ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ БИОХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. Н.М. ЭМАНУЭЛЯ

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ВОРОБЬЕВА АНАСТАСИЯ КОНСТАНТИНОВНА

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЭФИРНЫХ МАСЕЛ

ОРЕГАНО И ЧАБЕРА В ОПЫТАХ IN VIVO

03.01.02 Биофизика

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

д.б.н., проф. Бурлакова Е.Б.

Москва

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список использованных сокращений ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Роль растительных антиоксидантов в профилактике заболеваний, вызванных окислительным стрессом ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Объекты исследования 2.1.1. Характеристика эфирных масел чабера и орегано 2.1.2. Характеристика экспериментальных животных 2.2. Дизайн экспериментов 2.3. Методы исследования 2.3.1. Спектрофотометрический метод 2.3.2. Метод газо-жидкостной хроматографии и хромато-масс спектрометрии 2.3.3. Исследование биологической активности эфирного масла орегано на культуре клеток китайского хомячка

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение биологической активности эфирного масла орегано 3.1.1. Влияние эфирного масла орегано на продолжительность жизни здоровых мышей линии Balb/с 3.1.2. Исследование действия эфирного масла орегано in vitro 3.1.3. Влияние эфирного масла орегано на состояние иммунокомпетентных органов мышей Balb/с 3.1.4. Влияние эфирного масла орегано на физико-химические характеристики эритроцитов мышей Balb/с с увеличением возраста 3.1.5. Возрастные изменения состава жирных кислот, показателей ПОЛ и активности антиоксидантных ферментов в печени мышей Balb/с и влияние эфирного масла орегано на эти параметры 3.1.6. Возрастные изменения в составе жирных кислот липидов в мозге мышей линии Balb/c и влияние эфирного масла орегано на эти параметры 3.2. Влияние эфирного масла орегано на прививаемость и развитие карциномы Льюис, на параметры ПОЛ в эритроцитах, печени и мозге мышей-гибридов F DBAС57 Black 3.3. Влияние эфирного масла чабера на продолжительность жизни и биохимические характеристики тканей и органов мышей линии AKR со спонтанным лейкозом 3.3.1. Влияние приема эфирного масла чабера на продолжительность жизни мышей и развитие спонтанного лейкоза 3.3.2. Влияние приема эфирного масла чабера на физико-химические характеристики эритроцитов 3.3.3. Влияние приема эфирного масла чабера на состав жирных кислот в органах мышей ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

АО – антиоксидант ГЖХ – газожидкостная хроматография ГП – глутатион-пероксидаза ГР – глутатионредуктаза ГТ – глутатион-S-трансфераза ДГК – докозагексаеновая кислота ДМСИ – Дюльбекко модифицированная среда Игла – питательная среда для культивирования клеток ЖК – жирная кислота МНЖК – мононенасыщенные жирные кислоты НЖК – насыщенные жирные кислоты ПНЖК – полиненасыщенные жирные кислоты ПОЛ – перекисное окисление липидов СОД – супероксиддисмутаза СПЖ – средняя продолжительность жизни ТБК-АП – активные продукты окисления, реагирующие с тиобарбитуровоой кислотой ЭКО – эффективность колониеобразования ЭМ – эфирное масло

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы Для повышения антиоксидантного статуса организма широко используются синтетические антиоксиданты, в том числе являющиеся аналогами природных молекул [1]. Ряд эффективных и нетоксичных антиоксидантов (АО), в основном производных экранированных фенолов и оксипроизводных азотистых гетероциклов, были синтезированы в ИХФ РАН. Для этих АО были проведены широкие исследования антиканцерогенного действия АО и закономерностей их влияния на опухолевые процессы [2–4]. Эмануэлем Н.М. и Франкфурт О.С.

в 1967 г. было обнаружено антиканцерогенное действие АО дибутилокситолуола [5].

Биологическое действие АО основано на их способности нейтрализовать свободные радикалы, а также влиять на пути передачи клеточных сигналов. Показано, что антиоксиданты нормализуют регуляцию клеточного цикла, предотвращают распространение опухоли и ангиогенез, подавляют воспаление, стимулируют активность ферментов детоксификации ксенобиотиков и, таким образом, препятствуют канцерогенезу [6].

В ИХФ РАН более полувека назад было проведено кинетическое изучение модельных реакций старения и показана перспективность АО в качестве геропротекторов [7]. В последние годы особое внимание ученые всего мира уделяют поиску новых природных антиоксидантов, которые, в отличие от синтетических, практически не имеют побочных эффектов, при этом они обладают комплексом различных видов биологической активности. Особый интерес представляет изучение таких природных соединений, как эфирные масла (ЭМ), которые ответственны за фармакологические свойства многих лекарственных растений. Их благотворное действие на организм людей проявляется и при вдыхании воздуха, содержащего малые количества ЭМ. Отмечено, что в ряде стран Средиземноморья, Кавказа проживает самое большое число долгожителей. В жаркое время года в воздухе этих регионов содержатся летучие компоненты пряных трав (тимьяна, орегано, чабера, чабреца, лаванды, розмарина и других), которые постоянно попадают в организм живущих там людей. Кроме того, пряная зелень является обязательным компонентом питания и, безусловно, вносит положительный вклад в сохранение здоровья населения этих регионов. Вполне вероятно, что именно постоянное употребление малых доз летучих АО является одним из факторов, отвечающих за долгую и здоровую жизнь этих людей. Однако исследований по этой проблеме не проводилось.

