«АССОЦИИРОВАННЫХ С БИОЛОГИЧЕСКОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ ОРГАНИЗМА К РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ ...»

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

«ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ» ФЕДЕРАЛЬНОГО

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА

Уткин Константин Васильевич

На правах рукописи

ПОИСК ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМОРФИЗМОВ,

АССОЦИИРОВАННЫХ С БИОЛОГИЧЕСКОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ

ОРГАНИЗМА К РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ

Специальность «03.03.03 - иммунология»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, профессор Алексеев Л.П.

к.б.н. Кофиади И.А.

Москва 2012 год

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.

ПРОБЛЕМА РАДИАЦИОННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ НА ФОНЕ

1.

СОЦИО-ЭКОНОМИЧЕСКИХ И НАУЧНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ

ПРЕДПОСЫЛОК

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ НЕГАТИВНОГО

1.

ВОЗДЕЙСТВИЯ РАДИАЦИИ НА КЛЕТКУ

ОСОБЕННОСТИ ОТВЕТА ТКАНЕЙ НА ИОНИЗИРУЮЩЕЕ

1. ИЗЛУЧЕНИЕ

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ

1.

ОПУХОЛЕОБРАЗОВАНИЯ

НАСЛЕДУЕМОСТЬ ФЕНОТИПА, ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО К

1.

РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ

ОЦЕНКА РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ С ПОМОЩЬЮ

1.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНТИЧЕСКИХ ТЕСТОВ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.

СВЕДЕНИЯ ОБ ИССЛЕДОВАННЫХ ВЫБОРКАХ

2.1

ОЧИСТКА ДНК ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ

2. КРОВИ

ВЫБОР ГЕНОВ

2.3

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ

2.4

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПРОДУКТОВ ПЦР

2.5

2.5.1 ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МАТРИЦЫ ДЛЯ

СИКВЕНСНОЙ РЕАКЦИИ

2.5.2 ПРОВЕДЕНИЕ СИКВЕНСНОЙ РЕАКЦИИ 2.5.3 СЕКВЕНИРОВАНИЕ

БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ

2.6

СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

2.7

ИСПОЛЬЗОВАННОЕ В РАБОТЕ ПРОГРАММНОЕ

2.

ОБЕСПЕЧЕНИЕ И БАЗЫ ДАННЫХ

РЕЗУЛЬТАТЫ

РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОГО ВАРИАНТА

3. ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНОВ ATM (1801516, RS664677), TGFB1 (RS1800469), XRCC1 (RS1799782), OGG (RS1052133), IL-7 (RS2717536), IL15-RA (RS2296135) В РЕЖИМЕ

РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ОБРАЗЦОВ

ПРОВЕРКА СООТНОШЕНИЯ ХАРДИ-ВАЙНБЕРГА ДЛЯ

3.

ИССЛЕДОВАННЫХ АЛЛЕЛЕЙ

ХАРАКТЕРИСТИКА ЧАСТОТНОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ

3.

ИССЛЕДОВАННЫХ АЛЛЕЛЕЙ В ГРУППАХ СРАВНЕНИЯ

3.4.1 РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АЛЛЕЛЕЙ В ЕВРОПЕЙСКОЙ И

АЗИАТСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ОТНОСИТЕЛЬНО

ИССЛЕДОВАННЫХ ГРУПП

3.4.2 РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АЛЛЕЛЕЙ ИССЛЕДОВАННЫХ

МАРКЕРОВ В ГРУППАХ СРАВНЕНИЯ

ОБСУЖДЕНИЕ

ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ С АНАЛИЗОМ КРИВЫХ

4.

ПЛАВЛЕНИЯ, КАК МЕТОД ГЕНОТИПИРОВАНИЯ

РОЛЬ ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ В ОЦЕНКЕ

4.

ТОКСИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА РАДИАЦИИ НА НОРМАЛЬНЫЕ

РОЛЬ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАРУШЕНИЙ

4.

ДНК И БЕЛКОВ СИСТЕМЫ РЕПАРАЦИИ

ВОЗМОЖНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.

ГЕНОМНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ ОЦЕНКЕ НАСЛЕДУЕМОГО

РИСКА РАЗВИТИЯ ОНКОПАТОЛОГИЙ

ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПОЛУЧЕННЫХ

4.

ДАННЫХ ДЛЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПАТОГЕННОГО ЭФФЕКТА

РАДИАЦИИ НА ИНДИВИДУАЛЬНОМ УРОВНЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ

ATM – ген Ataxia-Telangiectasia Mutaded CHK1/2 – ген Cell Cycle Chekpoint Kinase FISH – Fluorescence in situ hybridization (флуресцентная гибридизация in situ) GWAS – Genome Wide Association Study (геномное ассоциативное исследование) HLA – Human Leukocyte Antigens (антигены тканевой совместимости человека) IFNG – ген Interferon Gamma IL15RA – ген Interleukin 15 Receptor, Alpha IL7 – ген Interleukin LMP2 – ген Large Multifunctional Protease LMP7 – ген Large Multifunctional Protease MCA – Methylcholanthrene (метилхолантрен) MHC – Major Histocompatibility Complex (главный гистосовместимости) OGG1 – ген 8-Oxoguanine DNA Glycosylase RAG2 – ген Recombination-Activating Gene SNP – Single Nucleotide Polymorphism (однонуклеотидный полиморфизм) TAP1 – ген Transporter ATP-binding Cassette TCR – T-cell Receptor (рецептор Т-клеток) TGFB1 – ген Transforming Growth Factor, Beta- TP53 – ген Tumor Protein p XRCC1 – ген X-ray Repair Complementing Defective, in Chinese Hamster АТЭЦ – Атомная теплоэлектроцентраль АЭС – Атомная электростанция ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота МАГАТЭ – Международное агентство по атомной энергии НДО – низкодозное облучение НКДАР – Научный комитет Организации объединенных наций по действию атомной радиации НРБ – Нормы радиационной безопасности ОИАЭ – объекты использования атомной энергии ООН – Организация объединенных наций ОСПОРБ – Основные санитарные правила обеспечения радиационной безопасности ПЦР – полимеразная цепная реакция РНК – рибонуклеиновая кислота ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы Развитие атомной промышленности и энергетики является залогом экономического роста государства и способствует реализации новых перспектив в достижении технологического и социального прогресса. На сегодняшний день только дальнейшее развитие индустрии может обеспечить растущие потребности человечества в недорогих источниках энергии.

Вместе с тем следует помнить, что путь освоения атомных технологий отмечен многими человеческими жертвами, число которых, к сожалению, продолжает расти и в настоящее время. Задача снижения медицинских рисков, ассоциированных с облучением, может быть решена путем комплексного изучения негативных эффектов радиации на здоровье человека, а также биологических основ реакции организма на радиационное воздействие.

Начиная с 40-х годов XX века одним из приоритетных направлений биомедицинской науки в области изучения принципов действия ионизирующих излучений на ткани стала радиобиология. Классические цитологические, иммунологические, биохимические методы позволяют установить дозовую нагрузку на организм, оценить реактивность и резистентность облученных тканей [1]. При этом возможность оценки радиационных рисков до облучения на сегодняшний день не реализована ни в одном из существующих подходов. Достоверная оценка показателей функционального уровня регуляторных и защитных систем невозможна без учета наследуемых особенностей метаболизма, восстановительных и компенсаторных свойств организма. Установление генетических маркеров, позволяющих выявлять лиц с повышенным или пониженным уровнем устойчивости к радиационному воздействию, остается одной из важнейших, нерешенных до настоящего времени проблем в этой области.

Сама возможность генетического контроля индивидуальной реакции на радиационное воздействие низких доз (в случае с детерминированными эффектами речь идет об иных типах воздействия и ответной реакции организма) подтверждена многочисленными клиническими и генетическими исследованиями [2-4]. Если вышеупомянутые биологические маркеры могут быть определены инструментально и с высокой степенью достоверности (будет разработан надежный метод идентификации и доказана клиническая значимость маркеров), то в перспективе их можно будет использовать для оценки вероятности отдаленных стохастических эффектов облучения (прежде всего возникновения злокачественных новообразований).

мониторинга состояния здоровья лиц, получавших в прошлом повышенные дозы хронического облучения. Кроме того, могут быть разработаны индивидуальные подходы к диагностике возможных последствий радиационного воздействия, использующие результаты генотипирования.

Эти результаты могли бы быть полезны также, при планировании повышенного облучения персонала в соответствии с положениями НРБ-99/2009 [5]. Так, предварительное генотипирование лиц из персонала объектов использования атомной энергии (ОИАЭ) может быть использовано для определения круга контингентов, привлечение которых к ликвидации последствий возможных радиационных аварий на объекте было бы предпочтительным по сравнению со всеми остальными, давшими добровольное согласие на повышенное облучение. В то же время, создание диагностических подходов к оценке индивидуального уровня естественной чувствительности к радиационному воздействию может стать важнейшим звеном в выборе и назначении эффективной и безопасной радиотерапии больных онкологическими заболеваниями.

Проведение такого рода медико-биологических исследований стало возможным благодаря развитию молекулярно-генетических исследований, в первую очередь, выполненных в рамках международной программы «Геном человека» [6]. Одним из результатов этого проекта стала возможность оценки генетического разнообразия человека на новом уровне – установления полиморфизма одиночных нуклеотидных замен – SNP. Этот уровень исследований позволяет идентифицировать варианты генов, продукты которых обладают специфическими функциональными характеристиками. Если изменения свойств продуктов генов не «включают»

механизмы естественного отбора, новые варианты генов (аллели) передаются последующим поколениям и, таким образом, закрепляются в популяции [7]. Число маркеров, ассоциированных с функциональными изменениями, относительно невелико по сравнению с общим числом полиморфных локусов, однако именно они представляют наибольший интерес с точки зрения практической биомедицинской науки и в частности радиологии и радиобиологии. Поиск ассоциаций генетических маркеров с уровнем естественной (наследуемой) устойчивости к радиации открывает новые возможности в медицине и фундаментальной науке. Этот подход фармакогенетике для установления индивидуальной чувствительности к тому или иному медицинскому препарату [8,9]. Одновременно с этим, имеются данные о взаимосвязи конкретных SNP с устойчивостью или чувствительностью к инфекционным возбудителям [10,11].

Наиболее полиморфной системой генов, регулирующих жизненно важные функции организма, являются гены иммунной системы. На сегодняшний день известны тысячи функциональных аллельных вариантов, определяющих особенности иммунного ответа. Принципиальная роль иммунной системы в регуляции восстановительных и защитных свойств организма, надзоре за факторами опухолеобразования, поддержании иммунологического гомеостаза определяет перспективность поиска SNP-маркеров, ассоциированных c естественной чувствительностью к радиации именно в генах, контролирующих основные этапы иммунного ответа. Кроме того хорошо известно разрушительное воздействие ионизирующего излучения на молекулы ДНК – универсальные хранители ассоциированных с индивидуальными свойствами компонентов системы репарации ДНК и регуляции клеточного цикла, давно признан ключевым направлением в области установления чувствительности клеток и тканей к радиационному воздействию [12]. Отдельного внимания заслуживает вопрос врожденной предрасположенности к онкологическим заболеваниям – одному из частых осложнений облучения. Геномные исследования позволяют с помощью клинико-статистических методов установить кандидатные маркеры, ассоциированные с повышенным риском развития онкозаболеваний [13,14]. Дальнейшие исследования ассоциации этих маркеров с процессом канцерогенеза позволят установить роль отдельных генов в развитии онкопатологий, а также получить представления о способе наследования данного типа нарушений.

