Тканевый гомеостаз в МЖ обеспечивается в результате равновесия между пролиферацией, дифференциацией и апоптозом. Апоптоз, или спонтанная запрограммированная гибель клеток играет главную роль в росте и регуляции как нормальной, так и опухолевой ткани [67, 205, 219, 223].

МЖ является органом-мишенью для половых гормонов, однако базовые знания о гормональных эффектах недостаточны и нередко противоречивы [9, 14, 74, 150, 173, 179, 186, 209]. Жизненный цикл МЖ до конца не уточнен. На фоне таких физиологических событий, как менструальный цикл, беременность, лактация и менопауза, МЖ подвергаются влиянию половых гормонов с учетом вариации секреции. В репродуктивном возрасте у нерожавших женщин эпителий МЖ подвергается циклической клеточной пролиферации и апоптозу, которые являются вторичными по отношению к циклической функции яичников. В фолликулиновой фазе менструального цикла происходит клеточная пролиферация в конечной протоково-дольчатой структуре. Прогестерон играет основную роль в стимуляции дольчато-альвеолярного развития и дифференциации [20, 43, 152, 156, 211, 239, 242].

Имеются данные о том, что снижение уровня прогестерона в лютеиновой фазе менструального цикла индуцирует развитие мастопатии [15, 36, 57, 108, 154]. Установлено, что у женщин с РМЖ уровень прогестерона во второй фазе менструального цикла достоверно ниже, чем в группе контроля. При этом содержание эстрогенов одинаковое, то есть имеется относительная прогестероновая недостаточность [20, 27, 41, 132, 150, 156, 220, 221].

Н.И.Сергеев, Л.К. Дзеранова (2005) и др. приводят следующую классификацию некоторых гормональных нарушений, приводящих к развитию РМЖ:

Увеличение уровня эстрогенов.

1. Абсолютное.

2. Относительное - снижение количества прогестерона на фоне нормального уровня эстрогенов. Это состояние требует более внимательного наблюдения, так как способствует пролиферативным II. Снижение уровня прогестерона.

1. Вне зависимости от уровня пролактина.

2. Обусловленное гиперпролактинемией.

III. Повышение уровня пролактина.

А) Вне зависимости от дня менструального цикла.

Б) Повышение в лютеиновой фазе менструального цикла.

2. Скрытое.

А) Нарушение суточного ритма пролактина Б) Гиперреакция при стимулирующих пробах.

В настоящее время предлагаются три равновозможных и не исключающих друг друга механизма пролиферативного действия эстрогенов на МЖ[14, 15, 66, 73, 134, 245]:

- прямая стимуляция клеточной пролиферации за счет взаимодействия эстрадиола, связанного с эстрогенным рецептором с ядерной ДНК;

- непрямой механизм - за счет индукции синтеза факторов роста, действующих на эпителий МЖ аутокринно или паракринно;

- стимуляция клеточного роста за счет отрицательной обратной связи, согласно которой эстрогены нивелируют эффекты ингибирующих факторов роста. Число ЭР в эпителии МЖ снижается в лютеиновой фазе цикла, в то время как число ПР остается высоким в течение всего цикла.

осуществляться опосредованно - через факторы роста. Они стимулируют пролиферацию и дифференцировку эпителиальных клеток МЖ и тормозят апоптоз следующие факторы роста и протоонкогены:

- ЭФР;

- инсулиноподобные факторы роста типов I и II (ИПФР-1 и ИПФР-И);

- -трансформирующий фактор роста и протоонкогены: c-foc, c-myc, cjun.

Стимулятором апоптоза и ингибитором роста эпетелиальных клеток молочной железы является -трансформирующий фактор роста.

Существует также теория генотоксического действия эстрогенов, согласно которой метаболиты эстрадиола - 4-ОН Е2; 3,4-quinone проникают в клетку, минуя эстрогеновые рецепторы, связываются с ядерной ДНК, повреждая ее [16, 46, 73, 134].

При РМЖ отмечается особый локальный стероидогенез эстрогенов [13, 16, 27, 66, 73, 217]. В образовании эстрадиола в раковой ткани МЖ участвуют три основных механизма [20, 30, 59, 66, 93, 134, 156, 173]:

• сульфатазный, при котором эстрона сульфат превращается в эстрон;

• ароматазный, при котором андрогены превращаются в эстрогены;

• 17р-гидроксистероиддегидрогеназный, превращается в эстрадиол.

