«ЛИПОПОЛИСАХАРИДНАЯ КАНДИДАТ-ВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЭНДОТОКСИЧЕСКОГО И СЕПТИЧЕСКОГО ШОКА ...»

Федеральное государственное бюджетное учреждение

«Государственный научный центр «Институт иммунологии»

Федерального медико-биологического агентства

На правах рукописи

Маркина Анна Александровна

ЛИПОПОЛИСАХАРИДНАЯ КАНДИДАТ-ВАКЦИНА ДЛЯ

ПРОФИЛАКТИКИ ЭНДОТОКСИЧЕСКОГО И

СЕПТИЧЕСКОГО ШОКА

03.03.03 – иммунология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук П.Г. Апарин Москва - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Список сокращений ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Сепсис – актуальная проблема современной медицины 1.2. Строение липополисахарида 1.2.1 Липид А 1.2.2. Олигосахарид кора 1.2.3. О-полисахарид 1.3. Этиология сепсиса 1.4. Патогенез сепсиса 1.4.1. Генерализованный васкулит 1.4.2. Гиперкоагуляция 1.4.3. Синдром диссеминированного внутрисосудистого свёртывания крови 1.4.4. Полиорганная недостаточность 1.5. Клеточный механизм сепсиса 1.5.1. Распознавание ЛПС и активация рецепторного комплекса TLR4-MD-2 1.5.2. MyD88-зависимый путь передачи сигнала. Активация транскрипционного фактора NFB 1.5.3. MyD88-независимый путь передачи сигнала. Активация транскрипционного фактора IRF3 1.5.4. Особенности функционирования системы врождённого иммунитета при септическом шоке 1.6. Агонисты и антагонисты TLR4 1.7. Современные подходы к терапии и профилактике эндотоксического и септического шока 1.7.1. Терапия сеспсиса в клинике 1.7.2. Нейтрализация провоспалительных цитокинов в кровотоке 1.7.3. Антагонисты бактериальных эндотоксинов 1.7.4. Модификация анти-эндотоксинового статуса 1.7.5. Другие подходы к профилактике шоковых состояний ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Материалы 2.2. Методы 2.2.1. Определение прирогенности БУП энтеробактерий 2.2.2. Изучение противошокового действия БУП энтеробактерий на различных моделях эндотоксического шока 2.2.3. Исследование иммунопрофилактики септического шока на модели экспериментального перитонита 2.2.4. Оценка эффективности связывания ЛПС энтеробактерий с липополисахаридсвязывающим белком LBP 2.2.5. Изучение иммуногенности БУП энтеробактерий в эксперименте 2.2.6. Оценка безопасности дизентерийной вакцины «Флексвак» в клинических исследованиях ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Экспериментальное моделирование эндотоксического и септического шока 3.1.1. D-галактозаминовая модель эндотоксического шока 3.1.2. Прямая модель эндотоксического шока 3.1.3. Разработка и оптимизация модели экспериментального перитонита (CLP-модель) 3.2. Установление возможности профилактики эндотоксического шока при предварительном введении мышам (CBAC57Bl/6)F1 БУП S.sonnei 3.3. Установление возможности профилактики септического шока при предварительном введении мышам (CBAC57Bl/6)F1 БУП S.sonnei 3.4. Разработка кандидат-вакцины для профилактики эндотоксического шока 3.5. Индукция ЛПС-специфических антител и коррекция анти-эндотоксинового статуса при иммунизации мышей (CBAC57Bl/6)F1 НЭТ-ЛПС энтеробактерий 3.6. Профилактика развития септического шока на модели экспериментального перитонита при иммунизации мышей (CBAC57Bl/6)F1 НЭТ-ЛПС 3.7. Клинические исследования безопасности НЭТ-ЛПС энтеробактерий 4.1. Комплексный подход к моделированию шоковых состояний 4.2. Установление возможности профилактики эндотоксического шока при предварительном введении мышам (CBAC57Bl/6)F1 БУП S.sonnei 4.3. Установление возможности профилактики септического шока при предварительном введении мышам (CBAC57Bl/6)F1 БУП S.sonnei 4.4. Разработка кандидат-вакцины для профилактикики эндотоксического шока 4.5. Модификация анти-эндотоксинового статуса при иммунизации мышей 4.6. Профилактика развития септического шока на модели экспериментального перитонита при иммунизации мышей (CBAC57Bl/6)F1 НЭТ-ЛПС 4.7. Клинические исследования безопасности НЭТ-ЛПС энтеробактерий АД – артериальное давление анти-J5-антитела – антитела к Rc-ЛПС мутантного штамма J5 E.coli О111:В анти–Ra-антитела – антитела к Ra-ЛПС E.coli EH БСА – бычий сывороточный альбумин БУП – биополимеры углеводной природы в/б – внутрибрюшинно в/в - внутривенно ВМ-ЛПС - высокомолекулярная фракция низкоэндотоксичного липополисахарида ДВС–синдром - синдром диссеминированного внутрисосудистого свёртывания крови дЛПС детоксицированный липополисахарид мутантного штамма J5 E.coli О111:В ИЛ – интерлейкин ИЛ-1 – интерлейкин- ИЛ-1Р – рецептор ИЛ- ИЛ-1РА – антагонист рецептора ИЛ- ИФА – иммуноферментный анализ ИФН – интерферон КДО – 2-кето-3-дезоксиоктоновая кислота Кор – центральная олигосахаридная область липополисахарида Кх – кратность подъёма титра антител ЛПС – липополисахарид МАТ – моноклональные антитела НМ-ЛПС – низкомолекулярная фракция низкоэндотоксичного липополисахарида низкоэндотоксичных липополисахаридов в соотношении по массе 1: НЭТ-ЛПС – низкоэндотоксичный липополисахарид ОМР – белок внешней мембраны Neisseria meningitidis (outer membrane protein) О-ПС - О-специфическая полисахаридная цепь липополисахарида ОРИТ – отделение реанимации и интенсивной терапии ОФД – орто-фенилендиамин ПАМП – патоген-ассоциированные молекулярные паттерны п/к - подкожно ПОН – полиорганная недостаточность ПРР – паттерн-распознающие рецепторы СВО – системный воспалительный ответ ССВО – синдром системного воспалительного ответа УПМ – условно-патогенные микроорганизмы Физ.раствор – апирогенный 0,9% раствор хлорида натрия ФНО- - фактор некроза опухоли - ФНО-Р – рецептор фактора некроза опухоли ФСБ – фосфатно-солевой буфер ЭПС – экзополисахарид S.sonnei BTK - тирозин киназа Брутона (Bruton’s tyrosine kinase) CASP – метод стентирования брыжейки ободочной восходящей кишки (colon ascendens stent peritonitis) CLP - метод перевязки и прокола слепой кишки (cecal ligation and puncture) DD – «домен смерти» (death domain) D-GalN – D-галактозамин IB - ингибиторный белок IB (inhibitory-binding protein B) IFR3 - интерферон-регулирующий фактор 3 (interferon-regulatory factor 3) IKK – ингибиторная киназа NFB (inhibitor of NFB kinase) IRAK – киназа, ассоциированная с IL-1R (IL-1R - associated kinase) J5 E.coli – мутантный штамм J5 E.coli O111:B4, Rc-хемотип LBP – липополисахарид-связывающий белок (LPS-binding protein) LRR – лейциновые повторы (leucine-rich repeats) MPL – монофосфорил липида А MyD88 –фактор дифференцировки миелоидов 88 (myeloid differentiation factor 88) NFB - ядерный фактор B (nuclear factor B) OD – оптическая плотность RIP-1 – рецепторвзаимодействующий белок 1 (receptor-interacting protein 1) SOCS – белок-супрессор проведения цитокиновых сигналов (suppressor of cytokine signaling) TAB – ТАК1-связывающий белок (TAK1-binding protein) TAK – киназа, активирующая трансформирующий фактор роста (transforming growth factor--activated kinase) TF – тканевой фактор TIR-домен - Toll/IL-1-рецепторный домен TIRAP - TIR-содержащий адаптерный белок (TIR-domain-containing adaptor protein) TLR – toll-подобные рецепторы (toll-like receptors) TRAF6 – фактор 6, ассоциированный с рецептором фактора некроза опухоли (tumor necrosis factor receptor-associated factor 6) TRAM - TRIF-родственная адаптерная молекула (TRIF-related adaptor molecule) TRIF - TIR-содержащая адаптерная молекула (TIR-domain-containing adaptor protein including interferon-) wЛПС – липополисахарид, полученный по методу Westphal