Таким образом, проблема поиска генетических маркеров требует разработки комплексного и всестороннего подхода, принимающего во внимание самые разнообразные аспекты реакции организма на облучение.

Оценка SNP полиморфизма генов, входящих в генетические системы, контролирующие ответ организма на неблагоприятные факторы окружающей среды, в том числе, радиацию, является одним из наиболее перспективных путей решения этой проблемы.

Цель исследования Установить ассоциации молекулярно-генетических маркеров с развитием фенотипа, характеризующегося повышенной/пониженной устойчивостью к радиационному воздействию.

Задачи исследования Разработать научно-методическую платформу для установления генов, перспективных для поиска маркеров наследуемой устойчивости или чувствительности к радиационному воздействию.

Разработать комплекс ПЦР-тест-систем для идентификации аллельных вариантов генов ATM, XRCC1, TGFB, OGG1, IL17, IL15RA, ассоциированных с функциональными свойствами кодируемых ими продуктов (изменением уровня экспрессии, альтернативным сплайсингом, изменением структуры и конформации).

С помощью разработанных тест-систем установить частоты аллелей радиорезистентных, радиочувствительных индивидуумов и в группе популяционного контроля.

Установить частоты аллелей локуса 8q24, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к развитию онкологических заболеваний в группах радиорезистентных, радиочувствительных индивидуумов и в группе популяционного контроля.

Установить частоты аллелей генов DQA1, DRB1, DQB1 системы HLA класса II в группах радиорезистентных, радиочувствительных индивидуумов и в группе популяционного контроля.

Охарактеризовать распределение выявленных аллелей в группах сравнения, оценить достоверность отличий в частотах аллелей, дать популяционно-генетическую характеристику обнаруженных отличий.

Оценить применимость исследованных маркеров для прогнозирования мутагенного/канцерогенного эффекта радиации на индивидуальном уровне.

Научная новизна исследования Впервые продемонстрирована ассоциация иммуногенетических маркеров системы HLA с развитием естественной устойчивости к радиационному воздействию. Полученные данные позволяют по-новому оценить роль молекул главного комплекса гистосовместимости класса II в цитотоксическое и мутагенное воздействие радиации. Проведен подробный анализ последовательности иммунных реакций и оценена возможная роль полиморфизма генов в развитии негативных последствий облучения.

В работе проведен углубленный анализ иммунологических основ формирования индивидуальной реакции человека на радиационное воздействие. Отобраны кандидатные молекулярно-генетические маркеры, ассоциированные с изменением структурно-функциональных свойств ключевых компонентов систем репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и восстановления защитных функций организма после облучения. Изучены образцы нуклеиновых кислот от радиорезистентных и радиочувствительных индивидуумов, охарактеризованных по радиобиологическим и иммунологическим параметрам. На основе полученных данных предложены возможные механизмы развития отдаленных последствий облучения, проанализированы механизмы канцерогенного воздействия радиации на молекулярном уровне.

Впервые получены данные о распределении выявленных молекулярногентических маркеров в русской популяции. Проведен анализ данных, позволяющий определить уровень межэтнической гетерогенности в распределении исследованных маркеров. Обсуждена значимость полученных данных с точки зрения радиационной эпидемиологии.

Характеристика геномного полиморфизма в исследованных выборках имеет общенаучное значение и служит вкладом в развитие фундаментальной иммунологии, медицины и популяционной генетики.

Полученные данные могут служить теоретической основой при оценке особенностей индивидуальной реакции на радиационное воздействие, а также важны при прогнозировании риска развития отдаленных эффектов облучения. Данные о частотах распределения клинически значимых генетических маркеров применимы при проведении клинико-статистических исследований и определении атрибутивных популяционных рисков.

Практическая значимость исследования облученных лиц и могут использоваться для целей радиационной защиты.

генотипирующие ПЦР тест-системы для выявления аллелей генов ATM (rs1801516, rs664677), TGFB1 (rs1800469), XRCC1 (rs1799782), OGG (rs1052133), IL-7 (rs2717536), IL15-RA (rs2296135). Комплекс дополнен тестсистемами для идентификации аллелей локуса 8q24 (rs9642880, rs6983267, rs1447295, rs13281615), а также аллелей HLA-DRB1, DQA1 и DQB1.

Адаптированы технологии лабораторного производства разработанных тестсистем, основанных на методе ПЦР в реальном времени. Данный метод диагностического инструмента для индивидуальной оценки диапазона безопасных терапевтических доз радиации и профилактики негативных эффектов радиационного воздействия.

Полученные данные могут быть использованы при проведении популяционно-генетических и радиационно-эпидемиологических исследований. Возможно включение результатов исследования в научнометодические программы для студентов медицинских ВУЗов, а также в образовательные программы учреждений высшего профессионального и последипломного образования.

Основные положения, выносимые на защиту Полиморфизм генов системы эксцизионной репарации ДНК (гены ATM, OGG1, XRCC1) ассоциирован с особенностями реакции человека на радиационное воздействие. Данные локусы являются перспективными для дальнейшего исследования влияния наследуемых факторов на индивидуальную устойчивость/чувствительность к радиации.

В рамках исследования не удалось подтвердить ассоциацию аллелей локуса 8q24 c предрасположенностью к онкологическим заболеваниям. Этот результат согласуется с современной теорией о комплексном механизме наследования предрасположенности к онкологическим заболеваниям и служит ее дополнительным подтверждением.

особенностями реакции человека на радиационное воздействие.

Предположительно, функциональная роль данного полиморфизма определяется специфичностью взаимодействия комплекса MHCp/TCR.

По результатам популяционно-генетического анализа большинство SNP-маркеров за исключением rs1052133 (ген OGG1), rs1801516 (ген ATM) и rs1799782 (ген XRCC1) попали в группу, характеризующуюся сходным распределением в контрольной группе (P) и в референтных коллекциях образцов от представителей популяций азиатского (CHB) и европейского (CEU) происхождения. Отличия в частоте аллелей генов OGG1, ATM и XRCC1 установлены только для групп P и CHB. В то же время в группе P и CEU указанные маркеры распределены одинаково (без статистически достоверных отличий) Примененный в работе вариант метода генотипирования «в реальном времени» обладает рядом преимуществ преред другими распространенными подходами и может быть рекомендован для использования в лабораторной практике.

Личный вклад автора Исходные данные, использованные в работе, получены при личном участии автора. Автору принадлежит ведущая роль в разработке схем и проведении научных экспериментов, а также в апробации результатов исследования. Обработка и интерпретация экспериментальных данных, а также подготовка основных публикаций по выполненной работе выполнена лично автором. Личный вклад автора в данном исследовании составляет около 80%.

Публикации.

Основное содержание диссертации изложено в 6 публикациях, в том числе 5 публикаций в периодических научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов докторских и кандидатских диссертаций, 1 публикация в научной печати.

Апробация диссертации Диссертация апробирована на заседании секции № 2 Ученого совета Государственного научного центра «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства» от 21 января 2012 г. и рекомендована к защите на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности «03.03.03 – иммунология».

Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на Семинаре по регулированию радиационной безопасности и медицинскому аварийному реагированию в случае аварий при транспортировании радиоактивных веществ (г. Сочи, 2011 г.), а также на XVI международной конференции Европейской федерации иммуногенетиков и Британского общества гистосовместимости и иммуногенетики (г. Ливерпуль, 2012 г.) Структура и объем работы

Работа изложена на 105 страницах, состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материалы и методы», раздела «Результаты», раздела «Обсуждение», выводов и списка литературы. Работа включает 10 рисунков и 7 таблиц.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ПРОБЛЕМА РАДИАЦИОННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ НА ФОНЕ

1.

СОЦИО-ЭКОНОМИЧЕСКИХ И НАУЧНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ

ПРЕДПОСЫЛОК

В XX веке человечество вступило в период широкомасштабного использования атомных технологий. Не смотря на то, что новые физические явления в первую очередь нашли применение в военной области, на их основе были созданы источники электрической и тепловой энергии в виде АЭС и АТЭЦ. Стремительно развилась новая отрасль индустрии — атомная энергетика – с широким спектром производств по добыче и обогащению руды, проектированию и строительству реакторов, выработке энергии, утилизации и хранению отработанного топлива. Для такой большой страны, как Россия важным преимуществом атомных электростанций стала логистические преимущества при поставках энергоносителей. Интенсивное развитие атомных технологий привело к широкому использованию источников излучения во многих сферах деятельности, обеспечив принципиально новые возможности, в том числе в медицине.

Однако, атомная технология, как и любая другая, наряду с несомненными преимуществами характеризуется и возможными негативными последствиями для здоровья человека и состояния среды его обитания. За последние 50 лет потенциальная опасность излучения изучена Объективными предпосылками к интенсификации исследований в области влияния радиации на организм человека стали тяжелые последствия военных и техногенных катастроф, вызванные воздействием радиации средних и высоких доз. Список наиболее известных инцидентов, связанных с освоением атомной энергии приведен в таблице 1. Детально изучены патогенез, патологическая морфология и клиника заболеваний, обусловленных поражающим действием облучения, риски их возникновения и зависимость от дозы радиации. По биологическим и клиническим проявлениям зачастую можно реконструировать дозу облучения индивидуума. На основе этих данных разработаны и внедрены жесткие нормы и меры безопасности, такие как НРБ-99/2009 и ОСПОРБ-99/2010.

Однако, не смотря на глубокое и всестороннее исследование механизмов и принципов воздействия радиации на клетки и ткани, многие аспекты этой проблемы до сих пор не ясны. Причина этого кроется в методических ограничениях при проведении экспериментов, а также в недоступности важных данных для широкого научного обсуждения. За последние десятилетия наука и биомедицинские технологии шагнули далеко вперед, особенно в области установления молекулярных основ развития заболеваний и формирования индивидуальной реакции на факторы окружающей среды. Стало понятно, что основные функциональные характеристики тканей и органов закладываются именно на молекулярном уровне. При этом исходным и ключевым компонентом, определяющим эффективность той или иной функции, является ДНК – универсальный хранитель информации о признаках организма. Исходя из этих представлений и основываясь на сведениях об индивидуальных различиях в реакции человека на радиационное воздействие, можно предположить, что молекулярно-генетические подходы в ближайшие десятилетия будут играть важную роль в развитии концепции радиационной биобезопасности.