В последние годы активно изучается противопаразитарная, фунгицидная, анальгетическая, противовоспалительная, антирадикальная, антиоксидантная и противораковая активность ЭМ, при этом большая часть исследований выполнена в модельных экспериментах на культурах клеток in vitro [8]. К сожалению, работ с лабораторными животными in vivo практически нет, так же как нет данных о влиянии на организм и на продолжительность жизни долгосрочного приема ЭМ. Поэтому изучение действия ЭМ на физиологические и биохимические процессы in vivo на различных этапах жизни от рождения до старости лабораторных животных является важной и актуальной задачей.

Цель и задачи исследования Целью работы являлось изучение влияния длительного систематического приема эфирных масел в малых дозах на физиологические и биохимические характеристики организма мышей в норме и при патологии.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать действие систематического приема эфирного масла орегано в малых дозах на протяжении всей жизни здоровыми мышами линии Balb/с на следующие показатели:

продолжительность жизни животных, степень гемолиза и содержание продуктов ПОЛ в эритроцитах мышей, активность АО ферментов в клетках печени и жирнокислотный (ЖК) состав печени и мозга мышей.

2. Изучить действие эфирного масла орегано в малой дозе на прививаемость, размеры солидной опухоли карциномы Льюис и параметры ПОЛ у мышей-гибридов F1 DBA C57 Black.

3. Исследовать влияние систематического приема эфирного масла чабера в малой дозе на продолжительность жизни, развитие спонтанного лейкоза и параметры ПОЛ у мышей высокораковой линии AKR.

Научная новизна Впервые в экспериментах in vivo установлено, что систематический прием эфирных масел в малых дозах на протяжении всей жизни здоровыми мышами линии Balb/c оказывал геропротекторное действие: средняя продолжительность жизни животных увеличивались на 120 дней (на 17% больше, чем в контроле). Такое действие основано на наличии у ЭМ орегано антибактериальной, противовоспалительной, противопаразитарной и противоопухолевой активности [9], а также биоантиоксидантных свойств. Найдено, что ЭМ орегано снижало уровень ПОЛ в органах и тканях мышей, модулировало ферментативную защитную систему печени, повышало антиоксидантный статус организма.

Впервые изучены изменения в составе ЖК в мозге и печени здоровых мышей Balb/c от рождения до старости. Выявлено, что в мозге стареющих животных снижалось содержание насыщенных и полиненасыщенных ЖК и значительно увеличивалось содержание мононенасыщенных ЖК. Прием ЭМ орегано защищал мозг от возрастных изменений, так как существенно улучшал ЖК состав мозга стареющих мышей, обогащая его полиненасыщенными ЖК.

Впервые в опытах in vivo установлена противораковая активность эфирных масел чабера и орегано. Прием ЭМ чабера снижал частоту лейкозов у мышей высокораковой линии AKR, увеличивал среднюю продолжительность их жизни на 47 дней (20%), уменьшал интенсивность окислительного стресса в органах и тканях животных. Прием мышами-гибридами F DBA C57ЭМ орегано в течение 3-х месяцев повышал антиоксидантный статус организма, существенно снижал степень прививаемости (в 1,8 раза) и максимальные размеры солидной опухоли карциномы Льюис (на 30%) у мышей опытных групп.

Практическое значение работы Полученные в работе данные имеют важное практическое значение. Главным результатом является обнаруженная способность ЭМ орегано увеличивать продолжительность жизни здоровых мышей. Установлено, что при старении мышей происходило увеличение интенсивности ПОЛ в различных органах, изменялся состав ЖК в мозге мышей, что влияло на его функциональную активность. Систематический прием ЭМ орегано существенно снижал интенсивность ПОЛ в органах и тканях здоровых мышей, значительно улучшал баланс жирных кислот в мозге стареющих животных, уменьшал количество насыщенных ЖК и обогащал его полезными полиненасыщенными ЖК, уровень которых в процессе старения снижался.

Важнейшим результатом работы является найденная у ЭМ орегано и чабера противораковая активность. Оба ЭМ являются перспективными натуральными профилактическими геропротекторными средствами и их систематический прием в малых дозах может быть эффективен для профилактики различных заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Эфирные масла чабера и орегано при систематическом приеме в течение всей жизни окислительного стресса в органах и тканях здоровых мышей и мышей со спонтанным лейкозом линии AKR.

2. Эфирное масло орегано проявляет свойства геропротектора. Ежедневный прием масла на протяжении всей жизни увеличивает продолжительность жизни мышей и нивелирует ряд изменений, происходящих при старении организма.