В раковой ткани также присутствует фермент сульфотрасфераза, которая превращает эстрогены в их сульфаты (эстрадиола сульфат и эстрона сульфат).

При определении эстрогенов (эстрона, эстрадиола и их сульфатов) в ткани МЖ у больных РМЖ в период постменопаузы обнаружено их сочетание и высокое содержание (особенно эстрона сульфата), которое в 15раз выше, чем в плазме [13, 15, 187, 242, 247].

Показано, что концентрация эстрадиола в соединительной ткани МЖ в 2-20 раз выше, чем в сыворотке крови, и она возрастает соответственно увеличению степени дисплазии эпителия [13, 15, 108, 194, 197]. Количество ЭР также увеличивается при повышении степени пролиферации в МЖ. Так, при фиброзе и кистах ЭР присутствуют в 35 % случаев, при аденозе - в 50%, при протоковой гиперплазии - в 85%. Уровень эстрогенов в крови также малигнизированных тканей отмечено, что частота встречаемости в окружающих тканях гиперпластических процессов (аденоз, протоковая гиперплазия) достоверно выше, чем в здоровых МЖ [30, 41, 165].

Из клинической практики известно, что МЖ отвечает на циклическое выделение половых гормонов. Максимальный размер МЖ наблюдается в позднюю лютеиновую фазу цикла. Пик секреции жидкости, митотической активности и продукции ДНК нежелезистой тканью и клетками эпителия отмечается (in vitro) в лютеиновой фазе [53, 57, 66, 147, 234]. Пик митозов в конце лютеиновой фазы сменяется апоптозом. Таким образом, основная роль прогестерона состоит в стимулировании развития альвеол. В зависимости от дозы и продолжительности воздействия прогестерон может потенциально видоизменять ответ как нормальных, так и раковых клеток на различных уровнях:

- стимуляция продукции 17Р-гидроксистероидегидрогеназы и эстронсульфотрансферазы, которые быстро окисляют эстрадиол в эстрон и затем, связывая эстрон, превращают его в неактивный эстронасульфат;

подвергается дальнейшему клеточному делению;

- down-регуляция ЭР в эпителии МЖ проявляется снижением пролиферации клеток, стимулированной эстрогенами;

- модуляция апоптоза клеток МЖ посредством р53-супрессора опухоли;

- модулирование митогенных протоонкогенов, таких как С-myc и Cfoc.

Таким образом, наряду со способностью прогестерона снижать экспрессию РЭ, данный гормон уменьшает локальный уровень активных эстрогенов, ограничивая тем самым стимуляцию пролиферации тканей МЖ [15, 27, 66, 108, 197, 200].

Концентрация прогестерона в тканях МЖ в 2-10 раз выше, чем в плазме крови [57, 165, 208]. Эпителий молочных протоков содержит фермент 17- гидроксистероиддегидрогеназу-2, который переводит более активный эстроген - эстрадиол - в менее активный - эстрон. Регулирует активность этого фермента прогестерон. Под влиянием прогестерона повышается проницаемости капилляров, обусловленной эстрогенами, и уменьшает отек соединительнотканной стромы, носящий циклический характер.

Экспериментальными данными доказана связь между повышенной секрецией пролактина и развитием гиперпластических процессов в МЖ[57, 150, 152, 154]. Пролактин активизирует обмен в тканях МЖ, повышает уровень собственных рецепторов в ткани железы, а также рецепторов к эстрогенам и прогестерону [66, 149, 154]. В сочетании с прогестероном этот чувствительность к наиболее активной фракции эстрогенов [57, 66, 150].

Имеются сообщения о значительно более высокой средней концентрации пролактина при фиброзно-кистозной мастопатии в постменопаузальном периоде в сочетании с повышенным уровнем эстрогенов и пониженными уровнями ФСГ и ЛГ [15, 40, 50, 56, 60, 112, 143]. В.П. Летягин (2005) указывает на корреляцию между степенью дисплазии и возрастанием концентрации эстрогенов и пролактина при неуклонном снижении уровня прогестерона[83].