Открытым также остается вопрос радиационных рисков при терапии онкологических заболеваний. Данный вид радиационного воздействия находит все большее применение в системе здравоохранения. Эффекты облучений, применяемых в радиодиагностике и радиотерапии не столь очевидны по сравнению с эффектами средних и высоких доз, и вероятность их клинических проявлений практически непредсказуема, однако их исследование имеет очевидный социальный аспект. Поэтому в последние десятилетия научные интересы переместились в область малых доз, с которыми преимущественно контактируют люди.

Современная наука обладает значительным арсеналом методов и знаний, позволяющих оценить подавляющее большинство рисков ассоциированных с развитием атомно-промышленного комплекса.

Возможность индивидуально-ориентированной оценки радиационных рисков, обусловленная переходом на базовые уровни организации живого организма, позволит внедрить новые стандарты безопасности в области профессиональной защиты в радиологии. Необходимо совершенствование научно обоснованной концепции радиационной безопасности, учитывающей современные научные и технологические возможности. Развитие такой концепции важно еще и потому, что ошибочные решения, принятые сегодня, могут иметь тяжелые экономические и социальные последствия.

В связи с вышесказанным стратегической целью инновационного развития атомно-промышленного комплекса России является обобщение накопленных теоретических и экспериментальных научных сведений о биологических и медицинских эффектах облучения, с акцентом на состояние знаний в области низких уровней и интенсивностей облучения, характерных для техногенных воздействий. В том числе:

сопоставление представлений о реальном и гипотетическом вреде для здоровья человека воздействий низких уровней излучения;

определение задач перспективных исследований и обоснование направления работ в области изучения влияния техногенного облучения на здоровье человека.

Таблица 1. Список крупнейших инцидентов, связанных с использованием атомной энергии.

Нагасаки (Япония) (Великобритания) производства оружейного плутония г. Кыштым (Россия) взрыв на хранилище радиоактивных отходов (Испания) г. Нижний Новгород несанкционированный запуск реактора при г. Гаррисберг (США) повреждение активной зоны реактора на Бухта Чажма (Россия) 1985 разгерметизация атомного реактора на на г. Гояния (Бразилия) утеря детали из установки для радиотерапии префектура Фукусима 2011 расплавление активной зоны реакторов АЭС

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ НЕГАТИВНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ

1.

РАДИАЦИИ НА КЛЕТКУ

Согласно существующим представлениям, ионизирующее излучение может приводить к развитию детерминированных (пороговых) и стохастических эффектов. Первые развиваются в результате массовой гибели клеток, спровоцированной физическим воздействием радиации. Для таких эффектов характерны: наличие минимальной (пороговой) дозы, ниже которой клинический эффект не возникает, зависимость выраженности определенный характер проявлений эффекта [15]. В свою очередь стохастические эффекты обусловлены случайной трансформацией и выживанием одиночных клеток, способных воспроизводить дочерние клетки или косвенно воздействовать на клеточное окружение. К таким эффектам относятся в первую очередь новообразования и генетические дефекты (наследуемые аномалии). Возникновение такого рода нарушений характеризуется определенной вероятностью. Их возникновение не является обязательным результатом радиационного воздействия, а вероятность их индивидуальном уровне. В основе этих различий могут лежать самые разнообразные факторы, обусловленные как внешними воздействиями, так и особенностями самого организма, подвергшегося облучению.

Нативные свойства организма, в свою очередь, определяются особенностями метаболизма, способностью тканей и систем органов к восстановлению, эффективностью компенсаторных (адаптивных) механизмов. На молекулярном уровне все эти процессы контролируются генами, кодирующими ту или иную функцию. С развитием представлений о роли генов в ключевых биохимических путях, становится ясно, что даже малейшая изменчивость структуры генома на индивидуальном уровне воздействие одинаковых свойств и силы.

Многочисленные исследования уровня экспрессии генов в культурах клеток, подвергавшихся воздействию ионизирующего излучения, показали, что ключевыми механизмами, связанными с особенностями реакции на (дифференцировка, деление, гибель клетки), система поддержания структурной целостности генома (репарация ДНК) и система иммунитета (презентация антигенов, иммунологический контроль опухолеобразования, репопуляция иммунных клеток) [16]. Далее рассмотрены основные этапы функционирования этих систем и дана характеристика их ключевых компонентов.

1.2.1 Контроль клеточного цикла Контроль клеточного цикла осуществляется сигнальными молекулами, способными задерживать начало деления до тех пор, пока не установятся условия, благоприятствующие успешному протеканию и завершению всех этапов цикла. Нарушение структуры ДНК может приводить к наложению ареста на дальнейшее деление клетки на ранних фазах цикла (вплоть до метафазы) или на этапе предшествующем непосредственно делению (рис.1).

репарационные механизмы предотвратили репликацию ДНК с нарушенной структурой или ее передачу дочерней клетке. Так анализ уровня лимфоцитов с остановкой клеточного цикла показал повышение процента клеток, находящихся в задержке клеточного цикла у облученных людей по сравнению с необлученными [17]. Это наблюдение отражает высокий уровень радиационно-индуцированного мутагенеза и позволяет говорить о высокой активности репарационных процессов. В зависимости от эффективности механизмов, восстанавливающих структуру ДНК, клетка может продолжить деление или погибнуть посредством апоптоза.

Рисунок 1. Контрольные точки клеточного цикла позволяют приостановить цикл на стадии репликации или митоза для «принятия решения» о необходимости запуска следующего этапа. Точка G1/S (контрольная точка 1) предотвращает удвоение поврежденной ДНК, точка G2 (контрольная точка 2) не дает вступить поврежденной клетке в митоз.

Ключевыми молекулами, регулирующими этот процесс, являются ATM, CHK1/2 и TP53 [18]. Структурно-функциональные нарушения этих молекул или других молекул, регулирующих успешное протекание клеточного цикла могут запускать последовательность реакций в конечном счете приводящих к развитию онкопатологий [19].

1.2.2 Репарация ДНК Структуры, которые под воздействием радиации могут приводить к гибели клетки, мутагенезу или канцерогенезу, расположены, главным образом, в клеточном ядре. Среди них основными являются молекулы ДНК, кодирующие свойства и признаки данного организма и оказывающие регулирующее воздействие на все процессы, связанные с его жизнедеятельностью. Повреждения ДНК, вызываемые ионизирующим излучением, могут приводить к мутациям – случайным изменениям репарационные механизмы эффективны, нарушения большей частью исправляются, если же то или иное звено системы репарации не достаточно функционально, существует вероятность передачи геномных нарушений следующим поколениям. В случае если эти нарушения связаны с потерей репродуктивного потенциала организма, данные генетические нарушения элиминируются из популяции. Отсутствие негативного эффекта (или положительный эффект) мутации на организм приводит к ее закреплению в популяции, что поддерживает высокий уровень изменчивости и является важным фактором эволюции.

В основе радиационно-индуцированных изменений структуры ДНК лежат нарушения нуклеотидов (основной группы или сахарофосфатного остова). Эти нарушения приводят к одноцепочечным или двуцепочечным разрывам молекулы ДНК, а также перекрестным связям типа ДНК-ДНК или ДНК-белок [20]. Репарационные механизмы достаточно эффективно исправляют нуклеотидные нарушения и одноцепочечные разрывы, однако при высоких дозах облучения или неправильной работе белков системы репарации в молекуле ДНК могут происходить двуцепочечные разрывы.

Данный тип нарушений является губительным для клетки и служит основной причиной гибели облученных клеток [21]. Неправильная сшивка нестабильных хромосомных аберраций, которые в свою очередь запускают процесс гибели клетки, мутагенеза или изменения уровня экспрессии генов.

Вместе с апоптозом (механизм гибели клетки вследствие повреждения мембраны) и некрозом (пассивная форма гибели клеток, связанная с изменением свойства проницаемости мембраны) эти процессы формируют условия для развития патологии. На рисунке 2 приведены описанные типы репарационных механизмов и гены, продукты которых вовлечены в востановление структурной целостности ДНК.

1.2.3 Реакция иммунной системы на радиационное воздействие Исследования воздействия радиации на организм человека и в частности на иммунную систему затруднено из-за сложности формирования когорт охарактеризованных по основным радиобиологическим, клиническим, биохимическим показателям. Большая часть экспериментов проводится на мышах или на культурах клеток. Так в экспериментах на мышах показано, что в отдаленном периоде после сублетального гаммаизлучения наблюдается снижение числа CD8+ лимфоцитов по сравнению с интактными животными, в то же время после фракционированного облучения общее число лимфоцитов увеличивалось с наибольшим повышением числа CD4+ клеток и снижением CD8+. В отдаленном периоде при действии малых доз на фоне лимфоцитоза зарегистрировано уменьшение субпопуляции Т-хелперов и повышение Т-лимфоцитов с супрессорной активностью. Кроме того отмечено нарастание фагоцитоза и других показателей функциональной активности неспецифического звена иммунитета [22].

Однако различия в строении иммунной системы людей и мышей (в том числе в относительной представленности типов клеток, созревании и дифференцировке клеток иммунной системы, экспрессии некоторых рецепторов, эффекте некоторых медиаторов и сигнальных молекул), а также ряд экспериментальных ограничений при работе с клеточными культурами часто не позволяют получить полную картину при изучении таких сложных Рисунок 2. Основные этапы процессов репарации нарушений структуры нуклеотидов (а) и двуцепочечных разрывов ДНК, а также гены, продукты которых участвуют в регуляции данных механизмов.

и многокомпонентных систем, как иммунитет. Поэтому приходится признать, что данные модели далеки от реальных условий и результаты таких экспериментов часто дают лишь отдаленное представление о принципах развития иммунных реакций в ответ на радиационное воздействие.

Несколько крупных техногенных катастроф, а также единственный в мировой истории случай военного применения атомной энергии (табл. 1) позволили приобрести печальный опыт в области клинических аспектов воздействия радиации на организм человека.

Длительные наблюдения за людьми, подвергшимися облучению показали, что иммунная система является одной из наиболее уязвимых к действию ионизирующего излучения. Иммуносупрессия является отличительной чертой острого радиационного синдрома, вызываемого средне- и высокодозным облучением. Так проспективное исследование лиц, выживших после атомной бомбардировки городов Хиросима и Нагасаки (Япония) показало значительное увеличение активности NK клеток с возрастом, причем абсолютное число CD16+ клеток у мужчин было значительно выше, чем у женщин [23]. В то же время число Т-клеток, в том числе CD4 + CD45RA + наивных клеток было значительно меньше относительно аналогичных показателей в контрольной группе индивидуумов, не подвергавшихся облучению. В целом, в исследованной когорте отмечался сдвиг баланса в относительной представленности популяций Т-клеток на фоне общей лимфопении [24]. В группе облученных людей была исследована также частота спонтанного мутагенеза в генах, кодирующих Т-клеточные рецепторы (TCR) и молекулы HLA класса I [25,26]. Частота возникновения спонтанных мутаций в этих генах достоверно превышала средние показатели, однако установить четкую зависимость от дозы облучения не удалось.