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Септический и эндотоксический шок являются чрезвычайно опасными патологическими состояниями, которые возникают на фоне массивного поступления в организм грамотрицательных бактерий и их эндотоксинов, вследствие септического (инфекционного) процесса или серьёзных нарушений микроциркуляции, и относятся к числу клинических состояний, в лечении которых не удаётся достичь существенного успеха. Несмотря на прогресс в понимании патофизиологии сепсиса и разработку антибиотиков последнего поколения, обладающих широким спектром действия, смертность от сепсиса, вызванного грамотрицательными бактериями, остаётся высокой, особенно в случае развития септического шока.

В мире ежегодно диагностируется 1,5 млн случаев сепсиса, который занимает первое место по причине смертности пациентов в отделениях реанимации (Linde-Zwirbe W.T.et al., 1999). Ежегодно от сепсиса умирает свыше 500 тыс.

пациентов, причём основная доля приходится на технологически развитые страны Евросоюза (около 135 тыс.) и США (около 250 тыс.). Грамотрицательный сепсис ассоциирован с высокой летальностью, уровень которой в среднем составляет 20а в случае септического шока – более 50% (Bone R.C., 1993).

Сепсис может развиваться как патологический процесс, сопровождая различные инфекционные заболевания, проявляться в виде осложнений заболеваний, вызванных травматическими факторами: ожог, хирургическая операция или открытая рана, множественные травмы механического характера. К факторам, обуславливающим (усиливающим) развитие грамотрицательного сепсиса, относят широкое распространение антибиотиков, иммуносупрессорную терапию (химиотерапия у больных онкологического профиля, препараты, подавляющие отторжение тканей при трансплантации), инвазивные методы лечения и приборы (хирургия, катетеры, дренажные трубки), кишечные язвы, возраст, тяжёлые сопутствующие заболевания (диабет, СПИД).