Систематический прием ЭМ чабера уменьшает частоту лейкозов и увеличивает среднюю продолжительность жизни мышей АКR, а ЭМ орегано снижает степень прививаемости и максимальные размеры опухоли у мышей-гибридов F1 DBA C57 Black карциномой Льюис.

Апробация работы Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на Моск. Межд.

конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009, 2010, 2011, 2012), 5 Межд. конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине»

(С.-Петербург, 2009, 2012), Национальной научно-практ. конф. с межд. участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2009), VII Всеросс. конф. с молодежной научной школой (Уфа, 2009), IX, X и ХI Ежегодных межд. конф.

«ИБХФ РАН - ВУЗЫ» (Москва, 2009, 2010, 2011), Межд. конф. «Генетика продолжительности жизни и старения» (Сыктывкар, 2010), VI Всеросс. конф. «Химия и технология растительных веществ» (С.-Петербург, 2010), IX Межд. симпозиуме «Биологические механизмы старения»

(Харьков, 2010), VIII Межд. конф. «Биоантиоксидант» (Москва, 2010), III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика – 2010» (Москва, 2010), Первой Росс. конф. по медицинской химии (MedChem Russia-2013) с международным участием (Москва, 2013), Межд. научно-практической конф. «Свободные радикалы и антиоксиданты в химии, биологии и медицине» (Новосибирск, 2013).

Финансовая поддержка работы

Работа выполнена в ИБХФ РАН рамках планов научно-исследовательских работ Института по теме «Природные и синтетические антиоксиданты. Синтез, кинетические характеристики, механизм действия в системах различной степени сложности, синергизм, специфическая активность, прикладные проблемы. Изучение антиоксидантной активности эфирных масел и ароматизаторов», а также при финансовой поддержке ОХНМ Президиума РАН: проект «Исследование биологической активности эфирных масел пряно-ароматических растений» - в 2009-2011 гг. и проект «Исследование антирадикальных и антиоксидантных свойств натуральных эфирных масел и экстрактов пряно-ароматических растений, обладающих физиологической активностью» - в 2012-2014 гг.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 39 работ: 8 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 14 статей в сборниках научных трудов и 17 публикаций в сборниках материалов конференций. Получен патент на изобретение № 2475258 от 20.02.13.

Личный вклад автора.

Экспериментальные данные по изучению влияния эфирных масел на продолжительность жизни животных, результаты биохимических и биофизических опытов, характеризующие состояние ряда систем органов животных, а также цитогеронтологические данные получены автором лично или при его непосредственном участии. Постановка работы, планирование экспериментов, их интерпретация и обобщение результатов проводились совместно с научным руководителем. Анализ данных литературы и написание диссертации проведено автором лично. Материалы диссертации доложены автором в виде устных и стендовых докладов на конференциях, симпозиумах, конгрессах.

Объем и структура диссертации Работа изложена на 136 страницах печатного текста, содержит 22 рисунка и 19 таблиц.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 253 источника.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Роль растительных антиоксидантов в профилактике заболеваний, Практически все жизненные процессы на Земле осуществляются при участии кислорода.

Считается, что около 1,5 – 5% потребляемого кислорода превращается в свободные радикалы активные формы кислорода (АФК), поэтому содержание АФК напрямую зависит от количества вдыхаемого кислорода. Основным местом потребления кислорода внутри клетки является электрон-транспортная цепь митохондрий, и именно в этих органеллах в основном происходит образование эндогенных АФК. Кроме того, АФК и оксид азота являются побочными продуктами ряда метаболических процессов, протекающих в клетке. Активные кислородные метаболиты являются непосредственными участниками множества регуляторных и сигнальных процессов, они контролируют метаболизм глюкозы, эйкозаноидов, изменяют концентрацию внутриклеточного Ca2+, стимулируют рост клеток. Помимо самих АФК, способностью модулировать передачу сигнала обладают и окисленные ими продукты, например, липопероксиды. Кроме того, обладая способностью окислять тиольные группы, АФК влияют на конформацию многих белков. АФК принимают участие в нейтрализации микроорганизмов фагоцитами, способствуют обновлению клеточных мембран [10–12].

АФК обладают повышенной реакционной способностью, поэтому в клетке они легко вступают в реакции окисления практически любых макромолекул с образованием высокотоксичных соединений. Так, при окислении ДНК происходит модификация азотистых оснований, окисление дезоксирибозы, разрыв цепей, образуются поперечные сшивки ДНКбелок. Под действием АФК изменяется работа генов, контролирующих процессы клеточной пролиферации, сигнальной трансдукции, и возникают мутации. Окислительное повреждение ДНК митохондрий провоцирует рак и сопровождает старение [13]. Белки, подвергшиеся действию АФК, теряют функциональную активность, изменяется их растворимость, образуются сшивки с другими макромолекулами. Например, помутнение хрусталика при катаракте по причине образования высокомолекулярных агрегатов в значительной мере обусловлено именно окислительным повреждением белков кристаллинов. Липофусцин, накапливающийся при старении, является продуктом агрегации белков с пероксидами липидов.

