«МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДНК РАЙОНА ПРИКРЕПЛЕНИЯ ХРОМОСОМЫ 2 L К ЯДЕРНОЙ ОБОЛОЧКЕ ТРОФОЦИТОВ ЯИЧНИКОВ МАЛЯРИЙНОГО КОМАРА ANOPHELES BEKLEMISHEVI (DIPTERA, CULICIDAE) Генетика – ...»

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

БИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ

ТОМСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА

На правах рукописи

Пищелко Анна Олеговна

МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДНК РАЙОНА

ПРИКРЕПЛЕНИЯ ХРОМОСОМЫ 2 L К ЯДЕРНОЙ ОБОЛОЧКЕ

ТРОФОЦИТОВ ЯИЧНИКОВ МАЛЯРИЙНОГО КОМАРА

ANOPHELES BEKLEMISHEVI

(DIPTERA, CULICIDAE) Генетика – 03.02.07 Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д–р биол. наук, профессор В.Н. Стегний МОСКВА –

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Гетерохроматин – эволюционно значимая часть генома эукариот 1.2 Структурно-функциональные особенности гетерохроматина интерфазных ядер 1.3 Молекулярный состав гетерохроматина 1.4 Гетерохроматин политенных хромосом Diptera 1.4.1 Drosophila 1.4.2 Anopheles 1.5. Таксономия комплекса maculipennis 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Характеристика объекта исследования 2.2 Приготовление цитологических препаратов политенных хромосом 2.3 Микродиссекция с последующим получением ПЦР продукта 2.4 Микроклонирование ПЦР-продукта 2.5 In situ гибридизация ДНК-пробы из хромосомы 2L Аn.

beklemishevi на геномную ДНК исследуемых видов 2.6 Выделение геномных ДНК An. beklemishevi, An. messeae, An. atroparvus 2.7 Выделение плазмидной ДНК 2.8 Секвенирование клонов минибиблиотеки Abekl2L 2.9 Анализ последовательностей ДНК

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Особенности локализации ДНК района прикрепления хромосомы 2L An. beklemishevi на хромосомах видов Diptera 3.1.1 Особенности локализации ДНК района прикрепления хромосомы 2L на хромосомах видов An. beklemishevi Anopheles комплекса maculipennis 3.1.2 Особенности локализации ДНК района прикрепления хромосомы 2L An. beklemishevi (Abekl2L) на хромосомах видов D. melanogaster, D. erecta, D. teissieri 3.1.3 Характеристика последовательностей ДНК минибиблиотеки Abekl2L 3.2 Взаимосвязь особенностей молекулярного состава ДНК и прикрепления к оболочке участков прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом комаров комплекса Anopheles maculipennis ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Список принятых сокращений и обозначений ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота Atr2R – минибиблиотека из прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2R An. atroparvus Abekl2L – минибиблиотека из прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2L An. beklemishevi ПГ – прицентромерный гетерохроматин РП – район прикрепления хромосомы к оболочке ядра ПЦР – полимеразная цепная реакция DOP-ПЦР вырожденными праймерами кДНК – ДНК, синтезированная из зрелой мРНК в реакции, катализируемой обратной транскриптазой.

МГЭ – мобильные генетические элементы М/SAR – Matrix/Scaffold Association Region п.н. – пар нуклеотидов срДНК – ДНК из белковых сердцевин розеткоподобных структур, скДНК – ДНК синаптонемного комплекса, ялДНК – ДНК ядерной ламины т.п.н. – тысяч пар нуклеотидов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Современный взгляд на структурную организацию генома предполагает существование хромосомных территорий и связь хромосом с ядерной оболочкой. В этом процессе большую роль хромосомно-мембранных отношений, что предусма тривает его гетерохроматин как фактор, сопутствующий видообразованию (Корочкин, 1983; Стегний, 1991; Жимулев, 1993). Одной из главных черт, отличающей гетерохроматин, является наличие повторенных последовательностей ДНК, что определяет его как быстро эволюционирующую часть генома. Состав и сочетание высоких и умеренных повторов, с включенными в них мобильными элементами, а также их разнообразие и особенн ости кластерной представленности, видимо, имеет специфичность и определяет особенную структуру гетерохроматина различных видов ( Dimitri et al, 2009, Stacie et al, 2009). Прицентромерные гетерохроматиновые районы (ПГ) хромосом часто являются районами прикре пления (РП) к ядерной оболочке, поэтому изучение прицентромерного изменений состава гетерохроматина на пространственную структуру ядра. Уникальным объектом для данных исследований maculipennis (Diptera, трофоцитов яичников у самок имаго и в ядрах слюнных желз у личинок.

Политенные хромосомы в ядрах трофоцитов яичников восьми видов комаров комплекса maculipennis имеют четкие различия по наличию, либо отсутствию облигатного прикрепления к ядерной внутрихромосомному расположению РП (Стегний, 1979, 1987). У мух рода Drosophila – Drosophila melanogaster (Meigen, 1830) и Drosophila virilis (Sturtevant, политенных хромосом и их отношения к ядерной оболочке при видообразовании (Стегний, Вассерлауф, 1994; Стегний и др, 1996).

Изучение гетерохроматина в группах близкородственных видов является актуальным, поскольку позволяет проследить процесс видообразования. Среди восьми видов комплекса наиболее яркие Anopheles atroparvus (van Thiel, 1927) в районе прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2R. Молекулярный состав данного гибридизации районспецифичного ДНК -зонда Atr2R из района прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2R на политенные прицентромерного (- и -) гетерохоматина хромосом данных видов, кроме прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2L An. beklemishevi (Грушко и др, 2004). Поэтому для изучения beklemishevi, поскольку он имеет «жесткое» крепление к оболочке ядра и, видимо, сильно отличается по молекулярному составу от гетерохроматина хромосомы 2R An. atroparvus.

сравнительный межвидовой анализ ДНК района прикрепления хромосомы 2L малярийного комара An. beklemishevi и сравнение его с ДНК районов прикрепления хромосом уже изученных видов комплекса maculipennis. Задачи исследования:

получить минибиблиотеку фрагментов хромосомной ДНК из РП левого плеча хромосомы 2 An. beklemishevi (Abekl2L) методом микродиссекции с последующей амплификацией и клонированием в плазмидном векторе, определить первичную последовательность полученных фрагментов ДНК;

провести сравнительный анализ локализации нуклеотидных последовательностям библиотеки Abekl2L в хромосомах An.

beklemishevi, An. atroparvus, An. messeae;

последовательностей РП на примере близкородственных видов двух родов Diptera: Anopheles и Drosophila;

определить нуклеотидную последовательность ДНК клонов фрагментов минибиблиотеки Abekl2L методом секвенирования.

биоинформатики;

оболочке хромосомы 2L Аn. beklemishevi к фрагментам ДНК, предположительно участвующим в формирование разных типов петель хроматина: MAR/SAR, ДНК ядерной ламины, ДНК синаптонемного комплекса, ДНК розеткоподобных структур.

Научная новизна.

нуклеотидная последовательность данного участка хромосомной ДНК, в результате анализа которой было выявлено наличие разнообразным мобильным элементам класса LINE семейства L1, (TTGTG), сателлитам (TAAAAA)2, (CAAAAA)n, фрагментам генов An. gambiae, Ae. aegypti и D. melanogaster. При сравнении нуклеотидных последовательностей минибиблиотеки изучае мого района An. beklemishevi и минибиблиотеки из района прикрепления 2L An. atroparvus фрагментов ДНК с высокой степенью гомологии (95 %). При помощи методов биоинформатики обнаружено, что в составе последовательностей ДНК минибиблиотеки РП к ядерной оболочке MAR/SAR, хромосом как от РП хромосомы 2R An. atroparvus так и от РП An.

messeae.

Практическая значимость.

последовательностей РП хромосомы 2 L An. beklemishevi; получена минибиблиотека клонов ДНК этого района, определена первичная хромосомы 2L An. beklemishevi. Полученные результаты имеют важное фундаментальное и прикладное значение. Они вносят весомый вклад в понимание механизма структурной реорганизации генома эпидемилогически опасных малярийных комаров комплекса maculipennis в процессе видообразования.

Апробация результатов.

молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 9 – 12 мая 2007 г.), на Международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 31 августа – 6 сентября 2009 г.), на Международной конференции (Новосибирск, 16 – 20 августа 2010 г.). По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, дае из которых – статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК.

Личный вклад автора.

Основные результаты получены автором самостоятельно. Автор самостоятельно планировал эксперименты и обобщал полученные результаты. Микродиссекция и DOP-ПЦР проводились совместно с д.б.н.

Н. Б. Рубцовым и к.б.н. Т. В. Карамышевой (ИЦиГ СО РАН).

Секвенирование фрагментов библиотеки Abekl2L на начальном этапе проводилось совместно с к.б.н. М.В. Лебедевой (НИИ МГ СО РАМН), последовательностей выполнен совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко (ИЦиГ СО РАН). FISH ДНК из прицентромерного района хромосомного плеча 2L An. beklemishevi с политенными хромосомами близкородственных видов Drosophila подгруппы melanogaster проведена при участии к.б.н. К.Е.

Усова (НИИ ББ ТомГУ).

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы, заключение, выводы и список литературы. Библиографический список включает 142 источника.

Работа иллюстрирована 13 рисунками и таблицами.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

эукариот Гетерохроматин является специфической частью хроматина. В 1904 году хроматин был охарактеризован Т. Бовери как вещество клеточного ядра, которое в процессе митоза преобразуется в хромосомы. Позднее понятие хроматина Э. Гейц дополняет двумя новыми понятиями – гетерохроматин и эухроматин. Уже на раннем закономерно связано с определенными участками хромосом и хромосомами в целом. Например, гетерохроматином полностью melanogaster полностью гетерохроматизирована Y-хромосома и около 40 % X-хромосомы. Так же, стало очевидным широкое ядрышкового организатора, в области центромер, в теломерных районах (Прокофьева-Бельговская, 1986). Открытие политенных эухроматиновых районов. Оказалось, что гетерохроматические зоны хромосом организованы так же, как и эухроматические – многочисленные исследования гетерохроматина выявили особые Гетерохроматин чаще всего располагается в прицентромерных районах, иногда в теломерных областях. Об наружены вкрапления гетерохроматина в эухроматиновые участки хромосомных плеч.

заметен в сильно декомпактизованных хромосомах, например, в политенных. Расположение и количество гетерохроматина на хромосомах видоспецифично (Redi et al., 2001).

Ряд методов специфичных окрасок позволяет выявить ярко окрашивающийся, блочный гетерохроматин – -гетерохроматин, производными и содержит меньше повторов (Прокофьева Бельговская, 1986). Переход между этими типами гетерохроматина определить довольно сложно (Zhimulev, 2003). У большинства гетерохроматин сконцентрирован в блоки (около миллиона пар нуклеотидов), в основном, в прицентромерных и субтеломерных некоторых организмов и около 30% геномов человека и дрозофилы (Прокофьева-Бельговская, 1986; Gatti, Pimpinelli, 1992; Жимулев, 1993).

Первые исследования гетерохроматина на предмет активности нейтральности его функций и мнению о том, что гетерохроматин является балластом в структуре хромосомы. В начале 70 -х г.г.

прошлого столетия было эксперименталь но доказано наличие сателлитных последовательностей в гетерохроматине, а затем и последовательностей (Commings, Mattoccia, 1972; Gall et al., 1971).

Эти факты указывали на наличие определенных функциональных гетерохроматина были открыты следующие его свойства. Первым открытым свойством является сохранение компактного состояния на протяжении почти всего клеточного цикла ( Heitz, 1928).

Впоследствии обнаружили преимущест венную локализацию гетерохроматина на периферии интерфазного ядра, а связи его с ядерной оболочкой имеют пространственно упорядоченный упорядочения хромосом между собой, так и по отношению к ядерной оболочке в интерфазном ядре в целом (Paddy et al., 1990;

Belmont et al., 1993; Marshall et al., 1996; Carvalho et al., 2001;

Sage, Csink, 2003; Стегний, 1993). Гетерохроматин реплицируется в самом конце S-фазы (Lima-de Faria, Jaworski, 1968; ПрокофьеваБельговская, 1986), благодаря, в том числе, и альтернативным механизмам инициации процесса, которые различны для эу - и для (Груздев, 1999). Таким образом, проявляется лабильность репликации гетерохроматина, что обеспечивает избирательное прилегающих к ним эухроматиновых районов в онто - и филогенезе (Прокофьева-Бельговская, 1986). В политенных хромосомах наблюдается недорепликация гетерохроматина прицентроме рных районов (Rudkin, 1965, Жимулев, 1993). Гетерохроматин наделяет специфическими свойствами прилегающие участки хромосом.