(липополисахарида ЛПС) в патогенезе грамотрицательного сепсиса Cross A.S. et al., 2004). Если до 1960-х годов грамотрицательные патогены были не типичны для клинических инфекций, то в дальнейшем произошёл сдвиг в сторону доминирования грамотрицательных бактерий в генезе различных воспалительных процессов, особенно у госпитализированных пациентов.

Стандартная терапия сепсиса заключается во введении инфузионных жидкостей и вазопрессоров (сосудосуживающие, повышающие кровяное давление препараты) для восстановления кровяного давления и кровотока в органах, оксигенации (насыщении кислородом) тканей и органов и использовании иммунотерапевтических интервенций на фоне септических состояний и при хирургических вмешательствах диктует необходимость разработки новых подходов не только к лечению сепсиса, но и к предотвращению, профилактике, подготовке пациента к возможному септическому состоянию.

Неудачи в области терапии шоковых состояний привлекли особое внимание к изучению иммунологического статуса пациентов с различными исходами неблагоприятные исходы при септических и эндотоксических состояниях ассоциированы с низким уровнем анти-ЛПС-антител (Strutz F. et al., 1999;

Bennett-Guerrero E. et al., 1997). В тоже время было установлено, что высокий антиэндотоксиновый статус пациентов, характеризующийся повышенными уровнями предсуществующих антител IgG и IgM к олигосахариду кора молекулы ЛПС, несущему слабовариабельные консервативные участки, общие для различных представителей рода Enterobacteriaceae, и к О-полисахаридному домену ЛПС, коррелировал с повышением выживаемости больных с грамотрицательным сепсисом (Gibbs R.J. et al., 2004). Таким образом, модификация антиэндотоксинового статуса является актуальной стратегией профилактики шоковых состояний.

В последние годы была сформулирована концепция иммунопрофилактики эндотоксического и септического шока, направленная на разработку противошоковых вакцин, на основе молекул липополисахаридов, применение которой позволит создать устойчивость организма к последующему массивному попаданию бактериального эндотоксина. Основные экспериментальные и клинические исследования в области профилактики эндотоксического шока, проведённые в последние годы, связаны с использованием производных липополисахарида и его синтетических аналогов c пониженной эндотоксичностью, обладающих антагонистическим действием по отношению к ЛПС, например, компонента R-формы ЛПС из S.enterica sv Minnesota R595 - монофосфорил липида А (Salkowski C.A. et al., 1998), синтетических аналогов нетоксичного ЛПС Rhodobacter capsulatus - E5531 и Е5564 (Bunnell E. et al., 2000; Lynn M. et al., 2003).

Другим направлением является прямая модификация анти-эндотоксинового статуса – вакцинация, направленная на индукцию анти-ЛПС-антител. На сегодняшний день разработан только один вариант противошоковой вакцины на основе детоксицированного ЛПС мутантного штамма J5 Escherichia coli О111:В Rc-хемотипа, нековалентно присоединённого к белку внешней мембраны Neisseria meningitides, которая на экспериментальных моделях защищала животных от септических состояний, а при иммунизации добровольцев обеспечивала модификацию анти-эндотоксинового статуса (Cross A. et al., 2004).

Несмотря на важность проблемы, количество работ по модификации антиэндотоксинового статуса ограничены необходимостью конструирования ЛПСиммуногена, безопасного для человека. Путь к получению клиническиприменимого препарата связан с решением проблемы рационального снижения токсичности ЛПС без снижения его иммуногенности. В последние годы сотрудниками ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России впервые были получены низкоэндотоксичные липополисахариды энтеробактерий, обладающие высокой степенью безопасности и представляющие интерес для клинического исследования. Оценка их противошокового действия представляется актуальной задачей в контексте разработки противошоковой вакцины, внедрение которой может привести к созданию новой медико-социальной технологии – профилактике эндотоксического и септического шока, которая может оказать существенное содействие в обеспечении выживаемости больных с различной патологией, а также лиц, находящихся в «шоковой» группе риска (военные, пожарные, сотрудники МВД и МЧС).

противошокового действия, иммуногенности, безопасности биополимеров углеводной природы (БУП) энтеробактерий с целью получения образцов кандидатвакцины для профилактики эндотоксического и септического шока.

Задачи исследования:

1. Провести комплексное моделирование эндотоксического и септического 2. Исследовать влияние предварительного введения БУП энетробактерий на выживаемость животных и продукцию ФНО- in vivo на различных моделях эндотоксического шока.

энтеробактерий с транспортным липополисахарид-связывающим белком энтеробактерий на развитие септического шока (экспериментального перитонита).

5. Разработать схемы иммунизации для профилактики септического шока препаратами низкоэндотоксичных ЛПС энтеробактерий.

6. Изучить продукцию анти-ЛПС-антител и возможность модификации антиэндотоксинового статуса при разных схемах иммунизации низкоэндотоксичными ЛПС энтеробактерий.