Мишенью свободных радикалов в клеточных мембранах являются полиненасыщенные жирные кислоты. Образующиеся пероксиды жирных кислот в липидах нарушают химические и физические свойства мембран: проницаемость, текучесть [14] и, как следствие, изменяют активность и функциональные свойства встроенных в мембрану белков.

Окислительный свободно-радикальный процесс носит цепной характер. По мере его протекания в реакции окисления вовлекаются все новые и новые молекулы, образуются супероксидный анион-радикал, гидропероксидный радикал НО2, гидроксил-радикал НО, пероксид водорода Н2О2, гипохлорная кислота НОСl, пероксинитрит ONOO, ряд липидных радикалов, и, таким образом, пул свободных радикалов увеличивается лавинообразно. Такая неконтролируемая окислительная модификация ключевых биомакромолекул может приводить к необратимым нарушениям их функций, повреждению клеточных структур вплоть до их деструкции. Особое физиологическое состояние клеток, при котором нарушается обратимая регуляция между процессами генерации свободных радикалов (активных форм кислорода и азота) и их утилизацией защитными системами клетки называют окислительным стрессом. Как показали тысячи исследований, окислительный стресс неизменно сопровождает патогенез большинства известных заболеваний, существенно осложняя их течение. Примеры патологий, включающих свободно-радикальную составляющую, приведены в Таблице 1.1 [15].

Таблица 1.1.

Примеры патологий, связанных с действием свободных радикалов Болезни сердечно-сосудистой системы Другие болезни Ишемия, инфаркт миокарда Болезни желудочно-кишечного тракта Сердечная недостаточность Глазные болезни, катаракта Опухолевые процессы Рост злокачественных новообразований Лучевая болезнь Нейродегенеративные заболевания Развитие окислительного стресса и избыток АФК контролируется внутриклеточной антиоксидантной ферментативной системой (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза и др.), а также низко-молекулярными соединениями (витамины Е, С, глутатион восстановленный, флавоноиды, каротиноиды). Снизить количество свободных радикалов позволяет также экзогенное поступление антиоксидантов с пищевыми продуктами или специальными добавками.

Антиоксиданты – вещества, способные непосредственно взаимодействовать со свободными радикалами с образованием малоактивных соединений. Биоантиоксидантами (БАО) называют вещества, которые в модельных свободно-радикальных процессах окисления проявляют свойства ингибиторов реакций окисления и сохраняют это свойство при введении их в биосистему [16]. Нарушение хотя бы одного постулата не позволяет называть вещества биоантиоксидантами. Несмотря на то, что увеличить устойчивость липидов к окислению можно с помощью веществ, являющихся синергистами к природным антиоксидантам или же превращающихся в антиоксиданты в процессе метаболизма, БАО обязательно должны обладать способностью ингибировать окислительный свободно-радикальный процесс в модельных реакциях. Это свойство позволяет прогнозировать спектр их биологических эффектов и осуществлять направленный синтез препаратов. При изучении роли антиоксидантов в нормальных физиологических процессах было сделано заключение о том, что они являются универсальными модификаторами состава, структуры и функциональной активности мембран, и что многие закономерности их влияния на клеточный метаболизм могут быть объяснены с этих позиций [17–19]. В настоящее время считается, что БАО могут влиять на клеточный метаболизм путем их взаимодействия со свободными радикалами различной природы; либо встраиванием БАО в структуру мембраны и изменением функциональной активности мембраны, связанной с изменением ее вязкостных свойств (текучести); влиянием непосредственно на активность мембранных белков-ферментов, рецепторов, на генетический аппарат клетки, в том числе на экспрессию генов, а также на регуляторные системы клетки и опосредованно на ее метаболизм в целом.

При выборе и оценке свойств БАО следует учитывать, что их эффективность зависит от природы АФК. Константы скорости реакций одних и тех же БАО с разными радикалами могут существенно (на порядки) отличаться друг от друга. Так, константа скорости реакции – токоферола с ОН радикалом составляет 8 1010 л/(моль сек), с липидным RO2• радикалом – О2-•– 47 104 л/(моль сек) [20, 21]. Кроме того, многие БАО имеют экстремальную зависимость эффекта от концентрации. В больших концентрациях антиоксиданты начинают не тормозить, а напротив, ускорять свободно-радикальные реакции. Это бывает связано либо с высокой активностью накапливающихся радикалов из ингибиторов, либо с преимущественным расходованием эндогенных антиоксидантов по сравнению с дополнительно вводимыми.

Многие из этих эффектов будут зависеть от начальных характеристик свободно-радикальных процессов и значений начального уровня антиоксидантов [22].

Изучение механизма действия БАО показало, что между отдельными показателями клеточного метаболизма, изменяющихся под действием антиоксидантов, существует целая система связей. Бурлаковой Е.Б. с сотрудниками, была предложена схема физико-химической регуляторной системы, поддерживающей уровень свободно-радикальных реакций в липидах, с одной стороны, и регулирующей обмен мембранных липидов и скорость расходования антиоксидантов в липидах, с другой стороны (Рисунок 1.1) [23, 24].