хромосомных перестроек (Прокофьева-Бельговская, 1938; 1986).

Эти свойства гетерохроматина имеют большое значение, особенно принимая во внимание его молекулярный состав. Сейчас известно, что гетерохроматин является не менее важной частью генома, чем эухроматин. (Корочкин, 1983; Стегни й, 1991; Кикнадзе и др., 1991, Dimitri et al., 2005, 2009).

Гетерохроматин содержит повторяющиеся последовательности ДНК и обогащен этими последовательностями ( Britten, Kohne, 1968, цит. по Жимулев,1993). Повторенные последовательности хлористом цезии. Эти последовательности ДНК были названы сателлитными ДНК (cатДНК) (по аналогии со спутник – сателлит), выделилось еще несколько – отличных по молекулярной массе.

Биологическое значение сатДНК неоспоримо, так как она является (кинетохора), что показано для хромосом D. melanogaster (Sun et al., 1997) и человека (Schueler et al., 2001). СатДНК состоит из локализована в конститутивном гетерохроматине хромосом – в прицентромерных районах. Что и обусла вливает обедненность гетерохроматина генами. Длина повторов, собственно сатДНК, родственных геномах часто обнаруживается наличие общих или родственных типов сатДНК. Повторяющиеся единицы сатДНК встречаются в большом количестве во всех видах определенного рода, в то время как другие могут присутствовать в одном или нескольких видах. Например, обнаружены существенные отличия в степени амплификации повторов между дикими и культурными видами высших растений (Schweizer et al., 1988; 1993, Hemleben et al, 2007). СатДНК участвует в формировании центромеры и обладает вариабельностью, в отличие от повторенных элементов, расположенных в теломерных концах хромосом, и являющихся различаться прицентромерные сателлитные последовательности.

Прослеживаются различия в гистоне CENP-A у близкородственных видов млекопитающих и Cid у видов Drosophila (Hennikoff et al., 2001). В состав гетерохроматина часто интегрируются мобильные элементы. Там они накапливаются и могут служить источником наблюдается значительное сходство последовательностей сатДНК и фрагментов мобильных элементов. У растений показано, что сатДНК является наиболее вариабельной частью генома с высокой эволюция сатДНК связана со способностью перем ещаться по геному (Southern, et al., 1980). Предполагается, что сатДНК не кодирует никакой информации, и поэтому отбор должен был привести к элиминации этих последовательностей. А так как мобильные элементы способны к транспозиции, это свойство обеспечивает их выживание в геноме. Существует еще ряд гипотез последовательностей, является гипотеза «библиотеки» ( Fry, Salser, 1977; цит по John, Milkos, 1979). Так как сатДНК участвует в процессах синапсиса хромосом в мейозе, то некоторые авторы значимыми. Изменение количества сатДНК ведет к нарушению послужить причиной каких-либо видообразовательных событий. В связи с этим, близкие виды или роды обладают библиотекой видообразованию (Lohe, Brutlag, 1987; Ugarkovi D et al., 2002).

Механизм возникновения и поддержания этой библиотеки можно описать так: 1) «кандидаты» сателлитных последовательностей, объединенных в библиотеку часто возникают de novo; 2) не часто «кандидаты» последовательностей приобретают би ологические функции, которые позволяют им входить в эту библиотеку; 3) библиотеку сателлитов сопровождает библиотека генов, узнающих белки (John, Milkos, 1979). Вследствие чего нужна двойная библиотека – самих сателлитов и генов, которые кодируют белки, связывающиеся с этими последовательностями. Так же требуется два набора «кандидатов», взаимодействие которых должно быть скоординировано в пространстве и времени. Таким образом, эта последовательностей сатДНК.

Открытие в составе гетерохроматиновых районов хромосом структурных генов и генов фертильности, а так же различных мобильных элементов, говорит об участии гетерохроматина в работе генома (McKee, Karpen, 1990; Gatti, Pimpinelli, 1992). Так гетерохроматине, способны влиять на время экспрессии генов.

Предполагается, что они участвуют в инициации подавления экспрессии гетерохроматина и его упаковки за счт связывания Drosophila littoralis Meigen отличающаяся по наличию (отсутствию) гетерохроматинового блока в районе G4 хромосомы 2, принадлежащего к кластеру изоферментов эстеразы в различных органах дрозофилы. Это вызывает изменения в синтезе гормонов развития (ювенильного гормона). Особи, в результате нарушения гормонального обмена, не могут закончить метаморфоз (Корочкин, 1982). Так им образом, (Корочкин, 2002).

1.2 Структурно-функциональные особенности гетерохроматина интерфазных ядер Структурно-функциональные особенности гетеро хроматина в являются ДНК и белки в примерном соо тношении 40 % и 60 %.

Ядерные белки важны для организации расположения хромосом в ядре. В структурном соотношении хроматин представлен в виде нитчатых комплексных молекул дезоксирибонуклеопротеида устойчивы и имеют соотношение ДНК -гистоны 1:1. Это основные или щелочные белки, содержащие такие аминокислоты, как лизин и аргинин. Гистоны схожи по свойствам у всех эукариот, то есть, являются консервативными. Выделяют пять классов гистонов, аминокислот (Н1, Н2А, Н2В, Н3, Н4). Размер полипептидных цепей гистонов в пределах ~220 (H1) и 102 (H4) аминокислотных остатков. Гистоны H1 представлены классом гистонов, со стоящих из нескольких близкородственных белков с перекрывающимися последовательностями аминокислот. Их размеры более крупные (около 220 аминокислот), и они менее консервативны в ходе эволюции. Гистоны класса сильно обогащены остатками лизина, поэтому это гистоновые белки с самыми основными свойствами молекул. Внутри классов Н1, Н2А, Н2В, и Н3 на основании аминокислотных последовательностей различают несколько субтипов, что особенно характерно для класса Н1 у млекопитающих (есть семь субтипов Н1.1 – Н1.5, Н1о и Н1t).

Белки Н2А и Н2В умеренно обогащены лизином. У различных объектов внутри этих групп обнаружены межвидовые вариации первичной структуры последовательности аминокислот. Гистоны класса Н3 и Н4 – белки, полипептидные цепи которых богаты аргинином, наиболее консервативны. Положительный заряд аминогрупп этих кислот связывается с отрицательным зарядом на фосфатных группах ДНК, что делает возможным плотную упаковку ДНК. По две молекулы каждого из гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4 составляют октамер, обвитый се гментом ДНК длиной п.о., образующим 1,8 витка спирали поверх белковой структуры.

Эта частица, – нуклеосома, имеет диаметр 7 нм. Участок ДНК гистоновым октамером, взаимодействует с гистоном Н1. Этот белок закрывает примерно 20 п.о. и обеспечивает формирование суперспиральной структуры – соленоида диаметром 30 нм. Во соленоидные структуры образуют петли диаметром 200 нм, содержащие ДНК длиной 80000 п.о. Петли связываются ядерным остовом (белковый остов). Образующиеся из ~20 петель мини диски укладываются в стопку, составляя хромосому ( Kornberg, 1974, Kolchinski et al., 1978, Jenuwein, 2001).

Группа негистоновых белков высоко гетерогенна и включает структурные ядерные белки и множество ферментов. Например, к метаболизме нуклеиновых кислот (ДНК -полимеразы, ДНКтопоизомеразы, метилазы ДНК и РНК, РНК -полимеразы, РНКазы и ДНКазы и т.д.), белков хроматина ( протеинкиназы, метилазы, определенными участками ДНК, и осуществляющих регуляцию изучены негистоновые белки, так называемой, группы с высокой подвижностью (HMG – high mobility group). Белки так названы изза их высокой электрофоретической подвижности. Эта группа наиболее богато представлена среди негистоновых белков: в клетке их около 5 % от общего количества. Часто встречаются в активном хроматине. Существует четыре основных класса HMGбелков: HMG-1, HMG-2, HMG-14, HMG-17. Белки HMG-1 и HMG- взаимодействия с РНК-полимеразой. В этом случае HMG-белки выступают в качестве регуляторов транскрипц ионной активности.

повышенной чувствительностью к ДНКазе I, обогащена HMGбелками. Считают, что определенные негистоновые белки, входящие в состав интеркалярного гетерохроматина, могут играть существенную роль в прикреплении к оболочке ядра (James, Elgin, 1986). Таким образом, элементами хроматина, которые выполняют ряд регуляторных и структурных функций.

клеточного цикла (Heitz, 1928), преимущественную локализацию на периферии интерфазного ядра (Paddy et al., 1990; Belmont et al., 1993; Marshall et al., 1996; Carvalho et al., 2001; Sage, Csink, 2003) и репликацию в самом конце S-фазы (Прокофьева-Бельговская, 1986).

Гетерохроматин участвует в регуляции транскрипции генов, в особенности, генов рибосомальных РНК. Также играет важную роль в процессе ориентации хромосом во время деления клетки.

Несмотря на эти важные и, можно сказать, консервативные функции, гетерохроматиновые участки чрезвычайно изменчивы и предположить, что не только эухроматин, несущий белоккодирующие гены, но и гетерохроматин как -то участвует в видообразовании. (Корочкин, 1983; Стегний, 1991; Hennig, 1999;

Patrick, et al., 2009; Stacie et al., 2009).

упорядоченной структурой. Впервые проблема упорядоченности интерфазного ядра обозначил в своих исследованиях Д. Комингс (Comings, 1968). Тканеспецифичность трхмерной организации интерфазных ядер, свидетельствующая об упорядоченности, впервые была выявлена с помощью РНК -ДНК in situ гибридизации у D. melanogaster (Steffensen, 1977; цит по Стегний, 1991). В настоящее время связь между пространственной организацией ядра и экспрессией генов считается доказанной ( Carvalho et al., 2001). При этом на любых объектах, от дрозофилы до человека отмечается, что в центре ядра происходит наиболее активная транскрипция, а гетерохроматин и молчащие гены локализованы на периферии. При перемещении генного локуса на периферию упорядоченность хроматина обнаружена в форме ассоциации некоторых хромосомных районов с ядерной периферией, чаще всего – это гетерохроматин (Gerasimova et al., 2000). Связь гетерохроматина с ядерной оболочкой и его расположение на периферии ядра в течение интерфазы отмечается рядом автор ов как одно из обычных свойств гетерохроматина ( Paddy et al., 1990;

Belmont et al., 1993; Carvalho et al., 2001). В политенных ядрах также обнаружена преимущественная периферическая локализация отдельных хромосомных районов (Стегний, 1979, 1987). Например, на электронно-микроскопических срезах политенных ядер клеток слюнных желз D. melanogaster выявлены двадцать два района политенных хромосом, контактирующих с ядерной оболочкой с частотой выше случайной (Hochstrasser, Sedat, 1987a,b; цит по Стегний, 1991). В ядрах проторакальных желз из двадцати трх, контактирующих с ядерной оболочкой районов, двадцать один содержит гетерохроматин, причм, двадцать из них совпадает в ядрах двух тканей (Hochstrasser, Sedat, 1987b; цит по Стегний, 1991).

На биохимическом уровне пространственная упорядоченность хроматина в различных стадиях клеточного цикла выражается в виде специфического связывания особых некодирующих последовательностей ДНК с различными ядерными белковыми розеткоподобных структур (Глазков, 1988a, 1995). При выделении этих структур из нативных ядер в их составе обнаруживаются фрагменты геномной ДНК, связанные с ними с высокой степенью ядерного матрикса (ямДНК), ДНК синаптонемного комплекса (скДНК), ДНК розеткоподобных структур (рсДНК), ДНК ядерной ламины (ялДНК) и т.д. Предполагается, что в нативном ядре эти структур, являются основой пространственной упорядоченности хроматина.

