«Клеточные и молекулярные особенности проявления атаксиителеангиэктазии ...»

Федеральное государственное бюджетное учреждение наук

и Институт

цитологии Российской академии наук

На правах рукописи

КУРАНОВА

Мирья Леонидовна

Клеточные и молекулярные особенности проявления атаксиителеангиэктазии

03.03.04- Клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук, Спивак Ирина Михайловна Санкт-Петербург Оглавление Список основных сокращений……………………………………. Введение……………………………………………………………… I.Обзор литературы………………………………………………… 1 Атаксия-телеангиэктазия………………………………………….. 2. Основные сигнальные пути в ответ на повреждения ДНК.

Протеинкиназа ATM……………………………………………….. 3. Эпигенетическая регуляция хроматина при ускоренном старении 3.1 Структура хроматина…………………………………... 3.2 Структура хроматина при двунитевых разрывах ДНК…………………………………………………………………… 3.3 Эпигенетические модификации хроматина…………….. 3.4 Посттрансляционные модификации гистонов…………. 4.Триметилированные формы гистона H3 – Н3К9me3 и Н3К27me3 при трансформации и старении клетки…………………………………. 5. Гистоновые деацетилазы SIRT1 и SIRT6 при старении клетки.. 5.1 Деацетилаза SIRT1………………………………………… 5.2 Деацетилаза SIRT6………………………………………… 6. Ядерная ламина при старении клетки…………………………... II. Материалы и методы…………………………………………… 1. Культивирование клеток………………………………….. 2. Получение первичных фибробластов……………………. 3. Иммунофлуоресценция…………………………………… 4. Микроскопия и анализ изображений…………………….. 5. Статистическая обработка результатов………………….. Результаты и обсуждение…………………………………... III.

Выявление фосфорилированной (активной) формы i.

протеинкиназы АТМ (фосфо-АТМ) ………………… Выявление ферментативной активности протеинкиназ ii.

фосфо-АТМ и ATR в клетках больной синдромом Секкеля………………………………………………… Выявление ферментативной активности протеинкиназ АТМ iii.

и ATR в исследуемых линиях

3.2. Интенсивность флуоресценции гистоновых деацетилаз SIRT и SIRT6 в исследуемых линиях…………………………………… 3.3. Интенсивность флуоресценции триметилированных форм гистона Н3 H3K9me3 и H3K27me3……………………………….. 3.4. Выявление гетерохроматинового маркера HP1-……... 3.5. Накопление аберраций ядерной ламины………………. 3.6 Определение количества SA--галактозидазы в исследуемых линиях…………………………………………………………… 3.7. Измерение длин теломер………………….……………. Заключение……………………………………………………… Выводы…………………………………………………………… Список литературы………………………………

АТ – атаксия-телеангиэктазия ATM - ataxia-telangiectasia mutated – мутантный ген атаксии-телеангтэктазии ATR -‘ataxia telangiectasia’ and ‘rad3-related’ BRCA1 - breast cancer type 1 susceptibility protein DDR- The DNA Damage Response – ответ на повреждение ДНК СХО – сестринские хроматидные обмены Актуальность проблемы. Атаксия-телеангиэктазия (АТ) является тяжёлым прогрессирующим мультисистемным нейродегенеративным заболеванием с признаками преждевременного старения и резко повышенным риском образования опухолей, наследуемым по аутосомнорецессивному типу. Причиной заболевания является мутация в гене ATM, который локализован в 11 хромосоме (11q23), имеет размер 150 т.п.н. и содержит 66 экзонов (Savitsky et al., 1995; Lavin, Khanna, 1999; Pulverer, 2003). На сегодняшний день описано более 100 мутаций, приводящих к АТ (Sandoval et al., 1999; Lee et al.,2013).

Частота заболевания в зависимости от популяции составляет от 1: до 1: 100000-300000 населения, при этом доля гетерозиготных носителей составляет от 1 до 7%. Гетерозиготные носители также подвержены высокому риску развития опухолей (Спивак, 1999, Cancannon 2002).

Клиническая картина при АТ полиморфна, и при диагностике заболевания могут возникать трудности. Учитывая, что молекулярногенетическая диагностика затруднена из-за большого количества мутаций, размера и высокой степени полиморфизма гена ATM, исследования клеточных особенностей пациентов с АТ крайне важны.

Ген ATM кодирует протеинкиназу АТМ(ataxia-telangiectasia mutated), играющую ключевую роль в ответе клетки на повреждение ДНК – возникновение двунитевых разрывов при действии генотоксических агентов или конформационных изменений при действии хроматин-ремодулирующих агентов(Savitsky et al., 1995; Shiloh Y. 2003; Pospelova et al., 2011). Таким образом, клетки АТ-пациентов являются стандартной клеточной моделью для изучения процессов глобального клеточного ответа на повреждение ДНК и механизмов репарации двунитевых разрывов (Lavin, 2008).

В то же время, признаки ускоренного старения в сочетании с повышенным риском развития опухолей у больных АТ также делают эти клетки уникальной моделью для изучения, как процессов старения, так и клеточной трансформации, поскольку они одновременно используют эти две разнонаправленные программы клеточного развития. В клетках пациентов АТ было описано характерное изменение таких маркеров старения, как SA-Gal, SAHF, HP1-, -H2AX, 53BP1, резкое снижение эффективности процессов репарации ДНК и высокий уровень хромосомных перестроек (Хомасуридзе и др., 1999; Полуботко и др., 2009а,б). Учитывая то, что протеинкиназа АТМ вовлечена во многие важные сигнальные пути клетки, исследования клеточных особенностей АТ актуальны как для фундаментальной науки, так и для клинических разработок.

Цели и задачи. Целью данной работы являлось изучение клеточных особенностей пациентов с АТ. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Подбор подходящей группы клеточных линий, в которую входят как линии, полученные от пациентов с АТ, так и клетки от пациентов с другими нарушениями репарации ДНК и здоровых доноров.

автофосфорилированию в ответ на повреждение ДНК, разработать и апробировать клеточный метод, позволяющий уточнить диагноз АТ в сложных случаях. Детектировать наличие активной формы АТМ – фосфо-АТМ (Р-АТМ) в исследуемых клетках для уточнения диагноза АТ в сложных случаях.

3. Изучить возможность ассоциации с АТ классического маркера старения SA--Gal.

4. Изучить возможность ассоциации с АТ эпигенетических маркеров старения: белка гетерохроматина HP1-, триметилированных форм гистона Н3 H3K9me3 и H3K27me3 и гистоновых деацетилаз сиртуинов SIRT1 и SIRT6.

5. Изучить состояние ядерной ламины в исследуемых линиях с поиском возможных ассоциаций с АТ.

6. Изучить длины теломер в исследуемых линиях с поиском возможных ассоциаций с АТ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработан и апробирован метод клеточной диагностики АТ, основанный на иммунофлуоресцентном выявлении в клетках активной формы АТМ (рАТМ) после действия генотоксических агентов – рентгеновского облучения в дозе 2 Гр, и радиомиметика блеомецина в концентрации 50 мкгр/мл.

2. Выявлены и описаны мозаичные формы АТ 3. При исследовании гистоновых деацетилаз SIRT1 и SIRT6 показано достоверное повышение количества SIRT6 во всех исследованных 4. При исследовании триметилированных форм гистона Н3 H3K9me и H3K27me3 обнаружено достоверное повышение количества H3K27me3 в клетках больных АТ по сравнению с клетками Научная новизна работы.

Впервые предложен быстрый метод уточнения диагноза АТ на клеточном уровне.

Впервые описана мозаичность при АТ: выявлены пациенты, часть клеток которых не содержала Р-АТМ, что характерно для АТ, а часть – содержала, то есть соответствовала нормальному фенотипу.

деацетилазы SIRT6 в клетках пациентов АТ всех изученных форм по наследственными нарушениями репарации ДНК: неустановленный радиочувствительный синдром, синдромом Секкеля, при наличии мутациии 5382insC в гене BRCA1 (семейная форма рака молочной железы).

Личный вклад автора. Все экспериментальные части работы были выполнены автором лично. Длины теломер измерялись совместно с Андреем Леонидовичем Руновым. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научными руководителями.

Финансовая поддержка работы.

Работа проводилась при поддержке Российского Научного Фонда (РФФИ), гранты №12-06-00189а и № 14-15а также Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине», гранты 2009-2014 гг.

Научно-практическое значение работы. Работа вносит значительный вклад в фундаментальные представления о причинах возникновения и развития наследственных синдромов с нарушением процессов репарации ДНК. Описанный при АТ мозаицизм, вероятнее всего возникающий путём гомологической рекомбинации гомологичных хромосом, демонстрирует недостаточность для развития нормального фенотипа наличия «здорового»

аллеля хотя бы в половине клеток. В то же время разработанный и апробированный метод уточнения диагноза АТ и радиочувствительных синдромов на основе детекции в клетках пациентов Р-АТМ является крайне важным для прикладной медицины уже используется врачами-клиницистами при постановке диагноза АТ в сложных случаях. Этот метод может быть использован для дальнейших разработок с целью его применения в пренатальной диагностике.

Учитывая то, что клетки от пациентов с АТ являются уникальной естественной моделью с нарушенным АТМ-зависимым сигнальным каскадом, полученные результаты наиболее близко подходят для понимания механизмов старения и трансформации в клетках человека, не страдающего АТ, по сравнению с искусственными моделями. Благодаря тому, что контрольная группа линий от пациентов с нарушениями репарации ДНК разнообразна, результаты исследования триметилированных форм гистона Н3 - H3K9me3 и H3K27me3 и гистновых дезацетилаз SIRT1 и SIRT6 вносят значительный вклад в понимание эпигенетических процессов при ремоделировании хроматина в результате старения и трансформации клетки.

Полученные данные о состоянии ядерной ламины и количества SA--Gal в исследуемых линиях также могут быть полезными при разработке клеточных методов оценки риска развития опухолей при старении, внося вклад в понимание механизмов «предтрансформационного» старения клетки.

Синдром атаксия-телеангиэктазия (АТ), характеризующийся мозжечковой атаксией и кожно-конъюнктивной телеангиэктазией, в 1941 г.

впервые описала французская исследовательница Луи-Бар, а в 1958 г. Бодер и Сэджвик предложили название АТ и выявили третий важный компонент этого синдрома - тяжелую рецидивирующую бронхо-легочную патологию. В дальнейшем Тейлор (Taylor, 1978 г.) предположил, что причиной чрезвычайно большого количества радиационно-индуцированных хромосомных аберраций в клетках больных AT, по сравнению с клетками здоровых доноров, является нарушение репарации ДНК при двунитевых разрывах, и именно это служит причиной повышенной радиочувствительности.

На сегодняшний день известно, что данный синдром (имеющий также названия: синдром Луи-Бар, синдром Бодера-Седжвика, ранняя прогрессирующая мозжечковая атаксия и цефало-окуло-кутанная телеангиэктазия) является тяжёлым прогрессирующим мультисистемным нейродегенеративным заболеванием из группы факоматозов, наследуемым по аутосомно-рецессивному типу (OMIM заболевания: 208900, OMIM гена ATM: 607585). Для больных характерны: патология центральной нервной системы (ЦНС), кожи, глаз, иммунологические нарушения, высокая предрасположенность к неоплазиям, преждевременное старение, а также резко повышенная чувствительность к ионизирующему излучению, ограниченная пролиферативная способность клеток и значительное укорочение теломер уже при рождении ребёнка.

Причиной заболевания является мутация в гене ATM. Ген локализован в 11 хромосоме (11q23), имеет размер 150 т.п.н. и содержит 66 экзонов (Savitsky et al., 1995; Lavin, Khanna, 1999; Pulverer, 2003).

Частота заболевания варьирует в различных популяциях от 1:40000 до 1: 100000-300000 населения, но доля гетерозиготных носителей гена ATM в популяции значительно выше, чем можно ожидать по распространенности самого заболевания, и составляет от 1 до 7%.

повышенный риск развития злокачественных опухолей обнаруживаются и у родителей больных – гетерозиготных носителей мутантного гена ATM (Спивак, 1999, Cancannon 2002).