Известно, что доброкачественные гиперплазии и неоплазии МЖ наиболее часто (в 69-82%) развиваются у больных миомой матки [9, 20, 47, 56, 131, 149]. Следует отметить, что результаты исследований, посвященных патогенезу миомы матки, достаточно отчетливо коррелируют с данными, полученными при изучении механизмов пролиферации и апоптоза в ткани МЖ при РМЖ [131, 136, 145]. Наряду с этим установлено, что сочетание пролиферативных заболеваний МЖ в позднем репродуктивном возрасте с аденомиозом составляет 53-74%, опухолями яичников 64-80% [17, 23]. По всей видимости, справедливо утверждение об универсальности механизмов эстрогензависимой пролиферации в органах репродуктивной системы.

По мнению В.Ф. Семиглазова и соавт. (2006), частое сочетание пролиферативных форм фиброзно-кистозной мастопатии с миомой матки, аденомиозом, доброкачественными образованиями яичников диктует необходимость включить больных с гиперпластическими процессами репродуктивной системы в группу риска развития РМЖ, нуждающуюся в особом подходе к ранней диагностике заболеваний МЖ[131].

специфические, могут быть причиной функциональных нарушений в системе гипоталамус-гипофиз-яичники, благодаря механизму обратной связи [60, 83, 86, 134, 135, 152, 165]. Более чем у половины больных нарушения выражаются в недостаточности второй фазы менструального цикла, ановуляции. При этом изменения в МЖ определяются в 65% [158, 161].

Многими авторами подчеркивается, что особенно неблагоприятно отражается на состоянии МЖ три и более абортов, поскольку желтое тело в полной мере «расцветает» во время беременности [185]. В этот период выделяется большое количество прогестерона для питания плодного яйца и поддержания беременности на физиологическом уровне. После прерывания беременности оно продолжает длительное время функционировать, что сопровождается избыточным поступлением в кровь прогестерона. Это приводит к подавлению выработки ЛГ гипофиза и повышению продукции ФСГ. В результате возникает дисбаланс гормонов, что приводит к преобладанию процессов пролиферации над секреторными процессами в тканях органов-мишеней. Искусственный аборт, выполненный в возрасте 20лет, увеличивает риск развития РМЖ в два раза [23, 81, 171].

заболеваний половых органов - синдроме поликистозных яичников – риск развития РМЖ увеличивается в 4 раза. Основной причиной возникновения дисгормональных гиперплазий при синдроме поликистозных яичников:

является прогестерондефицитное состояние, характерное для этого заболевания, что усугубляет процессы пролиферации в МЖ [8].

1.3. Особенности экспрессии рецепторов половых стероидных В последнее десятилетие активно внедрено в онкологическую службу исследование рецепторного статуса опухолей. Не исключением является и РМЖ. Чаще в литературе обсуждается вопрос об эстроген – прогестероновом рецепторном статусе, экспрессии этих рецепторов, соотношение их к друг другу, пролиферативной активности опухоли в зависимости от рецепторного фона [51, 58, 85, 170, 198].

В последние годы получены новые данные об их содержании, составе в злокачественных, доброкачественных новообразованиях, а также в неизменённых тканях на разных этапах маммогенеза [30, 46, 116, 225, 230].

К настоящему времени в МЖ идентифицированы 2 типа ЭР: и, которые кодируются генами, локализующимися в различных хромосомах [234, 240]. Оба типа ЭР имеют 96% гомологичных участков на ДНК и 58% гомологичных участков в домене, связывающем специфические лиганды. В последнее время идентифицированы различные изоформы -ЭР:-ЭР1,ЭР2,-ЭР5, -ЭР-дельта, -ЭРins [204, 216, 246, 248]. В МЖ человека -ЭР преимущественно находятся в эпителиальных клетках млечных протоков и альвеол. -ЭР распространены более широко - они выявляются как в протоковом эпителии, так и в миоэпителиальных клетках, фибробластах внутри дольковой соединительной ткани, эндотелии, лимфоцитах. Они имеются в большинстве неизменённых дольках МЖ (около 80%), тогда как -ЭР экспрессируются в пятой части от их общего числа [236, 241]. У человека в репродуктивном периоде от 15 до 30 % эпителиальных клеток в протоках являются ЭР-позитивными [88, 204, 243, 246]. С увеличением возраста женщин, содержание данных рецепторов в МЖ увеличивается [180, 199].

заместительную гормональную терапию отмечается возрастание содержания ЭР по сравнению с таковыми без гормональной терапии [229].