ДНК ядерных белковых структур не имеет гомологичных последовательностей и в составе генома близкородственных видов свидетельствует о том, что для специфичности связывания со структурными белками не важна первичная последовательность нуклеотидов. Показано, что для специфичности связывания имеет значение вторичная структура фрагмента ДНК, приобретаемая за счт общей композиции, по которой ДНК ядерных белковых структур различных организмов сходны между собой. Все они являются AT-богатыми последовательностями, имеют в свом составе поли-(A)- и поли-(T)-блоки, содержат чередующиеся пурин-приримидиновые гомополимерные блоки, ко торые дают изгибы молекулы ДНК, что может обеспечивать существование формирующие шпильки, а также, обогащены сайтами связывания топоизомеразы II (Глазков, 1995).

связыванию с ядерной оболочкой даже на хромосомах одного вида. Так, районы прицентромерного гетерохроматина хромосомы оболочкой, тогда как прицентромерный гетерохроматин правого и левого плеч хромосомы 3 всегда связан с оболочкой тяжами гетерохроматина (Стегний, Шарахова, 1991). Сходные результаты были получены при анализе пространственного расположения в пространстве ядра хромосомоспецифичных проб -сателлитов в центромерные районы одних хромосом (2, 4, 6, 7, X, 9, 10, 12 и 18) локализованы на ядерной периферии, а других (15, 16, 17, 18, 22) – преимущественно ассоциированы с ядрышком ( Carvalho et al., 2001). Результаты этого анализа говорят о том, что позиция прицентромерного гетерохроматина относительно ядерной оболочки хромосомоспецифична. Следовательно, прикрепление или не прикрепление гетерохроматиновых районов хромосом к ядерной оболочке определяется не их гетерохроматиновым состоянием, а может быть объяснено именно способностью или последовательностей, к специфическому взаимодействию с белками ядерной оболочки. Вероятность принадлежности данного фрагмента ДНК к фрагментам ялДНК можно вычислить на основе его первичной последовательности при помощи компьютерной программы ChrClass. Эта программа способна классифицировать фрагменты (области) хромосомной ДНК по их принадлежности к предположительно лежащим в основании разных типов петель хроматина: MAR/SAR (Matrix/Scaffold Association Region), ДНК ядерной ламины (ялДНК), ДНК синаптонемного коплекса (скДНК) и ДНК розеткоподобных структур (рсДНК) («структурные»

участки хромосомной ДНК) ( Glasko et al., 2001).

1.3 Молекулярный состав гетерохроматина собой сложную структуру из ДНК и, связанных с ней и друг с различаются по белковому составу уже на уровне гистонов.

Гистоны гетерохроматина гипоацетилированы у всех эукариот (Elgin, Grewal, 2003), а лизин или аргинин гистонов Н3 и Н4 в 2003). К негистоновым белкам гетерохроматина, обеспечивающим относятся HP1, HP2, SU(VAR)3-7, SU(VAR)3-9, PR/SET07 и SuUR.

Все эти белки локализуются в хромоцентре политенных хромосом D. melanogaster, модификаторами эффекта положения (Zhimulev, Belyaeva, 2003).

Белок HP1 специфически связан с метилированными участками (Sugimoto et al., 1996, цит по Eissenberg, Elgin, 2000). Белок, кодированный геном SU(VAR)3-7, связан с белком HP1, но также имеет 7 мотивов цинковых пальцев, что предполагает прямые Belyaeva, 2003). Белок SU(VAR)3-9 содержит взаимодействующий метилтрасферазной активностью и является каталитическим центром для реакции метилирования лизина гистонов ( Zhimulev, Belyaeva, 2003). Ген, гомологичный гену человека PR/SET07, кодирует гистон-H4-лизин20-метилтрансферазу. Белок SU(VAR)3связан с белками HP1 и SU(VAR)3-7 (Zhimulev, Belyaeva, 2003).

негистоновыми ядерными белками: LBR (ламин-B-рецептором), INCENP (внутренним центромерным белком), CAF (фактором сборки хроматина), ORC (origin recognition complex). Кроме того, белок HP1 способен к полимеризации (Eissenberg, Elgin, 2000).

Для многих гетерохроматиновых белков показано, что они последовательностями ДНК. Так, GAGA -фактор D. melanogaster в (Hennikoff, первичная последовательность ДНК играет определяющую роль определяющими могут являться другие факторы. Например, для HP1 более важным сигналом для связывания служит не столько повторнность последовательностей ДНК и формирование за счт этой повторнности структуры бо лее высокого порядка (Dorer, Henikoff, 1994; Fanti et al., 1998).

последовательностей ДНК гетерохроматина признан необходимым для полного понимания организации работы эукариотических последовательностей ДНК, является главной чертой, отличающей его от эухроматина (John, 1988; Weiler, Wakimoto, 1996; Elgin, гетерохроматина (Fanti et al., 1998). Большую часть генома у последовательности, состав оснований которых, отличается от генома. Анализ высокоповторенных последов ательностей ДНК дрозофилы позволяет разбить их на три группы в соответствии с состоящая из последовательности рибосомной ДНК, сателлиты, образованные повторами 5-10 пар нуклеотидов, и сателлит – клонировании коротких (300-600 пн) фрагментов, выделенных из определением последовательностей нуклеотидов установлено: 1) в состав сатДНК входит 11 типов повт оров; 2) как правило, большинство типов повторов присутствуют в каждой хромосоме, но есть и специфичные, для определенных хромосом; 3) обычно, нуклеотидный состав повторов гомогенен, единичные замены встречаются на тысячу пар нуклеотидов, иногда частота за мен последовательностей часто располагаются мобильные элементы (то есть умеренные повторы) (Жимулев, 1993).

Эксперименты по локализации сателлитов с помощью in situ гибридизации на хромосомах Arabidopsis thaliana (L.) Heynh, D.

melanogaster и Homo sapiens показали, что прицентромерный гетерохроматин этих далких друг от друга организмов почти полностью состоит из тандемных повторов ( Round et al., 1997; Sun et al., обнаруживаются в геномах различных эукариот. Тандемными повторами представлены жизненно важные для каждой клетки компонентов нуклеосом, являющихся структурными единицами хроматина. Вопрос о том, как возникли эти повторы, и каким кодирующий белки эукариотической клетки, известен только в случае генов гистонов. Второй пример – это обнаруженный кластер генов Stellate в гетерохроматине Х-хромосомы дрозофилы.

(умеренных повторов), и эти участки и дентичны в различных линиях дрозофил (Dimitri, Junakovic, 1999). Высоко повторенные генома. Сателлитные профили даже у очень близких видов сильно различаются. Так, у D. virilis 40 % ДНК приходится на долю сателлитных последовательностей, у Drosophila texana Blake 35 %, но с другими коэффициентами седиментации, у Drosophila ezoana Tokada end Okada совсем не найдено сателлитов (Жимулев, 1993).

Различие сателлитного состава показано и на Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (Hall et al., 2003). Но близкородственные виды содержат общие сателлиты (Heikkinen et al., 1995).

Содержание сателлитов в прицентромерном гетерохроматине скэффолдов Anopheles gambiae Giles с помощью программного простых и сложных сателлитов (Holt et al., 2002, Krzywinski et al., 2005). Исследование структур протяженных гетерохроматиновых повторов показало, что они представляют собой мозаику из последовательных событий внедрения подвижных элементов в обнаружено, что отдельные фракции сатДНК могут быть сайтами активного связывания регуляторных белков дрозофилы. В таком связывающихся с множеством эухроматиновых генов ( Krzywinski et al., 2005).

мобильные элементы также могут располагаться в виде тандемных гетерохроматиновых районов хромосом у большинства эукариот, как растений, так и животных (Dimitri, Junakovic, 1999). Чаще всего, их присутствие рассматривается как «островк и в море сателлитных последовательностей». В соответствии с механизмом Мобильные элементы класса I – ретроэлементы, переносятся с помощью механизма обратной транскрипции и РНК -посредника.

интерсперсные повторнные ядерные элементы ( long interspersed Переносятся LTR-ретротранспозоны по механизму сходному с механизмом переноса ретровирусов. Их терминальные повторы, в среднем 200-500 п.о. длиной, играют важную роль на всех стадиях переноса транспозона, включая функцию промотора и сигнала для функциональные домены: рибонуклеазу H, протеазу и интегразу.

Помимо pol-подобного белка LTR-ретротранспозоны кодируют капсид. Некоторые LTR-ретротранспозоны также содержат envподобный фрагмент, который кодирует белок, связывающий ретровирусов в клетку. Не-LTR ретротранспозоны или LINEs обычно длиной 3-8 т.п.н.. Как и LTR ретротранспозоны, не-LTR ретротранспозоны кодируют pol-подобный белок, содержащий домен обратной транскриптазы необходимый для транспоз иции.

Другими типичными структурными характеристиками не -LTRретротранспозонов являются Pol II-промоторы, содержащие мотив AATAAA, поли-(А)-блоки и простые тандемные повторы. SINEэлементы обычно 100-500 п.н. длиной, не содержат каких -либо кодирующих последовательностей и для перемещения используют позаимствованные у автономных не -LTR-ретротранспозонов белки. Среди мобильных элементов класса II, в зависимости от встройки, MITE-элементы и гелитроны (Helitrons) (Kapitonov, Jurka, 2001). Кодирующая часть элементов, перемещающихся по механизму вырезания и встройки фланкирована терминальными инвертированными повторами (TIR, terminal inverted repeat), длина нескольких тысяч нуклеотидов, содержит одну или более рамок считывания и кодирует белок транспозазу ( Tu, Coates, 2004).

MITE-элементы считывания и ограниченные терминальными инвертированными названных гелитронами (Helitrons), была открыта у насекомых и растений (Kapitonov, Jurka, 2001). Мобильные элементы этого обеспечивают репликацию гелитронов по механизму катящегося кольца (Walbot, Rudenko, 2002; цит. по Tu, Coates, 2004).

В настоящее время, в гетерохроматине генома дрозофилы регулироваться с помощью механизма РНК -интерференции.

гетерохроматин обеднен генами. Например, частота встречаемости их на единицу длины ДНК в гетерохроматине второй хромосомы D. melanogaster перенесении их в эухроматин ( Weiler, Wakimoto, 1996).

полностью состоящие из повторяющихся последовательностей «осколков» транспозонов. Вероятно, гетерохроматиновые гены и регулируются иначе. Кроме этого, найдено 13 единичных копий количество псевдогенов (Adams et al, 2000; Dimitri et al, 2005).

Так, в прицентромерном гетерохроматине X-хромосомы у D.

melanogaster рибосомальных РНК, а также ген supressor of forked (Pimpinelli, 1995). Важность генов, располож енных в гетерохроматине, хорошо прицентромерном гетерохроматине хромосомы 2. Показано, что активируемой протеинкиназе, участвует в передаче клеточных множественные уродства крыльев у имаго ( Dimitri, 1991). Ген concertina кодирует альфа-субьединицу G-протеина, играющего роль в межклеточных коммуникациях в ходе эмбрионального развития. К настоящему времени, хорошо изучено генетическое содержание гетерохроматина X-,Y-хромосом и аутосом у разных видов дрозофил и, в первую очередь, у D. melanogaster. Например, в X- и Y-хромосомах охарактеризованы гены bb (bobbed) – участки локализации генов, повторенных 1 50-250 раз, и кодирующих увеличивают политенизацию генов рДНК при потере одного из (ribosomal exchange) локус, индуцирующий митотический обмен между двумя кластерами рДНК (Zhimulev,1998).

У An. gambiae кластеры генов рибосомальных РНК также располагаются в прицентромерном гетерохроматине хромосомы X (Krzywinski et al., 2005). У Anopheles funestus Giles гены были найдены в -гетерохроматине левого плеча хромосомы 3 при in situ гибридизации с хромосомами трофоцитов клонов библиотеки кДНК этого вида (Sharakhov et al., 2002). То есть, также, как и Anopheles содержит активные гены.

К настоящему моменту накоплено множество данных об индивидуальных мономерах повторяющихся последовательностей ДНК у различных организмов, как сателлитов, так и мобильных элементов: известна их длина, первичная последоват ельность нуклеотидов, число копий на геном, вариабельность и локализация организация протяжнных участков гетерохроматиновых районов – ориентация повторнных единиц, взаимное расположение и центромерные районы высших эукариот характеризуются сходной организацией, что показано на примере изучения центромер человека, дрозофилы и арабидопсиса ( Henikoff, 2002). У D.

melanogaster встройками мобильных элементов чередуются с, так называемыми, островами комплексной ДНК, которые представляют собой смесь небольших фрагментов сателлитных массивов (Жимулв, 1993).