клинических исследованиях.

Научная новизна. Существенно расширены представления о возможностях иммунопрофилактики опасных патологических состояний – эндотоксического и септического шока. Доказана роль механизма понижающей регуляции продукции низкоэндотоксичных ЛПС энтеробактерий, в существенном увеличении выживаемости животных при индукции эндотоксического шока. Разработаны схемы вакцинации препаратами низкоэндотоксичных ЛПС энтеробактерий, индуцирующие адаптивный иммунный ответ к полиинфекции, вызывающей перекрёстно-реагирующих антител, специфичных к олигосахариду кора молекулы ЛПС и модуляцией септического шока (задержка развития экспериментального перитонита и продление времени жизни животных на фоне сепсиса) при энтеробактерий. Подтверждена важность долговременного анти-эндотоксинового иммунного ответа в качестве одного из основных защитных механизмов при липополисахаридной кандидат-вакцины для профилактики эндотоксического и септического шока, в качестве активного компонента которой предложены низкоэндотоксичные ЛПС энтеробактерий, активирующие механизмы неспецифической и специфической устойчивости к шоковым состояниям, безопасные для парентерального введения человеку.

Научно-практическая значимость. Полученные в ходе выполнения диссертационной работы результаты представляют собой основу для проведения клинических исследований противошокового действия вакцинного препарата, энтеробактерий, предназначенного для профилактики эндотоксического и септического шока. Внедрение противошокового препарата в практику здравоохранения имеет целью создание новой медико-социальной технологии – иммунопрофилактики шока, которая может внести дополнительный вклад в обеспечение выживаемости больных с самой различной патологией, в том числе пациентов с синдромом ишемии-реперфузии. Противошоковая вакцина, стимулирующая выработку антител к олигосахариду кора молекулы ЛПС, может подвергающихся воздействию различных травматизирующих факторов, находящихся в «шоковой» группе риска (военные, пожарные, сотрудники МВД и МЧС).

Апробация работы. Материалы работы были представлены на 2-м Международном Конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (2007 г., Москва), 11-ой Ежегодной конференции «Vaccine Research» (2008 г., Балтимор, США), Х Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (2009 г., Казань), 5-й Балтийской конференции по микробным углеводам (2012 г., Суздаль).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 14 печатных работах, включающие 4 статьи в 3 научных периодических изданиях, которые входят в перечень научных периодических изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций, и 10 публикаций в материалах российских и международных научных конгрессов.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора научной литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и списка использованной литературы.

Работа содержит 17 рисунков и 20 таблиц. Библиографический указатель содержит литературных источника, из которых 12 отечественных и 190 зарубежных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Сепсис – актуальная проблема современной медицины обусловленный попаданием в кровоток грамотрицательных микроорганизмов или их эндотоксинов, диагностировался достаточно редко, однако на сегодняшний день он, возможно, является самым опасным проявлением инфекционного процесса в клинике. Несмотря на прогресс в понимании патофизиологии сепсиса и разработку антибиотиков последнего поколения, обладающих широким спектром действия, смертность от грамотрицательного сепсиса остаётся высокой, особенно в случае развития септического шока.

В мире ежегодно диагностируется 1,5 млн. случаев сепсиса, который занимает первое место по причине смертности пациентов в отделениях реанимации (Linde-Zwirbe W.T. et al., 1999). В развитых странах сепсис диагностируется с частотой 300/ 100 000 населения или 1 случай на каждую сотню госпитализаций (Wheeler A.P., Bernard G.R., 1999).

В последние десятилетия наблюдается тенденция роста числа случаев сепсиса и септического шока. Согласно статистике в США за период с 1979 по 2000 годы было выявлено более 10 млн. 300 тыс. случаев сепсиса, причем наблюдается тенденция роста частоты септических осложнений с 82,7 до 240, случаев на 100 тысяч жителей (Martin G.S. et al., 2003). В России на протяжении последних лет также увеличилась смертность больных хирургического профиля, и фактическое количество септических больных превышает официальную статистику в 10 раз и соответствует частоте проявления сепсиса в ведущих клиниках мира (Рожков А.С. и др., 2005). Например, в Главном военном клиническом госпитале им. Н.Н. Бурденко из 1020 пациентов с раневыми (Брюсов П.Г., Костюченко А.Л., 1997).

Возрастание числа септических осложнений может быть связано с интенсификацией применения антибиотиков, иммуносупрессорных препаратов (химиотерапия у больных онкологического профиля, препараты, подавляющие отторжение тканей при трансплантации), методов инвазивной терапии и приборов (хирургия, катетеры, дренажные трубки); проникающие ранения, ожоги, тяжёлые травмы, кишечные язвы, возраст, тяжёлое сопутствующее заболевание (диабет, СПИД).

Сепсис ассоциирован с высоким уровнем летальности от 28 до 50%. Более 500 000 человек умирают ежегодно от септического шока, т.е. более 400 человек ежедневно (Friedman G. et al., 1998).

Долгие годы само понятие «сепсис» не имело чёткого определения. Для эффективной профилактики и терапии сепсиса необходимо было разработать единый подход к определению сущности и критериев диагностики данного заболевания.

