10- марта 1998, Нюрнберг, Германия, а также на научных семинарах в Институте химической кинетики и горения СО РАН (Новосибирск, 1992-2000 гг.), в институтах Сибирского отделения Российской академии наук (1999 г.), в Биомедицинском центре университета г. Упсала (Швеция, 1993 г.), на физическом отделении Стокгольмского университета (Швеция, 1994 г.), на отделении медицинской физики университета г. Турку (Финляндия, 1994- гг.)

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Дисперсная среда. Теоретические и экспериментальные подходы в Как было отмечено выше, элементы дисперсной среды могут быть исследованы по светорассеянию с помощью двух подходов [7], а именно: 1) анализ светорассеяния от ансамбля частиц, составляющих систему; 2) анализ светорассеяния от отдельных элементов системы. Более эффективным и точным является второй подход, когда рассеяние от частицы может быть промоделировано более реалистическим объектом по сравнению с моделью рассеяния от ансамбля частиц. Наиболее распространенными методами инструментального решения задачи измерения светорассеяния от одиночных частиц являются 1) метод, основанный на принципе Култера [8] и 2) проточная цитометрия [3].

1.2. Анализ дисперсной среды методами поштучного счета частиц Попытки создания методов поштучного анализа частиц ведут с времен создания светового микроскопа в 1674 г. И вплоть до середины 50х световой микроскоп оставался единственно доступным средством в анализе одиночных клеток. С появлением в 1953 году нового метода [9], запатентованного Култером, впервые появилась возможность автоматического, точного, и легко реализуемого анализа одиночных частиц в потоках. С появлением метода Култера резко возросли возможности статистического анализа дисперсных сред.

Основой метода Култера является прохождение частицей в проводящей среде через отверстие малого диаметра, так что анализируемая непроводящая частицы изменяет значение постоянного тока протекающего в среде. В результате наблюдается импульс напряжения, который зависит, в частности, и от морфологии анализируемой частицы. Достаточно детальное описание принципа Култера приведено в работе [8].

Длительные исследования возможности метода Култера в анализе одиночных частиц выявили ряд ограничений в его применимости. В частности, выяснилось, что зависимость амплитуды импульса от объема частицы носит достаточно сложный характер. Данная функция чувствительна к геометрии отверстия и траектории частицы внутри этого отверстия. Естественно, что зависимости амплитуды импульса от размера становятся существенно различными для биологических частиц и для металлических частиц. В распоряжении исследователя есть практически только два параметра:

амплитуда и интеграл импульса, при большом количестве параметров системы и частицы, влияющих на конечный результат анализа. Практически невозможно сделать стабильными хотя бы части параметров, особенно для биологических частиц. Все это привело к ограниченному использованию метода Култера в практическом использовании.

В настоящее время математическая связь между размером частицы и амплитудой импульса хорошо изучена, установлено влияние формы и проводимости частицы на результаты измерения, разработана оптическая техника для контроля положения частицы в отверстии [10]. Теоретическая основа и использование гидрофокусирующей системы для точного ввода частицы в отверстие, позволяет использовать метод Култера для точного определения распределения биологических частиц по размерам и интерпретировать данные в правильном направлении.

Основной инструментальной особенностью проточной цитометрии является высокая скорость анализа, достигающая 5000 частиц в секунду на обычных коммерческих цитометрах. Кроме того, скорость анализа на проточном цитометре, оснащенном современным компьютером, позволяет анализировать суспензии частиц в реальном времени [11]. Стандартный проточный цитометр сформирован проточным капилляром и лазером, излучение которого направляется ортогонально потоку. Исследуемая частица вводится в центр потока несущей жидкости, используя гидродинамическую фокусировку. Оптическая и электронные системы стандартного проточного цитометра обеспечивают измерение интенсивности света, излучаемого одиночной частицей только в определенные телесные углы, обычно это рассеяние вперед, рассеяние и флуоресценция в бок. При этом, обычно, частицы классифицируются по «цитограммам», которые представляют собой двумерные распределения интенсивности рассеяния или флуоресценции одиночными частицами в эти фиксированные углы [12]. Еще одним способом анализа частиц в проточной цитометрии является щелевое сканирование, где частица идентифицируется по контору флуоресцентного сигнала [13].

Высокая производительность новых методов, однако же, оказывается связанной с высокой стоимостью соответствующей аппаратуры (характерная цена проточного цитометра колеблется от 60 до 250 тыс. долл. США). Тем не менее, практически каждый научно-исследовательский центр в мире, связанный с работами в области биологии, обязательно оборудуется комплексом проточных цитометров. Проточные цитометры являются частью диагностических комплексов, используемых в крупных медицинских центрах. В течении многих десятилетий монопольным правом на развитие проточной цитометрии обладали американские компании (Becton Dickinson, Coulter) и научные центры (Los Alamos National Laboratory). В России работы в данном направлении практически отсутствовали. Научные и медицинские центры приобретали данную технику на западном рынке.