ДНК-состав центромер и прицентромерного гетерохроматина, cостав определяться видоспецифичный гетерохрома тин (Жимулев, 1993) Ещ первооткрыватель гетерохроматина Э. Хайтц предполагал, что гетерохроматин является генетически инертным ( Heitz, 1928).

Выявленные в последствии такие факты, как незначительный уровень транскрипции, обедннность структурными генами и обилие некодирующих повторяющихся последовательностей ДНК, поставили под сомнение активную роль гетерохроматина в геноме последовательностями, кодирующими бел ки. В настоящее время также существует много вопросов о функциональной значимости гетерохроматина, но, тем не менее, поиски разумных объяснений существования гетерохроматина активно продолжаются.

функциональную значимость гетерохроматина: 1) гетерохроматин эукариот; 2) гетерохроматин влияет на процессы генетической рекомбинации – при мейозе он затрудняет кроссинговер, а при кроссинговеру (Ladygina et al., 1991; цит. по Gruzdev, 2000); 3) перенесенные к нему хромосомными перестройками соседние гены, обусловливая мозаичный эффект положения ( Muller, 1930;

цит. по John, 1988), эффект положения может распространяться от расстояния, тем самым, вероятно, определяя адаптивный эффект хромосомных инверсий (Дубинин, 1935; Стегний, 1984; Жимулв, 1993); 4) гетерохроматин содержит некоторые жизненно важные структурные гены; 5) гетерохроматин способствует различным робертсоновских слияний хромосом часто картируются в районах (Прокофьева-Бельговская, 1986; Bovero et al., 2002); 6) связывание гетерохроматина с ядерной оболочкой играет основную роль в интерфазного ядра в целом (Paddy et al., 1990; Belmont et al., 1993;

Стегний, 1993; Marshall et al., 1996; Лобов, Подгорная, 1999;

Carvalho et al., 2001); 7) гетерохроматин является "накопителем" изменчивости, что предусматривает его важную роль в эволюции гетерохроматина в кариотипах являются сопутствующим фактором (Корочкин, 1983; Стегний, 1991; Кикнадзе и др., 1991).

организации гетерохроматина в функционировании интерфазного ядра. Результаты таких исследований позволят приблизиться к генома.

1.4 Гетерохроматин политенных хромосом Diptera Политенными называют гигантские хромосомы, состоящие из тысяч гомологичных нитей — хроматид, не разошедшихся в процессе нескольких циклов эндорепликации. Для таких хромосом структурой, где диски — более плотные участки, а междиски — менее плотные. Диск-междисковый рисунок уникален и удобен для идентификации хромосом. С момента их открытия Э. Бальбиани в 1881г. началось активное исследование хромосомных структур (Прокофьева-Бельговская, 1986).

Наличие в тканях ядер с крупными политенными хромосомами личинок отряда составляют ткани с политенными хромосомами. У имаго таких тканей меньше, как правило, это мальпигиевы сосуды, средний и задний отделы кишечника и питающие клетки ооцитов.

При первых исследованиях ядер с политенными хромосомами двукрылых оказалось, что прицентромерные гетерохроматиновые Например, в ядрах слюнных желз D. melanogaster хромосомы периферии ядра и контактирует с ядерной оболочкой при помощи гетерохроматина у видов рода Anopheles (Стегний, 1979; 1987).

maculipennis, хромосомы которых не связаны в единый хромоцентр и имеют характерную гетерохроматиновую структуру (Стегний, 1979, 1987а). У дрозофил политенные хромосомы и одновременное отсутствие хромоцентра показано в мутантных линиях otu и fs2b вида D. melanogaster (Mal’ceva, Zhimulev, 1993; Жимулв, 1993).

1.4.1 Drosophila Хромомерная структура характерна только для эухроматина. В гетерохроматине диски и междиски отсутствуют. Тем не менее, последовательности митотических хромосом могут быть более или менее представлены и, в соответствии с этим, образовыва ть - или -гетерохроматин уже политенных хромосом (Жимулев 1993).

псевдопитающих клетках яичников у мутантов otu D. melanogaster ведет к образованию структур, сходных с -гетерохроматином хромосомах, которое не отражается на размерах реплицирующихся частей политенных хромосом. Например, у D. ezoana в 3 раза меньше гетерохроматина, чем у D. virilis, но размеры дисковых инверсий, у этих видов одинаковы ( Holmquist, 1975а, цит по Жимулев, 1993).

В настоящее время известно, что - гетерохроматин состоит из богатых АТ-парами, сателлитных последовательностей (Gall et al, 1971), которые, в значительной степени, недореплицированы в политенных хромосомах (Gasser et al., 1992). Тогда как гетерохроматин состоит из умеренных повторов, у некоторых количества (Rudkin, 1969; Spradling,1987). Такие изменения могут касаться не только количественного, но и качественного состава последовательностей сатДНК у близких видов Drosophila были обнаружены большие различия. У двух близких видов D. virilis и D. texana различие по количественному содержанию сатДНК составляет 5 %, однако, присутствуют и качественные различия (Gall et al., 1971). У видов D. melanogaster, Drosophila simulans Sturtevant и Drosophila erecta Tsacas and Lachaise наблюдается сатДНК, а именно, изменение числа копий последовательностей.

Но есть случаи, когда некоторые последовательности выявляются у отдаленных видов и не выявляются у близких, например, некоторые последовательности D. melanogaster не выявляются у близкого D. simulans, но присутствуют у более далекого D.erecta (Lohe, Brutlag, гетерохроматина в митотических хромосомах так же наблюдается и на политенных хромосомах. Например, в группе virilis виды различаются по количеству прицентромерного гетерохроматина и наблюдается уменьшение количества гетерохроматина у филлады хромосомах трофоцитов яичников также обнаружено уменьшение количества прицентромерного гетерохроматина в группе virilis.

хромосом в пространстве ядра и формированию независ имых (Корочкин, 1983, Стегний 1991). В подгруппе melanogaster вида Drosophila хромоцентральной организации (Drosophila orena Tsacas) через диффузный хромоцентр (D. simulans, Drosophila sechellia Tsacas and Bchli) к прочному прикреплению каждой хромосомы к прикрепления их к оболочке (Drosophila mauritiana Tsacas and David), Это было показано в результате исследования ядер трофоцитов яичников (Стегний, Вассерлауф, 1994).

Степень недорепликации гетерохроматина может изменяться дисковый рисунок при отсутствии таких гетерохроматиновых белков как Supressor underreplication (SUUR) или SU(VAR)3- (Жимулев, 1993).

1.4.2 Anopheles В отличие от других Diptera, у малярийных комаров в генеративной ткани – в ядрах трофоцитов формируются развитые политенные хромосомы подобные хромосомам слюнных желез (Coluzzi, 1969; Стегний, 1979; 1987). В ядрах трофоцитов D.

melanogaster отсутствуют, что затрудняет исследование. Такая организация трофоцитов яичников позволяет использовать комаров комплекса An. maculipennis в качестве модели для изучения механизмов и роли преобразований гетерохроматина при видообразовании.

Слюнные железы Структура политенных хромосом слюнных желез у части гомосеквентных видов Anopheles по числу дисков и их яркости сходна с хромосомами трофоцитов яичников (Стегний и др., 1976;

Стегний, Шарахова, 1991). Однако ест ь значимые различия по плотности дисков и четкости дискоидального строения (Шарахова, прицентромерных районах.

слюнных желез малярийных комаров имеет хромоцентральную гетерохроматина, как и в ядрах слюнных желз D. melanogaster (Hochstrasser, Sedat, 1987a). Например, в ядрах слюнных желз у An. messeae – вида комплекса An. maculipennis прицентромерные гетерохроматиновые районы всех хромосом также объединены в хромоцентр и имеют прикрепление к ядерной оболочке. Кроме messeae значительную степень недорепликации (Шарахова и др., 1997).

варьирует от вида к виду в пределах комплекса, что затрудняет количественную оценку и сравнение их между собой. Тогда как изучение генеративной ткани – клеток трофоцитов яичников позволяет осуществить такое сравнение.

Трофоциты яичников было определено гетерохроматиновое строение прицентромерных районов политенных хромосом трофоцитов яичников восьми видов малярийных комаров комплекса An. maculipennis (Шарахова и др., относительно присутствия, количества и размеров блоков гетерохроматина. Так же, виды отличаются по степени асинапсиса гомологов и по степени расхождения правого и левого плеч хромосомы 2 и 3.

Для вида An. maculipennis установлено варьирование наличия или отсутствия гетерохроматина хромосомы Х. У An. messeae хромосома 2 полиморфна по размеру блоков -гетерохроматина. У An. atroparvus наблюдается полиморфизм хромосомы 2 по степени расхождения плеч.

веерообразные структуры, которые прочно прикрепляют плечи гомосеквентные виды, такие как An. atroparvus и Anopheles labranchiae Falleroni, Аn. maculipennis и Anopheles subalpinus материала -гетерохроматина является существенным признаком в эволюционном отношении (Стегний, 1979, 1987, 1993).

Различия в структуре -гетерохроматина и его прикреплении к ядерной оболочке наиболее четко прослеживаются на примере прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2. У An. messeae количеством -гетерохроматина, контакт с ядерной оболочкой отсутствует. Правое и левое плечи никогда не разобщаются, а в гетерохроматин хромосомы 2 образован тонкими блоками гетерохроматина, окружнными большим количеством типичного -гетерохроматина с рыхлой диффузной структурой, который факультативно, отдельными тяжами, контакт ирует с оболочкой ядра. Плечи хромосом, как правило, не разобщаются. В районах блоков -гетерохроматина, как и у An. messeae, наблюдается небольшой асинапсис гомологов (Шарахова, Шарахов, 1992). У An.

beklemishevi и An. labranchiae прицентромерный гетерохроматин хромосомы 2 облигатно крепится к оболочке тяжами гетерохроматина, которые формируют, внедряющиеся в оболочку нарушается (Стегний, 1979; Шарахова и др., 1997).

Различия в прикреплении гетерохроматина к ядерной оболочке обусловливают неповторимость пространственной организации ядра у каждого из видов комплекса. На основании фактов о комплекса maculipennis, а также, у дрозофил группы virilis и подгруппы melanogaster, была сформулирована теория системных мутаций, предполагающая пространственную реорганизацию ядер видообразования (Стегний, 1993, 1996). Изучение гетерохроматина определении его роли в процессе функционирования генома.

хроматина в ядре основаны на взаимодействии хроматина с белками внутриядерного матрикса и ядерной оболочки. Очевидно, последовательностями ДНК, которые опосредованно, через белки, пространстве. Поскольку в местах ко нтактов хромосом с ядерной оболочкой были обнаружены гетерохроматиновые блоки, можно говорить о том, что связи гетерохроматина с ядерной оболочкой являются основой для пространственного упорядочения отдельных хромосом и интерфазного ядра, в целом ( Paddy et all, 1990;

Belmont et all, 1993; Стегний, 1993; Marshall et all, 1996; Sage, Csink, 2003). Гетерохроматин ассоциирует в себе ряд различных изменчивости, что предусматривает его важную роль в эволюции эукариот (Hennig, 1999). В настоящее время известно, что не только эухроматин, но и гетерохроматин является важной частью генома и играет свою функциональную роль.

1.5 Таксономия комплекса maculipennis К настоящему времени известно девять видов малярийного комара палеарктического комплекса An. maculipennis: An.

maculipennis Meigen, An. messeae, An. beklemishevi, Anopheles saharovi Favre, An. atroparvus, An. melanoon Hackett (syn. An.

subalpinus), An. labranchiae, Anopheles martinius, Shingarev, Anopheles artemievi, Gordeev et. al. Все виды имеют одинаковое число хромосом (2n=6) относительно сходных по морфологии.

идентифицируются только по окраске экзохориона яиц.

Цитогенетическое исследование палеарктического компле кса An. maculipennis способствовало четкой дискриминации форм по структуре политенных хромосом (Frizzi, 1947; Стегний, 1981).