В 1991 году в Чикаго на согласительной конференции Американского общества торакальных хирургов и врачей медицины критических состояний ввели понятие синдрома системного воспалительного ответа (ССВО) или SIRS (systemic inflammatory response syndrome), (Bone R.C. et al., 1992). Системный воспалительный ответ проявляется в генерализованном воспалении, которое формируется при чрезмерной активации клеток, экспрессирующих цитокины, и медиаторов воспаления (Савельев В.С., Гельфанд Б.Р., 2006). ССВО отличается от сепсиса, тем, что последний является генерализованной внутрисосудистой инфекцией, для которой характерна бактеремия, тогда как при ССВО на начальных стадиях бактериальный компонент может отсутствовать.

Сепсис был систематизирован по степени тяжести клинического состояния пациентов, различая сепсис, тяжёлый сепсис и септический шок. Воспалительный ответ при прогрессировании повышает риск необратимого повреждения органов и смерти. Сепсис определяется у пациентов с инфекцией и двумя или более признаками ССВО. Если дополнительно имеет место поражение или дисфункция органов, то констатируется тяжёлый сепсис. Септический шок определяется как тяжёлый сепсис, сопровождающийся устойчивой гипотензией (Табл.1).

Табл 1. Стадии развития сепсиса (Bone R.C., 1993).

Тяжёлый сепсис Сепсис + органная дисфункция (ПОН), гипоперфузия Септический шок Тяжёлый сепсис + некомпенсируемая гипотензия, Гипотензия Систолическое АД < 90 мм рт.ст. или снижение Полиорганная Проявление органной дисфункции хотя бы по одной недостаточности (ПОН) системе органов. При развитии ПОН организм не в Системный воспалительный ответ (СВО) формируется как системная реакция организма на инфекцию, ожог, обширную травму, хирургическое вмешательство. При активации эффекторные клетки (моноциты/макрофаги, нейтрофилы, тромбоциты, лимфоциты, эндотелиоциты) продуцируют цитокины, при чрезмерной продукции которых происходит генерализация воспалительного процесса с утратой локализации воспалительного очага. Микроорганизмы и их токсины мигрируют из естественных резервуаров и/или инфекционного очага в общий кровоток, распространяясь через который, медиаторы воспаления достигают клеток-мишеней и повреждают ткани и органы, что приводит к развитию полиорганной недостаточности. При появлении признаков дисфункции хотя бы одной системы органов и снижении тканевой перфузии диагностируют тяжёлый сепсис. Септический шок классифицируется как состояние, когда на фоне систолического артериального давления (АД) от его начального уровня на 40 и более мм рт. ст. или при его значении менее 90 мм рт. ст.), не компенсируемая с помощью инфузионной терпаии (Bone R.C., 1993).

Клиническая картина сепсиса прежде всего обусловлена явлениями эндо(ауто)токсикоза и характеризуется падением АД, тахикардией, холодным потом, одышкой. При бактеремии в крови накапливаются эндотоксины возбудителей, с токсическими эффектами которых связано большинство симптомов. Прогноз при септическом шоке часто фатальный, особенно при развитии синдрома диссеминированного внутрисосудистого свёртывания крови (ДВС-синдром), так как затруднение её циркуляции в капиллярах приводят к дефициту кислорода, субстратов тканевого дыхания и питательных веществ в тканях. Со временем нарастает тканевая гипоксия и ацидоз, нарушаются основные метаболические процессы, что, учитывая масштабность и прогрессирование поражения, не совместимо с жизнью. Септический шок с ДВС-сидромом – наиболее частая причина летальных исходов при сепсисе (Козлов В.К., 2006).

1.2. Строение липополисахарида Системный воспалительный ответ отличается универсальностью: его развитие инициирующего бактериального агента, пораженные ткани и органы имеют схожие морфологические изменения. В экспериментах in vitro было показано, что при обработке перитониальных макрофагов бактериальной культурой Salmonella enterica serovar Typhimurium или одноимённым эндотоксином происходит схожее изменение экспрессии генов провоспалительных цитокинов у макрофагов, что подтверждает одинаковое воздействие грамотрицательных бактерий и их эндотоксинов на эффекторные клетки (Rosenberger C.M. et al., 2000). Таким образом, за патофизиологическое действие грамотрицательных бактерий отвечает эндотоксин или липополисахарид (ЛПС) – основной компонент внешней мембраны клеточной стенки (Jean-Baptiste E., 2007). Прежде чем перейти к рассмотрению патогенеза сепсиса и механизмов клеточной активации представляется логичным рассмотреть структуру самого липополисахарида, как объекта, который с одной стороны является инициатором развития эндотоксического и септического шока (Beutler, B., Rietschel E.T., 2003), а с другой – главным терапевтическим агентом для иммунопрофилактики септических состояний.