Ранее в нашей лаборатории было экспериментально подтверждено, что в клетках больных АТ одновременно реализуются две противоположно направленные клеточные программы: ускоренного старения – характерное изменение количества классических маркеров старения, таких как SA--gal, SAHF, HP1-, -H2AX, 53BP1; и трансформации – резкое снижение эффективности процессов репарации ДНК и высокий уровень хромосомных перестроек (Хомасуридзе и др., 1999; Полуботко и др., 2009а,б).

Опираясь на динамику процессов репарации ДНК после гаммаоблучения, можно выявить не только наличие самого синдрома АТ, но и его гетерозиготное носительство (Спивак и др., 2005; 2007). Например, время, на которое достоверно различается появление детектируемых количеств белка Р53 после гамма-облучения в клетках здорового человека и больных АТ, равно 1 часу. Эта разница объясняется тем, что функцию АТМ по фосфорилированию Р53 через какое-то время способна взять на себя родственная протеинкиназа ATR, дефект которой, вызванный мутацией в гене АТR, приводит к развитию другого наследственного заболевания – синдрома Секеля -го типа (ОMIM заболевания: 210600; MIM гена: 601215) (O’Driscoll et al., 2003). В клетках пациентов с АТ в ответ на повреждение ДНК появление p21Wafl/Cip1 – ингибитора циклинзависимых киназ – происходит со значительной задержкой (Полуботко и др., 2009а). На данный момент описано более 100 мутаций в гене ATM, приводящих к АТ (Sandoval et al., 1999; Lee et al.,2013). Развитие болезни начинается обычно с двух лет и прогрессирует к 10 – 20 годам. Клиническая картина при разных формах АТ схожа, но в то же время характеризуется определенным полиморфизмом. Все больные АТ страдают ослабленным иммунитетом, кожно-конъюнктивной телеангиэктазией, имеют признаки ускоренного старения, но тяжесть неврологических и неоплазийных проявлений различна (Спивак, 1999, Shiloh, 2003, Lanzy et al., 1992).

2 Основные сигнальные пути в ответ на повреждения ДНК.

определенных типов повреждений. У высших организмов существует два основных сигнальных пути в ответ на повреждения ДНК. Один реализуется благодаря активности белка АТМ (ataxia-telangiectasia mutated), другой – через АТR (‘ataxia telangiectasia’ and ‘rad3-related’). Киназы ATM (350 кДа) и ATR (301 кДа) принадлежат к семейсву фосфотодилинозитол-3-киназы (PI3Ks, Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase) 4 класс PI3-киназ – суперсемейство фосфатидилинозитол-3 подобных серин-треониновых киназ, которые активируются непосредственно сразу же после активации сенсоров повреждений (Savitsky et al., 1995; Shiloh Y. 2003).

Рис.1 фосфатидилинозитол-3-киназы человека (Shiloh, 2003) Сигнальный каскад, генерируемый в ответ на повреждение ДНК, включает в себя сенсорные, медиаторные и эффекторные белки и фосфорилированием и ацетилированием. Клеточный ответ на двуцепочечные разрывы ДНК инициируется распознаванием поврежденного участка молекулы сенсорными белками. Протеинкиназа АТМ действует совместно с протеинкиназой NBS1в качестве первичных сенсорных белков. В отличие от родственной протеинкиназы АТМ, АТR важна в ответе на иные формы стабилизацию остановленных репликативных вилок и/или остановку на конкретном этапе клеточного цикла, а также по некоторым данным активируется наличием регионов одноцепочечной ДНК.

Белок АТМ, неактивный или отсутствующий в клетках больных АТ, протеинкиназа, являющаяся ключевым регулятором механизма клеточного ответа на повреждение ДНК. Функция АТМ в процессе негомологичного воссоединения концов (NHEJ, non-homolodous end joining) заключается в фосфорилировании нуклеазы Artemis. АТМ активируется незамедлительно в ответ на двунитивые разрывы ДНК, вследствие чего происходzт конформационные изменения в высокоупорядоченной структуре хроматина для эффективной репарации ДНК и прохождения ключевых точек клеточного цикла (Shiloh, 2003; Lavin, 2008). При этом протеинкиназа АТМ, обычно находящаяся в неактивной димерной форме, автофосфорилируется по серину в 1981 положении и диссоциирует на две активные протеинкиназы – фосфо-АТМ (Р-АТМ), моментально начинающие фосфорилирование более, чем 800 белков-мишеней как активируя, так и ингибируя их активность (Bakkenist et al., 2003, Lavin 2008). Одним из первых белков-мишеней Р-АТМ является протеинкиназа CHK2, фосфорилирующая в свою очередь фосфатазу Cdc25A (Falck et al., 2001), которая в фосфорилированной форме неспособна снять ингибирующее фосфорилирование циклин-зависимой киназы CDK2, что приводит к остановке клеточного цикла (Burdon et al., 2002). Другой фосфорилирования АТМ белка Р53, что приводит к стабилизации последнего и его накоплению в клетке после повреждения ДНК (Kruse, Gu, 2009;

Mirzayans, 2012), а также проявлению его активности как фактора, усиливающего транскрипцию ингибитора циклин-зависимых киназ Р21Wafl/Cip1(Westphal, 1997). Кроме того, такие мишени АТМ, как Nbs1, BRCA1, FANCD2, SMC1 принимают участие в процессах репарации ДНК и аресте S-фазы клеточного цикла (Kutagawa, Kastan, 2005; Taniguchi et al., 2002; Xu, O’Donnell et al., 2002; Zhan et al., 2010; Yazdi, 2002).

АТМ является одним из основных белков, вовлеченных в сохранение генетической стабильности, контроль длины теломеры и в активацию контрольных точек клеточного цикла. При АТ функционирование белка АТМ нарушено и, как следствие, становится невозможным адекватный ответ клетки на повреждение ДНК, что приводит к накоплению в ней нерепарируемых повреждений. В этих условиях резко повышается риск клеточной трансформации или вероятность быстрого перехода к состоянию необратимого прекращения пролиферации, т.е. преждевременному клеточному старению (Lavin, 2008).

До сих пор не совсем ясно, каким образом активируется сама АТМ, и какие белки являются для этой активации сенсорами. По современным представлениям это комплекс белков Mre11-RAD50-NBS1 и BRCA1, которые участвуют в распознавании именно двунитевых разрывов ДНК. Белки, называемые медиаторами, прототипом которых является дрожжевой RAD9, участвуют в передаче сигнала. Они содержат два повторяющихся домена, впервые обнаруженных в С-конце белка BRCA1 и названные поэтому BRCТдоменами. BRCТ-содержащие белки найдены у млекопитающих, но имеют функции, сходные с дрожжевым RAD9. Среди подобных белков описаны сам BRCA1, TopBP1 (topoisomerase II binding protein I), 53BP1 (P53 binding protein I) и MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint protein I). BRCA взаимодействует с большим числом белков, вовлеченных в процессы репарации ДНК, и собирает белковый комплекс, участвующий в инициации и передаче сигнала BASC (BRCA1 associated genom surveillance complex) и, дополнительные мишени для фосфорилирования киназам-переносчикам исследователи полагают, что белок ATMIN (for ATM INeractor) может играть ключевую роль в сигналинге АТМ (Kanu, Behrens, 2008; Kanu et al., 2010;

Rapali et al., 2011; Zhang et al., 2012).

Рис. 2 Схема активации протеинкиназ АТR и АТМ (Cimprich, Cortez, 2008).

приводит к фосфорилированию последующей киназы CHK1и других эффекторов ATR. В ответ на повреждение ДНК или репликативный стресс ATR и его эффекторы начинают медленно запускать и индуцировать арест клеточного цикла и также остановку вилок репликации.

В) Формирование концов двунитевого разрыва ДНК приводит к вовлечению фосфорилированной мономерной форме АТМ, которая связывает MRN комплекс с двунитевым разрывом и затем активирует ДНК и MRN комплекс. Активированная АТМ Фосфорилированный H2AX (-H2AX) связывается с MDC1 посредством его BRCT домена, что приводит к вовлечению дополнительных ATM/MRN комплексов и к последующему фосфорилированию H2AX. Активированная АТМ также фосфорилирует мишени, среди которых CHK2. Фосфорилирование этих белков приводит к аресту клеточного цикла, ингибирование начала S фазы и инициирует репарацию двунитевых разрывов ДНК.

Эти два сигнальных пути после распознавания повреждений ДНК завязаны на фосфорилировании одних и тех же белков: H2AX, Rad 17, Rad1/Rad9/Hus1 комплекс, BRCA1, Chk1, 2-киназы, Nbs1/Rad50/Mre комплекса, p53.

Процесс репликации происходит в специализированных структурах – вилках реплицаии (рис 3). Остановившиеся вилки репликации активируют протеинкиназу АТR. Нуклеазы могут расщеплять остановившиеся вилки репликации, возникшие в результате двунитевых разрывов ДНК. Скорость, с которой ДР приводят к остановке вилок репликации, значительно увеличивается в клетках с нарушенным сигналингом АТR. ДР активируют АТМ, а затем АТR, и этот процесс зависит от АТМ и клеточного цикла таким образом, что активация протеинкиназы АТR происходит в основном в S и G2.

протеинкиниазы АТR и АТМ соответственно.

Рис.3. Взаимное преобразование ATR- и ATM- активации в ответ на повреждение ДНК (Cimprich, Cortez 2009) старении При таком серьёзном нарушении клеточного ответа на повреждение ДНК, как при АТ, происходит конформационное изменение хроматина (Shiloh, 2003; Lavin, 2008).

К началу XX в. было показано, что некоторые хромосомы или их фрагменты во время клеточного деления выглядят более конденсированно и интенсивно окрашенными. Это явление было выявлено Гютерцем в 1907 г. и названо гетеропикнозом (от греч. гетерос – иной, пикнозис - плотность), который может быть отрицательным при слабой окрашиваемости, и положительным – при сильной. В 1928 г. Хайц предложил термин «гетерохроматин» для обозначения районов хромосом, которые демонстрируют положительный гетеропикнозис для всех стадий клеточного цикла. Этот термин учёный предложил, исследовав поведение гетеропикнотических участков хромосом и интерфазных хромоцентров, когда он обнаружил, что плотные, сильно окрашенные районы хромосом не деконденсируются в телофазе, сохраняя свою плотность с последующим образованием хромоцентров в интерфазе. Позже Хайц предложил различать эухроматин и гетрохроматин. Их свойства различны. В первом случае термин обозначает основную часть митотических хромосом, претерпевающих обычный цикл компактизации – декомпактизации во время митоза, во втором – участки хромосом, постоянно находящиеся в компактном состоянии. У большинства видов эукариот хромосомы содержат оба вида хроматина. Как правило, значительную часть генома составляет гетерохроматин, который чаще всего располагается в прицентромерных и прителомерных областях.

Также различают интеркалярный хроматин – гетерохроматиновые участки в эухроматиновых плечах хромосом.

В 1974 г. сразу четверо исследователей показали, что хроматин состоит из нуклеосом. Р.Д. Конберг обнаружил, что хроматин состоит из субъедениц, содержащих по 200 п.о. ДНК и по две молекулы четырёх типов гистонов. Н.

Нолль изолировал эти структуры, а А. Олинс и Д. Олинс опубликовали первые электронно-микроскопические структуры нуклеосом. Сейчас известно, что нуклеосома содержит гистоновые и негистоновые белки, на которые намотана ДНК, состоящая из 147 п.о. ( Campos, Reinberg,2009).

Существуют восемь основных гистоновых белков (составляющих октамер), на которые намотана ДНК (по два: H2A (28кДа), H2B (28 кДа), H3 (30 кДа) и H4 (22 кДа)) и линкерный гистон H1 (24 кДа), соединяющий коровые гистоны и ДНК.

Рис.4. Строение нуклеосомы (Serravallo, et al., 2013) положение и могут модифицироваться за счёт ковалентного связывания определенных молекул со свободными группами аминокислот. Один гистоновый октамер в нуклеосоме содержит примерно 220 положительно заряженных остатков лизина и аргинина и примерно 74 отрицательно заряженных остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот. Также присутствуют 400 отрицательно заряженных фосфата, принадлежащих парам оснований ДНК. Для «энергосберегающей» конденсации ДНК нуклеосомной структурой нейтрализовано только около половины отрицательных зарядов ДНК, основные заряды нейтрализуются другими факторами: линкерным гистном H1, катионами и др.