В настоящее время измерение светорассеяния в проточных цитометрах широко используется при сортировке частиц [2, 3]. С этой целью обычно определяют интенсивность рассеяния вперед, рассеяния под углом 900 и ослабление. В работах [14, 15, 16, 17] было исследовано влияние углов сбора рассеянного излучения на эффективность селекции. Для определения объема эритроцитов и содержания гемоглобина (концентрация последнего связана с показателем преломления) в них измеряли [14, 18] сигналы светорассеяния в телесных углах, образованных полярными углами 3.0-5.50 и 5.5-9.00 и азимутальными углами 0-3600. Использовалось излучение диодного лазера мощностью 2.8 мВт при =842 нм. Объем и показатель преломления эритроцитов определяли методом двухуглового рассеяния (Two-Angle Light Scattering, 2ALS) с применением для калибровки сетки 2ALS капли гептана, нонана и додекана в воде. Показано, что на размер области корректных решений обратной задачи светорассеяния влияет величина углов сбора рассеянного излучения. Размер и показатель преломления эритроцитов вычислялись с достаточной точностью для размеров в диапазоне d = 3.5 - 6. мкм (n = 1.40).

Распределение фитопланктона по размерам определено [19] на основе измерения интенсивности света, рассеянного в полярные углы 1.5-19° и 73-107°.

Использовался аргоновый лазер ( = 514 нм, 100 мВт). Для измерения размера и показателя преломления частиц также применялся метод 2ALS с аналогичной калибровкой.

С целью уменьшения области некорректных решений для метода 2ALS измеряли [20] рассеянное излучение на двух длинах волн (He-Ne-лазер, 632.8 нм, 10 мВт и He-Cd-лазер, 441.6 нм, 17 мВт) в полярные углы 170 и 750 (числовая апертура линз - 0.29). Привязка сетки 2ALS осуществлялась с использованием полистирольных частиц. Были измерены распределение по размерам частиц полистирола и молока.

Угловая зависимость интенсивности рассеяния света (индикатриса) представляет наиболее полную информацию о свойствах рассеивающей частицы [21]. Ее значение в определении морфологических характеристик частицы аналогично значению отпечатков пальцев в криминалистике. Для измерения индикатрисы одиночной частицы в настоящее время используются два метода:

измерение рассеяния на зафиксированной в луче лазера частицы и проточная цитометрия [22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29]. Для расчета индикатрисы одиночной частицы используются как точные теории рассеяния (теория Ми. Метод тматриц, метод дискретных диполей и др.) [30, 31, 32, 33, 34, 35, 36], а также приближенные методы расчета [37, 38].

Измерение индикатрисы индивидуальных частиц, требует специальных методов для доставки и удержания частицы в зоне регистрации и обычно такие методы базируются на оптических, электростатических ловушках или гидрофокусирующих проточных системах. Различные типы устройств, использующих электростатические ловушки, использовались для измерения непрерывной угловой зависимости светорассеяния с использование лазерного излучения [29, 39]. Так же были продемонстрированы устройства на базе оптических ловушек, удерживающих частиц в фиксированном положении [22, 40]. Устройства, в которых частица удерживается в фиксированном положении, а вращающийся детектор или система неподвижных детекторов используются для записи индикатрисы, требуют относительно большого времени для измерения индикатрисы одиночной частицы и не позволяют накапливать данные от многих частиц для статистической обработки.

Несколько конструкций гидрофокусирующих головок для проточных цитометров, позволяющих измерять индикатрису одиночных частиц, описаны ранее (см., например, [3, 41, 42]). Индикатриса одиночных частиц позволяет определить морфологические характеристики рассеивающей частицы с наибольшей полнотой, поэтому ее измерение настолько важно. В частности, из анализа индикатрисы можно восстановить значения таких параметров частицы, как размер, показатель преломления, коэффициент поглощения, форма и т.д.[29, 43, 44, 45, 46].

индикатрису одиночной частицы с наибольшей скоростью (несколько мкс). При этом использовалось оригинальное эллипсоидальное зеркало, направляющее свет, рассеянный в полярных углах 2.5—177.50 и азимутальных углах 0—3600, на круговую матрицу, состоящую из 120 фотодиодов. Данная оптическая схема проточного цитометра дает возможность проводить измерение индикатрисы рассеяния и, тем самым, анализировать частицы с наибольшей скоростью.

Естественные недостатки системы проявляются в большом количестве фотоприемников, малом угловом разрешении, сложном для изготовления профиле эллипсоидального зеркала.

Индикатрису полистирольных частиц и спор измеряли, используя сканирующий дифрактометр с одним фотоумножителем [27]. Применение вращающегося диска и 174 оптических световодов позволило измерять индикатрису одиночных частиц в полярных углах от 30 до 1770 за 2.8 мс. Чтобы учесть различие в оптических характеристиках световодов, применялся цифроаналоговый преобразователь, работающий в режиме коррекции аналогового сигнала. Данная система не нашла широкого распространения из-за сложности в настройке множества световодов и в трудоемкости калибровочной процедуры.