Ещё в конце 19 века Pfeiffer обнаружил термостабильный компонент внешней мембраны клеточной стенки грамотрицательных бактерий, который он назвал эндотоксином, в противовес токсинам, секретируемым бактериями в культуральную среду во время роста – экзотоксинам (Bone R.C., 1993). В 1930-х годах эндотоксин был выделен и по строению оказался липополисахаридом, поэтому оба этих термина стали синонимами (Muller-Loennies S. et al., 2007). ЛПС представляет собой микрогетерогенную макромолекулу амфифильной природы, состоящую из трёх доменов: липида А, центрального олигосахарида (к О-специфической полисахаридной цепи (О-ПС). Все три домена различны как генетически, так и по антигенным и биохимическим свойствам. Липид А является наиболее консервативным участком молекулы ЛПС и проявляет свойства эндотоксина. О-полисахаридная цепь обладает свойствами О-антигена и определяет бактериальную сероспецифичность (серовар).

Заново синтезированные молекулы ЛПС транслоцируются через периплазму и внешнюю двухслойную мембрану клеточной стенки грамотрицательных бактерий, замещая существующие фосфолипиды, и в результате занимают до 75% всей клеточной поверхности (Caroff M., Karibian D., 2003). На поверхности каждой клетки Escherichia coli насчитывают приблизительно 106 молекул ЛПС (Raetz C.R., Whitfield C., 2002; van Amersfoort E.S. et al., 2003). Для организма ЛПС служит сигналом присутствия грамотрицательных бактерий. ЛПС не является токсичным, пока его молекула заякорена во внешней бактериальной мембране, но после высвобождения эндотоксина для клеток иммунной системы становится доступен липид А – токсичный участок молекулы ЛПС и запускается воспалительный ответ.

Эндотоксин и другие компоненты клеточной стенки могут высвобождаться во время деления или гибели (лизиса) клетки.

Колонии, образованные бактериями, экспрессирующими молекулы ЛПС, липополисахариды обозначают как S-ЛПС (от smooth – гладкий). Напротив, колонии, образованные бактериями, экспрессирующими молекулы ЛПС, у которых отсутствует О-ПС, выглядят шероховатыми, поэтому липополисахариды без О-антигена обозначают как R-ЛПС (от rough – шероховатый). Наименьшим из продуцируемых грамотрицательной бактериальной клеткой лпополисахаридов in 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты (КДО)). Ra- и Rd1-ЛПС состоят из липида А и целого или без внешней части олигосахарида кора, соответственно. Rb1- и Rc-ЛПС олигосахарида кора (van Amersfoort E.S. et al., 2003), (Рис. 1).

Рис. 1. Схема строения липополисахаридов различных хемотипов.

1.2.1. Липид А Липид А представляет собой липидный якорь молекулы ЛПС во внешней мембране грамотрицательных бактерий (Raetz C.R., 1990). Он является наиболее консервативной частью молекулы липополисахарида и имеет сходную структуру у большинства изученных микроорганизмов. Структура липида А, представленная у E.coli, рассматривается в качестве «канонической структуры» липида А для ЛПС кишечных и иных грамотрицательных бактерий. Его основу составляет дисахарид, построенный из фосфорилированных в положения 1 и 4'. Обе аминогруппы и часть гидроксильных Kumazawa Y. et al., 1998). Мощным иммуностимулирующим действием обладают гексаацильные молекулы липида А (Bryant C.E. et al., 2010). Любые изменения в «канонической структуре», например, числа, позиции и длины первичных и вторичных ацильных групп, удаление фосфатных или моносахаридных групп, приводит к существенному изменению биоактивности липида А.

В 1954 году впервые было установлено, что за патофизиологические свойства молекулы ЛПС несёт ответственность гидрофобный регион – липид А (Dobrovolskaia M.A., Vogel S.N., синтетических липидов А и Re-ЛПС, показали, что они проявляют полноценную эндотоксическую активность, что подтверждает роль липида А в качестве активного компонента ЛПС (Rietschel E.T., Westphal O., 1999).

1.2.2. Олигосахарид кора связывающим липид А с О-полисахаридом. Олигосахарид кора у многих бактерий содержит внутреннюю, примыкающюю к липиду А, и внешнюю, граничащую с О-ПС, части (Рис. 1). Такое деление характерно для ЛПС представителей семейств Enterobacteriaceae и Pseudomonadaceae (Di Padova F.E. et al., 1999). Внутренняя часть олигосахарида кора состоит из 2-3 остатков КДО и 2-3 гептозных остатков (L-глицеро-D-манно-гептоза) и является достаточно консервативным участком ЛПС в пределах одного вида. Внешняя часть олигосахарида состоит из 5- различных сахаров (Amor K. et al., 2000) и именно различия в её структуре вносят основной вклад в вариабельность кора.

1.2.3. О-полисахарид олигосахарида кора и экспонирован в сторону окружающей среды. Он является наиболее вариабельным фрагментом ЛПС и представляет собой регулярный гомоили гетерополимер, часто разветвленный, построенный из повторяющихся олигосахаридных (от двух до шести остатков моносахаридов) или моносахаридных звеньев. Например, пентасахаридное звено, придставленное на рисунке 1, состоит из трёх последовательно соединённых моносахаридных остатков, образующих основную цепь, и к первому и третьему остаткам присоединяется по одной моносахаридной боковой цепи. Длина О-полисахарида может варьироваться от одного звена в SR-формах до 50 повторяющихся звеньев (в основном 10-20) в S-формах (Muller-Loennies S. et al., 2007).