В МЖ грызунов в препубертатную фазу развития ЭР обнаруживаются в 40% эпителиальных клеток, во время пубертата эта величина снижается до 30%, а во время беременности - до 5%. Максимальное количество -ЭР обнаруживается только во время лактации, во время которой 70% эпителия является -ЭР-позитивным. В отличие -ЭР, экспрессия -ЭР в эти периоды дифференцированных дольках МЖ I типа по сравнению с более зрелыми дольками II и III типов [193, 203, 246].

Считается, что -ЭР играют ведущую роль в росте и развитии МЖ [201, 243]. Данные о функциональной роли -ЭP являются весьма ограниченными. Предполагается, что они необходимы, в основном, для дифференцировки железистой ткани органа при беременности и лактации, а также для функционирования миоэпителиальных клеток. Кроме этого, имеются данные о том, что -ЭР способны модулировать транскрипционную активность гена -ЭР и, таким образом, изменять ответ клетки при воздействии эстрогенов [243]. В некоторых работах было выявлено снижение прогрессировании в них неопластического процесса [246].

В физиологических условиях между концентрацией эстрогенов в крови и содержанием ЭР в тканях МЖ имеется обратная взаимосвязь. При увеличении концентрации эстрадиола в сыворотке крови уменьшается содержание в клетках -ЭР, и, таким образом, изменяется относительное содержание -ЭР и -ЭР [248].

В МЖ описаны два вида прогестероновых рецепторов (ПР): А (ПРА) и В (ПРВ). Причем уровень содержания рецепторов А-типа превосходит таковой содержания рецепторов B-типа. По данным ряда исследований, ПР экспрессируются преимущественно эпителиальных клетках (15-30% их общего количества являются ПР-позитивными). При этом они содержат также -ЭР [227, 228, 248]. Содержание прогестероновых рецепторов выше в слабо дифференцированных дольках I типа по сравнению с дольками II и III типов [142, 228].

Считается, что в функциональном плане ПРА и ПРВ являются различными. С помощью ПРВ активируются определённые, зависимые от них гены (гены-мишени), а ПРА могут функционировать в качестве репрессора рецептора В. Поэтому чувствительность клетки к прогестерону и гестагенам модулируется их относительным содержанием. Высокая продукция прогестероновых рецепторов А-типа может привести к снижению экспериментальных работах показано, что ПРВ необходимы для развития протоков, их бокового ветвления и правильного формирование альвеол во время гестации. Считается, что эстрогены приводят к усилению, а прогестерон — к ослаблению экспрессии ПР [181, 199].

У человека и экспериментальных животных митотически активные пролиферативную активность является опосредованным. Считается, что эстрадиол и прогестерон взаимодействуют с ЭР- и ПР- позитивными, митотически неактивными клетками. Последние, в свою очередь, продуцируют факторы, модулирующие митотическую активность рядом расположенных клеток, не содержащих ЭР и ПР. Пролиферация эпителия возникает только при преобладании и достаточной силе паракринного митогенного воздействия, возникающего при длительном воздействии высокого уровня стероидов (например, при беременности). Данный физиологический механизм может обеспечивать протективную роль в отношении избыточной пролиферации клеток. В качестве возможных паракринных факторов действия эстрогенов рассматриваются эпидермальный, -трансформирующий, инсулиноподобные факторы роста, фактор роста фибробластов и некоторые другие, прогестерона гликопротеиды семейства Wnt [116, 142, 191, 226].

В некоторых исследованиях было выявлено, что при развитии злокачественной опухоли, в тканях МЖ увеличивается экспрессия рецепторов к овариальным стероидам, и нарушаются механизмы её содержания ЭР в эпителии МЖ в качестве раннего признака развития в них обнаружено у женщин, относящихся к группе повышенного риска по развитию РМЖ[226], в неизменённом эпителии участков МЖ, прилегающих к опухолевой ткани [196, 227]. При этом в МЖ снижается содержание -ЭР и, соответственно, возрастает отношение -ЭР/-ЭР [227, 246]. Происходит, нарушение, имеющей место в физиологических условиях, обратной взаимосвязи между концентрацией эстрогенов в крови и содержанием ЭР в тканях МЖ [248].

Согласно некоторых исследований, неопластическая транформация сопровождается также усилением экспрессии ПР, преимущественно А-типа и изменением отношения ПРА/ПРВ [227, 228].