ДНК является отрицательно заряженным полимером, в котором происходит электростатическое отталкивание между двумя соседними участками ДНК. По этой причине в клетках не бывает чистой ДНК – она упакована в нуклеопротеиновые структуры на всех этапах клеточного цикла (Olins and Olins 1974; Kornberg 1974; Woodcock et al. 1976). Митотические или мейотические хромосомы на стадии метафазы формируются каждый раз с очень большой точностью, сохраняя все соотношения длин плеч, размеров, особенности продольной дифференциации, подразделение на эу- и гетерохроматин. При этом на этой стадии ДНК наиболее конденсирована, упаковываясь и укорачиваясь в несколько тысяч раз для того, чтобы двухметровую растянутую молекулу сжать до размеров хромосомы (в среднем 15 мкм в диаметре), компактизировав её при этом более чем в раз. В основе этого процесса лежит механизм, удивительный по своей надёжности, которая достигается путём гиперфосфорилирования линкерного (H1) и корового гистона H3 и зависит от АТФ действия кондексиновых и когезиновых комплексов и топоизомеразы Точные механизмы модификации митотического хроматина посредством негистоновых комплексов до конца ещё не известны. Полагают, что в этом процессе играет роль хорошо известное митотическое фосфорилирование гистона H3 (т.е.

серинов 10 и 28) и членов семейства H1, но полного понимания роли этих митотических меток пока нет. Существует теория, согласно которой, специфические метки, обусловленные метилированием, при сочетании с фосфорилированием, могут действовать в гистоновых белках как «двоичный перключатель», управляя связыванием и высвобождением «эффекторов», затрагивающих хроматиновую матрицу (Fischle et al., 2003). Опираясь на связывание гетерохроматинового маркера HP1 с метилированным по лизину 9 гистоном H3 (НЗК9mе) и митотическое фосфорилирование серина (H3S10ph), были получены данные в поддержку митотического «метил/фоспереключателя» (Daujat et al., 2005; Fischle et al., 2005; Hirota et al., 2005).

специализированные хромосомные домены, как теломеры и центромеры, играющие фундаментальную роль в надёжном расхождении хромосом.

Теломеры – концы линейных эукариотических хромосом, состоящие из восстанавливаются ферментом теломеразой. Они обеспечивают включение самых дистальных концов хромосом в репликацию ДНК, обеспечивают защиту концов хромосом от деградации, подавляют слияние хромосом у нуклеотидных последовательностей, так и эпигенетически. Барбара МакКлинток первой описала явление «разрыв-слияние-мостик», при котором слияние между разорванными хромосомами или слияние концов хромосом приводят к образованию дицентрических хромосом и анафазных мостов, генерирующих дальнейшие разрывы. В работе на Drosophila было показано, что утрата конца теломеры у Drosophila может приводить к DSB в одном поколении, но в последующих укороченная теломера действует как полностью функциональная без какого-либо добавления ретротранспазонов или каких-либо изменений в последовательности (Ahmad and Golic, 1998).

В 1880 г. Флеммингом были впервые описаны центромеры как «первичные» перетяжки в хромосоме. В настоящее время центромеру (CEN) определяют как ДНК и белки хроматина, ответственные за формирование белковой структуры, облегчающей прикрепление микротрубочек и движение вдоль них – кинетохора. Кинетохор обращён к пластинке во время прометафазы и к полюсам во время анафазы митоза и мейоза и служит также местом действия ключевой для клеточного цикла «контрольной точки», известной как «контрольная точка сборки веретена» (SAC, spindle assemble checkpoint), или «митотическая контрольная точка».

эухроматина и от других гетерохроматиновых районов присутствием уникальных хроматиновых структур, которые в основном оказывают репрессивное действие на активность генов и рекомбинацию. Перемещение экспрессируемых генов из нормального положения в эухроматине в новое положение в центромерном гетерохроматине или поблизости от него может заставить гены «замолчать», создавая возможность скрининга для поиска и идентификации супрессоров или энхансеров эффекта положения мозаичного типа (PEV), либо эффектов прителомерного положения (TPE, telomereposition effects) (Gottschling et al., 1990; Aparicio et al., 1991). Центромеры и теломеры имеют молекулярные сигнатуры, такие как гипоацетилированные гистоны. Центромеры вдобавок имеют гистоновый вариант CENP-A, играющий активную роль в сегрегации хромосом. Т.о., правильная сборка и поддержание различающихся центромерного и перицентромерного гетерохроматина являются критичными для завершения митоза или мейоза и, отсюда, для жизнеспособности клеток.

гетерохроматина исследуются механизмы эпигенетического контроля центромерной (и теломерной) «идентичности». Было показано, что вместо нормальных центромер могут функционировать «неоцентромеры», демонстрируя тем самым, что идентичность центромер не диктуется специализированный хромосомный домен маркируется эпигенетическими особенностями. Это относится и к паттернам специфических для центромер модификаций и вариантов гистонов.

организована 30-нанометровая фибрилла хроматина, велись долгое время. На (одностартовая спираль) модель, в которой нуклеосомы постепенно сворачиваются вокруг центральной оси (6-8 нуклеосом на один оборот), и более открытая модель типа «зигзаг», предполагающая самосборку более высокого порядка (двухстартовая спираль). Данные рентгеноструктурного нуклеосомы, позволяют отдать предпочтение двустартовой, загзагообразной модели организации фибрилл, в которой линкерная ДНК соединяет две стопки нуклеосомных частиц (Khorasanizadeh, 2004; Schalch et al., 2005;

Maeshima et al., 2014). При этом линкерный гистон H1 не присутствует в данных структурах.

нуклеотидные последовательности ДНК в живых клетках, была изучена динамика «открытия» и «закрытия» хроматина in vivo в реальном времени, что позволило выявить динамическое взаимодействие позитивных и негативных факторов ремоделирования хроматина, ассоциированного с экспрессией генов (Fisher, Merkenschlager, 2002; Felsenfeld, Groudin, 2003;

Misteli, 2004). Результаты этих исследований также позволили выявить в интерфазных хромосомах множество уровней сворачивания хроматина (выше, чем 30-нм фибрилла). Например, модель радиальной петли (Laemmli et al. 1978), в которой многие петельные структуры 30- нм волокон хроматина обернуты вокруг несущей структуры, состоящей из конденсина и топоизомеразы II (Maeshima, Laemmli, 2003), образуя, т.о., петлевидные хроматиновые домены (300-700 нм). Некоторые исследователи полагают, что организация таких доменов происходит путём заякоревания хроматиновой фибриллы на периферии ядра или на других ядерных скаффолдах (остовах) с помощью таких ассоциированных с хроматином белков, как ядерные ламины.

Рис. 7. Две классические модели 30 нм хроматиновых волокон высшего порядка (Maeshima et al., 2014).

Таким образом, в организации хроматина существует значительно больше уровней более высокого порядка, обусловливающих либо интерфазное, либо митотическое состояние, которые ещё предстоит различить.

3.2 Структура хроматина при двунитевых разрывах ДНК При двунитевых разрывах ДНК структура хроматина претерпевает изменения: на месте разрыва ДНК происходит быстрая потеря нуклеосом, создавая короткие участки ДНК, свободные от нуклеосом вокруг разрывов.

Высвобождение нуклеосом – ключевой этап репарации ДНК – является активным процессом, для которого необходим MRN комплекс (MRE11, RAD50 и NBS1) и ремодулятор хроматина Ino80 (Shroff et al., 2004; Tsukuda et al., 2005; Berkovich et al., 2007). Пока до конца не известно, действует ли MRN комплекс на местах ДР напрямую при удалении нуклеосом, или он привлекает отдельный ремодулирующий комплекс, но известно, что он имеет как нуклеазную (Mre11), так и АТФазную (rad50) активность и быстро привлекается к коцам ДНК в местах ДР (Lavin, 2007). Важную роль в гетерохроматинового белка kap1, происходящее в местах ДР (Ziv et al., 2006;

Goodarzi et al., 2008). До конца не ясно, каким образом фосфорилирование kap1 с помощью АТМ влияет на структуру гетерохроматина, т.к.

фосфорилированный kap1остаётся связанным с хроматином (Goodarzi et al., 2008). Известно, что kap1 является репрессором транскрипции, образуя метилтрансферазой и HP1, таким образом способствуя образованию репрессированных гетерохроматиновых доменов, возможно, из-за изменения взаимодействия kap1 с этими белками (Li et al., 2010). Другими словами, фосфорилирование kap1 и изменения в распределении HP1 необходимы для эффективной репарации ДНК, что делает структуру гетерохроматина компактной.

Структура хроматина и экспрессия генов зависят и от эпигенетических изменений, проходящих без изменений в нуклеотидной последовательности ДНК. Типы эпигенетических модификаций представлены в табл.2.

Табл 1. Типы эпигенетических модификаций ДНК-метилирование - химическая модификация, добавляющая метильные групппы (CH3) на специфические сайты ДНК. Реакция ДНК-метилирования катализируется метильной группы с S-аденозилметионина на цитозин, стоящий перед вариантные формы гуанином.

гистонов (вариантах). Пул гистона Н3 в клетке состоит из вариантов Н3.3 (требуются в течение всего клеточного цикла), CENP-A и H3.1, H3.2 (синтезируются в Sфазе). Н3.3 ассоциирован с транскрипционно активными областями генов и богат посттрансляционными модификациями. H3.2 несет репрессирующие ремоделлинг нуклеосомы РНК-интерференция - способ посттранскрипционного подавления экспрессии генов (сайленсинга, деградацию гомологичной мРНК. Двухцепочечная РНК при этом распадается на короткие двухцепочечные фрагменты (21-25 п.о.), обозначаемые как малые модификации гистонов Как именно клетка становится всё более детерминированной, а также как происходит увеличение дифференциации в процессе её развития, наглядно демонстрирует модель, представленная Конрадом Уэддингтоном (рисю 8). Он сравнил развитие клетки с шаром, катящимся по долинам и возвышенностям к различным точкам назначения. На рисунке отражены различные типы модификаций гистонов, влияющие на развитие клетки.

фосфорилирование) меняют судьбу клетки в меньшей степени (зеленые накапливаются в процессе развития и могут иметь большое влияние на окончательный вариант развития клетки (красная стрелка).

Рис 8. Различные типы модификаций гистонов на эпигенетическом ландшафте Уэддингтона Под воздействием различных факторов (внутренних и внешних, генетических и негенетических) возможен переход с одной траектории на другую, в связи с чем, на основании одной и той же генетической программы (поливариантность онтогенеза). Траектории, получающие преимущество, Уоддингтон называл креодами. «Хребты», разделяющие траектории – репеллерами (от англ. to repel– отталкивать).

Хроматин претерпевает изменения в своей структуре за счёт двух процессов, тесно связанных между собой: изменение структуры хроматина большими моторными АТФазами и динамичная регуляция посттрансляционных модификаций гистонов (Cairns, 2005; Campos, Reinberg, 2009).

эпигенетических механизмов, в том числе метилированием свободных аминогрупп лизина и модификацией гистонов. При метилировании ДНК метильные группы добавляются к определённым основаниям ДНК, удаляя положительный заряд NH+3 и, как следствие, подавляя генную активность.

Метилироваться могут аргинин и гистидин. Ферментативная модификация коровых гистонов происходит на гистновых, достаточно подвижных, терминальных N-хвостах, располагающихся вне нуклеосомы и имеющих сайты для регуляторных модификаций. При этом изменяется связь между гистонами и окружающей ДНК. В результате деацетилирования гистонов происходит уплотнение хроматина, которое приводит к предотвращению транскрипции генов, в то время как ацетилирование гистонов делает структуру хроматина более открытой, что позволяет происходить транскрипции генов. Фосфорилирование происходит по гидроксильной группе серина, а также по гистидину, внося фосфатную группу с дополнительным отрицательным зарядом. Изменение заряда белковой молекулы может повлиять на функциональные свойства всего октамера (Serravallo et. all 2013).