Накопление мутаций в генах, продукты которых ответственны за презентацию антигенов и регуляцию развития иммунного ответа, может сыграть решающую роль в специфичности их связывания с антигеном. В большей степени это относится к врожденным (наследуемым) особенностям кодирующих и регуляторных локусов. На рисунке 3 изображено, как полиморфизм генов может влиять на специфичность связывания молекулы HLA с пептидом. Замена всего одной аминокислоты приводит к изменению конформации пептида, изменению стерических условий взаимодействия и афинности связи. Это в свою очередь может запускать каскад дальнейших реакций, стимулирующих воспалительный процесс и вовлекающих в иммунный ответ новые клетки.

Отдельного внимания заслуживает процесс восстановления пула лимфоцитов, после облучения. Лимфоциты являются одними из наиболее уязвимых к токсическому действию радиации клеток. В условиях лимфопении, вызванной внешним (или эндогенным) воздействием, существует два пути восстановления популяции лимфоцитов: (1) из тимуса путем активации тимопоэза и (2) за счет клональной экспансии в периферических органах иммунной системы путем гомеостатической пролиферации [27]. Как правило, у взрослых людей функциональная активность тимуса подавлена, и восстановление популяций лимфоцитов происходит за счет гомеостатических механизмов. Сдвиг баланса в сторону экспансии олигоклональных клеток памяти приводит к уменьшению разнообразия представленных субпопуляций лимфоцитов и может стать причиной развития ауто- и аллоиммунных реакций, а также онкологических заболеваний [28,29].

В организме механизмы поддержания гомеостаза Т-клеток находятся под контролем эндогенных стимулов: цитокинов и комплексов MHCсобственный пептид [30]. Таким образом, фенотип и функциональные характеристики восстановленной популяции могут быть связаны с наследуемыми отличиями в эффективности экспрессии регуляторных молекул или в структуре их связывающих доменов.

Рисунок 3. Пептид m9 связывается с аллелями HLA-B*2705 и HLAB*2709, отличающимися единственной аминокислотой (замена Asp116His).

Соляные связи отмечены пунктирной линией. На рисунке видно, что различные аллели HLA формируют различные условия для связи с одним и тем же пептидом. Кроме того, изменяется структура самого пептида [31].

принципиальную роль играют цитокины, содержащие общую частности IL-7 и IL-15 [32,33]. Причем на особенности развития и активации лимфоцитов могут влиять как сами цитокины, так и их рецепторы [34,35].

Гомеостаз наивных Т-клеток регулируется IL-7 и комплексом MHC-собственный пептид, а гомеостаз CD8+ клеток памяти контролируется IL-7 и IL-15 [36] Исследование гуморального звена иммунитета у людей, подвергшихся воздействию радиации, показало, что общее число B-клеток обнаруживает тенденцию к уменьшению с возрастом, однако прямая зависимость числа клеток от дозы радиации отсутствует. Обнаружено достоверное повышение концентрации иммуноглобулина в сыворотке облученных индивидуумов [37].

Однако почти во всех упомянутых экспериментах, демонстрирующих важные аспекты функционирования иммунной системы, дозовая нагрузка варьировала в диапазоне от средних до высоких значений. При этом четкое понимание модифицирующего воздействия на организм человека низких доз на сегодняшний день отсутствует.

Различными авторами описано, как негативное воздействие хронического НДО на организм в целом и его защитные свойства в частности, так и положительное, характеризующееся увеличением продолжительности жизни и повышением эффективности иммунных реакций [38]. Таким образом, установление отличий, лежащих в основе формирования столь разнообразных эффектов в ответ на один и тот же тип воздействия, является одной из наиболее интригующих задач современной иммунологии. Особенно интересной и важной эта задача выглядит на фоне современных концепций о принципиальной роли иммунитета в защите организма от онкологических заболеваний.

ОСОБЕННОСТИ ОТВЕТА ТКАНЕЙ НА ИОНИЗИРУЮЩЕЕ

1.

ИЗЛУЧЕНИЕ

Патологические процессы, протекающие в тканях в ответ на радиационное воздействие, инициируются практически сразу после облучения, однако клинические и гистологические признаки патологии могут быть диагностированы спустя месяцы или даже годы после радиационного воздействия. По времени возникновения симптомов эффекты радиационного воздействия принято делить на острые и отсроченные. С клинической точки зрения их делят на детерминированные (результат облучения в высоких дозах) и стохастические (случайные эффекты, способные развиваться при любых, в том числе сколь угодно малых дозах облучения). На рисунке 4 приведены основные типы нарушений, клинические симптомы и диагнозы, ассоциированные с радиационным воздействием на этапах острого (раннего) и отсроченного (позднего) ответов.

Рисунок 4. Ранние и поздние (отсроченные) клинические симптомы, характерные для тканей, подвергшихся облучению.

1.3.1 Острые эффекты радиационного воздействия Острые эффекты, индуцированные радиационным воздействием, наиболее отчетливо проявляются на клетках, проходящих пролиферативный цикл. Так, например, часто делящиеся клетки эпителия кожи и желудочнокишечного тракта наиболее уязвимы к воздействию ионизирующего излучения. Негативный эффект облучения обусловлен в первую очередь физическим повреждением ткани и нарушением процессов регенерации, обусловленным поражением стволовых клеток. Ионизация и высвобождение свободных радикалов, вызванное облучением, приводят к нарушению жизненно важных компонентов клетки. Так нарушение структуры ДНК ведет к гибели клетки в первом цикле деления после облучения, реже в течение нескольких первых циклов [39].

Как было сказано выше, причиной гибели клеток во время митоза чаще всего являются неисправимые нарушения структуры хромосом или ошибки, допускаемые белками системы репарации ДНК и приводящие к патологическому изменению структурно-функциональных свойств хромосомного аппарата клетки. Еще одним распространенным путем гибели клеток является апоптоз. В норме естественный процесс апоптоза приводит к обновлению популяций клеток и удалению измененных клеток, в том числе несущих маркеры онкогенного перерождения [40].

Однако некоторые наиболее уязвимые представители клеточных популяций могут гибнуть под воздействием радиации, даже находясь в интерфазе [41].

1.3.2 Отсроченные эффекты радиационного воздействия Считается что отсроченные эффекты облучения возникают в тканях, характеризующихся пониженной скоростью обновления: в глубоких подкожных тканях мезенхимального происхождения, мышцах, почках и печени, а также в пределах тканей, содержащих оба вида клеток – и активно пролиферирующие и с замеденным типом обновления, как например ткани, формирующие стенки кишечника. Этой точки зрения придерживались на протяжении многих лет, однако с появлением новых данных стало понятно, что отсроченные эффекты облучения являются причиной не только прямого воздействия радиации на паренхиматозные и сосудистые клетки, но и результатом опосредованного взаимодействия клеток и сигналов в пределах органа или системы органов.

Так, например, в соответствии с современной теорией индукции опухолеобразования, одними из ключевых клеток, стимулирующих рост опухоли (посредством выработки факторов роста) и создающих условия для воспаления являются макрофаги [42]. В норме эти клетки призваны бороться с локальными источниками воспаления, путем привлечения других фагоцитов (развитие неспецифического ответа) или стимуляции специфического звена иммунитета. Однако в условиях гипоксии и повышенного содержания антигенов, спровоцированного облучением, данный механизм может приводить к развитию хронических процессов предшествующих формированию опухолевых клеток [43].

приводящим к сдвигу иммунологического гомеостаза и развитию аберрантных реакций и патологии. Нарушение функции или гибель клеток приводит к чрезмерной продукции цитокинов и факторов роста, что в зависимости от типа органа вызывает фиброз, некроз, атрофию или сосудистые повреждения. Воспалительный ответ ассоциирован с формированием коллагена, повышением проницаемости сосудов и активацией цитокинов стимулирующих рост фибробластов. Одним из таких цитокинов, играющих принципиальную роль в развитии отсроченных эффектов радиационного воздействия является TGFB. Он способен стимулировать фиброз тканей посредством индукции белков внеклеточного матрикса, ингибирования протеаз, вовлеченных в деградацию матрикса, стимуляции роста фибробластов и ингибирования пролиферации эндотелиальных клеток [44].

1.3.3 Онкогенное воздействие радиации О канцерогенном эффекте ионизирующего излучения известно с самых ранних этапов освоения атомной энергии [45]. Эти наблюдения неоднократно подтверждались при медицинском обследовании рабочих, предприятий атомной промышленности, лиц, переживших атомную бомбардировку, больных, перенесших лучевую терапию и у лабораторных животных, которые подверглись облучению.

новообразования, вызванные облучением, появляются через годы и десятилетия, не проявляя никаких особенностей, по которым их можно отличить от опухолей, вызванных другими причинами. На сегодняшний день многими авторитетными учеными в области онкологии и генетики постулируется факт наследуемой предрасположенности к развитию онкологических заболеваний. Результаты клинико-статистических исследований демонстрируют значительный генетический компонент в развитии большинства типов опухолей (рисунок 5) [46-48].

Большинство распространенных стохастических патологий примерно на треть обусловлены генетическим компонентом [49]. Эти данные послужили отправной точкой для разработки подробной генетической карты онкологических заболеваний. Однако в данном случае технологический прогресс опередил развитие фундаментальных представлений о способе наследования предрасположенности к онкологическим заболеваниям. Часто результаты одного геномного исследования не находят подтверждения в других работах. Причиной этому может служить множество факторов, в том числе: популяционно-генетические отличия в распределении генетических онкозаболеваниями, сложная архитектура наследования данного типа предрасположенности [50]. По всей видимости онкологические заболевания обусловлены как высокопенетрантными мутациями, так и большим числом генетических полиморфизмов, оказывающих незначительный эффект на риск развития заболевания [51]. Решение задачи установления достоверных генетических маркеров, ассоциированных с процессом канцерогенеза возможно при условии формирования комплексного подхода к проблеме.

Необходимо принятие стандартов валидации исследований, параметров тестируемых групп, а также оценки генетического риска.

Не смотря на то, что молекулярные механизмы радиационного канцерогенеза требуют дальнейшего изучения, но наблюдения показали, что во многих случаях воздействие проявляется в активации онкогенов и/или инактивации или потере гена-супрессора опухоли [52]. Кроме того, канцерогенные эффекты облучения напоминают воздействие химических канцерогенов, будучи сходно модифицированы гормонами, изменениями в питании и другими модифицирующими факторами. Стоит заметить, кроме того, что эффекты облучения могут быть аддитивными, синергическими или взаимно антагонистическими с такими химическими канцерогенами, в зависимости от специфики химикатов и особых условий в рассматриваемом случае [53].

Недостаточность имеющихся данных не позволяет однозначно описать взаимосвязь "доза-заболеваемость" для любых видов опухолей или определить, как долго после облучения остается риск того, что опухоль может увеличиваться у облученных людей. Любой риск, присущий низкому уровню облучения, может, следовательно, определяться только с помощью экстраполяции, основанной на моделях объединения предположений о подобных параметрах. Непороговые модели этого типа были применены при обработке эпидемиологических данных, касающихся японцев, переживших атомную бомбардировку, и других облученных людей, чтобы произвести оценку риска возникновения на протяжении жизни различных форм вызванного облучением рака. Однако при попытках прогнозировать риск рака, являющегося результатом низких доз и/или хронических доз облучения, результаты подобных оценок должны интерпретироваться с осторожностью, поскольку в экспериментах на лабораторных животных было показано, что канцерогенное воздействие рентгеновских и гамма-лучей уменьшается на порядок при значительно продленном времени облучения.