Следующим, характерным признаком опухоли является нарушение компартментализация пролиферирующих и содержащих рецепторы к половым гормонам клеток [58, 192, 243].

Целью изучения многих авторов [58, 85, 198] стало сравнительное изучение гистологических форм рака от различного сочетания рецепторного статуса эстрогенов и прогестерона. Существуют четыре комбинации:

РЭ+РП+, РЭ+РП-, РЭ-РП+, РЭ-РП- [192]. В нормальной ткани МЖ женщины, находящейся в пременопаузе, 6-11% клеток РЭ+. С возрастом количество рецептор - положительных клеток возрастает: после 55 лет в 34% экспрессируются РЭ [126, 201]. Замечено, что в более старшем возрасте у пациенток с РМЖчаще выявляются РЭ+, тогда как пациентки молодого возраста чаще имеют РП+ опухоли [14, 167]. Результаты их исследований показали, что рецепторпозитивные опухоли (РЭ+РП+, РЭ+РП-, РЭ-РП+) по сравнению с рецепторнегативными ( РЭ-РП-) раками имели небольшие размеры и меньшее количество лимфатических узлов, пораженных метастазами. Отмечено, что в опухолях РЭ+РП+ по сравнению с РЭ-РПчаще встречались опухоли с отсутствием метастазов, хотя узлы в обеих группах, в большинстве случаев, были больших размеров. Так же важно, то, что независимо от рецепторно - гормонального статуса опухоли во всех группах самым частым типом рака был инвазивно – протоковый [10, 27, 28, 53].

Влияние статуса рецепторов стероидных гормонов обсуждается для женщин различных возрастных групп, в зависимости от сохранности менструально- овариальной функции. В целом большинство авторов склонны считать, что присутствие гормональных рецепторов определяет высокую эффективность гормонотерапии. Эффективность гормонотерапии при наличии в опухоли рецепторов составляет 50-70%. При наличии рецепторов только одного типа эффективность снижается до 33%. Приблизительно 11% рецептор отрицательных опухолей отвечает на применение гормонального лечения. Содержание рецепторов к стероидным гормонам в разных возрастных группах различно: у 45% больных в пременопаузе и у 63% пациенток в постменопаузе опухолевые клетки содержат рецепторы к эстрогену и прогестерону, 25% больных в пременопаузе и 9% в постменопаузе имеют положительный только один из стероидных гормонов.

У 28% больных в пременопаузе и у 17% в постменопаузе рецепторы отрицательные. [58, 116, 241].

чувствительны к гормональной терапии и имеют более благоприятный прогноз [44, 105, 106, 129]. Изолированная экспрессия РП+ является неблагоприятным прогностическим признаком [116].

1.4.Гормональная функция яичников у женщин с опухолевыми Данные, касающиеся структуры овуляторной недостаточности у женщин с различными типами опухолевых процессов в МЖ остаются неоднозначными. Так, с одной стороны, в некоторых работах было показано, что они развиваются на фоне ановуляции или недостаточности лютеиновой фазы менструального цикла. С другой стороны, согласно результатам многих исследований, концентрация овариальных и гипофизарных гормонов в сыворотке крови у больных не выходят за пределы нормативных значений, а заболевание развивается на фоне овуляторного менструального цикла и сохранённой репродуктивной функции [6, 7, 8, 9, 15, 17, 26, 27, 34, 52]. По данным Л.М. Бурдиной у 45,1% пациенток заболевание МЖ развивается на фоне регулярных овуляторных циклов, у 19,2% - при НФЛ и у 35,5% - в условиях ановуляции. Ановуляция была выявлена у 27,6% женщин с дисгормональными заболеваниями молочных желёз[40, 41, 66, 74, 160].

Наиболее выраженные гиперпластические изменения МЖ возникали на инволютивные изменения, не соответствующие возрасту, были у больных с недостаточностью функции яичников. Предполагается, что такие эндокринные сдвиги как гиперэстрогения, нарушение ритма секреции гонадотропинов на фоне снижения концентрации прогестерона, вызывают расстройства адаптационных механизмов и оказывают супрессивное действие на показатели клеточного иммунитета, способствуя развитию органических пролиферативных изменений репродуктивной системы [25].