Было показано, что увеличение концентрации АО приводит к уменьшению скорости пероксидного окисления липидов, снижению концентрации продуктов окисления и скорости выхода липидов из мембран, обогащению их ненасыщенными липидами и, соответственно, увеличению окисляемости липидов. Увеличение окисляемости ведет, в свою очередь, к увеличению скорости снижения антиоксидантной активности и, соответственно, к последующему возвращению АО активности и скорости пероксидного окисления к норме.

Обратная картина наблюдается при уменьшении АО активности системы, увеличении скорости перекисного окисления липидов (ПОЛ). Существование такой системы регуляции было обнаружено практически для всех изученных внутриклеточных и клеточных мембран клеток животных, растительных организмов и микроорганизмов. Следует иметь в виду, что изменение состава липидов и степени их окисляемости приводит к изменению текучести различных слоев мембраны. Все указанные характеристики также влияют на активность и кинетические характеристики мембранных белков-ферментов, рецепторов, а потому изменение скорости ПОЛ может приводить к изменению не только структуры, но и функциональной активности мембран. Во всех мембранах в норме наблюдаются одинаковые закономерности между параметрами, а различие заключается лишь во времени релаксации системы (от минут до суток) [23, 24].

Рисунок 1.1. Схема физико-химической регуляции уровня ПОЛ в При действии на организм какого-либо повреждающего фактора происходят изменения в этой системе регуляции. Длительные изменения могут быть вызваны, во-первых, действием хронического фактора, который не приводит к разрыву связей в системе регуляции, и тогда после окончания его действия система может возвратиться к норме. Во-вторых, возможны ситуации, когда под действием повреждающего фактора происходит переход на новый уровень регуляции и, наконец, возможны разрывы связей в этой системе, которые не позволяют ей вернуться к норме [24]. В таком случае антиоксиданты могут быть полезны как один из компонентов в комплексной терапии. Подобные закономерности были найдены как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях. Изучение не отдельных изменений в описанной выше системе регуляции, а системы в целом позволяет сказать, когда мы можем обойтись монотерапией антиоксидантами, а когда требуется комплексная терапия, в которой помимо антиоксидантов для лечения необходимы другие биологически активные вещества, имеющие другие мишени. В определенной степени это требование может быть удовлетворено благодаря использованию препаратов, действующих на многе мишени, или же комбинированию средств, обладающих разной биологической активностью [22].

В настоящее время не существует строго определенной трактовки понятия «старение».

Это, в первую очередь, связано не только с тем, что разные организмы стареют по-разному, но и с тем, что изучение данного феномена ведется на разных уровнях организации живого – от молекулярно-генетического до популяционно-видового. Это влечет естественные трудности при попытке сформировать единое понимание проблемы и многообразие теорий, пытающихся объяснить механизмы старения. Тем не менее, определение старения, как увеличения вероятности смерти организма со временем, представляется наиболее ёмким, поскольку справедливо практически для всех индивидуальных механизмов старения. В целом, можно сказать, что процесс старения – это набор эндогенно-обусловленных, прогрессирующих, необратимых изменений, в конечном итоге, приводящих к гибели организма [26].

Существует ряд теорий, которые в качестве причины старения указывают накопление мутаций с увеличением возраста, отмечая при этом значение внешних факторов, другие же считают, что старение – закономерный запрограммированный этап развития организма [27].

Среди множества геронтологических гипотез чрезвычайно широкое экспериментальное подтверждение получило представление о существовании взаимосвязи между продолжительностью жизни и интенсивностью протекания свободно-радикальных реакций.

Основы свободно-радикальной теории старения были заложены Д. Харманом в 1956 году. В основе этой теории лежат представления о том, что свободные радикалы, образующиеся в ходе аэробного дыхания, вызывают повреждения окружающих молекул – ДНК, белков и липидов.

Харман полагал, что in vivo в течение всей жизни эндогенно образующиеся кислородные радикалы являются побочными продуктами работы окислительно-восстановительной цепи митохондрий и вызывают необратимые повреждения макромолекул, оказывающих разрушительное действие на клетку Таким образом, именно образование активных форм кислорода может рассматриваться, как фактор, обусловливающий старение. Кроме того, свободно-радикальная теория старения опирается на многочисленные экспериментальные свидетельства того, что стареющий организм всегда пребывает в состоянии окислительного стресса. Известно, что окислительный стресс приводит к накоплению поврежденных белков и белков с неправильной конформацией [28], увеличению скорости мутагенеза [26] и воспалению [29]. С другой стороны, известно, что умеренный окислительный стресс необходим клетке, поскольку запускает защитные механизмы, повышающие шансы на выживаемость.

Существует мнение, согласно которому, старение и болезни, вызываемые окислительными повреждениями, являются платой за участие свободных радикалов в осуществлении таких важнейших для организма функций, как рост, развитие, размножение [30]. В свете представлений о старении как процессе, сопряженном с повышенным риском заболеваемости (в том числе и от инфекций) и, в конечном итоге, смертности организма, большую популярность приобрело обсуждение роли иммунной системы. По данным [31] все клетки иммунной системы подвержены старению, что проявляется в повышенной восприимчивости стареющего организма к инфекциям и, следовательно, увеличению вероятности гибели.