На самом деле, как отмечалось в других работах, имеющиеся данные не исключают возможности того, что может существовать порог эквивалентного миллизивертовой (mSv) дозе диапазона, ниже которого облучение может утратить канцерогенность [54].

Рисунок 5. Вклад генетического фактора в развитие онкологических заболеваний (по результатам исследования регистров близнецов Дании и Финляндии)

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ОПУХОЛЕОБРАЗОВАНИЯ

1. На сегодняшний день известно как минимум три супрессорных пути, препятствующих развитию опухоли или позволяющих компетентным клеткам своевременно реагировать на возникновение онкоперерожденных клеток. Первый основан на создании условий обязательной зависимости клеток от специфических сигналов, способных подавлять запуск программы гибели клетки (так например стабилизация внеклеточного матрикса препятствует его разрушению, вызывающему гибель клетки) [55,56].

Во второй путь вовлечены гены, регулирующие полярность делящихся клеток и контролирующие процессы клеточного взаимодействия и пролиферации. Запуск данного типа супрессии приводит к остановке клеточного цикла в случае идентификации нарушений, способных привести к гибели клетки или нарушению целостности ее генетического аппарата [57].

трансформации онкоперерожденных клеток посредством клеток иммунной системы [58].

Иммунная система защищает организм от опухолей, ассоциированных с вирусными инфекциями, элиминирует антигены, вызывающие воспаление и способна специфически распознавать и элиминировать клетки экспрессирующие опухолевые антигены. В последнем случае принято говорить об осуществлении иммунологического надзора за опухолевыми клетками, избежавшими действия других супрессорных механизмов.

Инструментарий иммунных клеток, осуществляющих иммунологический надзор за опухолями достаточно широк. Они способны к многообразным взаимодействиям с рецепторами митохондрий и компонентами пути, ответственного за запуск апоптоза и, таким образом, обладают к возможностью к выборочному уничтожению онкоперерожденных клеток [59].

1.4.1 Современная теория иммунологического надзора за опухолями За последнее столетие концепция иммунологического надзора за опухолями несколько раз претерпевала серьезные изменения. В конце 90-х годов прошлого столетия интерес к данному вопросу практически угас.

Однако с появлением новых данных о более интенсивном росте опухолей, пересаженных экспериментальным животным, обработанным антителами к интерферону гамма (IFNG), а также о большей чувствительности мышей с подавленной функцией IFNG к формированию метилхолантрен (MCA)ассоциированных сарком, интерес к проблеме иммунологического надзора за опухолями вновь возрос. С тех пор регулирующая роль иммунной трансплантированных опухолей неоднократно подтверждалась [60-62].

Важным этапом в развитии представлений о роли иммунной системы в защите организма от опухолей стало открытие влияния иммунных клеток не иммунодефицитных мышей с подавленной функцией IFNG или гена RAG2, регулирующего процесс рекомбинации, способны вызывать иммунный ответ у наивных мышей дикого типа, в то время как MCA-индуцированные опухоли иммунокомпетентных мышей демонстрируют стабильный рост [63]. Таким образом, опухоли, сформировавшиеся в условиях иммунной системы с ограниченной функциональностью, более иммуногены по сравнению о опухолями, сформировавшимся у животных с интактной иммунной системой. Эти данные несколько модифицировали теорию иммунологического надзора и в современной интерпретации она построена как на представлениях о протективном действии иммунной системы в отношении опухолей, так и на регулирующей роли иммунитета в изменении их свойств. Современная теория изучает три этапа взаимодействия иммунной системы с опухолью: фазу элиминации, фазу равновесия и фазу потери иммунлогического контроля над опухолеобразованием.

1.4.2 Фаза элиминации В фазе элиминации молекулы и клетки врожденного и приобретенного иммунитета работают в тесной связке с целью установления и уничтожения опухоли еще до проявления клинических симптомов. Этот процесс ни разу не был подтвержден в экспериментах in vivo, однако в экспериментах на мышах, дефицитных по определенной популяции иммунных клеток, рецепторам распознавания (линии Rag1-/-, Rag2-/-, Stat1-/- Ccl11-/- и др.) эффекторным путям или цитокинам (CD80-/-, Il12b-/-, Il23a-/-, Trail-/- и др.) удавалось показать раннее развитие или более высокую пенетрантность неоплазм [64-66]. Иногда результаты этих экспериментов находят подтверждение в клинике онкозаболеваний человека. Таким образом, можно предположить, что, не смотря на ряд отличий в строении и функциональных особенностях иммунной системы человека и мыши, основные этапы онкогенеза построены на общих механизмах [67].

В основе представлений о роли иммунной системы в элиминации опухолей у мышей лежат три модели: модель индукции опухолеобразования канцерогенными веществами, модель спонтанного онкогенеза, предрасположенности к онкозаболеваниям [68]. В фазе элиминации принимают участие как клетки врожденного так и приобретенного иммунитета. Показано, что мыши, дефицитные по Т, B и NK клеткам более предрасположены к развитию MCA-индуцированных опухолей [69]. Кроме того результаты экспериментов с мышами дефицитными и Т супрессии опухолеобразования [70]. Т-клеточные рецепторы (TCR) также являются принципиальным компонентом в реализации иммунологического надзора за опухолями. Мыши, Т-клетки которых не экспрессируют эти рецепторы характеризуются повышенной предрасположенностью к опухолеобразованию [71].

Пути регуляции спонтанного канцерогенеза основаны на эффекторных механизмах, реализуемых Т и NK клетками. Инактивация других цитотоксических путей, например TRAIL и FasL также повышает риск спонтанной индукции опухолеобразования. Эти данные указывают на иммунологического надзора [72-73].

Генетические модели канцерогенеза указывают в первую очередь на значимость генов, принимающих участие в супрессорных механизмах контроля за опухолями. Так мыши дефицитные по гену p53 демонстрируют повышенный уровень предрасположенности к онкозаболеваниям [74].

В последнее время значительный прогресс отмечен в области установления факторов генетической предрасположенности к развитию онкологических заболеваний человека. Это связано с удешевлением технологий геномного анализа и проведением массовых клиникостатистических исследований с целью установления маркеров наследуемой предрасположенности к различным типам рака [75-78]. Признанным молекулярно-генетических исследований, когда определение маркерных генов проводится на основании экпериментальных данных, полногеномные исследования являются вариантом «слепого» поиска. В качестве маркеров распространенный тип биаллельных вариаций единичных нуклеотидов.

охарактеризованных по интересующим клиническим показателям. Далее на основании статистического анализа делается вывод о значимости данного полиморфизма, как маркера исследуемого признака [79].

1.4.3 Фаза равновесия Некоторые типы опухолевых клеток способны уходить от действия иммунной системы. Эти клетки переходят в следующую фазу, на которой иммунная система способна контролировать их рост – фазу равновесия.

Считается что опухолевые клетки, перешедшие в фазу равновесия, не способны проявлять патогенных свойств и остаются безопасными на протяжении всей жизни организма. В фазе равновесия иммунная система и опухоль находятся в состоянии динамического баланса, когда компоненты противоопухолевого иммунитета активны, однако не способны полностью элиминировать гетерогенную популяцию опухолевых клеток, часть из которых научилась избегать действия иммунной системы. Так обработка наивных мышей дикого типа небольшими дозами MCA приволит к явной индукции опухолеобразования лишь у незначительного числа подопытных животных. Однако при создании условий лимфопении (понижения уровня CD4+ и CD8+ лимфоцитов) или инактивации IFNG примерно у половины мышей без клинических симптомов обнаруживается интенсивный рост опухолей [80]. Аналогичные получены в экспериментах по исследованию канцерогенного воздействия УФ-излучения [81].

опухолеобразованием опухолевых клеток (в том числе под воздействием иммунной системы) или в случае изменения функциональных свойств иммунной системы, вызванного старением или нарушением баланса защитных механизмов. Именно эта фаза проявляется клинически, поэтому поиск причин, лежащих в ее основе, является приоритетной задачей современной науки и медицины.

На сегодняшний день основной причиной «отказа» механизмов иммунологического надзора за опухолями считаются случайные генетические и эпигенетические изменения в опухолевых клетках, приводящие к их трансформации, и позволяющие избегать действия врожденного и приобретенного иммунитета. В основе этого процесса лежит «естественный отбор» клеток опухоли способных оставаться невидимыми для иммунной системы и, таким образом, имеющих преимущества в плане выживаемости перед другими клетками [82].

Развитие условий, благоприятствующих потере иммунологического контроля над опухолью возможно на фоне индукции механизмов иммунологической толерантности. Отсутствие нео-антигенов, экспрессированных на поверхности опухолевых клеток, не позволяет Тклеткам, прошедшим селекцию против собственных антигенов, распознать эти клетки и запустить механизмы приобретенного иммунитета [83-84].

Кроме того опухолевые клетки могут накапливать дефекты в генах регулирующих процессинг и презентацию антигенов. Нарушения экспрессии молекул TAP1, MHC, LMP2 и LMP7, а также потеря восприимчивости к IFNG приводит к пргрессии развития опухоли и блокированию элиминации, опосредованной Т-клетками [85-87].

Описанные эксперименты дают достаточно полное представление о механизмах регуляции развития онкопатологий. Понятно, что негативные эффекты радиационного облучения и, в первую очередь онкопатологии, вызваны нарушением иммунологического гомеостаза. Описанные выше изменения в структуре популяций иммунных клеток, а также мутационный процесс, приводящий к повышению частоты мутаций в генах, кодирующих основные молекулы иммунной системы, играют принципиальную роль в их развитии.

НАСЛЕДУЕМОСТЬ ФЕНОТИПА, ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО К

1.

РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ

Несмотря на проведение многочисленных исследований мутагенов (и в частности радиации), как факторов предрасположенности к онкозаболеваниям, вопрос самой наследуемости фенотипа, характеризующегося повышенной или пониженной чувствительностью к мутагенам до последнего времени оставался открытым. Как правило установить вклад генетического фактора в формирование исследуемого признака можно с помощью оценки встречаемости признака в парах монозиготных и дизиготных близнецов. Так, например, показатель генетической конкордантности по сахарному диабету 1 типа значительно выше у монозиготных близнецов по сравнению с дизиготными, что свидетельствует о значительной роли генетической составляющей в развитии данного заболевания. Аналогичное исследование было проведено с целью оценки наследуемой предрасположенности к действию нескольких химических мутагенов, а также к воздействию -излучения. По результатам исследования 148 пар монозиготных близнецов, 57 пар дизиготных близнецов и 50 сиблингов удалось показать достоверный вклад генетического компонента в развитие чувствительности ко всем исследованным мутагенам, в том числе к радиации. Биометрическое генетическое моделирование показало, что генетическая наследуемость фенотипа, характеризующегося повышенной чувствительностью к -излучению составляет 62,5% [88].