При РМЖ стромальная гиперплазия в форме микроузелков была обнаружена в 2 раза чаще, чем в контрольной группе; в 18% случаев кортикальной стромальной гиперплазии, особенно в постклимактерическом периоде, принято видеть в абсолютном или относительном усилении гипофизарной стимуляции, при отсутствии в яичнике половых клеток и фолликулов. В периоде физиологического климактерия структура и функциональное состояние яичников не так просты и однородны, как принято считать. Гормональный режим в пред- и постклимактерическом периоде подвержен широким индивидуальным колебаниям, которые или не проявляют себя в клинически выраженной форме или сопровождаются другим патологическим процессом. Аналогичное положение было установлено на МЖ, так же тонко реагирующей на колебания гормонального режима[8, 26, 60, 61, 153, 168, 169].

пролиферации млечного эпителия, преобразованиях стромы и сосудов органа, могут принимать участие в развитии гиперпластического процесса.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В зависимости от возраста больные разделены на 3 возрастные группы:

I – от 30 до 40 лет - поздний репродуктивный возраст, n=50 (36,48±2, лет);II – от 41 до 50 лет - преклимактерический возрастn=94 (45,7±2,2 лет); III – 51-60 лет - климактерический возрастной период n=24 (52±1,6 лет).

Средний возраст больных основной группы составил 43,86±5,76 года, (таблица 1).

В зависимости от стадии заболевания РМЖ все больные разделены на 3 группы: Т 2 – 44 человек, Т 3 – 104 человек, Т 4 – 20 человек.

В зависимости от вида лечения больные разделены на 4 группы:

I - женщины после оперативного лечения (48 человек).Больным проводилось только хирургическое лечение (поскольку имелись различные противопоказания к иным видам терапии), включающие в себя мастэктомию по Холстеду или Пейти с лимфаденэктомией регионарных лимфатических узлов и одномоментным удалением яичников.

II – женщины, получающие лучевое лечение (26 человек). Больные подвергались ежедневному облучению опухолевого узла и зон регионального метастазирования в течение 10 дней. На 2-3-й день после окончания курса дистационной гамма терапии проводилось оперативное лечение в объеме мастэктомии по Холстеду, Пейти или секторальной резекцией МЖ с лимфаденэктомией аксилярных и подключичных лимфатических узлов.

III – женщины после химиотерапии (36 человек). Больные, получившие 2 курса полихимиотерапии.

IV– женщины после гормонального лечения (58 человек) (таблица 2).

ИГХ исследование было проведено 100 пациенткам с определением у них рецепторов ЭФР человека 2 типа (Her-2/neu), РП (PgR) и ЭР (ER).

Всем больным определялась степень злокачественности первичной опухоли по схеме Эльстона [4]:

1. Образование тубулярных и железистых структур, %:

В опухолях с преобладанием солидного, скиррозного, трабекулярного, альвеолярного характера роста раковых клеток или их сочетанием, структурная атипия оценивается на 3 балла.

2. Клеточный полиморфизм:

Мелкие клетки одного размера и формы с дисперсным распределением хроматина, без ядрышек или с наличием одиночного ядрышка в некоторых клетках Небольшой полиморфизм ядер, некоторое укрупнение клеток, наличие в некоторых клетках одного или нескольких Крупные ядра различной формы с одним или перстневидные клетки 3. Число митозов в 10 различных полях зрения (увел.х400):

Степень злокачественности определяется по сумме балов:

Распределение больных в зависимости от возраста Возраст Кол-во больных Вид применяемого лечения в различные возрастные периоды.

В ходе исследования группой сравнения послужили 60 практически Контрольная группа разделена на соответствующие возрастные группы.

Критериями включения в группу сравнения явились: возраст 30-60 лет;

отсутствие заболевания МЖ, отсутствие гиперпластических процессов в других органах репродуктивной системы.

послужили анализ анамнеза и результатов гормонального обследования у женщин возрастом 29-55 (34,6±7,52) лет, критериями включения в группу явилось отсутствие заболеваний МЖ, отсутствие гиперпластических менструальным циклом.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Данные о результатах гормонального исследования больных были взяты из амбулаторных карт и историй болезни. Исследования проводились как в частных диагностических центрах, так и государственных лечебных учреждениях. Определение содержания в крови эстрадиола, прогестерона, иммуноферментными методами с использованием стандартных наборов.