3.4 Посттрансляционные модификации гистонов Хроматин не является однородной структурой, и в последнее время интерес к изучению вариаций в структуре хроматина резка возрос, что позволило углубить понимание механизмов, регулирующих геномные матричные процессы, в частности, посттрансляционных модификаций гистоновых белков (HPTMs, histone posttranslation modifications), являющихся центральной характеристикой этого геномного регулирования.

В 1960-е годы Винсент Олфри идентифицировал ацетилирование, метилирование и фосфорилирование гистонов, которые были также первыми распознанными убиквитинированными белковыми субстратами. В 2000 году Strahl и Allis предложили гипотезу, предполагающую, что существуют модификации гистонов, которые могут приводить к активации, либо репрессии транскрипции, и назвали её гистновым кодом. Гистоновый код представляет из себя паттерн N-концевой посттрансляционной модификации определённых аминокислотных остатков гистонов. Энзиматическая модификация гистонов – trans-эффекты ковалентных модификаций гистонов:

ацетилирование, метилирование, фосфорилирование и убиквитинирование, которые вовлекаются в сборку, поддержание структуры и модификацию представляют собой код, который влияет на то, какие белки способны взаимодействовать с комплексами гистонов с ДНК и, следовательно, какие гены регулируются этими белками. Полного понимания механизмов действия гистонового кода пока нет, но считается, что гистоновый код потенциально может быть центральной эпигенетической функцией. Типы ковалентных посттрансляционных модификаций гистнов представлены в таблице 2.

Табл 2. Типы ковалентных посттрансляционных модификаций гистонов и ответственные ферменты. Группа 1 – модификации малыми химическими группами, группа 2 –более крупные химические модификации (Zhang, Pralhan, 2014).

модификация ответственные де-модифицирующие роль H3K H4K12, H4K H1.2S172, H1.4S H2AS139 ATR, ATM, DNA-PK H3S28 Aurora-B, MSK1, MSK2 PP H2B (K123) H2A (K119) H3 (?), H4K5, H4K8, H4K12, H4K16, H2AK126, H2BK6, H2BK7, H2BK16, H2BK Благодаря мощному методу иммунопреципитации (ChIP, chromatin immunoprecipitation), который с начала 1990-х годов начали активно использовать, было обнаружено, что гистоны и, в частности, сайты обратимого ацетилирования играют роль в регуляции генов и коррелируют с транскрипцией. Первая ядерная ацетилтрансфераза (HAT) была выделена из так называемого макронуклеуса (очень крупного транскрипционно активного ядра в отличие от мейотического микронуклеуса) инфузории Tetrahymena (Brownell at al., 1996), а первая деацетилаза гистонов (HDAC, отсутствие ацетилирования), была выделена посредством биохимической чистки их клеточных экстрактов (Taunton at al., 1996).

Ацетилтрансферазы гистонов HAT рекрутируются активаторами, которые связываются обратимыми активирующими нуклеотидными последовательностями (UAS, upstream activating sequences). Этот фермент катализирует ацетилирование локальных гистонов, которые вносят вклад в транскрипцию. Деацетилазы гистонов (HDAC) рекрутируются репрессорами транскрипции, которые связываются с репрессивными нуклеотидными обратными последовательностями течения» и деацетилируют локальные гистоны, внося вклад в репрессию транскрипции.

Белки HAT могут ацетилировать остатки лизина на всех четырёх коровых гистонах, но разные энзимы обладают разной специфичностью в отношении предпочтительного субстрата, хотя каждый энзим редко «нацелен» только на один сайт. Ферментов HDAC, удаляющих ацетильные группы, существует множество (Kurdistani, Grunstein, 2003; Yang, Seto, 2003).

Они распадаются на три каталитические группы, консервативные в эволюции от S. cerevisiae до млекопитающих, и которые обозначаются как энзимы типа I, типа II и типа III.

Более сложной модификацией гистонов является метилирование, поскольку оно может происходить как по лизинам, так и по аргининам.

Кроме того, его последствия могут быть как позитивными, так и негативными по отношению к транскрипционной экспрессии в зависимости от положения остатка в гистоне. К тому же, по каждому остатку могут быть множественные метилированные состояния. Лизины могут быть моно- (me1), ди-(me2) или три-(me3) метилированными, тогда как аргинины могут быть моно- (me1) или ди-(me2) метилированными. В виду того, что на H3, H4, H2A и H2B имеется по меньшей мере 24 идентифицированных сайта метилирования лизинов и аргининов, число различающихся метилированных состояний нуклеосом невообразимо велико (Jenuwei, Allis, 2001; Martin, Zhang, 2005; Wysoka et al., 2006).

4. Триметилированные формы гистона H3 – Н3К9me3 и Н3К27me при трансформации и старении клетки Тот факт, что лизиновые остатки в гистонах метилированы, был известен уже достаточно давно, однако биологическое значение этого факта стало понятно относительно недавно – после идентификации первой метилтрансферазы лизинов, использующей гистоны в качестве субстрата (Rea et al., 2000). На сегодняшний день идентифицировано большое количество лизиновых метилтранфераз (HKMTs), и определены сайты, модифицируемые ими в гистонах (Martin, Zhang, 2005). Также известно, что все эти ферменты, за исключением Dot1, имеют общий домен SET, который содержит каталитически активный сайт и делает возможным связывание с Sаденозил-L-метиониновым кофактором. К настоящему времени хорошо охарактеризовано шесть сайтов метилирования: пять на H3 (K4, K9, K27, K36, K79) и один на H4 (K20). Каждый из шести этих белков распознают специфические белки-связки, имеющие домен узнавания лизина, относящийся к одному из трёх разных типов: хромо, тюдор и PHD-повтор.

Наиболее изученной модификацией гистонов является метилирование H3K9 (Рис 9). К тому же, метилтрансфераза HKMTs была идентифицирована первой (Rea et al., 2000).

Рис. 9. H3K9 метилирование и метилирование ДНК связи (Zhang and Pralhan, 2014).

Белок MBD1может распознавать метилированную ДНК и привлекать SUV39H1, метилированным К9 гистона Н3 и вовлекает DNMT3 к месту зарождающегося метилирования на ДНК; UHRF1 также может распознавать H3K9 метилирование и направлять DNMT1-метилирование, опосредованное метилированием ДНК. Усики с красными кружочками представляют метилированые динуклеотиды CpG; Синие кружочки – метилированные чёрные точки представляют метиониновые субстраты для DNMTs.

формировании перицентромерного гетерохроматина посредством кооперации двух белков: SUV39H (или Clr4 у дробянковых дрожжей) и его паттерна по связыванию (или Swi6 у дробянковых дрожжей [Nakayama et al., 2001; Noma et al., 2001]). Ряд исследователей предложили модель, в которой SUV39H метилирует H3K9, создавая платформу для связывания HP1через его хромодомен (Bannister et al., 2001; Lachner et al., 2001), для последующего распространения HP1 на соседние нуклеосомы за счёт его ассоциации с SUV39Y, который затем катализирует метилирование соседних гистонов (Nakayama et al., 2001). Помимо этого, HP1 ассоциируется сам с собой через домен «chromoshadow», значительно облегчая распространение гетерохроматина. Известно, что потеря H3S10 киназы Jil-1 у Drosophila приводит к увеличению метилирования H3K9 вдоль плеч хромосом и увеличению распространения гетерохроматина (Zhang et al. 2006). Тем не менее, остаётся неясным, каким образом распространение HP1диктует формирование плотно упакованных гетерохроматиновых структур.

необходимо для метилирования ДНК, по-видимому, действует и реципрокная связь, когда метилирование H3K9 зависит от метилирования ДНК. Работы на раковых клетках млекопитающих, у которых нет ДНК-метилтрансферазных ферментов (Dnmts), демонстрируют сниженные уровни метилирования H3K9. Возможно, это связано с тем, что связывающийся с метил-CpG белок MBD1 (methyl-CpG-binding protein 1) ассоциируется с H3K9 HKMT SETDB (Zhang, Reinberg, 2001; Martin, Zhang, 2005). Методом ChIP было выявлено, что в промоуторе генов млекопитающих метилирование по H3K9 также участвует в репрессии эухроматиновых генов. Однако механизм данного гетерохроматиновых районах. Нужно отметить, что метилирование Н3К9 и Н3К27 характерно для областей транскрипционо неактивного хроматина (Peters et al., 2003), причем модификация H3K9me3 ассоциирована со структурами конститутивного гетерохроматина (Peters et al., 2003; Rice et al., 2003), а H3K27me3 является маркером факультативного гетерохроматина (Bernstein et al., 2002; Chandwick, Willard, 2004).

обнаруживаемой в клетке в трёх разных местах: в эухроматиновых генных локусах, преимущественно в местах реагирующих элементов Polycomb (PREs, Polycomb Repsponse Elements); в перицентромерном гетерохроматине и в неактивной X-хромосоме у млекопитающих. Ферментом, опосредующим метилирование H3K27 в клетках человека является EZH2, обнаруживаемый в ряде отдельных репрессивных комплексах Polycomb (PRCs). Важной функцией триметилирования H3K27 является репрессия транскрипции. Эта модификация является взаимозаменяемой с триметилированием H3K4, возможно, из-за пониженного родства H3K27me3 к SET1-like H3K метилтрансферазному комплексу (Kim et al., 2013). В двухвалентных доменах хроматина большие хроматиновые регионы H3K27 метилирования обычно являются платформой для небольших суб-регионов H3K метилирования, которые подавляют гены раннего развития (Ezhkova et al., 2011). Фосфорилированные субъединицы CBX2, которые участвуют в поддержании баланса между самообновлением и дифференцировкой стволовых клеток, демонстрируют повышенное предпочтение к связыванию с H3K27me3 и H3K9me3 модификациями гистона H3 (Hatano et al. 2010).

частично через модификацию хроматина, в том числе метилированием ДНК и посредством модификации гистонов. Всё больше исследователей считают, что глобальные изменения в эпигеноме следует рассматривать как ключевые события в прогрессировании рака. Одним из таких примеров может служить недавно описанная патогенная роль усилителя zeste гомолога 2 (EZH2): его метилтранферазная активность по лизину в 27 положении гистона H (H3K27) ассоциирована с генной репрессией. Результаты работы группы Jane-Sanz позволили при помощи анализа экспрессии геномных областей H3K27me3 и EZH2 связывания позволили считать триметилированную форму H3K27 (H3K27me3) прогностическим маркером, позволяющим выделить группы больных раком молочной железы с тяжёлым прогнозом заболевания, и благоприятным (Jne-Sanz et al., 2013).

Ряд работ свидетельствует, что уровень Н3К27me3 резко повышается или снижается в специфических сайтах в зависимости от вида опухоли (Kondo Y. et all., 2008; Ke X. et all., 2009; McCabe M. et all., 2012). Показано, что триметилирование гистона H3 по лизину в 27 положении ассоциировано с репрессией транскрипции и регулируется PRC2 (Polycomb repressive complex 2), гистоновой метилтренсферазой, специфичной для Н3К27 (Cao et al., 2002). Существует мнение, что данная модификация гистона Н3К27me3 и группа белков комплекса Polycomb являются промоутерами для образования закрытой структуры хроматина, таким образом репрессируя транскрипцию (Francis et.all, 2004; Eskeland et. all., 2010). Н3К27me3 контролирует молчание гена HoX и молчание X хромосомы, что является необходимым для триметилирование гистона Н3 по лизину К27 (Н3К27me3) регулируется онкогенными формами в виде небольшого накопления ГТФаз Ras. Хотя точно известно, что Н3К27me3 вовлечён в регуляции транскрипции, до сих пор остаётся неясным, являются ли изменения Ras, обусловленные триметилированием Н3К27, пусковым механизмом, или следствием изменения в транскрипционной активности (Hosogane et al., 2013). Было показано, что мутация Y641F в сайте связывания лизина в остатке тирозина, ассоциированная с повышенным трансформационным статусом, эффективно изменяет субстратную специфичность фермента, отменяя свою способность производить моно - и диметилированные продукты, таким образом, позволяя EZH2 производить триметилированный Н3К27, резко увеличивая уровень модификации гистона (Kipp et al., 2013).