Большинство видов палеарктического комплекса maculipennis сравнительные фотокарты политенных хромосом могут служить своеобразным определителем этой подгруппы (Стегний, 1980). В результате сравнительного изучения политенных хромосом палеарктических видов был выявлен новый вид An. beklemishevi (Стегний, Кабанова, 1976; Stegnii et Kabanova, 1978), изучена его популяционно-генетическая структура и составлена фотокарта политенных хромосом слюнных желз (Стегний и др., 1978). В результате цитогенетического и гибридологического анализа An.

(Стегний, 1991). Были созданы фотокарты хромосом слюнных желз семи видов палеарктического комплекса maculipennis и установлены филогенетические хромосомные связи между ними транскрибируемого спейсера рДНК (ITS2) ряда видов комплекса maculipennis, был выявлен новый вид An. artemievi (Гордеев и др.

хромосом идентичен видам An. maculipennis и An. melanoon, отличается от них по структуре и рисунку экзохориона яиц и по диагностическому гену (ITS2). Анализ архитектуры генома так же показал четкое отличие An. artemievi от An. maculipennis и An.

melanoon (Стегний, 2007).

В этом комплексе имеются две группы видов: An. atroparvus – An. labranchiae и An. maculipennis – An. melanoon – An. artemievi, (Гордеев и др., 2005; Андреева и др., 2007). Гибридологический остальные палеарктические виды ( Frizzi, De Carii, 1954; Стегний, политенных хромосом в данной ситуации не может служить таксономическим признаком (Стегний 1991).

1968). Исследования, проведенные отечественными учеными в 80 х г.г. показали как наличие видоспецифичных ферментов, так и эстеразам) (Стегний, 1991). Интересно, что вид An. beklemishevi (Стегний, 1991; Саура, 1979).

питающих клеток (трофоцитов) яичников взрослых самок видов комплекса maculipennis показал, что есть четкие различия по наличию или отсутствию связей хромосом с ядерной оболочкой и хромосомах. Так у An. labranchiae хромосома 2 прикреплена к прицентромерный район хромосомы 2 L расходится на гомологи. У An. atroparvus хромосома 2 не прикреплена к оболочке ядра, хромосома ХL прикреплена к оболочке центромерн ым локусом с разобщением гомологов. У An. maculipennis хромосома 2 не центромерным локусом с разобщением гомологов. У An. melanoon хромосомы 2 и ХL не прикреплены к оболочке ядра, хромосома 3 L (разошедшимися гомологами в этом районе). У An. artemievi прикреплены к оболочке ядра хромосома 2 (центром ерными центромеры гомологи расходятся) и хромосома 3 L, которая имеет расхождение гомологов только в районе диска 34, хромосома XL с оболочкой ядра не контактирует. У An. messeae хромосома 2 не прикреплена к оболочке ядра, ХL прикреплена к оболочке ядра латеральным локусом 2bc, хромосома 3 прикрепляется к оболочк е ядра разобщенными гомологами обоих плеч. У An. saharovi хромосомы 2 и ХL не прикреплены к оболочке ядра, хромосома имеет прикрепление, отличное от остальных видов комплекса – гомологи обоих плеч хромосомы не разобщены, а находятся в компактном состоянии и прикрепляются к оболочке ядра только небольшими веерообразными разветвлениями. У An. beklemishevi хромосома ХL имеет эктопический контакт с ядерной оболочкой прикрепления всегда расходятся. Хромосома 3 имеет жесткое локальную систему крепления, хромосома 3 L прикреплена к оболочке с разобщением гомологов (Cтегний, 2007).

Трехмерная организация хромосом в ядрах питающих клеток генеративной ткани представлена более "жесткой" структурой геномов (если иметь ввиду наличие/отсутствие прикрепления хромосом к ядерной оболочке) у An. messeae и An. maculipennis по сравнению с An. melanoon. XL-хромосома прикреплена к ядерной центромерным концом у An. maculipennis, тогда как у An. melanoon и у An. artemievi она не обнаруживает никакой связи с оболочкой разобщение гомологов в центромерном районе, что характерно для An. maculipennis и не характерно для An. melanoon. В то же время, в отличие от An. melanoon, в прицентромерном районе An.

artemievi не формируется яркоокрашенный гетерохроматиновый видообразователи, подобно An. melanoon и An. artemievi, должны иметь минимальное количество хромосомно -мембранных связей.

Х-хромосома An. melanoon как бы находится в неустойчивом (активном) состоянии, тогда как у An. maculipennis и An. messeae, (Стегний, 1993).

labranchiae палеарктической группы maculipennis (Стегний, 1979). От этого хромосомного типа берут начало две филогенетические линии:

atroparvus – saharovi – martinius и labranchiae – maculipennis– beklemishevi, поскольку его статус в Палеарктике относительно независим, и он непосредственно связа н с неарктическим хромосомным типом Anopheles earlei Vargas (Стегний, Кобанова, 1976, Сибатаев, 2007).

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Характеристика объекта исследования В работе использовали взрослых самок малярийных комаров трех видов: An. beklemishevi, An. messeae и An. atroparvus. Самок An. atroparvus отбирали из лабораторной культуры НИИ Биологии и Биофизики ТомГУ. Самок An. messeae и An. beklemishevi из природных популяций собирали в местах дневки (пос. Коларово, Томский р-н., и поселка Тегульдет Томская обл., соответственно (Таблица 1)) в летний период. Идентификация видов -сиблингов An. messeae и An. beklemishevi проводилась цитогенетическим методом с использованием карт политенных хромосом слюнных желз видов An. atroparvus (Стегний, Кабанова 1978), An. messeae (Стегний, Кабанова, Новиков, 1976) и An. beklemishevi (Стегний, Кабанова, 1976; Stegniy, Kabanova, 1978).

Таблица 1. Количество особей An. messeae и An. beklemishevi собранных с 2006 по 2008 год в пос. Коларово и пос. Тегульдет.

Тегуль 2.2 Приготовление цитологических препаратов политенных хромосом Для приготовления сухо-воздушных препаратов политенных хромосом использовали яичники, An. beklemishevi, An messeae. и An. atroparvus, фиксированные в растворе Карнуа (96 % этанол и ледяная уксусная кислота в соотношении 3: 1) при – 20 C фолликулов из яичника и помещали на предметное стекло в каплю мацерировали и накрывали покровным стеклом (18х18мм) на 10 – 15 мин. Препарат раздавливали, и замораживали жидк им азотом.

Затем покровное стекло удаляли, а препарат помещали в холодный (–20 C) этанол 50 % и инкубировали до 4 часов. Обезвоживание препарата осуществляли последовательным инкубированием по минут в 70 %, 90 % и 100 % этаноле при + 4 C. Фиксацию препарата проводили в растворе Карнуа в течение 5 мин при + C, подсушивали на воздухе 1–2 минуты, промывали в 100 % этаноле и снова высушивали на воздухе. Хранили препараты при 25 С.

2.3 Микродиссекция с последующим получением ПЦР -продукта Микродиссекцию проводили на микроскопе AXIOVERT 10, оснащенном микроманипулятором IR (Zeiss, ФРГ) и механическим позиционером в лаборатории Н. Б. Рубцова. Фрагменты хромосом соскабливали с поверхности сухого препарата, изготовленного на покровном стекле 60х24 мм. Всего б ыло вырезано 6 фрагментов хромосом с трх препаратов, полученных из яичников одной особи An. beklemishevi Диссектированный материал переносили в микрокаплю составом 10 мМ Трис НСl (рН 7,5), 10 мМ NaCl, 0,1 % SDS, 30 % глицерин, 500 мкг/мл протеиназы К (Boehringer Mannheim) (20–40 нл), помещенную в силиконизированную микропипетку. Во время сбора микропипетка находилась во влажной камере при комнатной температуре. По завершению сбора необходимого числа копий хромосом или хромосомных районов, пипетку с диссектированным хромосомным материалом переносили в коробку из нержавеющей стали, помещенную в водяную баню (60 о С), на 2 часа (Rubtsov et al., 2000).

Собранный материал перенесли в 0,5 мл пробирку со смесью для низко-температурных циклов (0,6 кратный Секвеназный буфер (24 мМ Трис HCl pH 7.5; 12 мМ MgCl 2 ; 30 мМ NaCl), 5 мкМ DOPпраймера, 200 мкМ каждого из дНТФ). Нагрели материал до 96 о С провели 8 низко-температурных циклов (25 о С – 2 минуты; 36 о С – 2 минуты; 94 о С – 1 минута). Затем внесли на 2 минуты при 94 о С 50 мкл смеси для высоко-температурных циклов (1хStoffel буфер, CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3'), AmpliTag, Stoffel Fragment высоко-температурных цикла (94 о С – 1 минута; 56 о С – 1 минута 30 сек.; 72 о С – 2 минуты). После последнего цикла выдерживали минут при 72 С для полного завершения элонгации цепей (Rubtsov et al., 2000).

проверяли методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле. На старт наносили 1/10 объма реакционной смеси. Гель окрашивали бромистым этидием (0,1 мкг/мл). Прокрашенный гель смотрели в Амплифицированная ДНК выявлялась в виде шмера фрагментов размером от 200 до 500 пар нуклеотидов.

2.4 Микроклонирование ПЦР-продукта Часть амплифицированной ДНК была исп ользована для реПЦР, затем очищена с применением колонок QIAquick PCR Purification kit (Германия) с помощью QIAquick PCR product Purification kit (Германия) по рекомендованному протоколу. Для лигирования из смеси 3 мкл амплифицированной очищенной ДНК, 1 мкл соли (NaCl и MgCl 2 ) и 1 мкл вектора pCR ® 4-TOPO ® брали 2,5 мкл для трансформирования с 25 мкл компетентных клеток E.

сoli, штамм DHS. К смеси на льду добавили не перемешивая мкл лигазной смеси, инкубировали 5 мин, затем смесь подвергли тепловому шоку в водяной бане 30 сек при инкубировали на льду 2 мин, после чего добавили 125 мкл восстановительной среды и инкубирова ли 1 час при 37 С.

Выращивание клеток на селективной среде, отбор позитивных разделением фрагментов в 2 % агарозно м геле.

beklemishevi на геномную ДНК исследуемых видов Амплифицированная в ходе DOP-ПЦР смесь фрагментов ДНК диссектированных районов хромосом Abekl2L использовалась в Anopheles.

инкубировали в 2xSSС 5 минут при 24 С, затем инкубировали по 5 минут в 50 %, 70 %, 90 % и 100 % этаноле (24 С), после чего высушивали при 37 С. Затем на препараты наносили 70 мкл рабочего раствора РНК-азы (), накрывали покровным стеклом, и инкубировали 30 минут при 37 С. От РНК-азы препараты промывали в трех растворах 2 xSSС по 5 минут при 37 С, и инкубировали с пепсином 10 минут при 37 С. Затем отмывали препараты в двух растворах 1х PBS 5 минут в каждом при 24 С.

параформальдегида на 10 минут при 24 С, отмывали 5 минут в обезвоживали в батарее спиртов (50 %, 70 %, 90 % этанол) и Денатурировали 2 минут при 72 С, и гибридизовали 17 часов при 37 С в TERMOBRAIT (США).

стекло снимали и препарат отмывали от несвязавшейся ДНК в трех растворах 50 % формамида по 5 минут при 45 С. Формамид отмывали в 2xSSС 8 минут при 37 С и быстро споласкивали в инкубировали 15 минут при 37 С во влажной камере.

Детекция зонда проводилась при помощи Anti-DigoxygeninRhodamine (США) путем инкубирования втечение 15 минут при С. После отмывали в трех сменах отмывочного буфера по 5 минут при 24 С. Хромосомы затем окрашивали DAPI (SIGMA, США) и Определение районов включения зонда определяли сравнением программного обеспечения AxioVision LE Rel. 4.5.

2.6 Выделение геномных ДНК An. beklemishevi, An. messeae, An.

atroparvus Геномные ДНК An. beklemishevi, An. messeae и An. atroparvus выделяли по модифицированному методу Бэндера ( Bender et al., 1983) из личинок, зафиксированных в 96 % этаноле. Личинок гомогенизировали в гомогенизирующем буфере из расчта по мкл на каждую личинку. Cостав буфера : 0,1 М Tris-HCl pH 7.5;

0,1 М NaCl; 0,05 М ЭДТА pH 9,1; 0,5 % SDS; 0,2 М сахароза; 1 % DEPC (диэтилпирокарбонат). После чего гомогенат инкубировали 30 минут при 65 °С, добавляли 20 мкл 3 М ацетата калия и центрифугированием 5-7 минут при 10000 g, прибавляли к нему равный объем 96 % этанола и инкубировали 5 минут при 25 °С.