Содержание в крови ФСГ, ЛГ, эстрадиола производили в середину фолликулярной фазы менструального цикла (на 5-7-й день), содержание пролактина, прогестерона и эстрадиола – в середину лютеиновой фазы менструального цикла (на 20-23-й день). Для оценки соотношения между концентрацией эстрадиола (Э) и прогестерона (П) на 20-23-й день менструального цикла вычисляли величину их соотношения (Э/П)[53,70]:

Исследование послеоперационного материала включало изучение МЖ и яичников (после радикальной мастэктомии и овариоэктомии, выполненной одномоментно или в отсроченном порядке). Морфологическое изучение начиналось с описания МЖ и макроскопической характеристики формы, размеров и топографии новообразования, консистенции, рисунка плоскости среза, наличие участков геморрагического пропитывания, некротического детрита в опухоли. Контрольный аутопсийный материал включал исследование ткани обоих яичников.

Для микроскопического исследования материал фиксировался в 10% нейтральном формалине, жидкости Карнуа и жидкости Буэна. Материал обезвоживался в спиртах восходящей крепости и заливался в парафин по стандартной методике или уплотнения с помощью замораживания.

продольные перпендикулярно к тангенциальной поверхности органа) обзорно окрашивались гематоксилином и эозином. Коллагеновые и эластические волокна выявлялись методом ван Гизона, Мэллори и Гейденгайна. Кислые мукополисахариды выявлялись с помощью окраски толуидиновым синим при разных значениях рН и ШИК – реакцией, липиды судан III.

производилась оценка пролиферативной активности, содержания ЭР и ПР в млечном эпителии, определение Her-2/neu статуса.

Парафиновые срезы толщиной 5 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина (Sigma). Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием моноклональных мышиных антител к ER, Clone 6F11 (1:40, Dako); PgR, ClonePgR 636 (1:100,Dako); Herneu,ClonePoly(1:100,Dako). В качестве вторых антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные анти-мышиные и анти-кроличьи иммуноглобулины. Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABCkit), с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (Novocastra). В качестве позитивного контроля на ER и PgR– эндометрий.

Негативный контроль во всех случаях проводили с применением блокирующей сыворотки (DAKO LSAB 2 kit).

Для визуализации ER,PgR и Her-2/neu использовали одноэтапный протокол с демаскировкой антигена (высокотемпературной обработкой ткани) в 0,01 М цитратном буфере pH 7.6 [116].

Полученные препараты изучали в световом микроскопе МT 4300L, фотографировали с помощью цифровой фотокамеры CAM V 500/1,5М. Для анализа микроскопического изображения использовали персональный компьютер на базе IntelPentium4, программное обеспечение Vision Morfo для морфологического анализа препаратов.

Для оценки иммунногистохимической реакции определения ЭР и ПР использовали полуколичественный метод. Интерпретацию результатов проводили с использованием качественной оценки ядерной реакции:

отрицательная «-», слабо положительная «+», умеренно положительная «++», сильно положительная «+++»и количественной системы оценки реакций в % окрашенных опухолевых клеток.

При оценке экспрессии Her-2/neuотмечали выраженность окрашивания цитоплазматической базальной мембраны:

реакция «», «+» - отсутствие гиперэкспрессии, реакция «+++» - гиперэкспрессия Her-2/neu.

Наличие гиперэкспрессии Her2/neu в случаях реакции «++» проводится с помощью метода гибридизации in situ при использовании флюоресцентной метки FISH (флюоресцентная in situ гибридизация)и при использовании хромогенной метки – СISH (хромогенная in situ гибридизация). Оценивается наличие амплификации гена Her2/neu путем подсчета сигналов, которыми помечен центромерный участок 17 хромосомы и сигналов, метящих ген Her2/neu. Если их соотношение больше 2, это свидетельствует о наличии амплификации.

С помощью метода измеряли интегральную яркость ядер клеток (сумму яркостей всех точек-пикселей объекта), отражающую содержание Фёльген-ДНК в изучаемом объекте.

Операционный материал фиксировался в 10% растворе нейтрального забуференного формалина с последующей заливкой в парафин. С каждого блока делались серийные срезы толщиной 5 мкм., которые окрашивались по Фёльгену для выявления ДНК ( без докраски фона).

цитоморфометрический анализ в среднем 12480 клеток с учетом требований сравнительной микроспектрофотометрии по Г.Г. Автандилову [2,4].