Найдена высокая корреляция между трансформационными процессами в организме и особенностями организации хроматина в соматических клетках: самая высокая корреляция обнаружена при репрессивной модификации гистонов H3K9me3, а затем H3K9me2 и H4K20me3. Считается, что более 55% различных видов рака связанно с изменением уровня H3K9me3. Существуют данные о том, что кормление крыс с метильнодефицитной диетой вызывает глобальное снижение гистонов H3K9me3 и H4K20me3 и способствует канцерогенезу (Pogribny et al. 2007). Интересны также работы, в которых было показано, что условия гипоксии вызывает ингибирование деметилаз семейства JARID и JmjD, а это в свою очередь приводит к возрастанию уровня метилирования гистонов H3K4me3, H3K9me3 в H3K36me3 в клетках разных тканей (Zhou et al. 2010;

Tausendschon et al., 2011). Эти интересные наблюдения показывают, что некоторые деметилазы чувствительны к уровню кислорода в клетках и потенциально могут изменять каталитическое поведение в условиях гипоксии, которые присущи раневым участкам тканей и опухолям (Kolybaba, Classen, 2014).

При изучении гистонового кода старения в культурах диплоидных фибробластов было обнаружено, что интенсивность снижения количества клеток, содержащих триметилированные модификации гистона Н3, прямо пропорционально зависит от возраста донора. Резко сниженный уровень интенсивности флуоресценции Н3К9me3 показан при прогерии детей – синдроме Хатчинсона-Гилфорда (Scaffidi, Misteli, 2006; Shumaker et al., 2006). Описаны специфические для клеточного старения изменения хроматина, влияющие на статус транскрипции и эффективность репарации ДНК (Ramrez et al., 2007). В тоже время с клеточным старением ассоциировано снижение эффективности репарации ДНК, в ходе которого также изменяется экспрессия генов.

Многочисленные работы позволили сделать вывод, что хроматинопосредуемое старение возникает в связи с изменением в эффективной упаковке хроматина. Тесная упаковка молчащего хроматина играет важную роль в поддержании целостности генома. С возрастом это уплотнение ослабевает, что приводит к разрегулированию важных для выживания клетки локуосов. В результате этого многие гены, активность которых должна быть подавлена, запускают транскрипцию, что приводит к эрозии хроматина и, в конечном счёте, потере целостности генома (Matharu, Mishra, 2011).

5. Гистоновые деацетилазы SIRT1 и SIRT6 при старении клетки В клетках каждой ткани функционируют только те гены, которые экспрессируют белки, нужные для работы этой ткани. Остальные гены молчат. Их молчание обеспечивают специальные белки – сиртуины, или SIRT-белки (Silent Information Regulators), принадлежащие к III классу гистондезацетилаз. С момента открытия сиртуинов, которое произошло чуть более чем десять лет назад, интерес к ним моментально возрос из-за их функции эволюционно консервативных регуляторов продолжительности жизни. Было установлено, что у млекопитающих сиртуины регулируют два ключевых фактора, влияющие на процесс старения, - физиологические реакции на стресс и обмен веществ. Также они активно участвуют во многих клеточных процессах, таких как регуляция клеточного цикла, репарация и пролиферациия ДНК, контроль экспрессии генов, эпигенетические изменения, играют существенную роль в контроле обмена веществ и принимают участие в процессах воспаления и злокачественного роста.

Все сиртуины имеют НАД+ зависимый высоко консервативный каталитический коровый домен, представленный 250 - 270 аминокислотными остатками, который, в свою очередь, содержит большой домен - укладку Росманна, и малый – цинковую ленту с гибким спиральным субдоменом.

Щель между этими двумя доменами образует туннель, облицованный гидрофобными аминокислотными остатками, в котором происходит катализ.

Укладка Росманна содержит важную для связывания фосфата НАД последовательность Gly-X-Gly, а также небольшой карман и заряженные остатки, чтобы связать две группы рибозы НАД.

сиртуины освобождают никотинамид (NAM, Nicotinamide) и O- ацетил-АДФрибозу (O-AADPR, Никотинамид ингибирует предполагается, что O-AADPR функционирует в качестве сигнальной молекулы. ADPRT активность является пострансляционной модификацией белка, в результате чего добавляются одна или несколько АДФ рибозных групп.

Цинковая лента состоит из трех спиральных антипараллельных пластин, спирали и атома цинка, связанных и стабилизированых двумя парами цистеиновых остатков. Для инициации катализа сиртуину необходимы два ацетилированных субстрата - лизин и НАД, чтобы связать щель и укладку Росманна, образов при этом тройной комплекс. Субстратное связывание вызывает конформационное изменение, которое погружает ацетил-лизин субстрат в гидрофобный туннель. Эти конформационные изменения также образуют фермент-субстрат -пластины и генерируют определенный заряд дестабилизации, способствующий продуктивному связыванию НАД.

В ходе этих процессов сиртуины расщепляют гликозидную связь, отделяя никотинамид от рибозных фрагментов с образованием никотиамида и промежуточного фермента АДФ-рибозы (Landry et al., 2000). После этого сиртуины передают ацетильную группу от ацетилированного субстрата к АДФ-рибозе, являющейся частью НАД, образуя 20-O-ацетил-АДФ-рибозу (Borra et al. 2005; Zhao et al. 2004). Далее НАД освобождается с деацетилированного лизина. В отличие от в высокой степени сохранённой структуры в этом каталитическом домене всех членов данного семейства (Finnin et al. 2001; Min et al. 2001), N- и С- концевые участки, прилегающие к нему, сильно расходятся (Zhao et al., 2003).

При старении, а также при повреждении ДНК, может изменяться экспрессия генов. В результате этих эпигенетических изменений сиртуины могут отсоединяться от локусов молчащих генов и перемещаться к поврежденным участкам ДНК, где способствуют их репарации (в этом – вторая функция сиртуинов, наряду с обеспечением молчания ненужных в данной ткани генов). Освободившиеся от сиртуинов молчащие гены перестают быть молчащими, и экспрессируемые ими, не нужные в данной ткани белки нарушают нормальную работу её клеток и тем способствуют освобождению от сиртуинов новых, ранее молчавших, генов (порочный круг).

Сиртуины модулируют активность многих белков, регулирующих клеточный цикл, например, белок Rb, действующий как опухолевый супрессор в гипофосфорилированном состоянии. Когда Rb фосфорилируется, циклин-CDK4, E2F-DP1 может отделяться от Rb и становиться активным, активируя другие циклины и позволяя проходить фазам клеточного цикла.

Деацетилирование белка Rb киназой SIRT1 приводит к фосфорилированию белка Rb, отделению Rb от транскрипционного фактора 2 (E2F, transcriptional factor 2) и, следовательно, завершению цикла.

Рис. 11. Функции сиртуинов (Serravallo, et. all 2013) Все белки этого класса являются регуляторными генами и обнаружены у всех живых организмов от бактерий до человека. Число членов семьи Sirtuin имеет тенденцию увеличиваться в зависимости от сложности организма. Прокариоты имеют от 1 до 2 видов сиртуинов, делящиеся дрожжи – три (за исключением некоторых видов, имеющих пять видов сиртуинов), молекулярной массой от 34 до 62 кДа (Blander and Guarente 2004).

Локализация, мишени и функции сиртуинов представлены на рисунках 12- и в таблице 3.

Рис. 12 Локализация, мишени и функции сиртуинов Таблица 3. Мишени сиртуинов (Serravallo, et. all 2013).

Регуляторы транскрипции Опухолевые супрессоры Структурные белки Белки репарации ДНК Клеточные сигнальные Транспортные белки Цитохром-с Рис. 13. Основное расположение и функции сиртуинов в клетке (Serravallo, et. all 2013).

Деацетилаза SIRT1 является наиболее изученным белком данного класса и считается ядерным ферментом, хотя может появляться и в цитоплазме. Спектр его действия широк: он участвует в регуляции возрастных физиологических изменений, ассоциированных с возрастом заболеваний, включая диабет 2 типа, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, возникновении опухолей и многое другое. Некоторые учёные полагают, что увеличение активности SIRT1 положительно влияет на метаболизм млекопитающих, приводя к торможению старения и долголетию (Satoh et al., 2010). SIRT1 проявляет свое действие через модуляцию гистоновых и негистоновых мишеней, перемещаясь между двумя клеточными компратментами в ответ на клеточный стресс, а также в процессе дифференцировки нейронных клеток-предшественников. Эти ядерно-цитоплазматические перемещения белка SIRT1 в том и другом направлении регулируются сигналами ядерной локализации SIRT1 и локализации выводимых из ядра аминокислотных последовательностей этого белка. Т.о. эти сигналы работают как в ядре, так и за его пределами в виде аминокислотных последовательностей белка SIRT1. Ядерная трансформация SIRT1 индуцирует его PI3K/Akt- и JNK1-опосредованное фосфорилирование (Nasrin et al., 2009) и представляется необходимой для проявления его защитных функций в клетке, тогда как биологическое значение цитоплазматического SIRT1 пока не выяснено.

Как было выше сказано, SIRT1 активируется повышением уровня НАД+ или косвенно различными малыми молекулами-активаторами, такими как ресвератрол, SIRT1720, активаторы AMPK) или ингибиторы PARP.

многочисленных транскрипционных факторов, таких как PPAR gamma coactivator (PGC)-1a, FOXOs, и p53. Их активация, в свою очередь, приводит к повышению митохондриального биогенеза и способствует окислительному метаболизму путём повышения уровня ключевых митохондриальных ферментов, участвующих в конечном окислении, деградации жирных кислот и митохондриальном разобщении в некоторых тканях-мишенях.

На настоящий момент идентифицировано два белка, которые регулируют активность SIRT1 через прямое взаимодействие: AROS (active regulator of SIRT1) и DBC1 (deleted in breast cancer). Связывание ядерного деацетилированием р53, ингибируя, таким образом, транскрипционную активность р53 и предотвращая р53-индуцированную остановку клеточного цикла и апоптоз в ответ на повреждение ДНК. В отличие от AROS, связывание DBC1 с каталитическим доменом SIRT1 ингибирует его активность, предохоаняя SIRT1 от деацетилирования белками р53 и FOXOs, что приводит к клеточному стрессу и увеличению (активации) p53- и Foxoопосредованного апоптоза.

SIRT1 может поддерживать стабильность генома, а может, наоборот, быть причиной дефектной репарации ДНК (рис. 14), что приводит к нестабильности генома (Oberdoerffer et al., 2008). Изменение SIRT1, индуцированное повреждением ДНК, происходит после сигнала через PI киназу АТМ и одну из её мишеней – гистон H2AX. Показано, что SIRT работает на сайтах повреждения ДНК, чтобы реконструировать структуры хроматина для облегчения репарации в раковых клетках (O’Hagan et al., 2008;

2011).

С одной стороны, активация SIRT1 может обеспечить выживание раковых клеток и пролиферацию, избегая пагубного воздействия повреждений ДНК на ключевые онкогены, при этом превращение сопровождается увеличением продукции активных форм кислорода (АФК) и окислительного повреждения ДНК. С другой стороны, интенсификация репарации ДНК под действием SIRT1 может привести к большему числу мутаций в раковых клетках, и в дальнейшем к нестабильности генома и развитию рака. Это подтверждается данными (Wang et al., 2013), показывающими, что SIRT1 способствует появлению генетических мутаций de novo и устойчивости к лекарственным средствам в клетках CML (хронической мийелоидной лейкемии) и рака простаты. Способность SIRT усиливать мутации связана с его способностью увеличивать ошибки репарации ДНК в раковых клетках, в частности, через деацетилирующий ключевой фактор репарации NHEJ Ku70 (Wang et al., Oberdoffer et al., 2008).

Из-за пониженной генетической стабильности при потере SIRT1, SIRT1 гетерозиготные делеции ускоряют образование опухолей у p53+/нокаутных мышей. Использование условных аллелей с оверэкспрессией SIRT1, который специфически экспрессируется в клетках, выстилающих кишечник, уменьшает избыточную экспрессию SIRT1 и вследствие этого, уменьшая кишечные опухоли у мышей с аденоматозным кишечным полипозом (APC)+/min (Roth,Chen, 2013).