Подход, использующий движение частицы в потоке, был описан Loken и др. [17]. Оптическая система проточного цитометра позволяла измерять индикатрису одиночных частиц в полярных углах от 1 до 490 с применением одного фотоумножителя. При этом частица двигалась в расфокусированном в направлении движения частицы луче лазера. Для учета изменения интенсивности излучения, падающего на частицу во время движения, а также телесного угла сбора рассеянного излучения, измерялся корректирующий сигнал флуоресценции от частиц, окрашенных красителем. Низкая чувствительность, вызванная малым углом сбора рассеяния в азимутальных углах, сложность в калибровке и пересчете положения частицы в угол рассеяния не позволили в дальнейшем развить данную конструкцию проточного цитометра для измерения индикатрисы одиночной частицы.

Основным методом, позволяющим оценивать параметры рассеивающих частиц, является метод наименьших квадратов (МНК). Для сферических частиц величины d и n подбираются так, чтобы обеспечить наилучшую аппроксимацию экспериментальных данных рассчитанными по теории Ми. Данный метод широко использовался последнее время в связи с увеличением вычислительных мощностей компьютеров [39]. Первоначально МНК использовался в экспериментах, связанных с индикатрисами одиночных зафиксированных частиц. Известна техника удержания частицы электрическим полем в луче лазера (Differential II, Science Spectrum, Inc.). В работе [22] была измерена индикатриса рассеяния частицы полистирольного латекса с диаметром 1099. нм. Использование МНК позволило определить диаметр и показатель преломления одиночной частицы: d = 1200±10 нм и n = 1.59±0.01. Возможности МНК в дальнейшем расширены [24]. Измерялись индикатрисы одиночных биологических клеток с использованием техники Differential II. Применяли МНК для модели сферической частицы с покрытием. В результате были определены параметры бактерий Staphylococcus epidermidis: радиус 353±5 нм;

толщина мембраны 25±5 нм; показатель преломления цитоплазмы 1.50±0.01;

показатель преломления мембраны 1.54±0.01.

Расчет на основе данных о положении минимумов индикатрисы одиночных бактерий Staphylococcus epidermidis позволил получить d = 350±5 нм [25].

В проточной цитометрии МНК использовался в ряде работ [26, 27]. Так, состав пятикомпонентной смеси, состоящей из частиц с размерами 1.1, 5.0, 10.0, 15.6 и 19.5 мкм, определен [26] на основе данных по светорассеянию, измеренных на проточном цитометре. Для полистирольных латексных частиц получено достаточно хорошее согласие между измеренной функцией рассеяния и вычисленной по теории Ми. Из сравнения индикатрис рассеяния, рассчитанных по теории Ми для гомогенных сфер, определены [27] распределение по размерам и среднее значение показателя преломления для спор.

Метод наименьших квадратов с использованием точной теории рассеяния является наиболее точным методом решения обратной задачи светорассеяния для одиночных частиц. Однако он требует длительных вычислений и довольно точного задания начальных параметров подгонки. Одной из первых попыток найти решение обратной задачей светорассеяния через создание эмпирических уравнений был метод оптического картографирования, предложенный Quist и Wyatt [47]. В дальнейшем этот метод получил развитие в определении распределения частиц по размеру и показателю преломления [48].

Спектральный подход в нахождении решения обратной задачи светорассеяния для одиночных частиц был развит Ludlow и Everitt [49, 50].

Разложив поле рассеяния в ряд Гегенбауэра, авторы показали, что точка среза спектра однозначно связана с размером частицы. Авторы предположили, что из спектра так же можно определить показатель преломления частицы. Быстрое преобразование Фурье было использовано Min и Gomez [51], чтобы определить размер частиц с известным показателем преломления с точностью 3%. Данный метод позволял определять размер частицы с частотой 20-30 кГц из индикатрисы, измеренной в углах от 90 до 180. Аппроксимационное решение обратной задачи светорассеяния для частиц сравнимых с длиной волны был предложен Warner и Hirleman [52], которые продемонстрировали работоспособность метода для определения размера и показателя преломления частицы, лежащей на поверхности. Индикатриса, измеренная в углах 100 - аппроксимировалась функцией Гаусса и параметры частицы определялись из параметров полученной функции. Ulanowski и др. [53] использовали метод нейронных сетей (neural network), чтобы найти решение обратной задачи светорассеяния для сфер. Типичное время обучения такой нейронной сети и определения параметров частицы равнялись соответственно 50 секунд и миллисекунд. При этом использовался пакет MATLAB 4.2, работающий на 166MГц Intel 80586 процессоре. Рабочая область метода ограничивалась 0.5 мкм <