Одним из центральных звеньев иммунной системы являются макрофаги и нейтрофилы, функционирование которых определяется как внутренними событиями в организме, так и факторами внешней среды. Уничтожение чужеродных агентов в этих клетках сопровождается усиленной генерацией АФК, при этом происходит так называемый респираторный взрыв. C увеличением возраста отмечаются нарушения в тонкой и слаженной работе иммунной системы:

изменяется соотношение противо- и провоспалительных сигнальных молекул, истощается продукция активных форм кислорода и азота в нейтрофилах и макрофагах [32], некорректно или несвоевременно запускается респираторный взрыв. Эти процессы, в свою очередь, вызывают окислительное повреждение компонентов органов и тканей, снижают способность сопротивляться инфекциям [33].

Говоря о старении, в большинстве случаев мы подразумеваем болезни, которые оно сопровождает – это нейродегенеративные заболевания, рак, атеросклероз, диабет, болезни глаз и сердечно-сосудистой системы. Эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что прием антиоксидантов помогает снизить риск возникновения этих расстройств [34]. Однако существует ряд ограничений на широкое применение добавок с антиоксидантами. В первую очередь, это недостаток знаний о возможных прооксидантных, оксидантных и антиоксидантных свойствах у таких препаратов. Во-вторых, это наши все более углубляющиеся представления о том, насколько сложна роль свободных радикалов в процессах апоптоза, воспаления, передачи сигнала. И хотя к настоящему моменту не существует подтвержденных свидетельств того, что прием антиоксидантов способен увеличить максимальную продолжительность жизни, тем не менее, можно с уверенностью утверждать, что антиоксиданты способны служить средством профилактики или облегчать течение множества патологий, существенно улучшая качество жизни в преклонном возрасте [35]. В ряде работ показано увеличение средней продолжительности жизни (СПЖ) животных при употреблении синтетических АО. Так, например, прием бутилгидрокситолуола, добавляемого в пищу мышам линии Bаlb/с, способствовал увеличению средней продолжительности жизни животных на 22% согласно [36], а прием этоксиквина на 19% увеличивал продолжительность жизни мышей линии С3Н [37].

Известно, что потребление пищи, богатой антиоксидантами (овощей и фруктов), снижает риск развития некоторых видов рака. Результаты эпидемиологических исследований, имеющие целью выявить компоненты пищи, ответственные за такой защитный эффект, демонстрируют обратно-пропорциональную зависимость между уровнем потребления витаминов Е и С, каротина и риском развития таких заболеваний, как рак шейки матки, рак легких, рак пищевода, желудка, поджелудочной железы, простаты, яичников, матки, мочевого пузыря [38, 39]. В то же время имеются данные и о стимулирующем действии антиоксидантов на опухолевый рост. Так, например, в ряде работ такое действие обнаружено у витамина С [40, 41]. В связи с этим изучение особенностей применения антиоксидантов при терапии различных опухолевых состояний является актуальной задачей для исследователей.

Процесс перерождения нормальной клетки в трансформированную сопровождается рядом биохимических изменений, итогом которых становится приобретение клеткой ряда новых свойств. Вследствие пониженной потребности в растворимых факторах, инициирующих пролиферацию, на фоне слабой чувствительности к рост-ингибирующим сигналам, отсутствии механизма «контактного торможения» и ряда других факторов трансформированная клетка приобретает способность к неограниченному росту и делению. Кроме того, в раковых клетках ослаблена индукция апоптоза и выражена способность стимулировать неоангиогенез, что является необходимым условием для дальнейшего опухолевого роста [42].

Способность клетки генерировать внутриклеточный ответ на внеклеточные стимулы невозможна без процессов клеточной сигнализации, основными и непосредственными компонентами которых являются АФК. В этом смысле различного рода патологические состояния можно рассматривать как результат неправильной передачи сигнала [43]. Было продемонстрировано, что АФК влияют на экспрессию и количество генов и сигнальные пути передачи сигнала, и, таким образом, могут быть регуляторным инструментом в процессе канцерогенеза [44].

Действие АФК охватывает широкий спектр биологических процессов в клетке, в том числе и имеющих прямое отношение к канцерогенезу. Так, известно, что одним из регуляторов работы генов, вовлеченных в процессы клеточной трансформации, роста и пролиферации, воспаления, ангиогенеза, является транскрипционный фактор NF-B. Его активацию связывают с действием как внешних (УФ-облучение, химические канцерогены), так и эндогенных стимулов. Будучи вторичными мессенджерами, АФК влияют на активность NF-B через фактор некроза опухоли и интерлейкин 1 [45].

Окислительное повреждение генетического аппарата клеток свободными радикалами лежит в основе мутагенеза, канцерогенеза и старения. АФК индуцируют в ДНК одно- и двунитевые разрывы, модификацию дезоксирибозы, пуриновых и пиримидиновых оснований, а также вызывают образование поперечных сшивок между основаниями ДНК. К настоящему моменту известно более 100 соединений, образующихся в ходе окислительной модификации ДНК, а сам процесс сопровождает практически все известные виды рака [46]. Это указывает на то, что повреждающее геном действие АФК может быть причиной онкологических заболеваний. Ключевую роль в подавлении опухолевого роста играет транскрипционный фактор p53. Он запрещает процесс деления клеток с поврежденным генетическим материалом или запускает их апоптоз. Мутации гена p53 отмечены более чем у половины видов рака и также могут быть вызваны прямым действием АФК [47].