ОЦЕНКА РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ С ПОМОЩЬЮ

1.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНТИЧЕСКИХ ТЕСТОВ

Оценка доз при воздействии внешних источников излучения обычно выполняется или на основе данных индивидуального мониторинга с помощью дозиметров, или в случае ретроспективных оценок посредством оценки амбиентного эквивалента дозы H* с последующим использованием соответствующих коэффициентов перехода [89].

Оценка доз внутреннего облучения, обусловленных поступлением радионуклеидов в организм человека возможна либо посредством прямых измерений (например мониторинг излучения исходящего с поверхности всего тела человека или от отдельных органов и тканей), либо с помощью косвенных измерений (например измерений биообразцов) или по применением биокинетических моделей) [90].

Однако в профессиональных условиях работы с источниками ионизирующих излучений возможно возникновение нештатных ситуаций, когда определение поглощенной дозы с помощью физической дозиметрии может быть ограниченно или невозможно. В этих случаях могут быть применены биологические методы дозиметрии, которые позволяют оценить суммарный эффект от воздействия радиации с учетом индивидуальных особенностей облученного организма. Такая информация имеет, несомненно, большое значение для оказания своевременной эффективной помощи в случае острого радиационного воздействия, а также для прогностической оценки возможных отдаленных последствий облучения.

Наибольшее распространение получили методы биодозиметрии, основанные на анализе частоты радиационно-индуцированных генетических изменений в соматических клетках – геномных хромосомных или генных мутаций [91,92]. Одним из самых известных на сегодняшний день является цитогенетический метод, при котором в качестве биологического маркера облучения используются хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови [93]. Материалы многочисленных отечественных и зарубежных цитогенетических исследований послужили основой для выработки рекомендаций ВОЗ, МАГАТЭ, НКДАР ООН по практическому использованию данного метода при определении доз облучения [94].

Радиобиологической основой для применения цитогенетического метода в дозиметрии является высокая чувствительность лимфоцитов периферической крови, а также наличие специфичных для радиации хромосомных перестроек, дозовая зависимость частоты которых для большинства видов ионизирующих излучений хорошо изучена. Под воздействием радиации могут возникать два типа хромосомных аберраций:

нестабильные (дицентрики, центрические кольца, ацентрические фрагменты) и стабильные (реципрокные и другие типы транслокаций) [95].

Чаще всего для оценки величины поглощенной организмом дозы используют частоту возникновения обменных аберраций нестабильного типа, а именно, дицентрических хромосом. Преимущество дицентриков состоит в том, что аберрации данного типа являются специфичными для воздействия ионизирующих излучений, их легко обнаружить в световом микроскопе без применения сложных методов обработки и окрашивания хромосомных препаратов [96]. Однако следует иметь ввиду, что клетки, несущие такие аберрации, образуют при делении генетически несбалансированные клетки, что в дальнейшем приводит к их элиминации.

Поэтому успешное применение нестабильных аберраций для определения дозы облучения в основном возможно в ранние (до 3-4 месяцев) сроки после однократного относительно равномерного радиационного воздействия. В случае хронического облучения и при ретроспективной оценке дозы радиационного воздействия необходимо применение различных математических моделей, учитывающих либо процесс элиминации подобных клеток из кровотока, либо особенности распределения аберраций по клеткам [97].

Определить степень радиационного поражения организма, а также оценить дозу облучения спустя длительное время после радиационного воздействия или в случае хронического облучения возможно с помощью стабильных хромосомных аберраций (транслокаций) в лимфоцитах периферической крови. Это возможно благодаря тому, что такие повреждения хромосом не нарушают течения митоза и могут передаваться в ряду клеточных поколений, то есть частота транслокаций не должна подвергаться значительным изменениям со временем [98].

В последние годы для определения частоты стабильных хромосомных аберраций (транслокаций) широко используют метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) который позволяет визуализировать отдельные хромосомы или участки хромосом (рисунок 6).

Развитие методов молекулярно-генетического анализа позволяет прейти на принципиально иной уровень установления генетического полиморфизма уровень одиночных нуклеотидных замен. Оценка наследуемых и приобретаемых de novo свойств молекул открывает новые возможности в установлении молекулярно-генетических маркеров чувствительности к радиационному воздействию. Доступность этих методов определяет их преимущество перед классическими методами молекулярной генетики и определяет перспективность их включения в комплекс мер по повышению радиационной безопасности, в том числе оценке рисков развития негативного воздействия радиации и предотвращению развития радиационно-индуцированных заболеваний.

Рисунок 6. Результаты оценки различных типов генетических вариаций (делеций, дупликаций, изменения числа повторов) с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

СВЕДЕНИЯ ОБ ИССЛЕДОВАННЫХ ВЫБОРКАХ

2. Было обследовано 220 человек. Первую группу (группа - RR) составили 70 образцов геномной ДНК из коллекции Уральского научнопрактического центра радиационной медицины, полученных от неродственных пациентов–жителей прибрежных сёл р. Теча, подвергшихся длительному комбинированному облучению: внешнему - и внутреннему, обусловленному инкорпорацией 90Sr в костную ткань.

ФГУН Уральский научно-практический центр радиационной медицины ведет многолетний мониторинг изменений в клеточном составе крови облученных жителей. Анализ изменений клеточного состава крови и способности лимфоцитов периферической крови облученных лиц к адаптивному ответу позволяют по характеру адаптивного потенциала разделить обследуемых индивидуумов на 4 группы: лиц с адаптивным ответом, лиц с недостоверным адаптивным ответом, лиц с недостоверным повышением радиочувствительности и лиц с достоверным повышением радиочувствительности. Причем единственным показателем анализов крови, достоверно связанным с адаптивным потенциалом, является абсолютное содержание в крови лимфоцитов, которое снижается в ряду от лиц с достоверным адаптивным ответом до лиц с достоверным повышением радиочувствительности. В этом же ряду достоверно уменьшается суммарное число лиц, у которых содержание нейтрофилов в крови выше или ниже нормы. По сравнению с другими группами, среди лиц с достоверным адаптивным ответом гораздо реже встречаются люди с тромбопенией, и нет лиц с повышенным содержанием тромбоцитов [99-101].

Именно из лиц, характеризующихся достоверным адаптивным ответом, была сформирована группа сравнения RR. Показатель медианы накопленной дозы на красный костный мозг составил 1,23 Зв. Выборка включала представителей русской популяции, а также объединенной группы татарской и башкирской популяций тюркской ветви алтайской языковой семьи (25 и 45 человек, соответственно) 1933-1949 года рождения.

Обследованные лица не имели серьёзной соматической патологии.

Во вторую группу (группа RS – 50 человек) вошли пациенты с клиническими признаками соматической патологии, возраста 38-64 лет, подвергшиеся профессионально-ассоциированному облучению в рамках предельно допустимых концентраций. Образцы собраны в ходе проспективного исследования контингентов, задействованных на предприятиях атомной промышленности, и предоставлены ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России.

Данные по онкогенному воздействию радиации в режиме предельно допустимых доз часто не учитывают дополнительных клинических показателей, без которых оценка риска радиационно-индуцированного канцерогенеза затруднена. Данные по животным (в основном грызунам) свидетельствуют о прямо пропорциональной зависимости между дозой и риском развития онкопатологий. Однако существует ряд примеров непрямой порогоподобной зависимости, например, при индукции тимусной лимфомы и рака яичника у мышей.

Для оценки коэффициентов риска развития онкопатологий у людей чаще всего применяют эпидемиологические данные. На основании этих данных рассчитываются коэффициенты номинального риска, радиационный вред и взвешивающие коэффициенты ткани, которые впоследствии применяются при расчете допустимых доз для целей радиационной защиты сотрудников предприятий атомно-промышленного комплекса.

В нашем случае можно говорить о тенденции к повышению встречаемости онкологических заболеваний в мониторируемой группе по сравнению с популяционными данными. Однако сделать выводы о статистической достоверности таких отличий на данном этапе исследований не представляется возможным. Кроме того, отсутствуют данные по дополнительным клиническим показателям, которые позволили бы провести оценку адаптивного потенциала лиц из исследованной группы, а также данные по анамнезу заболевания. Поэтому выделение в отдельную группу проведено лишь на основании показателя наличия/отсутствия онкопатологии на момент проведения исследования.

В третью группу (популяционный контроль - P) вошли образцы ДНК, полученные от 100 здоровых представителей русской популяции – доноров первичной кроводачи из коллекции «Института иммунологии» ФМБА России, собранной на базе ФГБУ Российский научный центр хирургии им.

акад. Б.В. Петровского РАМН. В состав группы вошли индивидуумы, проживающие на территории Центрального, Южного, Волжского, Уральского и Северного-западного федеральных округов РФ.

использовали эталонные выборки из популяций европейского (CEU – неродственных представителей) и азиатского (CHB – 45 неродственных (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov ).

ОЧИСТКА ДНК ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

2. Очистку ДНК проводили по стандартной процедуре [102]. 0,5 мл крови, взятой с ЭДТА в качестве антикоагулянта, смешивали в 1,5 мл пробирках типа Эппендорф с 0,5 мл лизирующего раствора, состоящего из 0,32 М сахарозы, 10 мМ Трис-HCl рН 7,5, 5 мМ MgCl2, 1% Tритона Х-100, центрифугировали в течение 1 мин. При 10000 об/мин, супернатант удаляли, а осадки клеточных ядер два раза промывали указанным буфером.

Последующий протеолиз проводили в 50 мкл буферного раствора, содержащего 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl pH 8,3, 2,5 мМ MgCl2, 0,45% NPТвина-20 и 250 мкг/мл протеиназы К при 37С в течение 20 мин.

Инактивировали протеиназу К нагреванием в твердотельном термостате при 95 С в течение 5 мин. Полученные образцы ДНК сразу использовали для типирования, либо хранили при –20С в ТЕ-буфере. Концентрация ДНК, определенная по флуоресценции с Hoechst 33258 на ДНК-флуориметре (Hoefer, США), составляла в среднем 50-100мкг/мл. Общее время процедуры выделения ДНК составляло 30-40 мин.

ВЫБОР ГЕНОВ

2. На основании полученных ранее экспериментальных данных [103а также результатов исследований, подтверждающих влияние полиморфизма генов на чувствительность тканей к радиационному воздействию [107,108], были выбраны 5 кандидатных SNP-маркеров в четырех генах: ATM (2 маркера), TGFB1, XRCC1 и OGG1 (табл. 2). Серинпротеиновая киназа ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) принимает участие в фосфорилировании белков репарарации ДНК, регуляции механизма апоптоза в ответ на формирование двуцепочечных разрывов ДНК, а также в стабилизации супрессорного опухолевого белка p53. Трансформирующий фактор роста бета TGFB1 вовлечен в ответ клетки на стрессорное воздействие (цитотоксические препараты, ионизирующее излучение, температурный шок, окислительный стресс), а также является медиатором системы передачи сигнала между компонентами врожденного и приобретенного иммунитета (KEGG:hsa04010, hsa04060). Оба гена являются важными компонентами систем репарации ДНК и регуляции клеточного цикла, нарушения в которых связаны с процессом канцерогенеза (KEGG:hsa05200). Гены XRCC1 и OGG1 кодируют тесно связанные продукты регулирующие процесс гомологичной рекомбинации и репарации одноцепочечных разрывов ДНК (KEGG:hsa03410). На рисунке 7 приведены основные этапы восстановительных путей и указано место выбранных генов в их реализации.