Было показано, что SIRT1 ингибирует NF-кВ путь, который способствует воспалению, выживанию клеток и образованию метастазов при раке. Кроме того, в соответствии функцией супрессора опухолей, SIRT действует на BRCA1, негативно регулируя антиапоптотический ген, тем самым подавляя его транскрипцию. Таким образом, BRCA1 абляция, благодаря снижению активности SIRT1, приводит к повышенным уровням cурвивина и усиливает рост опухоли (Wang et al., 2008).

В своей работе (Herranz et al., 2011) представили результаты 3-летнего исследования на трансгенных мышах с избыточной экспрессией SIRT1.

Оказалось, что повышенная экспрессия SIRT1 в три раза улучшает состояние старых мышей и снижает количество спонтанных карцином и сарком, а также заболевания раком печени. Хотя исследования на мышах показали, что SIRT1 может иметь функцию подавления роста опухоли, до сих пор не найдены какие-либо мутации или делеции в SIRT1, или активатор гиперметилирования SIRT1, приводящие к раку у человека.

Активность и экспрессия SIRT1 снижается с возрастом в некоторых тканях. Например, в почках и в клетках поджелудочной железы, что связано с уменьшением биосинтеза НАД. Взаимодействие между SIRT1 и FOXO3В, чья транскрипционная активность регулируется SIRT1, также снижается с возрастом мышей. (Satoh et al., 2011) и при ускоренном старении (Sommer et all., 2006; Pallas et al., 2008), как и во время репликативного старения в нормальных человеческих фибробластах (Michishita et al., 2005). Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что экспрессия и/или активность SIRT может предотвращать старение и возрастные заболевания. Интересно, что при старении действие генов-мишеней, связанных с SIRT1, подавляется окислительным стрессом в мышиных эмбриональных клетках, и их активность также уменьшается в мозге мыши. Гиперэкспрессия SIRT1 может подавлять эти возрастные изменения.

потенциальной терапевтической мишенью для борьбы с нарушением обмена веществ; он также играет важную роль в циркадных ритмах, регулируя CLOCK/BMAL1.

В отличие от SIRT1, SIRT6 описан не так подробно. Известно, что он также играет важную роль в регуляции старения и долголетия. У нокаунтных по SIRT6 мышей наблюдался фенотип преждевременного старения, тяжелая лимфопения, потеря подкожного жира, остеопения и нарушения обмена веществ. Погибают такие мыши в возрасте 4 недель (Mostoslavsky et al., 2006). SIRT6 модулирует теломерный хроматин, деацетилируя лизин гистона H3 (рис 15) и предотвращая тем самым теломерную дисфункцию и раннее клеточное старение (Michishita et al., 2008).

Рис.15. Регуляция SIRT6 стабильности генома (Michishita et al., 2008).

Кроме того, SIRT6 ослабляет передачу на хроматин сигнала NF-Кб по деацетилирующему лизину 9 гистона H3, ингибируя апоптоз и клеточное старение (Kawahara et al., 2009; Mahajan et al., 2011). Эти результаты дают основание полагать, что увеличение SIRT6 может замедлить возрастные продолжительность жизни. Было показано, что SIRT1 участвует в поддержании экспрессии SIRT6 при недостатке питательных веществ как in vivo, так in vitro (Kim et al., 2010).

Помимо этих функций деацетилазы SIRT6, было показано, что она участвует в процессах воспаления, деацетелируя определённые промоуторы субъединицы RelA/p65. Гиперэксрпессия SIRT6 приводит к увеличению TNFSeravallo et al., 2009).

Таблица 4. Участие SIRT1 и SIRT6 в некоторых наследственных болезнях нарушения репарации и ускоренного старения Атаксия- Мутация в гене АТМ, Прогрессирующая мозжечковая атаксия, SIRT1 деацетилирует телангиэктазия вовлечённом в контроль окулокутанные телеангиэктазии, TIP60 с последующим (аутосомно клеточного цикла и ответ преждевременное поседение волос, ингибированием рецессивный т.н.) на повреждение ДНК сухость кожи, атрофия кожи, нарушение Кауден синдром Мутация в гене PTEN, Увеличение частоты злокачественных SIRT1 вовлечён в (аутосомно фукцинатдегидрогеназа образований, особенно молочной и эпигенетическую доминантный т.н.) мутация, или щитовидной желёз, гамартомы, регуляцию через его Дискератоз Мутация в гене DCK1, Ретикулярная коричневая гипер и SIRT6 вовлечён в врождённый (Х- кодирующий дискерин, гипопигментация с телангиэктазиями и поддержание теломер хромосомно компонент РНК, мутация в атрофией, дистрофия ногтей с рецессивный, теломеразе приводит к продольными рубцами (часто с ранним аутосомно- резкому укорочению проявлением синдрома), предраковые доминантный и теломер (Х-хромосомный дейкоплакии полости рта, увеличение аутосомно – рецессивный т.н.). случаев рака (включая острый рецессивный т.н.) Несколько других фажных миелоидный лейкоз (ОМЛ), йна - Тейби (аутосомнолицо (выпуклый лоб, густые ресницы, деминатный) Ядерная ламина (Takahashi et al. 1996; Orth et al., 1996) является жёсткой структурой, подстилающей ядерную мембрану и причастной к организации хроматина. Она сформирована последовательностью одинаково ориентированных полимеров белков – промежуточных филаментов, называемых ламинами, и представляет собой фиброзный слой ядерной оболочки с поровыми комплексами, расположенный на границе между хроматиновыми филаментами и ядерной мембраной (Hutchison, Worman, 2004; Mounkes, Stewart 2004; Zastrow et al. 2004; Smith et al. 2005). Все ядерные ламины имеют -спиральные гептаповторы ламинов и образуют биспиральные димеры, которые объединяются по типу «голова в хвост» в нити от поры к поре (Рис. 16).

Также ядерная ламина служит каркасом для крепления ДНК-белковых комплексов, которые регулируют как эу-, так и гетерохроматиновую модификацию гистонов. Помимо этого, ламина контактирует с ядерными РНК. Ядерная ламина вовлечена в регуляцию многих важных биологических процессов, включая репликацию ДНК, транскрипцию, регуляцию клеточного цикла и организацию хроматина.

Учитывая центральную роль ядерной ламины в таком широком диапазоне важных клеточных процессов, не удивительно, что изменения в нормальную клеточную функцию, а в некоторых случаях приводят к болезням или даже летальным последствиям. В клетках позвоночных она формируется в основном из ламина А (646 аминокислотных остатков), ламина В и ламина С (572 аминокислотных остатка). Ламин В имеет две формы: ламин В1 (586 аминокислот) и ламин В2 (600 аминокислот).

Молекулярная масса трех главных полипептидов матрикса - примерно 60- кДа (Heald, McKeon, 1990; Luderus et al., 1992).

У человека ламин А кодируется только одним геном - LMNA (Entrez Gene ID: 4000), локализованным на 1q21.2 хромосоме, ламин В кодируется двумя генами – LMNB1 и LMNB2 (Entrez Gene ID: 4001 и 84823), локализованными на 5q23.2 и 19p13.3 хромосомах соответственно. В результате ассоциации трех главных полипептидов, путем димер-димерного присоединяющиеся к специфическим белкам ядерной мембраны через Сламин. Ламин А осуществляет связь между С и В ламинами (Surdej et al., 1991). Важной функцией полипептидов ядерного матрикса является дезинтеграция ядерной оболочки в процессе митоза (Halikowski, Leiw, 1987;

Bailer et al., 1991).

В то время, как ламин С синтезируется сразу в виде зрелого белка, ламин А продуцируется сначала из предшественника – преламина А ( амининокислотных остатков) 74 кДа, который претерпевает 4 шага пострансляционных модификаций, включая фарнезелирование, двойное эндопротеазное расщепление и карбоксиметилирование (Maraldi, Lattanzi, 2007).

В случае LMNA важным шагом в биосинтезе белка и созревании белка является процесс фарнезилирования на С-конце с помощью фермента фарнезилтрансферазы. Эта посттрансляционная модификация играет роль в ориентации преламина А к внутренней ядерной мембране.

Фарнезилирование заключает в себе несколько этапов, включающих эндопротеолитическое расщепление последних трёх аминокислот при помощи цинковой металлопротеазы ZMPSTE24, карбоксиметилирование Сконцевого цистеина метилтрансферазой ICMT и протеилитическое удаление последних 18 аминокислот протеазой ZMPSTE24. В результате удаляется фарнезилиновый хвост на С-конце и происходит высвобождение зрелого ламина из его мембранного якоря, что приводит к его правильному расположению в ядерной мембране. Факторы, нарушающие эти шаги и влияющие на созревания ламина, могут иметь негативные последствия для ядерной ламины и, в конечном счёте, могут привести к нежелательным эффектам, влияющих на здоровье и долголетие.

Рис 17. Схематическая диаграмма генов и структуры ядерной ламины (Jung et al., 2012).

Все ядерные ламины имеют -спиральный центральный стержневой домен (серый цвет), окружённый глобулярными головками и хвостовыми доменами. Хвостовые домены содержат сигнал ядерной локализации (красный цвет). Преламин А и ламин С являются альтернативными продуктами сплайсинга одного гена LMNA. Ламин С заканчивается на 10-м аминокислот в карбоксильном конце (зелёный цвет). Преламин А содержит последовательность из 11-го и 12-го экзонов, включающих 98 уникальных аминокислот в его карбоксильном конце (синий цвет). 3’ UTR для ламина С обозначен жёлтым цветом, для других ядерных ламинов – красным. 5’ UTRs обозначен оранжевым цветом. Ламин А формируется из преламина А в ходе серии из 4 посттрансляционных изменений, включающих удаление аминокислот преламина А. Ламин В1 и ламин В2 продуцируются независимыми генами LMNB1 и LMNB2. Все ламины (за исключением ламина С) содержат карбокситерминальные CaaX мотивы, которые запускают фарнезелирование. Фарнезелированные сегменты преламина А (голубые полосы) удаляются во время биогенеза зрелого ламина А.

Мутации в гене LMNA и последующие изменения в структуре и функциях белков могут привезти к широкому спектру заболеваний, известных как ламинопатии. Такие заболевания характеризуются тяжёлым спектром клинических симптомов и осложнений, в некоторых случаях могут приводить к гибели. В последнее время описывается всё больше мутаций как в локусах самого гена, так и в генах, кодирующих ламин-связывающие белки.

В гене LMNA описано более 400 точечных мутаций, многие из которых являются основными причинами ламинопатий. При мелких минорных мутациях в ламине А наблюдаются дефекты в гетерохроматине и H3K9me (Goldman et al., 2004; Scaffidi et al., 2005; Shamaker et al., 2006).

Как известно, в эукариотических клетках ядерный компартмент отделён от цитоплазмы внутренней и наружной двуслойной ядерной мембраной, пронизанной ядерными порами, представленными большими многоклеточных ядерная оболочка выстлана непрерывной сетью ламинов и ламин-ассоциированных белков (LAPs), которые преимущественно ассоциированы с неактивными хроматиновыми регионами (Pickersgill et al., 2006). Было обнаружено, что примерно 500 генов ламин-ассоциированы и при этом наблюдалась гистоновая модификация и транскрипционная неактивность (Pickersgill, et al, 2006).

Рис. 18. Возможные нарушения в клетке при мутации в гене LMNA (Zuela et al., 2012).

Показано, что при прогерии происходят характерные изменения, ассоциированные с синтезом прогерина в зрелом ламине А, и нарушения балансов в уровнях этих белков влияют на ключевые биологические процессы, происходящие на клеточном и молекулярном уровнях. Прогерин накапливается во всех тканях пациентов с HGPS, действуя в качестве доминантно-негативного белка, который в значительной степени изменяет структуру ядерной оболочки. Клеточный фенотип таких пациентов включает в себя ядерный блеббинг, истончение ядерной оболочки, потерю периферического гетерохроматина и кластеризацию ядерной поры.