Биологическое действие антиоксидантов основано не только на их способности захватывать свободные радикалы, но также влиять на пути передачи клеточных сигналов [6].

АО нормализуют регуляцию клеточного цикла, ингибируют пролиферацию и индукцию апоптоза, предотвращают распространение опухоли и ангиогенез, подавляют воспаление, стимулируют активность ферментов детоксикации ксенобиотиков фазы II, и, таким образом, препятствуют канцерогенезу. Было показано, что АО блокируют активацию вышеупомянутого транскрипционного фактора NF-В. Супероксиддисмутаза, утилизируя супероксиданион радикал, подавляет стимулируемый активными формами кислорода клеточный рост. Хорошо известно о связи рака с нарушениями в работе глутатион-зависимых ферментов, в особенности глутатион S-трансфераз [48]. Глутатион S-трансферазы используют глутатион в реакциях инактивации ксенобиотиков, канцерогенов и продуктов, образующихся в ходе окислительного повреждения биомакромолекул. Кроме того, окислительный стресс приводит к нарушению окислительно-восстановительного гомеостаза клеток, которое обнаружено у множества раковых клеток. Таким образом, изменение окислительно-восстановительного баланса может стимулировать онкогенез. Поэтому в работу АО системы защиты заметный вклад вносит низкомолекулярный белок тиоредоксин, который контролирует поддержание окислительновосстановительного гомеостаза клетки. Повышенное содержание тиоредоксина обнаруживается при раке желудка, прямой кишки, легких, гепатоцеллюлярной карциноме и др. Следует также отметить роль множества низкомолекулярных антиоксидантов, которые непосредственно взаимодействуют с АФК с образованием менее реакционноспособных молекул [49].

Однако, несмотря на вышеизложенное, в терапии онкологических заболеваний следует с осторожностью применять соединения, обладающие антиоксидантной активностью [50, 51].

Как известно, канцерогенез включает ряд стадий: инициация, промоция, прогрессия. В тканях организма-опухоленосителя баланс свободных радикалов и антиоксидантов на каждой стадии может существенно различаться [52]. Так, например, в работе [53] показано, что опухолевые ткани содержат более низкие концентрации свободных радикалов в сочетании с относительно высоким содержанием антиоксидантов (аскорбиновой кислоты, глутатиона) и активностью протеинкиназы С, являющейся ключевым ферментом в процессах злокачественного роста.

Поскольку динамика свободнорадикальных реакций в тканях организма-опухоленосителя на разных стадиях канцерогенеза неодинакова, то при назначении антиоксидантной терапии следует учитывать исходный пул антиоксидантов в опухоли.

Механизм действия антиоксидантов на опухолевый процесс заключается в воздействии на определенные стадии канцерогенеза. На стадии инициации антиоксиданты препятствуют образованию канцерогенных соединений из молекул-предшественников. Например, витамины С и Е могут реагировать с нитритом, препятствуя образованию нитрозоаминов in vivo [54–56].

Фенольные соединения зеленого чая также ингибируют формирование нитрозаминов в экспериментах in vivo [57]. Поскольку высокий уровень свободных радикалов инициирует процесс апоптоза, то излишнее потребление АО может способствовать выживанию поврежденных клеток и их переходу в неопластическое состояние. На стадии прогресса опухоли АО могут стимулировать ее рост, поскольку увеличивают жизнеспособность раковых клеток. Наконец, нельзя не учитывать тот факт, что многие АО приобретают прооксидантную активность при определенной концентрации [51, 58].

При терапии различных заболеваний эффективность использования лекарственных средств часто ограничивается побочными или токсическими эффектами. На пути решения данной проблемы особый интерес представляет поиск малотоксичных натуральных растительных препаратов с определенными свойствами. О лечебных свойствах некоторых растений было хорошо известно еще 5000 лет назад в Китае. Пряности и травы использовались как лекарственные средства в древнем Египте и Сирии, а также в качестве естественных пищевых консервантов в Древнем Риме и Греции [59]. В ряде эпидемиологических исследований было подтверждено, что диета, обогащенная фруктами и овощами, способствует снижению риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и некоторых видов рака [34, 60].

Известно, что лекарственные свойства многих препаратов растительного происхождения, используемых в народной медицине, обусловлены наличием в них органических и неорганических соединений c различными видами биологической активности, в том числе с антиоксидантными свойствами. К таким соединениям относятся каротиноиды, флавоноиды, антоцианы, фенольные кислоты, кумарины, танины, а также некоторые металлы Mn, Cu, Zn [61–65].