Рисунок 7. Место выбранных генов в системе эксцизионной репарации ДНК.

С точки зрения иммунной системы наиболее критическим параметром, влияющим на эффективность и специфичность иммунных реакций в ответ на облучение, является система восстановления популяций лимфоцитов и система предоставления антигенов (в том числе нео-антигенов) эндогенного и экзогенного для клетки происхождения.

Для установления ассоциации вариантов генов иммунного ответа с устойчивостью к радиационному воздействию, было проведено исследование частоты аллелей генов IL-7 (rs2717536), IL15-RA (rs2296135), а протестированных в работе вариантов генов IL-7 и IL-15RA ранее была установлена ассоциация с аутоиммунными и онкологическими заболеваниями (http://www.gwascentral.org ) Кроме того мы включили в панель несколько маркеров, связанных с повышенным риском развития ЗНО по результатам полногеномных ассоциативных исследований – GWAS (Genome-Wide Association Study) (www.genome.gov/gwastudies). Этот подход основан на статистической оценке ассоциации генотипа с признаком без учета экспериментальных данных. Было выбрано 4 маркера из региона 8q24 на 8 хромосоме, для которых установлена ассоциация с раком простаты, прямой кишки и молочной железы [109-112] (табл. 2). Все SNP-маркеры проверяли на независимое наследование с помощью базы HapMap Национального Центра Биотехнологической Информации США (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov ).

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ

2. Генотипирование образцов по выбранным SNP-полиморфизмам проводили методом полимеразной цепной реакции с использованием аллель-специфичных репортерных проб и отдельной акцепторной пробой (рис. 8). Детекцию аллелей проводили методом анализа плавления ДНК-дуплексов. Точность использованных систем была подтверждена повторным Таблица 2. Кандидатные SNP-маркеры и аллели HLA класса II, включенные в исследование генотипированием выборки образцов методом секвенирования по Сэнгеру [113]). ПЦР проводили в детектирующем амплификаторе ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия) по следующей программе: 94С – 10 с, 64 – 20 с, 72С – 10 с в течение 40 циклов, с измерением флуоресценции на этапе плавления проб. Последовательности праймеров и проб приведены в таблице 3.

Генотипирование по 34 аллелям генов HLA-DRB1, DQA1 и DQB проводили с помощью тест-систем, предоставленных ЗАО «НПФ ДНКТехнология». Тест-системы позволяют в режиме реального времени определять аллели генов HLA на среднем уровне разрешения.

В ходе работы по оптимизации условий проведения полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» использовались наборы по 6 детектирующих олигонуклеотидов для каждого полиморфизма. Три из них – на «+» цепь ДНК (два репортерных и один акцепторный) и 3 на «-» цепь ДНК. Таким образом, каждый набор олигонуклеотидов был синтезирован в двух вариантах, по одному на каждую из комплементарных цепей. Это было сделано для повышения вероятности получения эффективных олигонуклеотидов и возможности выбора оптимально работающей системы.

Опытным путем были выбраны системы олигонуклеотидов, специфично детектирующие аллельные варианты исследуемых локусов, а так же определен состав реакционного буфера и оптимизированы условия проведения ПЦР (табл. 4).

Оптимальную температуру отжига праймеров определяли постановкой ПЦР на градиенте температур отжига праймеров в диапазоне 60 – 72С, с последующей оценкой количества ПЦР продукта методом агарозного гельэлектрофореза. Для постановки электрофореза использовали источник тока «Эльф» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия) и камеру для электофореза (ООО «Компания Хеликон», Россия).

2.5 СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПРОДУКТОВ ПЦР

В качестве референсного метода определения генотипа образцов использовали секвенирование по Сэнгеру. Секвенировали по пять образцов каждого генотипа по всем исследуемым полиморфизмам (данные не приведены). Генотип образцов определяли с помощью разработанных тестсистем.

Таблица 3. Последовательности праймеров и проб для генотипирования полиморфизмов rs1801516 rs664677 rs1800469 rs1799782 rs rs2717536 rs

5'- GCT TTG GCA AGG TGA GTA TGT TGG

5'- CGC TAT TTC CTC TCC TTT GTT AGA

5'- ACT TCC AAT ATG TCT TTC TGT GCT

5'- CGC AGC AGT ATG TTG AGT TTA TGG

5'- GTC GAA GAC AGC TGG TGA AAA

ATM1673-as ATC CCT -3' ATM16_fpg3 (FAM) ATM16_vpa3 (VIC)

5'- ATG GAG AAA TCT GCT TTC TAC ACA

ATM1673_bp -3'-(P)

5'- AAA GGA GAG CAA TTC TTA CAG GTG

5'- CCC AGA ACG GAA GGA GAG TCA

TGF_fpc 5'- CTT CCA TCC CTC AGG T -3'-(FAM) TGF_vpt 5'- CTT CCA TCC TTC AGG T -3'-(VIC) XRCC1-vp 3'-(VIC) 5'-TGA TTA CGG TGC TCC CTG TCA TA-3'проба XRCC1-fp (FAM) XRCC1-bp 3'-(P) OGG1-s OGG1-as OGG1-fp 5'-GAT GAG GGC TGG GTC TCA CTC TG- репортерная OGG1-vp 3'-(VIC) OGG1-bp 5'- AAA TCT GCT TTC TAC ACA -3'-(P)

5'- GCG AGT ATG TTG AGT TTA TGG CAG

5'- AAC GAC AGC TGG TGA AAA ATC CCT

IL7-fp 5'- TTA GTA CAA ATG AAT C -3'-(FAM) IL7-vp (VIC) 5'- ATG GAG AAA TCT GCT TTC TAC ACA акцепторная IL7-bp -3'-(P) IL15RA-s 5'- CGC TTG AGT TTA TGG CAG -3' IL15RA-as 5'- GTC GAA TGG TGA AAA ATC CCT -3' 5'- TTA CTC CAA GTA CAA ATG AAT C -3'- репортерная IL15RA-fp (FAM) IL15RA-vp (VIC) IL15RA-bp (P) Денатурация, отжиг праймеров и элонгация Рисунок 8. Для увеличения вероятности синтеза работоспособных олигонуклеотидов, на каждую из комплементарных цепей ДНК были созданы отдельные системы олигонуклеотидов, каждая из которых включала пару общих праймеров, фланкирующих регион, содержащий полиморфизм и по 3 олигонуклеотидных пробы на каждую из комплементарных цепей ДНК. Репортерные пробы несут молекулы флуорофоров, способные излучать флуоресценцию определенной длины волны. В свою очередь общая акцепторная проба несет молекулу «гасителя флуоресценции», способную принимать на себя энергию флуорофора при условии, что репортерная и акцепторная молекулы расположены в непосредственной близости. Динамика денатурации формирующихся ДНКдуплексов при повышении температуры реакции, позволяет судить о генотипе исследуемого образца.

Таблица 4. Оптимальный состав реакционного буфера dNTP’s Taq-полимераза (деионизированная) 2.5.1 Проведение ПЦР для получения матрицы для сиквенсной реакции комплементарные участкам выше и ниже полиморфного участка.

Последовательности праймеров приведены в таблице 3. ПЦР проводили в стандартных условиях, определенных ранее для реакций генотипирования (табл. 2) в амплификаторе «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология») по следующей программе: 94 – 10 с, 64 – 20 с, 72 – 10 с в течение циклов.

2.5.2 Проведение сиквенсной реакции В сиквенсной реакции использовали один из праймеров (табл. 3) и набор меченых дидезоксирибонуклеотидтрифосфатов (BigDye Terminator Kit, Applied Biosystems, США). Реакцию проводили в амплификаторе «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология») в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем, по следующей программе: 94 – 10 с, 56С – 20 с, 72С – 20 с в течение 40 циклов.

2.5.3 Секвенирование Дальнейшая подготовка продукта для проведения реакции секвенирования включала химическую денатурацию матрицы с помощью денатурирующего буфера TSR (Template Suppression Reagent, Applied Biosystems, США) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Секвенирование проводили с помощью автоматического секвенатора ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям производителя.

2.6 БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ Приготовление реактивов, входящих в состав наборов для амплификации Состав буфера для проведения ПЦР 93 мМ Трис-HCl (рН 8,6) 25 мМ (NH4)2SO 1,8 мМ MgCl 0,003% Tween- Приготовление 1,25 кратного ПЦР-буфера Для приготовления 1 л 1,25x-буфера слить 116 мл 1М Tris-HCl pH 8,6, 4,5 мл 0,5М MgCl2, 0,38 мл 10% Tween-20 и довести объем mQ примерно до 900 мл. Растворить в 50 мл mQ 4,6 г сульфата аммония и прилить к основному раствору. Довести объем до 1 л в мерной посуде. Стерилизовать автоклавированием. Хранить при +4С.

Состав TE-буфера 10 мМ Tris-HCl (pH 8,6) 1 мМ ЭДТА Приготовление ТЕ – буфера Для приготовления 1,0 л буфера в мерном стакане на 1000 мл смешать 10 мл 1М Tris-HCl pH 8,6 и 5 мл 0,2М ЭДТА рН 8,0. Добавить mQ примерно до 950 мл, проверить рН: если необходимо – довести с помощью 2N HCl.

Довести объем до 1 л.

Приготовление реактивов, входящих в состав наборов для электрофореза Состав TBE-буфера 89 мМ TRIS (основного) 89 мМ борной кислоты 2 мМ ЭДТА (pH 8,0) Приготовление 10 кратного TBE-буфера Для приготовления 1 л 10 кратного TBE-буфера добавить в мерную колбу 108 г TRIS (основного), 55 г. борной кислоты, 40 мл 0,5М ЭДТА (pH 8,0) и довести объем mQ до 1 л.

Состав геля для электрофореза TBE-буффер – 1% Агароза (Sigma Aldrich, США) – 1% Бромистый этидий – 0,01% Приготовление геля для электрофореза Для приготовления геля для электрофореза в мерном стакане на 50 мл смешать 25 мл 1% TBE-буфера, 0,25 г агарозы и 1 мкл бромистого этидия.

Разогреть смесь в микроволновой печи до полного расворения агарозы.

Залить смесь в камеру для приготовления гелей. Дать остыть в течение минут.

2.7 СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Частоту аллелей вычисляли по формуле:

где n – встречаемость аллеля. N – число исследованных образцов.

Отклонение от ожидаемого распределения оценивали методом 2 (p < 0,05).

ИСПОЛЬЗОВАННОЕ В РАБОТЕ ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ

2.