Затем ДНК осаждали центрифугированием 10 минут при 14000 g, высушивали и растворяли в 100 мкл деионизированной воды.

Хранили при 4 °С.

2.7 Выделение плазмидной ДНК Выделение проводилось методом щелочного лизиса. Клетки E.

сoli в объеме 1,5 мл культуры осаждали центрифугированием при 13-14 тысяч оборотов в секунду в течение 2 мин ут при комнатной температре. Осадок ресуспендировали в 200 мкл буфера №1 ( мM Трис-HCl pH 8.0, 10 мМ ЭДТА и 100 мкг/мл РНКазы А), затем добавляли 200 мкл буфера №2 (0.2 М NaOH и 1% SDS), затем быстро приливали 200 мкл предварительно охлажднного буфера центрифугированием 13-14 тысяч оборотов в секунду в течение 5 минут. Супернатант переносили в новую пробирку.

оборотов в секунду с добавлением 320 мкл изопропанола 100 % на добавлением 200 мкл этанола 75 % центрифугировали 7 минут.

растворяли в 50 мкл деионизированной воды 2.8 Секвенирование клонов минибиблиотеки Abekl2L Клоны минибиблиотеки были просеквенированы с помощью набора реактивов BigDye Terminators (ABI PRISM, США) версия 3.1 на автоматическом секвенаторе в Институте медицинской генетики (Томск), используя стандартные праймеры T3 (5"GCAATTAACCCTCACTAAAGG-3") и T7 (5"-ТААТАСGACTCACTATAGGG-3").

2.9 Анализ последовательностей ДНК последовательностей проводился по базам данных нуклеотидных (http://ncbi.nlm.nih.gov/ ). Выравнивание двух и помощи программ PipMaker (http://pipmaker.bx.psu.edu/pipmaker/), LALIGN потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов (http://www.genomatix.de) MatсhTM (http://www.gene-regulation.com).

соответствующих баз данных секвенированных геномов ( UCSC элементы идентифицировали с помощью программ CENSOR и Repeat Masker (http://www.repeatmasker.org ) между фрагментами минибиблиотеки осуществлялся с помощью ftp://ftp.ncbi.nih.gov/BLAST/executables/.

матрикса проводился с использованием про граммы ChrClass (Rogozin et al., 2000).

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Особенности локализации гомологичных последовательностей ДНК РП к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi на хромосомах видов Diptera Прицентромерные гетерохроматиновые р айоны (ПГ) хромосом часто являются районами прикрепления (РП) к ядерной оболочке, поэтому исследование РП позволяет расширить представление о влиянии изменений состава гетерохроматина на пространственную структуру ядра.

Ранее, в нашей лаборатории был изуче н молекулярный состав районспецифичного ДНК-зонда Atr2R на политенные хромосомы комаров An. atroparvus, An. messeae, An. beklemishevi показал последовательностями ДНК во всех районах ПГ хромосом данных видов и отсутствие таковых в районе ПГ хромосомы 2L An.

beklemishevi. Хромосома 2L An. beklemishevi жестко крепится к ядерной оболочке прицентромерным районом прик репления (РП) 15d, образованным – гетерохроматином (Стегний, 1993). Данная работа посвящена изучению состава ДНК района 15d хромосомы 2L An. beklemishevi.

хромосомы 2L An. beklemishevi на хромосомах видов Anopheles комплекса maculipennis гетерохромаина хромосомы 2L An. beklemishevi.

Несмотря на то, что основной спектр последовательностей известен, о составе гетерохроматина видов, представителей комплекса Anopheles maculipennis и, тем более, об эволюционных применяют метод гибридизации отдельных участков хромосом на гибридизации in situ с меченным флуоресцентным красителем зондом. Свечение флуоресцентной метки в различных участках последовательности (группы последовательностей), гомологичные ДНК, входящей в состав изучаемого зонда. В нашем случае этот метод применяется, так как ДНК ПГ насыщена повторяющимися последовательностями. Набор повторенны х последовательностей ДНК может сильно отличаться как между видами, так и внутри одного вида (например, у негомологичных хромосом).

район, подвергшийся микродиссекции.

Получение районспецифичного зонда осуществили методом микродиссекции, с последующей амплификацией участка 15d ПГ хромосомы 2L An. beklemishevi (рисунок 1), имеющей жесткое прикрепление к ядерной оболочке.

частично использовали в приготовлении районспецифичного зонда флуоресцентным красителем биотином. Так как фрагменты ДНК Abekl2L фрагментов составляла 250 п.н.) при гибридизации выявляются только те области хромосом, где присутствует очень много гомологичных последовательностей. Области, где гомологичных выявляются совсем.

Гибридизация in situ, полученной районспецифичного ДНКзонда Abekl2L, на политенные хромосомы из трофоцитов яичников видов An. atroparvus, An. messeae, An. beklemishevi позволит качественного и количественного состава.

гибридизации в комплексе maculipennis.

Чтобы определить наличие общих последовательностей ДНК РП к ядерной оболочке хромосомы 2 L An. beklemishevi и ДНК прицентромерных районов (некоторые из них являются РП) других видов комплекса maculipennis была проведена in situ гибридизация районспецифичного зонда прицентромерного района хромосомы 2L An. beklemishevi на хромосомы питающих клеток яичников An.

beklemishevi, An. messeae, An. atroparvus.

Рис. 2 Микрофотография хромосомы 2L An. beklemishevi.

Примечание – Квадратами ограничены участки прикрепления хромосмы 2L к ядерной оболочке, подвергшиеся микродиссекции;

масштабная шкала 10 m.

Следует отметить, что у трех изучаемых видов хромосомы трофоцитов яичников не объединены в один хромоцентр и есть различия по характеру прикрепления хромосомы 2. Так, у An. beklemishevi хромосома 2 в области прицентромерного гетерохроматина образует облигатный контакт с оболочкой ядра, у An. messeae хромосома вообще не образует контактов с ядерной оболочкой, а у An. atroparvus обнаруживается внутривидовая изменчивость морфологии данного района с образованием факультативных связей хромосома – ядерная оболочка (Стегний, 1993).

Особенности хромосомной локализации районспецифичного ДНК-зонда Abekl2L из ПГ хромосомы 2L An. beklemishevi на beklemishevi оценивали в сравнении с результатами гибридизации районспецифичного зонда Atr2R (Грушко, и др., 2004).

небольшом участке проксимальной области прицентромерного района 5ab хромосомы XL (рисунок 3). В хромосоме 2L метка Abekl2L включилась в область прикрепления к оболочке ядра (район 15d, из которого была взят образец для зонда), при этом видны ярко светящиеся тяжи (рисунок 3). В прицентромерном участке хромосомы 2R (район 14с) также можно наблюдать меченые тяжи ДНК прикрепления к ядерной оболочке, но менее яркие, чем у смежного участка хромосомы 2 L. В хромосоме 3R, гомологичные зонду последовательности, локализованы в районе расхождения гомологов 33c, разделенных участком, где сигнал отсутствует (рисунок 3).

Ранее, в работе с фрагментом ПГ 2 R An. atroparvus, у An.

beklemishevi хромосомы XL не была определена (Грушко и др., 2004).

Так же, не было обнаружено локализации флуоресцентной метки на хромосоме 2L (рисунок 4), но в участках прикрепления хромосомы 2R мечение имело место с характерными тяжами прикрепления к ядерной оболочке. Хромосома 3 была тоже помечена, но гомологичные последовательности были включены как в -, так и в -гетерохроматин (Грушко и др., 2004).

Рис. 3 Флуоресцентная in situ гибридизация районспецифичного яичников малярийных комаров An. beklemishevi.

Примечание – 2L, 2R, 3R, 3L, XL – политенные хромосомы; 5ab, 14c, 15d, 32cd и 33abc – локализации зонда; масштабная шкала Хромосома 2L An. messeae пометилась в прицентромерном районе 15d (мечение наблюдается только в районе -гетерохроматина).

Рис. 4 Флуоресцентная in situ гибридизация районспецифичного яичников малярийных комаров An. beklemishevi (Грушко и др., 2004).

Примечание – 2L, 2R, 3R, 3L, X – политенные хромосомы;

стрелками указаны районы локализации зонда; масштабная шкала 20 m.

прицентромерной области, район 32 cd и более диффузно, в хромосоме 3L (район 33c) (рисунок 5). Отсутствие метки наблюдается на участках с -гетерохроматином прицентромерого участка и в других районах хромосомы 3 R.

Рис. 5 Флуоресцентная in situ гибридизация районспецифичного яичников малярийных комаров An. messeae.

Примечание – 2L, 2R, 3R, 3L, XL – политенные хромосомы; 5ab, 15d, 32cd и 33ab – локализации ДНК-зонда; масштабная шкала Ранее, при гибридизации ДНК-зонда Atr2R с политенными хромосомами An. messeae наблюдалось мечение ПГ хромосомы XL.

Хромосома 2 обнаруживала сигнал в районах и - и гетерохроматина прицентромерного района обоих плеч, а уровень сигнала был высоким. Гомологичные последовательности были обнаружены в блочном как -, так и -гетерохроматине хромосомы 3 (рисунок 6) (Грушко и др., 2004).

Рис. 6 Флуоресцентная in situ гибридизация районспецифичного яичников малярийных комаров An. messeae (Грушко и др., 2004).

Примечание – 2L, 2R, 3R, 3L, X – политенные хромосомы;

стрелками указаны районы локализации зонда; масштабная шкал а 20 m.

последовательности, гомологичные ДНК -последовательностям ПГ локализованны в районе 5ab (рисунок 7), который у данного вида в трофоцитах яичников всегда п рикреплн к ядерной оболочке. На хромосоме 2 сигнал расположен в прицентромерном районе обоих плеч – 15d плеча 2L (помечен только -гетерохроматин) и 14c плеча 2R, но в правом плече наблюдается менее интенсивное свечение метки (рисунок 7). На хромосомах An. atroparvus, как и на хромосомах двух предыдущих видов, помечен ПГ хромосомы 3:

районы 32a-c хромосомы 3R и 33cd 3хромосомы L (рисунок 7).

Рис. 7 Флуоресцентная in situ гибридизация районспецифичного яичников малярийных комаров An. atroparvus.

Примечание – 2L, 2R, 3R, 3L, XL – политенные хромосомы; 5ab, 14с15d, 32cd и 33abс – локализации зонда; масштабная шкала В работе с районспецифичным ДНК-зондом Atr2R (Грушко и др., 2004) наблюдалось мечение ПГ хромосомы XL An. atroparvus – района интеркалярного гетерохроматина 2 b. На хромосомах An.

atroparvus прицентромерного района обоих плеч второй хромосомы, так же, как и у An. messeae. Уровень сигнала на хромосоме 2 An.

atroparvus был высоким (Грушко и др., 2004). ПГ хромосомы 3 An.

atroparvus так же включал в свой состав последовательности, гомологичные ДНК-зонду Atr2R, заключенные в блочном - и гетерохроматине (рисунок 8) (Грушко и др., 2004).

Рис. 8 Флуоресцентная in situ гибридизация районспецифичного яичников малярийных комаров An. atroparvus (Грушко и др., 2004).

Примечание – 2L, 2R, 3R, 3L, X – политенные хромосомы;

стрелками указаны районы локализации зонда; масштабная шкала 20 m.

Таким образом, в ранее проведенных исследованиях с ДНК пробой Atr2R, гомология обнаруживалась со всеми хромосомами, независимо от их отношения к ядерной оболочке. Причем, левое плечо хромосомы 2 An. beklemishevi, которое облигатно крепится к оболочке ядра, не гибридизовалось с мечным зонодом. Не обнаружено сигнала и в районе 2bс прикрепления XL хромосомы An. messeae.

В наших исследованиях с ДНК-зондом Abekl2L на хромосомах An. beklemishevi и An. atroparvus зонд гибридизовался во все прицентромерные районы. На хромосомах вида An. messeae сигнал присутстввал в во всех прицентромерных районах, но отсутствовал в блоках прицентромерного -гетерохроматина хромосом 2 и 3.

присутствуют во всех хромосомах исследуемых видо комплекса последовательности, гомологичные последовательностям района прикрепления хромосомы 2L An. beklemishevi.