В силу высокой вариабельности (среди компонентов полисахарида насчитывают более 100 различных моносахаридов) О-антиген содержит большое количество эпитопов, экспонированных на поверхности бактериальных клеток и обладающих высоким потенциалом антигенной активности (иммуногенности) (Pollack M., 1999).

1.3. Этиология сепсиса манифестируемыми инфекционными агентами у больных с септическими осложнениями (Shapiro I.,Gelfand J.A., 1993; Willatts S.M. et al., 1994; Astiz M.E., Rackow E.C., 1998), большинство из которых связано с Escherichia coli (Di Padova F.E. et al., 1993). Второе и третье место занимают Klebsiella и Enterobacter spp. Несмотря на то, что синегнойная палочка встречается менее часто, сепсис, обусловленный Pseudomonas aeruginosa, ассоциируется с самым высоким уровнем смертности (Bone R.C., 1993).

В этиологии как внебольничных, так и госпитальных инфекций важное значение имеют отдельные представители нормальной микрофлоры человека.

Кожа, дыхательные пути, желудочно-кишечный тракт обильно заселены микроорганизмами. Например, кишечный тракт населяют миллиарды бактерий E.coli (van Amersfoort E.S. et al., 2003).

Условно-патогенные микроорганизмы (УПМ) выполняют полезные для организма функции и обладают низкой инвазивностью. УПМ постоянно присутствуют в естественных полостях организма, в кишечнике, на покровных тканях и слизистых. В норме иммунная система сдерживает распространение микроорганизмов внутри организма. В патологических условиях (стресс, оперативное вмешательство, тяжёлая травма, ожог, тяжёлое соматическое заболевание) эндогенные микроорганизмы из условно-патогенных становятся патогенными и транслоцируются через защитные барьеры организма.

Факультативная, или условно-патогенная микрофлора, обладает определёнными факторами патогенности, которые при массивном росте бактерий могут обуславливать воспалительный процесс с различной локализацией. Ряд факторов вирулентности, способствующих адгезии к эндотелию, изменению морфологии клеток и синтезу медиаторов воспаления выявлен у многих представителей комменсалической микрофлоры кишечника человека семейства Enterobacteriaceae:

Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Shigella, Proteus, Enterobacter, Providencia, Citrobacter, Yersinia. Так же доказана их роль в патогенезе внекишечных инфекций.

(Muller-Loennies S. et al., 2007).

Госпитальные инфекции наиболее распространены в отделениях реанимации и интенсивной терапии. При анализе видового состава инфекционных агентов у больных с сепсисом, была выделена группа основных возбудителей гнойнохирургических инфекций (хирургического сепсиса): грамположительные (Staphylococcus aureus, Enterococcus spp.) и грамотрицательные представители семейства Enterobacteriaceae, прежде всего E.coli и P. aeruginosa, которые вызывают до 70% постоперационных инфекций (Козлов В.К., 2006).

1.4. Патогенез сепсиса В патогенезе сепсиса можно выделить основные звенья: воспаление (активация клеток врождённой иммунной системы), генерализованный васкулит, гиперкоагуляция, синдром диссеминированного внутрисосудистого свёртывания крови и полиорганная недостаточность (Рис. 2).

Развитие септического шока чаще всего связано с раневыми инфекциями и послеоперационными осложнениями. Входными воротами возбудителей инфекции экзогенного и эндогенного происхождения могут быть сама рана, места инъекций, при проведении внутривенных инфузий нестерильных лекарственных средств или при длительном сохранении внутривенных катетеров, а также органы, барьерные функции которых пострадали вследствие системных нарушений – желудочнокишечный тракт, мочеполовая система, лёгкие. Однако, среди всех гнойных послеоперационным (операции на органах брюшной полости, сердце, мочеполовой системе) или посттравматическим (генерализация инфекции у пострадавших от ранений и травм). Наиболее высока частота послеоперационного сепсиса наблюдается при хирургических вмешательствах на органах брюшной полости.

Так, сепсис развивается в 5% случаев при операции на желудке, поджелудочной сопровождается абдоминальным сепсисом (Гельфанд Б.Р. и др., 1998).

Во время сепсиса при генерализации воспаления организм утрачивает способность локализовать инфекцию и контролировать её распространение за пределы первичного очага инфекции. Кроме того при травматических повреждениях именно собственная микрофлора, преодолевая защитные барьеры организма (проникающее ранение, перфорация стенок кишечника или транслокация микроорганизмов через стенки кишечника) обуславливает развитие инфекционного процесса (сепсиса) (Hubbard W.J., et al., 2005). У 30% пациентов с бактеремией и ПОН не был определён источник инфекции. Полагают, что у тяжелобольных пациентов происходит транслокация бактерий из кишечника, большинство этих бактерий в норме являются облигатными микроорганизмами микрофлоры кишечника. Возрастание проницаемости сосудов и/или ишемическое повреждение стенки кишечника способствует транслокации бактерий в просвет кишечника, а затем – в кровоток (Jean-Baptiste E., 2007).