И БАЗЫ ДАННЫХ

последовательностям, а также рассчитывать приблизительную температуру отжига праймеров.

Chromas. Позволяет переводить в текстовый формат хроматограмы, полученные в результате секвенирования.

Пакет программ Microsoft office 2000.

Интернет ресурсы:

Сервер NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov ).

поддерживаемая NIH (National Institutes of Health), содержащая коллекцию общедоступных последовательностей ДНК, РНК и белков (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html ).

РЕЗУЛЬТАТЫ

РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОГО ВАРИАНТА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ

3. ВЫЯВЛЕНИЯ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНОВ ATM (1801516, RS664677), TGFB (RS1800469), XRCC1 (RS1799782), OGG1 (RS1052133), IL-7 (RS2717536), IL15-RA (RS2296135) В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ В ходе работы созданы тест-системы для выявления аллелей генов ATM (rs1801516, rs664677), TGFB1 (rs1800469), XRCC1 (rs1799782), OGG (rs1052133), IL-7 (rs2717536), IL15-RA (rs2296135) в геноме человека методом ПЦР «в реальном времени». Тест-системы представляют собой комплекты синтетических реагентов (биомолекул), буферных растворов, а также сертифицированных технических средств визуализации и анализа.

Оригинальные модификации, используемые при конструировании биомолекул, позволяют повысить аналитическую чувствительность технологии по сравнению с существующими аналогами. Преимущества предлагаемой модификации метода в области оптики (перенос энергии флуоресценции) и биотехнологии (биосинтез, биоинформатика) определяют ее превосходство над аналогичными разработками.

Использованная в работе модификация метода позволяет проводить одновременную детекцию обоих аллелей ДНК. Из существующего разнообразия флуоресцентных методик нами был выбран наиболее эффективный, на наш взгляд, подход к определению полимофизмов с помощью аллель-специфичных проб и анализа кривых плавления ДНКдуплексов. Для идентификации аллелей проводили ПЦР с праймерами, фланкирующими полиморфный участок генома. Условия реакции подбирали так, чтобы максимизировать разницу в эффективности некомплементарной пробы. Таким образом, если анализируемый образец содержит только один вариант последовательности (то есть гомозиготен по комплементарной пробы будет выше температуры денатурации частично некомплементарной пробы (рис. 9А). Если же анализируют гетерозиготный образец, обе пробы будут денатурировать на примерно одинаковых температурах (рис. 9Б). Регистрацию сигнала осуществляли при помощи молекул флуорофора (по одному на каждый из тестируемых аллелей) и «гасителя флуоресценции». В данной модификации метода использовали отдельную «акцепторную» пробу примыкающую к аллель-специфичной «репортерной» пробе. Такой подход позволил существенно упростить условия проведения реакции.

dF/dT Рисунок 9 Графики плавления ДНК-дуплексов, полученные с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96. A - результат исследования гомозиготного образца. Зеленая кривая отражает динамику денатурации частично некомплементарного праймера; Б - результат исследования гетерозиготного образца.

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ОБРАЗЦОВ

3. С помощью разработанных тест-систем были определены генотипы 220 образцов из исследуемых групп сравнения по 7 полиморфизмам: ATM (rs1801516, rs664677), TGFB1 (rs1800469), XRCC1 (rs1799782), OGG (rs1052133), IL-7 (rs2717536), IL15-RA (rs2296135). Для оценки возможной ассоциации генетических маркеров с риском развития онкопатологий в группах сравнения использовали тест-системы, позволяющие определять генотип по 4 аллелям локуса 8q24, изготовленные в рамках научноисследовательской разработки, проводимой отделом иммуногенетики ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» совместно с РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Результаты генотипирования приведены в таблице 5.

Таблица 5 Результаты генотипирования биообразцов по 11 исследованным SNP-маркерам rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs rs *Частота минорного аллеля для популяции в исследованной группе выше Генотипирование по 34 аллелям генов HLA-DRB1, DQA1 и DQB проводили с помощью тест-систем, предоставленных ЗАО «НПФ ДНКТехнология». Тест-системы позволяют в режиме реального времени определять аллели генов HLA на среднем уровне разрешения. Результаты генотипирования приведены в таблице 6.

ПРОВЕРКА СООТНОШЕНИЯ ХАРДИ-ВАЙНБЕРГА ДЛЯ

3.

ИССЛЕДОВАННЫХ АЛЛЕЛЕЙ

исследуемый генотип, может влиять на представленность аллелей в популяции. Для проверки этой гипотезы сравнивали полученные результаты с равновесным распределением Харди-Вайнберга. Для сравнения использовали критерий 2.

соответствовали распределению Харди-Вайнберга.

Таблица 6 Результаты генотипирования биообразцов по 34 исследованным аллелям HLA.

ХАРАКТЕРИСТИКА ЧАСТОТНОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ

3.

ИССЛЕДОВАННЫХ АЛЛЕЛЕЙ В ГРУППАХ СРАВНЕНИЯ

3.4.1 Распределение аллелей в европейской и азиатской популяции относительно исследованных групп Группа облучённых людей, проживающих в селах на побережье р. Теча, неоднородна по этническому составу. Большая часть группы (64%) представлена лицами тюркской этнической принадлежности (татары, башкиры). Чтобы исключить возможность отклонений, вызванных отличиями в распределении маркеров в различных популяциях, нами был проведен сравнительный анализ частот аллелей исследованных SNP в референтных популяциях азиатского (CHB) и европейского (CEU) происхождения, представленных в базе данных HapMap относительно выборки P из русской популяции. По результатам анализа большинство SNP-маркеров за исключением rs1052133 (ген OGG1), rs1801516 (ген ATM) и rs1799782 (ген XRCC1) попали в группу, характеризующуюся сходным распределением во всех трех группах сравнения. Таким образом, можно исключить влияние фактора геномного разнообразия отдельных популяций, этносов, этнотерриториальных сообществ (популяционной стратификации) при исследовании распределения маркеров в выбранных группах. Отличия в частоте аллелей генов OGG1, ATM и XRCC1 установлены только для групп P и CHB. В то же время в группе P и CEU указанные маркеры распределены одинаково (без статистически достоверных отличий) (рис. 10А).

Частота аллеля G в гене OGG1 варьирует от 0,22 среди европейцев до 0,55 в популяциях Китая и Японии. Другой маркер, rs1801516, расположенный в гене ATM (аллель T), практически не встречается в популяциях азиатского происхождения и, напротив, широко распространен в европейской этнической группе (0,19). Частоты аллелей SNP-маркеров по-разному представленных в популяциях европейского и азиатского региона могут отличаться и в пределах популяционной системы населения России. Это может приводить к искажению результатов исследования. Однако, по данным о распределении SNP-маркеров в евроазиатском регионе, генофонд популяций, проживающих на территории центральной части и ВолгоУральского региона России, в большей степени испытывает на себе влияние «притока генов» со стороны Европы [114]. Кроме того, по результатам исследования полиморфизма генов системы HLA, русские, татары и башкиры принадлежат одному этническому кластеру, что позволяет предположить сходное распределение эволюционно-стабильных независимых SNP-маркеров, в этих популяциях (рисунок 10Б) [115]. Это дает основания к рассмотрению исследованных групп в составе общей по этнической принадлежности выборки и позволяет исключить влияние фактора популяционной стратификации на результат исследования.

3.4.2 Распределение аллелей исследованных маркеров в группах сравнения Из 11 исследованных SNP-маркеров, для четырех (rs1801516, rs664677, rs1052133, rs1799782) в сравниваемых группах обнаружены различия в распределении (табл. 7). Минорный аллель T варианта Asp1853Asn гена популяционного контроля (P). В то же время частота минорного аллеля T варианта IVS22-77 (rs664677) того же гена в группе RR выше, чем в группе радиорезистентные индивидуумы, можно предположить разнонаправленное влияние данных полиморфизмов на признак радиорезистентности.

Еще одно отличие обнаружено для минорного аллеля G варианта Ser326Cys, расположенного в 326 кодоне гена OGG1 (rs1052133). Наличие протективного эффекта для этого маркера описывалось ранее [116]. В группе RS установлено единственное отличие в распределении аллеля А гена XRCC1 (rs1799782). Частота аллеля А в данной группе достоверно ниже, чем в двух других исследованных группах. В данном случае полученные нами результаты подтверждают установленную ранее ассоциацию маркера rs1799782 с онкозаболеваниями [117].

Рисунок 10. Сравнительный анализ распределения аллелей исследованных SNP-маркеров. A-собственные данные, основанные на распределении аллелей в группе P относительно референтных популяций азиатского и территории Евроазиатского региона.

В настоящее время представления о роли конкретных аллелей гена в формировании предрасположенности к онкозаболеваниям XRCC противоречивы. Разными научными коллективами получены данные как о прямой, так и об обратной связи аллеля A с риском развития ЗНО.

Результаты, полученные в настоящей работе, служат вкладом в дальнейшее развитие представлений о роли гена XRCC1 в механизме канцерогенеза.

Из 34 аллелей HLA класса II единственная достоверная ассоциация с признаком устойчивости к радиационному воздействию установлена для группы аллелей HLA-DRB1*11 (таблица 6). Помимо этого, нами обнаружены группы аллелей в генах HLA-DRB1 и HLA-DQB1, перспективные для дальнейшего исследования в более широких группах. Данные по распределению аллелей HLA класса II в группах индивидуумов с повышенной/пониженной устойчивостью к радиации получены впервые.

Результаты настоящей работы открывают новые представления о роли молекул главного комплекса гистосовместимости в радиационной генетике.

В таблице 7 представлены суммарные результаты по подтвержденным и выявленным впервые в рамках данного исследования ассоциациям.

В настоящем исследовании не удалось подтвердить описанную ранее ассоциацию варианта TGFB1 (rs1800469) с повышенным риском развития онкологических заболеваний [118]. Не удалось также установить ассоциации с аллелями rs2717536, rs2296135 (гены IL7 и IL15RA, соответственно) и аллелями локуса 8q24.

Таблица 7 Суммарные результаты по подтвержденным и установленным впервые в рамках данного исследования ассоциациям.

(rs664677) XRCC (rs1799782)

ОБСУЖДЕНИЕ

ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ С АНАЛИЗОМ КРИВЫХ

4.

ПЛАВЛЕНИЯ, КАК МЕТОД ГЕНОТИПИРОВАНИЯ

Реализованный в данном исследовании подход к генотипированию обладает рядом преимуществ перед другими распространенными методами генетического анализа. Так, например, при использовании аллельспецифичных затравок (праймеров), существуют ограничения по количеству генетического материала попавшего в пробирку. Разница в числе исходных молекул ДНК, а также ограничения при разработке аллель-специфичных дискриминации аллелей, что снижает его привлекательность с точки зрения решения задач рутинной диагностики [119].

Использование методик, основанных на способности ферментов с разной эффективностью удлинять или лигировать различные варианты ПЦРпродуктов, также не позволяет адаптировать подход к практическим целям из-за их высокой стоимости и зависимости от качества фермента.