Интерес к изучению и применению веществ натурального происхождения за последние годы резко вырос. В отличие от синтетических такие препараты имеют существенно меньше побочных эффектов, часто они проявляют выраженное биологическое действие при более низких концентрациях из-за присутствия натуральных веществ-синергистов [65]. Биологически активные соединения растительного происхождения чрезвычайно разнообразны по химической структуре, исследование их свойств является актуальной задачей при производстве продуктов функционального питания (Таблица 1.2).

Использование антиоксидантных препаратов показано при профилактике многих заболеваний, а их применение в период интенсивной терапии может усилить эффективность действия некоторых лекарств. Как известно, большинство синтетических антиоксидантов являются структурными аналогами природных молекул, и в основе их действия лежат одни и те же механизмы. Исходя из этого, следует признать вполне оправданным регулярный прием препаратов, содержащих природные АО для повышения АО статуса организма и снижения опасности возникновения свободнорадикальных патологий.

Таблица 1.2.

Примеры физиологически активных растительных соединений и спектр их биологического действия [66] Источниками природных антиоксидантов являются травы, коренья, пряности, вытяжки и экстракты из различных частей растений (Таблица 1.3). Такие растения и препараты из них содержат большое число различных биологически активных веществ, включая антиоксиданты, к которым относятся некоторые из витаминов, полифенолы – флавоноиды, каротиноиды, а также эфирные масла.

Таблица 1.3.

Содержание антиоксидантов в некоторых травах и пряностях [67] Флавоноиды являются фенолами растительного происхождения. Они принадлежат к соединениям С6-С3-С6 ряда, т.е. состоят из 2-х бензольных колец, соединенных 3-х углеродным фрагментом. В растениях флавоноиды встречаются в свободной форме в виде агликонов, в форме гликозилированных или ацилированных производных или же в виде олигомерных полимеризованных структур [68–70]. Наличие связей, возникающих между гидроксильными группами фавоноидов и одним или несколькими остатками сахаров, обусловливает значительное структурное разнообразие (известно более 6 тыс. флавоноидов) соединений данной группы. По степени окисленности хромонового цикла выделяют несколько классов флавоноидов (Таблица 1.4).

Флавоноиды содержатся практически в любом растении. Основными источниками флавоноидов в пище являются: зеленый чай, какао, мед, фрукты (яблоко, груша, абрикос, слива, персик, цитрусовые ), ягоды (ежевика, смородина, черника, клюква, малина, вишня, клубника), овощи (цветная капуста, краснокочанная и белокочанная капуста, брокколи, репа, лук, томат, морковь, перец сладкий), травы (петрушка, укроп), бобы, орехи [71].

Таблица 1.4.

Примеры, структурное разнообразие и источники флавоноидов [72] процианидины Продолжение Таблицы 1.4.

Флаваноны Гиспередин, Апельсиновый Нарингенин Изофлавоны Генистеин, Соевая мука, Генистеин Содержание флавоноидов и фенольных соединений в водных экстрактах часто употребляемых трав и пряностей представлено в Таблице 1.5. Функции флавоноидов в растениях разнообразны. Например, флавоноиды принимают участие в процессе фотосинтеза, защите растений от ультрафиолета, в образовании суберина и лигнина. Они имеют огромное значение для защиты растений от инфекций и травоядных животных, обеспечивают взаимодействие с насекомыми-опылителями [73]. В различных растениях содержание флавоноидов варьирует от 0,5% до 20%.

Разнообразие химической структуры флавоноидов определяет богатство биологических свойств. Многочисленные исследования подтвердили наличие антиэстрогенной и эстрогенной активности таких флавоноидов, как генистеин, даидзеин, апигенин, кемпферол, нарингенин [74].

Показано положительное действие флавоноидов в отношении болезни Альцгеймера [75, 76], сердечных [77, 78] и сосудистых заболеваний [79]. Флавоноидные соединения обладают низкой токсичностью и используются в медицине в качестве витаминов (рутин) или БАДов (кверцетин, диквертин, катехины чая и др.). Эпигаллокатехин галлат, имеющий фенольную природу, является ключевым антиоксидантным соединением зеленого чая, его защитное действие было продемонстрировано в отношении таких хронических нейродегенеративных расстройств, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, амиотрофический латеральный склероз in vitro и in vivo [80, 81]. Кверцетин, в большом нейропротекторного средства [82]. Есть данные о способности флавоноидов регулировать экспрессию генов через взаимодействие с внутриклеточными сигнальными молекулами (протеинкиназами). Известно, что ингибирование протеинкиназ благотворно сказывается на течении нейродегенеративных, воспалительных процессов, а также процессов опухолевого роста [83]. Кроме того, к механизмам, обеспечивающим действие многих флавоноидов на стадии инициации и промоции канцерогенеза, относят снижение экспрессии мутантного белка р53, остановку клеточного цикла, проапоптотическую активность, ингибирование тирозинкиназ и белков теплового шока, способность связываться с рецепторами к эстрогенам, ингибировать ангиогенез, подавлять экспрессию Ras белков [84, 85].

Таблица 1.5.

Общее содержание фенольных соединений (ФС) и флавоноидов (Ф) в некоторых травах и пряностях [86]