Накопление прогерина в нуклеоплазме приводит к ухудшению транспортировки некоторых факторов, играющих ключевую роль в функционировании ядра и, в конечном итоге, – к ускоренному старению или увеличению апоптоза (Bridger, Kill, 2004): при HGPS наблюдается нарушение в модификации гистонов, изменение в экспрессии генов, задержка в ответе на повреждение ДНК, нарушение митоза и цитокинеза, нарушение в сегрегации хромосом и увеличение количества двуядерных клеток. Хотя вышеперечисленные изменения в клеточном фенотипе имеют место при HGPS, их нельзя трактовать как характерные только для ускоренного старения, как и само заболевание.

Известно, что на процессы старения и долголетия влияют несколько генов, идентифицированных за последнее время. Вклад гена LMNA в здоровье человека и восприимчивость ко многим заболеванием оценивается достаточно высоко. В частности, группа Скаффиди (Scaffidi, Misteli, 2008) показали, что молекулярный механизм, лежащий в основе HGPS, также характерен для клеток пожилого здорового человека, включая изменения в модификации гистонов и процессах репарации ДНК, хотя значительно слабее выражены.

Возрастные изменения в ядрах клеток здоровых людей, могут быть вызваны недостаточным функционированием того же скрытого сайта сплайсинга ламина А, чья конститутивная активация генерирует транскрипт прогерина. Сверхэкспрессия преламина А может привести к дефектам роста гладких мышц сосудов в человеческих клетках (Ragnauth et al., 2010), аналогичные изменения наблюдаются в клетках, продуцирущих прогерин (Candelario et al., 2011). Цитотоксичность может быть также вызвана незначительным повышением уровня одного из промежуточных продуктов синтеза преламина А (Lopez-Mejia et al.,2011; Candelario et al., 2011).

Обширные исследования последних лет показали потенциальный вклад мутаций в гене LMNA в развитие целого ряда болезней. При исследовании факторов, ассоциированных с такими заболеваниями, было показано, что однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs, Single-nucleotide polymorphism) в локусах ламина участвуют в развитии метаболических синдромов, дислипидемии, диабета II типа, ожирения, синдрома поликистоза яичников, артериальной ригидности и сосудистых заболеваний. Кроме того, существуют данные о потенциальном влиянии генетической изменчивости в гене LMNA на продолжительность жизни (Conneely et al., 2012). В большинстве случаев отмечена роль мутации 1908C > T и rs4641 LMNA SNP.

Rs4641 SNP – замена молчавшего C > T, происходящая в 10-м экзоне гена LMNA. В данном экзоне альтернативный сплайсинг приводит к mRNAs, который кодирует либо преламин А, либо ламин С (Lin, Horma, 1993). В результате этого SNP происходит изменение генного продукта LMNA, но пока точно не известно, как именно это приводит к заболеваниям. Тем не менее, последние данные свидетельствуют о том, что С и Т аллели связаны по-разному с фенотипом генной экспрессии: с С аллелем более ассоциирован повышенный уровень транскриптов ламина А и ламина С, чем с Т аллелем (Rodriguez, Eriksson, 2011).

Сигналинг инсулинового фактора роста (IGF-1) участвует в процессах старения и долголетия у многих животных: от нематод до млекопитающих (Kenyon, 2010). На мышиной модели с прогерией (Zmpste24 (/) mice) было показано, что у таких прогероидных мышей происходит нарушение регуляции соматотропного баланса, характеризующееся высоким уровнем гормона роста (GH, growth hormone) и уменьшением инсулиноподобного фактора-1 (IGF-1) (Ugolde et al., 2010). Применение рекомбинантного IGF- востанавливает равновесие между IGF-1 и GH, что задерживает развитие некоторых прогероидных симптомов и позволяет продлить жизнь животным (Ugolde et al., 2010; Marino et al., 2010).

человеческих фибробластах служит интенсивное укорочение теломер (Cao et al., 2011). Известно, что активность теломеразы удлиняет in vitro продолжительность жизни клеток, полученных от пациентов HGPS за счёт уменьшения сигналинга прогерин-индуцированного повреждения ДНК и преждевременного старения (Benson et al., 2010).

Накопление прогерина приводит к преждевременному репликативному клеточному старению (Mehta et al., 2010). Некоторые учёные предполагают, что дефекты в Rb сигнальном пути могут играть ключевую роль не только при ускоренном старении HGPS, но и в нормальном старении (Marji et al., 2010). Активность Rb снижается в фибробластах как при HGPS, так и при нормальном старении с соответствующим снижением фосфорилирования (Dechat et al., 2007; Marli et al., 2010), а также может быть подавлена такими реагентами, как росковитин и PD-0332991 – ингибиторами Cdk2–циклина E и Cdk4/циклина D1комплексов, соответственно (Heijink et al., 2011).

Ряд работ показали, что антидепрессант рапамицин может задерживать клеточное и организменное старение, снижая блеббинг ядерной оболочки и стимулируя деградацию прогерина в клетках HGPS (Cao et al.; Blagosklonny, 2011) посредством механизма аутофагической деградации (Cenni et al., 2012).

Доксорубицин (известный также как адриамицмн) представляет собой ингибитор топоизомеразы II и используется в противораковой терапии в качестве активатора каспаз, что приводит к расщеплению ламина А/С (Stravopodis et al., 2009). Также ламин А/С в клетках человека расщипляется сангивамицином – аналогом нуклеозида, который действует через активацию c-Jun N-концевых киназ (JNK c-Jun N-terminal kinases) и протеинкиназы С дельта. В клетках мыши увеличение расщепления белка LMNA посредством активации каспаз вызывают стресс - индукторы туницамицин и тапсигаргин (Siman et al., 2001).

На экспрессию, функцию и фосфорилирование ламина А влияют также некоторые гормоны. Например, гормоны, увеличивающие уровни цАМФ глюкагон, кальцитонин, вазопрессин и паратгормон (ППГ) - уменьшают фосфорилирование белка ламина А у крыс в клетках мозгового вещества фосфорилирование может приводить к реконструированию ядерной ламины.

При гипотиреозе у мышей гормон щитовидной железы уменьшает экспрессию ламина А в mRNA в клетках печени (Feng et al., 2000). Также при аутосомно-рецессивном синдроме Де-Барше, характеризующемся прогероидными чертами, наблюдается низкий уровень тирозина (Т3) (Ioan et al., 1988; Kivuva et al., 2008), что не случайно, так как показано влияние эндокринной системы на процессы старения. Т3 связан с долголетием, изменения его уровня наблюдаются в пожилом возрасте, особенно у женщин (Faggiano et al., 2011; Suzuki et al., 2012).

Некоторые работы показали, что LMNA может регулироваться через фосфотидилинозитол-3-киназные (PI3K) пути (Tullai et. al, 2004).

1. Культивирование клеток.

Исследование проводились на первичных фибробластах, полученных от пациентов АТ: пациент 8 лет лёгкая форма АТ1SP, пациент 26 лет лёгкая форма АТ6SP, пациент 12 лет тяжёлая форма АТ8SP, пациент 3 года лёгкая форма АТ9SP, клетки больного АТ с молекулярно подтверждённым диагнозом AT4BR; а также на линиях больного синдромом Секкеля (Ss1SP) 0,9 лет, пациентки с мутацией 5382insC в гене BRCA1 (BRCA1SP) 30 лет, радиочувствительный неустановленный синдром АТ2SP 4 года, донора лет, имеющего инвалидность 2 группы, не страдающего АТ - 1SP, больной атаксией, вызванной опухолью мозжечка 4 лет - AT7SP, больной пигментной ксеродермой 16 лет XP2SP, пациента 4 лет с симптомами, клинически сходными с АТ - P1SP, пациента 13 лет с симптомами, клинически сходными с АТ – P2SP. В качестве контроля использовали клетки здорового донора лет VH-10. Все линии, кроме линий здорового донора VH-10 и пациента с АТ AT4BR, были получены в нашей лаборатории радиационной цитологии ИНЦ РАН. Линия VH-10 любезно предоставлена Адой Кольман (Стокгольм), AT4BR с генетически подтвержденным диагнозом АТ – получена в лаборатории А. Лемана в Траффорд-Центре (Университет графства Сассекс, Великобритания).

2. Получение первичных фибробластов.

Получение первичной культуры фибробластов кожи проводилось при помощи стандартной методики получали биоптат кожи из области предплечья доноров. Полученные фрагменты кожи помещали в чашку Петри в питательную среду DMEM с добавлением антибиотиков и механически диспергировали. Затем измельченные фрагменты помещали под покровное стекло в чашки Петри диаметром 3 см (Nuncon, США) и добавляли полную ростовую питательную среду DMEM (Gibco, США) с 16% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, США), 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 25 мкг/мл фунгизона и 0.3 мг/мл L-глутамина. Эксплантат кожи инкубировали, меняя питательную среду 1 раз в 4-7 сут до появления достаточной конфлюенции фибробластов. При достижении необходимого монослоя клетки снимали с подложки с помощью раствора трипсин-ЭДТА и культивировали в чашках Петри в стандартных условиях.

Клетки выращивали в пластиковых флаконах, на чашках Петри (Nunclon, США), на среде DMEM (Sigma, США) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Sigma) и антибиотиков ( ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США); клетки культивировали в инкубаторе при 37° С в атмосфере с содержанием 5% CO2.

3. Иммунофлуоресценция.

В ядрах клеток выявлялись активная форма протеинкиназы АТМ (РАТМ, фосфорилированная по серину в 1981 положении), гистоновые деацетилазы сиртуины SIRT1, SIRT6 и триметилированные формы гистона Н3. Клетки, выращенные в чашках Петри на покровных стёклах, промывали раствором PBS, фиксировали 4 %-ным параформальдегидом 10 мин на льду в холодильнике и пермеабилизовали 3 %-ным тритоном X-100 в PBS 20 мин при комнатной температуре. Затем клетки промывали 3 раза по 5 мин в PBS и инкубировали в блокирующем растворе (PBS, 5 % БСА, 0.01 % Tween-20) ч при комнатной температуре. Первые и вторые антитела разводили в блокирующем растворе. В качестве первых антител использовали IgG мыши против белка Р-АТМ (Thermo Scientific, США) в разведении 1:100, IgG мыши против SIRT1 и H3K9me3 (Cell Signaling, США) в разведении 1:100, IgG мыши против LaminaA/C (Abcam, США) в разведении 1:200 и IgG кролика против белка SIRT6 и H3K27me3 (Cell Signaling, США) в разведении 1:100, IgG кролика против HP1 (Abcam, США) в разведении 1:200. В качестве вторых антител использовали IgG козы против IgG мыши и кролика, коньюгированные с FITC и родамином, в разведении 1:500 (Sigma-Aldrich Co., США). В качестве контроля специфичности иммунной реакции использовали клетки, инкубированные только со вторыми антителами. Для предотвращения быстрого «выгорания» флуоресцентной метки использовали антифейдинг с ДАПИ (DAPI) (Invitrogen, США). Все тесты повторяли 3 и более раз. ДНК исследуемых клеток повреждали рентгеновским облучением на установке РУМ-17 в дозе 2 Гр или радиомиметиком (блеомицином в концентрации 50-100 мкг/мл).

5. Микроскопия и анализ изображений.

Микроскопия и анализ изображений проводились с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Zeiss LSM 5 PASCAL.

Для визуализации флуорофоров был использован аргоновый (488 нм) и гелиево-неоновые (543 нм) лазеры. Для получения изображений использовали сканирующий модуль микроскопа с помощью компьютера и соответствующего программного обеспечения LSM 5 PASCAL. Для анализа полученных изображений (определение уровня интенсивности флуоресценции) использовали программы LSM 5 PASCAL и WCIF ImageJ 1,37m.

Активность SA--Gal выявляли с использованием фирменного набора “Senescence-galactosidase staining kit” (Cell Signalling Thecnology, США) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Клетки на чашках промывали PBS, фиксировали в течение 10 мин. при комнатной температуре 1-кратным фиксирующим раствором, после чего дважды промывали PBS и окрашивали в -галактозидазном растворе при 37 оС в течение ночи. Об активности SA--Gal судили по появлению синих гранул в цитоплазме клеток. Уровень относительной активности SA--галактозидазы измерялся в программе ТТЕСТ приравнивая оптическую относительную плотность количеству фермента.