Исследование проводилось на компьютерном анализаторе изображения, в состав которого включены световой микроскоп МT 4300L, план-объектив микроскопического изображения использовали персональный компьютер на морфологического анализа препаратов.

В качестве методов оценки морфофункционального состояния исследуемых объектов применялись стериологические методики, благодаря которым на основании изучения срезов можно судить о реальных трехмерных объектах [3].

На микроскопическом уровне при морфометрическом исследовании МЖ, с помощью светового микроскопа МT 4300L, план-объектива 40х/10, цифровой фотокамеры CAM V 500/1,5М с анализом микроскопического изображения на персональном компьютере на базе IntelPentium4, программным обеспечением Vision Morfo для анализа морфологических препаратов, окулярного микрометра МОВ - 1-15 и окулярной сетки для цитологических исследований со 100 и 25 равноудаленными точками нулевой толщины, определяли средний диаметр поперечного среза клетки (мкм), площадь поперечного сечения клетки Sк (мкм2), площадь поперечного сечения ядра клетки Sя (мкм2); ЯЦС, вычисляемое по Sк и Sя, процентное соотношение стромальных структур и паренхимы, периметр ядра (мкм);

степень кровенаполнения; инвазию сосудов; ИМА на 1000 клеток при увеличении микроскопа х1000; среднее количество ядрышек. Количество дистрофически измененных клеток в сохранившейся паренхиме определялось путем подсчета элементов с гиалиново-капельной, гидропической и жировой дистрофиями на 1000 клеток. Результат выражался в процентах.

При морфометрическом исследовании яичников определяли высоту покровного цилиндрического слоя (мкм); степень кровенаполнения сосудов;

численность атретических фолликулов; количество и площадь желтых тел;

фазу желтого тела; объем интерстициального компартмента яичника;

наличие или отсутствие полостных фолликулов, их площадь; толщина белочной оболочки (max, min); толщина наружной и внутренней теки самого крупного полостного фолликула; количество фолликулов на 1мм длины коркового слоя.

Из цифровых значений выстраивались вариационные ряды, находились:

- средняя величина ряда (М) по формуле:

где М - среднее арифметическое вариационного ряда; - сумма вариант; N - число наблюдений.

- среднее квадратичное отклонение, характеризующее степень вариабельности измеряемой величины:

- сумма квадратов вариант; N - число наблюдений; М2 - квадрат где среднего арифметического ряда.

Поиск статистически достоверного различия между показателями регрессии опухолевой паренхимы, объёмами стромы, паренхимы, участков гиалиноза, площадями зон гемодинамических и гемореологических нарушений, митотической активностью и другими количественными критериями осуществлялся по группам карцином с различными вариантами лечения, разной гистологической структуры и стадии заболевания.

Достоверность различия значений определялась внутри каждой группы с учётом стадии заболевания, гистологического типа карцином.

показателями в карциномах, прослеживалась в группах больных с определением коэффициента корреляции (г), который принимал значения от -1 до +1. При этом учитывалось следующее: если коэффициент корреляции равен 0, то связь между признаками отсутствовала, при значениях коэффициента корреляции ±0,1 - 0,3 - связь слабая, при ±0,31 - 0,7 - связь между признаками умеренная, и значения коэффициента ±0,71 — 1 говорили о сильной функциональной связи между признаками.

Полученные числовые данные подвергались статистической обработке согласно правилам медицинской статистики [18, 37, 125] с использованием ЭВМ (программы ExcelMicrosoft, Statistica6,0; Biomed).

Выбор поиска достоверности различия между признаками зависел от характера их распределения [125]. При адекватности распределения значений признаков нормальному закону Пуассона, производилось сопоставление дисперсий методом Фишера, а поиск достоверности различия между ними осуществлялся по методу Стьюдента. При распределении одного или двух признаков с отличием от нормального закона, поиск достоверности различий между ними проводился непараметрическим критерием Вилкоксона- Манна-Уитни.

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ АКУШЕРСКО-ГИНЕКОЛОГИЧЕСКОГО

АНАМНЕЗА, ДАННЫХ ГОРМОНАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

По сравнению со здоровыми женщинами, больные РМЖ в анамнезе в1,3 раза реже имели беременности (67,5% по сравнению с 89,1% у здоровых