«жесткого» крепления к ядерной оболочке) и зонда из ПГ левого прикрепления, с районом прикрепления XL хромосомы к оболочке ядра An. messeae говорит о наличии в этом районе отличного состава ДНК ПГ от такового в исследуемых зондах Atr2R и Abekl2L.

помеченными прицентромерные области всех хромосом. Кроме того, гомология была обнаружена с множеств ом интеркалярных районов хромосомы 2 и хромосомы 3. Блоки -гетерохроматина также обнаруживали метку (Стегний и др., 2007).

Табл. 2 Особенности флуоресцентной in situ гибридизации нуклеотидных последовательностей т.ф. Abekl2L и т.ф.Atr2R An. beklemishevi, An.antroparvus и An. messeae * район 2bc – сигнал отсутствует микродиссектированного района прикрепления хромосомы XL An.

Atroparvus (5ab) на хромосомы изучаемых видов Anopheles были близкородственных ему видов An. messeae и An. beklemishevi (Артемов, 2009).

У трех изучаемых видов различается характер прикрепления хромосомы 2. Так, у An. beklemishevi хромосома 2 в области прицентромерного гетерохроматина образует облигатный контакт с оболочкой ядра, у An. messeae хромосома вообще не образует контактов с ядерной оболочкой, а у An. atroparvus обнаруживается оболочка. Исходя из этих различий, можно предположить, что расположение хромосом в ядре и их взаимоотношение с ядерной последовательностями, так как не все области прикрепления имеют одинаковую первичную структуру.

хромосомы 2L An. beklemishevi (Abekl2L) на хромосомах видов D.

melanogaster, D. erecta, D. teissieri Среди Drosophila подгруппы melanogaster так же, как и у морфологические типы организации хромосом по отношению к ядерной оболочке в пространстве ядер трофоцитов (Стегний, 1993) Представлялось интересным выяснить, имеют ли политенные подгруппы melanogaster последовательности ДНК, гомологичные последовательностям из района прикрепления 2 L к оболочке ядра An. beklemishevi, последовательностей. У D. melanogaster хромосомы разобщены и прицентромерным контактируют с оболочкой ядра, у D. erecta прикрепляются к ядерной оболоке. У D. teissieri хромосомы, визуально необъединены в хромоцентр, плечи хромосом 2 и 3 не контактируют с облочкой ядра (Стегний, 1993). В связи с этим, хромосомах трофоцитов данных видов.

Была проведена флуоресцентная in situ гибридизация ДНК из прицентромерного района хромосомного плеча 2 L An. beklemishevi с политенными хромосомами трофоцитов D. melanogaster, D.

erecta, Drosophila teissieri Tsacas. В результате, у всех трех видов последовательностям районоспецифичной ДНК из хромосомного прицентромерных районах хромосом. Так у D. melanogaster пометились прицентромерные районы всех хромосом (рисунок 11).

Интенсивность сигнала в прицентромерном районе хромосомного плеча 3R была значительно ниже, чем в прицентромерном районе хромосомного плеча 3L (рисунок 11). Интенсивность сигнала в прицентромерном районе хромосомного плеча 2 L заметно не отличалась от таковой в 2R (рисунок 11).

Рис. 11 Флуоресцентная in situ гибридизация районспецифичного ДНК-зонда Abekl2L на политенных хромосомах трофоцитов D.

melanogaster.

Примечание – 2L, 2R, 3R, 3L, XL – политенные хромосомы; с – центромерные районы; масштабная шкала 5 m.

прицентромерном районе одного из плеч хромосомы 2 (рисунок 12). Прицентромерные районы хромосомного плеча XL и одного из гомологичных последовательностям районоспецифичной ДНК An.

beklemishevi (рисунок 12).

Рис. 12 Флуоресцентная in situ гибридизация районспецифичного ДНК-зонда Abekl2L на политенных хромосомах трофо цитов D.

erecta.

центромерные районы; масштабная шкала 5 m.

У D. teissieri пометились прицентромерные районы всех хромосом (рисунок 13). Интенсивность сигнала была наиболее высокой в прицентромерном районе хромосомы 3, а наименьшей в хромосомном плече XL (рисунок 13).

Рис. 13 Флуоресцентная in situ гибридизация районспецифичного ДНК-зонда Abekl2L на политенных хромосомах трофоцитов D.

teissieri.

центромерные районы; масштабная шкала 5 m.

последовательности, гомологичные ДНК т.ф. Abekl2L обнаружены у всех трех видов Drosophila (рис. 3). Необходимо отметить, что у D. melanogaster был выявлен наиболее интенсивный сигнал в ПГ всех хромосом, который является РП. Что говорит о сходстве нуклеотидного состава РП хромосомы 2 L An. beklemishevi и РП последовательностями являются разнообразные повторы ДНК.

Кроме того, интенсивность сигнала в прицентромерных районах разных хромосом у D. melanogaster, D. erecta, D. teissieri была неодинаковой. Это может быть связано как с различиями в гомологичных последовательностей из РП хромосомы 2L An.

beklemishevi на исследуемых хромосомах D. melanogaster, D.

erecta, D. Teissieri, или и тем и другим.

3.1.3. Характеристика последовательностей ДНК минибиблиотеки Abekl2L.

Клонирование ДНК прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2L An. beklemishevi хромосомы 2L An. beklemishevi из части микродиссектированного материала ДНК участка 15d ПГ хромосомы 2L An. beklemishevi послужила матрицей в полимеразной цепной реакции с частично вырожденным праймером (DOP-праймером). Полученная смесь состояла из амплифицированных фрагментов длиной от 150 до п.н. (Рисунок 9). При помощи метода микродиссекции был вырезан (наблюдаемое у этого вида постоянно) прикрепление к ядерной оболочке. Далее фрагменты клонировали в плазмидном ТОРОвекторе и получили набор отдельных клонов ДНК, рекомбинантных вставок путем переваривания рестриктазой EcoR I с последующим электрофорезом в агарозном геле.

Определение первичной последовательности и анализ фрагментов минибиблиотеки Abekl2L Первичная последовательность ДНК была определена у фрагментов длиной до 500 п.н. Общая длина просеквенированных последовательностей составила 46921 п.н.

фрагмента прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 L An.

beklemishevi в 1% агарозном геле.

Примечание – 1 – маркер молекулярного веса 1 Kb; 2– продукт DOP-ПЦР.

Всего было получено 232 плазмидных клона (рисунок 10).

обработанных рестриктазой EcoR I.

Часть подобных между собой фрагментов была сгруппирована длинной 10824 п.н. Анализ последовательностей проводили с использованием различных электронных баз данных.

гомологичных последовательностей между ее фрагментами и фрагментами библиотеки Atr2R из хромосомы 2R An. atroparvus и района прикрепления хромосомы XL An. messeae последовательность фрагментов библиотеки Аbekl2L на первом этапе, было решено сравнить их с последовательностями ранее полученных библиотек из ДНК ПГ хромосомы 2 R An. atroparvus и ДНК РП хромосомы XL An. messeae (Артемов, 2010). Мы сравнили последовательности минибиблиотек методом п оиска гомологии, который подтвердил наше предположение о высокой специфичности участка ПГ хромосомы 2 L An. beklemishevi. В результате поиска были найдены только две пары клонов – Аbekl2L-37 и Atr2R-70, Аbekl2L-135 и Atr2R-133 с высокой степенью гомологии (80 % – 90 %)(таблица 2) и один клон Аbekl2L-46 проявил высокую гомологию с двумя клонами Ме s2bcи Меs2bc-426 (70%). Это может говорить о специфичности данного участка хромосомы 2L An. beklemishevi внутри комплекса.

Далее, клонированные фрагменты были пр оверены на гомологию с геномами других Diptera.

последовательностей библиотек Abekl2L и Atr2R.

>Abekl2L- vs atrparvus.lib library searching atrparvus.lib library 23769 residues in 99 sequences Expectation_n fit: rho(ln(x))= 8.1153+/-0.0448; mu= 8.4736+/- 2. mean_var=55.2384+/-16.991, 0's: 0 Z-trim: 1 B-trim: 0 in 0/ Lambda= 0. Kolmogorov-Smirnov statistic: 0.0616 (N=22) at FASTA (3.45an0 Mar 2002) function [optimized, +5/-4 matrix (5:-4)] ktup: join: 62, opt: 47, open/ext:

-15/-3, width: Scan time: 0. rev-comp initn: 923 init1: 535 opt: 929 Z-score: 1221.3 bits: 234.2 E():

1.6e- Smith-Waterman score: 929; 93.868% identity (94.313% ungapped) in 212 nt overlap (217-7:158-369)

Abekl- AATCCCAAAAAGTAGGATGCGGAATTTATT

Atr2R- ACCACCAGATCTTCACAGATGGCTCAGTTCAACTCAAAAAAGTAGGATGCGGAATCTATT

Abekl- CTAGTTCTTCATCCTGCAGTATATAACTCAATAATAACCTATCTATTTATTCAGCAGAAG

::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::: ::::::::::

Atr2R- CTAGTTCTTCATCCTGCAGTATAAAACTCAATAATAACCTATCTATTTACTCAGCAGAAG

Abekl- CACTCGCACTAGCAATAGCAGCCGACGAGGCC-ACAACAGCGAACACACCAAATGTTATT

:: :: :::::::::::::::::::::::::: :::::::: ::::::::::::::::::

Atr2R- CATTCTCACTAGCAATAGCAGCCGACGAGGCCGACAACAGCAAACACACCAAATGTTATT

Abekl- TTCACAGATTCCGCCAGCGCACTAGAAGCCCTGGAGGCAGGCAAATCCAAGCACCCCCAC

:::::::::::::::::::::::::::::::::::: : :::::::::::::::::: ::

Atr2R- TTCACAGATTCCGCCAGCGCACTAGAAGCCCTGGAGACTGGCAAATCCAAGCACCCCTAC

Abekl- ATGTCCCA

Atr2R- ATACAAGCTATAGACGAACACATTCTATCAAGGAAAATCTCCTTCTGCTGGATCCCCAGC

Поиск гомологичных последовательностей библиотеки Abekl2L с базами данных различных геномов Diptera Поиск последовательностей, гомологичных фрагментам ДНК библиотеки Abekl2L, выявил ряд значимых гомологий (более 60%) с последовательностями из геномов Anopheles gambiae Giles (Culicidae, Diptera) (таблица 3), Aedes aegypti Linnaeus (Culicidae, Diptera) (таблица 4) и D. melanogaster Meigen (Drosophilidae, Diptera) (таблица 5).

Табл. 3 Нуклеотидные последовательности, гомологичные фрагментам библиотеки Abekl2L в геноме An. gambiae.

Примечание – Score – значение, вычисляемое из числа брешей и замен в сравниваемых нуклеотидных последовательностях.

SmallestSum ProbabilityP(N) – наименьшая суммарная вероятнсть сходства сравниваемых нуклеотидных последовательностей Табл. 4 Нуклеотидные последовательности, гомологичные фрагментам библиотеки Abekl2L в геноме Ae. Aegypti.

Abekl2L-209 388 supercontl.577 AaegLl :supercontl.577:1:756046:1 88 Примечание – Score – значение, вычисляемое из числа брешей и замен в сравниваемых нуклеотидных последовательностях.

SmallestSum ProbabilityP(N) – наименьшая суммарная вероятнсть сходства сравниваемых нуклеотидных последовательностей Табл. 5 Нуклеотидные последовательности, гомологичные фрагментам библиотеки Abekl2L в геноме D. melanogaster.

Примечание – Score – значение, вычисляемое из числа брешей и замен в сравниваемых нуклеотидных последовательностях.