5. Статистическая обработка результатов.

Статистическую обработку проводили с помощью программы MS Excel 2007 обще принятыми для медико-биологических исследований методами: расчёт средней арифметической величины, среднего квадратичного отклонения, ошибки репрезентативности для каждого параметра в исследуемых группах клеток, сравнение средних значений по критерию Стьюдента с определением достоверности различий.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

протеинкиназы АТМ (фосфо-АТМ).

Протеинкиназа АТМ является основной протеинкиназой клеточного ответа на повреждение ДНК (DDR, DNA damage response), а её фосфорилированная (активная) форма (фосфо-АТМ, далее Р-АТМ) появляется в клетках практически сразу после возникновения двунитевых разрывов ДНК. Так как при синдроме атаксии-телеангиэктазии ген ATM из-за мутации в нём не функционирует нормально, протеинкиназа АТМ неактивна, т.е. в клетках больных АТ нет её активной формы Р-АТМ. В работе было исследовано наличие активной формы Р-АТМ в дермальных фибробластах больных АТ, больных с клиническими признаками, сходными с АТ, в дермальных фибробластах здорового донора, а также у пациентов с синдромом Секкеля, пигментной ксеродермой и у носителя мутации в гене BRCA1 (BRCA1 5382insC).

При окрашивании полученных препаратов антителами к протеинкиназе АТМ, фосфорилированной по серину в 1981 положении (Р-АТМ), наблюдались закономерные различия между клетками больных АТ и лиц, не страдающих этим заболеванием. Как видно на рисунке 19, фокусы, соответствующие активной форме протеинкиназы АТМ (Р-АТМ) образуются в ядрах клеток здорового донора, предварительно облучённых в дозе 2 Гр или обработанных радиомиметиком (блеомицином) в концентрации мкг/мл. После воздействия повреждающего ДНК агента образуются характерные фокусы, детектируемые при окраске антителами к фосфо-АТМ которые не образуются в ядрах больных АТ после аналогичного воздействия на них. Данный факт свидетельствует об отсутствии в клетках больных АТ активной формы протеинкиназы АТМ (Р-АТМ). В ответ на повреждение ДНК фокусы Р-АТМ выявлялись также в клетках больных с другими синдромами с нарушениями репарации ДНК: больной пигментной ксеродермой XP2SP, больной синдромом Секкеля Ss1SP и больной атаксией, вызванной опухолью мозжечка АТ7SP радиочувствительности. Повышенная чувствительность к ионизирующей радиации на клеточном уровне описана также у пациентов с Ниймегенским синдромом ломкости хромосом (мутация в гене NBS1), RS-SCID - синдромом внезапной детской смертности (ген специфической расщепляющей ДНКшпильки нуклеазы DCLRE1C/Artemis), синдромом LIGIV (ген лигазы IV, lig IV), ATLD (AT-like disease, ген RAD50), синдромом Вернера (ген нуклеазыгеликазы WRN), синдромом Ли-Фромени (гетерозиготное носительство мутаций в гене Р53). Некоторые из этих генов, такие как Р53 и NBS1, являются прямыми мишенями протеинкиназы АТМ, другие же принимают участие в процессе репарации ДНК при двунитевых разрывах и зависят от активности АТМ опосредованно. Интересно, что есть данные о случаях повышенной радиочувствительности клеток больных с синдромами, возникающими при мутациях в генах эксцизионной репарации нуклеотидов – таких как синдром Коккейна и пигментная ксеродерма (Михельсон и др., 1975; 1995; Arlett et al., 1978; 1992; 2008; Спивак и др., 1997). Причина повышенной клеточной радиочувствительности в этих случаях менее очевидна. Для выяснения этой причины крайне интересными представляются полученные нами различия в клеточных паттернах фосфорилирования белка АТМ: у здоровых доноров фосфорилированная форма АТМ после повреждения ДНК выявляется в ядрах клеток, а у больной пигментной ксеродермой ХР2SP - преимущественно в цитоплазме, как это видно на рисунке. Эти различия в локализации Р-АТМ свидетельствуют о замедлении или нарушении переноса активной молекулы из цитоплазмы в ядро клетки, так как в норме автофосфорилирирование происходит в ядре (Lavin M.F., Kozlov S. 2007).

В случае атаксии вызванной опухолью мозжечка (AT7SP) процесс автофосфорилирования АТМ идет так же, как у здорового донора, и фосфоАТМ локализуется в ядре, хотя процесс репарации ДНК после действия ионизирующей радиации у этого больного замедлен, а количество маркеров старения в клетках – повышено (Полуботко и др., 2009а,б). Т.е. в обоих этих случаях, несмотря на повышенную клеточную радиочувствительность и даже сопутствующую ей (в случае AT7SP) атаксию, ген ATM остается функционально активным, тогда как в случае AT6SP (АТ-вариант, стертая форма течения заболевания) этот ген неактивен, и Р-АТМ после действия повреждающих агентов ни в ядре, ни в цитоплазме не выявляется. Также можно сделать вывод, что пациенты P1SP и P2SP, не страдающие АТ, но с клинической картиной, сходной с АТ, имеют функционально активный ген ATM (Рис.19), т.к. их клеточная реакция в ответ на повреждение схожа с таковой для здоровых лиц. Можно также заключить, что для выявления фокусов в качестве повреждающего агента можно использовать как ионизирующее излучение, так и радиомиметик (блеомицин): фокусы образуются и достаточно отчётливо визуализируются при использовании обоих способов.

Предложенный нами метод детекции активной формы протеинкиназы АТМ (Р-АТМ) может быть полезен врачам-клиницистам при подтверждении или опровержении диагноза АТ в трудных случаях, а также для выявления мозаичной формы синдрома АТ.

соответствующими антителами, в исследуемых клеточных линиях после облучения в дозе 2Гр и воздействия 50 мкг/мл блеомицина. Вторые антитела коньюгированы с FITS (зелёный цвет) или родамином (красный цвет). Синий цвет –окраска ядер DAPI.

Таким образом, нами было показано, что радиочувствительная линия AT2SP неустановленного синдрома, описанная раннее нами как АТ – вариант (Игушева и др., 1999), маловероятно является линией с синдромом Луи-Бар (АТ), т.к. при воздействии на неё блеомицином наблюдалась активация протеинкиназы АТМ. Мы полагаем, что она может относиться к другому радиочувствительному синдрому.

В линиях AT1SP и AT9SP фокусы протеинкиназы фосфо-АТМ детектировались в 69,15% и 56,4% клеток, соответственно.

В основном фокусы в обеих линиях локализовались в ядре, но у небольшого процента клеток Р-АТМ обнаруживалась как в цитоплазме, так и в ядре одновременно. Исходя из этих результатов, можно предположить, что линии AT1SP и AT9SP относятся к «мозаичной» форме АТ, а сами пробанды – «мозаики», т.к. содержат два разных вида клеток: с активной формой протеинкиназы АТМ и без неё. «Мозаичность» культур AT1SP и AT9SP достаточно хорошо видна на рис. 20.

Таблица 5. Доля клеток с активной формой P-ATM (в %) Такой мозаицизм может быть связан с тем, что ген ATM имеет достаточно большой размер – 150 т.п.н. и содержит 66 экзонов (Savitsky et al., 1995; Lavin, Khanna, 1999; Pulverer, 2003), так что большинство больных являются копмаундами, т.е. несут на материнской и отцовской хромосомах различные мутации. В этом случае в некоторых клетках возможно восстановление нормального аллеля этого гена путём гомологической рекомбинации – перераспределения генетического материала (ДНК), приводящего к возникновению новых комбинаций генов (Глазер, 2008).

ядро клетки, как это было описано в случае с линией пигментной ксеродермы (Куранова и др. 2013).

Таким образом, детектирование активной формы протеинкиназы АТМ позволяет отличить похожие по проявлениям на организменном и клеточном уровнях синдромы друг от друга.

3.1.2 Выявление ферментативной активности протеинкиназ фосфоАТМ и ATR в клетках больной синдромом Секкеля.

Генетической основой одной из форм синдрома Секкеля является отсутствие активной формы протеинкиназы ATR (O’ Driscoll et all., 2003).

Протеинкиназы ATR и ATM являются родственными, и их активные центры структурно близки. Поэтому для выявления активной формы протеинкиназы ATR после индукции двунитевых разрывов ДНК нами были использованы два типа первых антител: моноклональные антитела к фосфо-АТМ, фосфорилированные по Серину в 1981 положении и поликлональные антитела фосфо-(Ser/Thr) ATM/ATR, которые связываются с белками, фосфорилированными протеинкиназами ATM и ATR: (c-Abl (S465), BRCA (S1524), Chk1 (S345), Chk1 (S317), Chk2 (T68), MDM2 (T419), p53 (S15), p95/NBS1 (Ser343), MAPKAPK-2 (T222).

Последующее окрашивание клеток двумя различными типами вторых антител, несущих разные флуорохромы, позволяло путём наложения дискриминировать фокусы. Так как известно, что при синдроме Секкеля протеинкиназа ATR может быть не активной, то мы полагали вычислить фокусы, принадлежащие к фосфо-АТМ и фокусы, принадлежащие к сайтам фосфорилирования протеинкиназы.

Рис.20. Ядра клеток здорового донора (VH-10) и пациента с синдромом Секкеля (Ss1SP), окрашеные антителами к сайтам фосфорилирования фосфо-ATM/ATR (красным) и фосфо-ATM (зелёное свечение) коньюгированые с FITS (зелёное свечение) или родамином (красное свечение).

Как видно из рисунка 6, в клетках здорового донора оказывается заметно больше фокусов, принадлежащих сайтам фосфорилирования протеинкиназ АТМ ATR (красное свечение) заметно больше, чем Р-АТМ (зелёное свечение). Это свидетельствует о наличии в клетках здорового донора нормально работающих белков ATR и АТМ. Также можно сделать вывод, что в клетках пациента Ss1SP все фокусы колокализованны. Т.е. при окрашивании антителами к сайтам фосфорилирования ATM и ATR и фосфоATM видны фокусы, которые принадлежат только Р - АТМ. Следовательно, можно сделать вывод, что протеинкиназа ATR не активна, что, в свою очередь, хорошо согласуется с поставленным по клиническим признакам диагнозом синдром Секкеля.

3.1.3 Выявление ферментативной активности протеинкиназ АТМ и ATR в исследуемых линиях.

В интактных клетках, обладающих повышенной чувствительностью к ДНК - повреждающим агентам, в которых нарушены процессы репарации ДНК, а также в клетках пожилых доноров, наблюдается повышенное количество маркеров DDR-ответа (Scaffidi, Mistelli 2006, Полуботко и др., 2009). Так как активация протеинкиназ ATM и ATR также является одним из маркеров DDR-ответа, было важно оценить количество клеток, несущих активные формы этих протеинкиназ при отсутствии внешних воздействий в линиях здорового донора и больных с различными генетическими нарушениями процессов репарации ДНК. Нами было показано, что в ответ на инкубацию клеток в течение 1 часа в среде с добавлением блеомицина в концентрации ~50 мкг/1 мл и окрашивании полученных препаратов поликлональными антителами к сайтам фосфорилирования обеих протеинкиназ ATM и ATR, в клетках появляются фокусы ~ 60-80 на клетку, что связанно с появлением двунитевых разрывов ДНК и показывает активацию этих протеинкиназ в ответ на повреждение ДНК. Фокусы в интактных клетках соответствуют нерепарированной поврежденной ДНК или остановившимся вилкам репликации. Количество фокусов и их размер в таких клетках значительно меньше, чем после воздействия блеомицина.

Из рисунка 21 видно, что примерно в половине ядер клеток здорового донора (45%) фокусы, принадлежащие сайтам фосфорилирования протеинкиназ ATM и ATR не детектируется, а в остальных клетках наблюдается по 1-2, и иногда более 5 этих фокусов на клетку в среднем.