SmallestSum ProbabilityP(N) – наименьшая суммарная вероятнсть сходства сравниваемых нуклеотидных последовательностей Гомология нуклеотидных последовательностей библиотеки Abekl2L с последовательностями генома Anopheles последовательностями исследуемого района и аннотированными геномами малярийных комаров позволяет оценить качественный последовательностей выполняли с помощью пакетов программ BLAST, FASTA, DNASTAR (DNASTAR Inc.). Поиск гомологичных последовательностей проводился по базам данных нуклеотидных последовательностей на BLAST-сервере NCBI NIH. В результате был обнаружен ряд последовательностей значимо гомологичных с геномом An. gambiae (Abekl2L-211, Abekl2L -l37, Abekl2L -138, Abekl2L -150, Abekl2L - 45(2), Abekl2L -48). Клон Abekl2L- (AgamP3:3R:53200684:1) и с последовательностью интрона mRNA BX029300 (1AgamP3:3L:l:41963435:l). Клон Abekl2L -48 проявляет сходство с несколькими LTR. Остальные последовательности последовательности в геноме Ae. аegypti. Значимые гомологии с неизвестными последовательностями генома Ae. аegypti проявили клоны Abekl2L-137, Abekl2L-133, Abekl2L-215, Abekl2L-209, микросателлитный тракт (СААААА) n.

Гомология ДНК-фрагментов библиотеки Abekl2L с ДНК видов изучаемого участка ДНК к семейству Culicidae отряда Diptera.

Abekl2L с геномом Drosophila Ряд нуклеотидных последовательностей библиотеки Abekl2L обнаружили значимую гомологию с геномом D. melanogaster. Клон Abekl2L -125 и Abekl2L -171 гомологичны фрагменту Gypsy12_I, класса LTR семейства Gypsy, клон Abekl2L - 114 гомологичен МГЭ FB_4DM семейства TC1, клоны Abekl2L - 39 и Abekl2L - оказались гомологичными с последовательностью неизвестной локализации. Клон Abekl2L- 93 проявил гомологию с районом интрона гена DOP 2R, Abekl2L-130 – гомологию с интронным участком гена дрозофилы chico, который является инсулиновым рецептором, принимающим участие в контроле пролиферации и развития клеток, а также в контроле сигнальных путей. Abekl2L гомологичен экзону и последовательности 3' -UTR белок кодирующего гена D. melanogaster CG4609-RD. Фрагмент Abekl2L - 67 показывает сходство с геном nahoda transcript (nahoda) и mRNA, NM_ tyrosine kinase CG1511-RC D. melanogaster, фрагмент Abekl2L - гомологичен гену AY070948 D. melanogaster RE04191 full length cDNA, который кодирует NADH dehydrogenase subunit 4.

последовательностями An. gambiae, Ae. aegypti и D. melanogaster говорит о том, что они являются осколками LTRретротранспозонов и LINE-элементов, гомологичных генов из генома D. melanogaster, а так же о присутствии в ПГ (районе прикрепления) хромосомы 2L An. beklemishevi данных классов последовательностей. Молекулярный состав ПГ характеризуется прочих классов последовательностей. У An. gambiae среди всех ретротранспозонов (Tu, Coates, 2003). Предполагается, что обилие gypsy-подобных ретротранспозонов обусловливает способность ПГ (Gerasimova, 2000). Известно, что ПГ видов D. melanogaster и An.

gambiae контакты с ядерной оболочкой у D. melanogaster (Стегний, (Sharakhov, 2002).

прицентромерного гетерохроматина к прикреплениям к оболочке зависит от присутствия в нм определенного количества встроек gypsy-подобных LTR-ретротранспозонов.

Фрагменты минибиблиотеки проверили на наличие повторов более подробно методом компьютерного анализа. Как оказалось, мобильным элементам. Были найдены такие мобильные элементы генома класса LINE семейства L1, как L1M4c, L1M4, L1PB, L1P1.

Класса SINE семейства MIR мобильный элемент MIRb и семейства Alu мобильный элемент AluSp. Также были обнаружены LTRретротранспозоны семейства ERV1 – LTR71в и LTR23. Семейство Gypsy представлено последовательностью клона Abekl2L - melanogaster.

Анализ последовательностей на наличие тандемных повторов Тандемные повторы — один из первых изученных классов ДНК. Они устроены из простых, относительно небольших последовательностей, уложенных тандемно — «голова к голове».

К тандемным повторам относятся теломерные и сателлитные ДНК.

Сателлитные ДНК, в отличие от теломерных, очень вариабельны и видоспецифичны.

При помощи методов биоинформатики н ами были выявлены следующие тандемные повторы (таблица 6): Abekl2L-45 (простой повтор ТТGTG), несколько сателлитов, например, фрагмент Abekl2L-41 содержит микросателлит (ТААААА2), Abekl2L-64, Abekl2L- Фрагменты Abekl2L-212, Abekl2L-33 фрагменты с вырожденным микросателлитным трактом (ТАСАА).

Тандемные повторы играют важную роль в геноме. Известно, что кроме видоспецифичности сатДНК внутри вида могут иметь хромосомоспецифичный характер. Такая ДНК территориально фиксирована на хромосоме и, возможно, участвует в определении положения хромосомы в пространстве (взаимное расположение между хромосомами) (Кузнецова и др., 2002; Cremer, 2006).

Существует версия, что именно тандемные повторы, посредством числа копий влияют на процессы в геноме. Гены, кодирующие белки, которые для этого очень консервативны и не могут обеспечить всех межвидовых и индивидуальных различий между особями одного вида. В то же время, однозначно, тандемные повторы являются важной структурно -функциональной частью генома, так как связываются с белками ламина на переферии ядра, регулируя, тем самым, экспрессию генов.

Табл. 6 Результаты поиска повторенных последовательностей в программе «Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences».

Sequence: p212bekl Parameters: 2 7 7 80 10 Length: Tables: This is table 1 of 1 ( 1 repeats found ) Click on indices to view alignment Sequence: pAbekl183F Parameters: 2 7 7 80 10 Length: Tables: This is table 1 of 1 ( 1 repeats found ) Click on indices to view alignment Sequence: pAbekl64F Parameters: 2 7 7 80 10 Length: Tables: This is table 1 of 1 ( 1 repeats found ) Click on indices to view alignment 3.2 Классификация РП хромосомы 2L An. beklemishevi по программе ChrClass.

хроматина в ядре основаны на взаимодействии хром атина с белками внутриядерного матрикса и ядерной оболочки. Очевидно, последовательностями ДНК, которые опосредованно через белки пространстве. Поскольку в местах контактов хромосом с ядерной оболочкой были обнаружены гетерохроматиновые блоки, можно говорить о том, что связи гетерохроматина с ядерной оболочкой важны для пространственного упорядочения отдельных хромосом и интерфазного ядра в целом (Paddy et al., 1990; Belmont et al., 1993; Стегний, 1993; Marshall et al., 1886; Sage et al., 2003).

Анализ последовательностей на присутствие SAR/MARs ДНК классифицировать фрагменты (области) хромосомной ДНК по их Association Region), структур (рсДНК) («структурные» участки хромосомной ДНК) (Glasko et al., 2001). Районы прикрепления хромосом к ядерной хромосомных участков MAR/SAR (Gasser, Laemmli, 1987). Так как фрагменты ДНК библиотеки Abekl2L принадлежат к РП хромосом к ядерной оболочке, было интересно выявить отношение хромосомной ДНК (Таблица 7, 8).

Ранее было установлено, что порядка 80 – 90 % изученных фрагментов ДНК минибиблиотеки из района прицентромерного хромосомы и XL An. messeae классифицируются как те или иные «структурные» участки хромосом. У An. atroparvus в большем количестве представлены последовательно сти ДНК, относящиеся к скДНК – 59 %, однако, выявляются и последовательности ДНК, фрагментов (Грушко и др., 2004).

Табл. 7 Сравнительный анализ представленности «структурных»

участков в составе РП хромосомы 2L An. beklemishevi, 2R An.

atroparvus и XL An. messeae (по программе ChrClass).

Таким образом, несмотря на отсутствие прочного крепления изучаемого района прицентромерного гетерохроматина к оболочке ядра в трофоцитах яичников у An. atroparvus, в его составе присутствуют потенциальные «структурные» участки хромосом.

Следовательно, одного наличия подобных последовательностей хромосомы с ядерной оболочкой. У An. messeae 19% фрагментов относятся к MAR/SAR, 21% – к ялДНК, 16% – скДНК и 37 % – последовательностей библиотеки Abekl2L на принадлежность к ChrClass было выяснено, что ими обладают 90 % исследуемых фрагментов, из них 37 % относятся к MAR/SAR, 28 % – к ялДНК, 22 % – скДНК, 13 % – срДНК.

beklemishevi среди различных классов «структурных» участков хромосомной ДНК.

Abekl2L-117 Abekl2L- Abekl2L-118 Abekl2L- Abekl2L- Abekl2L- Abekl2L- Abekl2L- «структурных» участков хромосом. У An. beklemishevi наиболее представлен класс MAR/SAR – 37 %, у An. atroparvus скДНК – %, у An. messeae срДНК – 37 %, к тому же участок РП хромосомы 2 R An. atroparvus эволюционно исходного вида отличается по морфологи взаимодействия с ядерной оболочкой (не имеет прочного крепления) от РП хромосомы 2 L вида An. beklemishevi и РП хромосомы и XL An. messeae, имеющих «жесткое» крепление к ядерной оболочке. Что может говорить о взаимосвязи между морфологическим типом отношения хромосом к ядерной оболочке и паттерном нуклеотидных последовательностей РП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

прикрепления хромосомы 2L An. beklemishevi к ядерной оболочке результаты поиска гомологии с использованием компьютерных баз геномов Diptera. Гомологичные последовательности фрагментов ДНК района прикрепления хромосомы 2 L An. beklemishevi к ядерной оболочке были найдены с геномом An. gambiae, Ae.

aegypti, и D. melanogaster.

В ДНК района прикрепления хромосомы 2 L An. beklemishevi методом биоинформатики были обнаружены мобильные элементы, тандемные и сателлитные повторы, а также последовательности, геномах An. gambiae, Ae. aegypti и D. melanogaster.

Показано, что состав ДНК РП к ядерной оболочке хромосомы 2 L An. beklemishevi характеризуется частичным сходством с составом ДНК РП всех районов прикрепления хромосом у An. atroparvus, An. messeae, и района прикрепления хромосомы XL у An. messeae.

хромосомы 2L An. beklemishevi и РП хромосомы XL An. messeae обладают какими-то уникальными последовательностями, которые обеспечивают характерный морфологический тип организации гомологичные последовательности фрагментов РП хромосомы 2 L An. beklemishevi были найдены в геномах других Diptera но они не являются РП этих видов. Тем не менее, молекулярный состав ДНК единичные случаи гомологии при сравнении последовательности минибиблиотек из прицентромерного района хромосомы 2 R An.

atroparvus, района прикрепления 2b-c хромосомы An. messeae и особенностями взаимодействия хромосом с ядерной оболочкой.

Интересно, что РП к ядерной оболочке хромосомы 2 L An.

beklemishevi обнаружил сходство со всеми прицентромерными melanogaster с различным морфологическим типом организации хромосом по отношению к ядерной оболочке D. melanogaster, D.

erecta, D. Teissieri. Но необходимо отметить, что у D. melanogaster был выявлен наиболее интенсивный сигнал in-situ гибридмзации.

(представленностью) гомологичных последовательностей, так и последовательностей в библиотеке Abekl2L с РП хромосом D.

melanogaster, или же – и тем и другим.

При анализе последовательностей библиотеки Abekl2L на принадлежность к «структурным» участкам хромосом, с помощью программы ChrClass было выяснено, что к ним относятся 90 % исследуемых фрагментов, из них 37 % –MAR/SAR, 28 % – к ялДНК, 22 % – скДНК, 13 % – срДНК. Интересно, что при сравнении по этому же критерию участков ПГ 2R An. atroparvus, и РП хромосомы и XL An. messeae классифицируются как те или исследуемых фрагментов. Однако представленность разных типов «структурных» участков хромосом в РП у всех трех видов различна. Это можно обьяснить как тем, что исследуемые РП принадлежат к разным хромосомам.

универсальными последовательностями ДНК в РП. Но возможно определяется сложными сочетаниями определенного числа копий композициями нуклеотидных последовательностей РП.

ВЫВОДЫ

хромосомы 2L к ядерной оболочке трофоцитов яичниов An.

beklemishevi, которые затем использовали для анализа первичной структуры ДНК района прикрепления.

Локализованы нуклеотидные последовательности из РП к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi, на хромосомах видов Diptera. Гомологичные нуклеотидные последовательности прикрепления хромосомы XL у An. messeae.

типом отношения хромосом к ядерной оболочке и паттерном нуклеотидных последовательностей РП.

Показано, что ДНК района прикрепления хромосомы 2 L An.