Главная роль в ответе организма на инфекционные агенты и их токсины, которые мигрируют из естественных резервуаров организма и/или инфекционного очага, принадлежит системе врождённого (неспецифичного) иммунитета, направленного на распознавание высоко консервативных антигенных структур, общих для многих групп микроорганизмов. Если в качестве лиганда выступают липополисахариды грамотрицательных бактерий, появляющиеся в кровотоке в высокой концентрации при генерализованных инфекциях, то после связывания с соответствующими рецепторами на мононуклеарных фагоцитах они через множественные внутриклеточные регуляторные белки активируют транскрипционные факторы, например, ядерный фактор B - NFB, отвечающий за (Matsuda N., Hattori Y., 2006). NFB, связываясь с соответствующими участками ДНК, активирует гены-мишени, что приводит к выработке ранних (первичных) провоспалительных цитокинов – фактора некроза опухоли альфа (ФНО-) и интерлейкина один бета (ИЛ-1) (Cinel I., Dellinger R.P., 2007; Fukui M. et al., 2003;

Lin W.J., Yeh W.C., 2005), а также противовоспалительных цитокинов – интерлейкинов 4 и 10 (ИЛ4, ИЛ10), трансформирующего фактора роста TGF (Volk H.D. et al., 1996). Чрезмерная продукция ФНО- и ИЛ -1 стимулируе т высвобождение мононуклеарными фагоцитами и иммунокомпетентными клетками вторичных провоспалительных цитокинов - ИЛ-6, ИЛ-8 и медиаторов воспаления факторов активации тромбоцитов, тромбоксанов, простагландинов, компонентов системы комплемента и оксида азота (NO), являющегося главным медиатором расширения сосудов (Shapiro I., Gelfand J.A., 1993; Jean-Baptiste E., 2007).

Моноциты/ макрофаги способны продуцировать и секретировать более различных молекул, большая часть из которых являются индуцибельными.

Продукты секреции макрофагов могут выполнять как регуляторные, так и эффекторные функции. Важнейшими продуктами секреции макрофагов являются про- и противовоспалительные цитокины. Провоспалительные цитокины при попадании в кровоток связываются через свои рецепторы с иммунокомпетентными клетками на ранней стадии воспалительного ответа, активируют и усиливают неспецифический иммунный ответ. Действие противовоспалительных цитокинов как правило ингибирующее, в большинстве случаев они являются антагонистами провоспалительных цитокинов. Сепсис можно определить как дисбаланс между воспалительным (тяжёлый сепсис и эндотоксический/септический шок) и противовоспалительным (иммуносупрессия) ответами.

При сепсисе регуляция раннего ответа организма на инфекцию утрачивается.

Происходит массивное, избыточное выделение клетками провоспалительных цитокинов, прежде всего ФНО- и ИЛ -1 (Dinarello C., 1996; Astiz M.E., Rackow E.C., 1998). ФНО- действует синергически с ИЛ -1: при совместном патофизиологических изменений, если вводить их по отдельности, обуславливают (Shapiro I., Gelfand J.A., 1993). Чрезмерная продукция этих цитокинов весьма опасна за счёт преодоления нормальной регуляции иммунной системы и запуска патологических процессов, характерных для сепсиса, таких, как диффузное капиллярное повреждение, активация процессов коагуляции и снижение фибринолиза, приводящих к развитию ДВС-синдрома, гипоксии тканей и, как следствие, повреждению тканей и органной дисфункции (Ulloa L., Tracey K.J., 2005), (Рис.2). Полиорганная недостаточность является основной характеристикой септического шока (Dobrovolskaia M.A., Vogel S.N., 2002).

1.4.1. Генерализованный васкулит Среди медиаторов, вырабатываемых во время сепсиса, ФНО- и ИЛ - являются важнейшими цитокинами, участвующими в развитии циркуляторного коллапса (Williams G., Giroir B.P., 1995). Они передают сигнал иммунным клеткам, лейкоцитам и лимфоцитам, для привлечения их к месту инфекции, а так же активируют эти клетки, стимулируя продукцию ими цитокинов. Таким образом, осуществляется усиленная выработка цитокинов по механизму обратной связи, процесс становится неконтролируемым и в одном месте скапливается чрезмерное количество иммунных клеток (Matsuda N., Hattori Y., 2006). Так же под действием этих цитокинов происходит изменение морфологии эндотелия сосудов и таким образом создаются условия для задержки нейтрофилов в артериолах, капиллярах и венулах.

ФНО- боле е других цитокинов усиливает адгезию циркулирующих гранулоцитов и моноцитов к клеткам эндотелия сосудов, стимулирует их миграцию в ткани. Усиление миграции клеток в ткани осуществляется путём активации процессов роллинга («катания») по эндотелию лейкоцитов с последующей их адгезией на клетках эндотелия, которые при активации цитокинами начинают усиленно экспрессировать расширенный репертуар молекул клеточной адгезии. Под влиянием ФНО- происходит экспрессия Р- и Еселектинов на эпителиальных клетках сосудов. Лейкоциты, проходя мимо эпителиальных клеток с Р- и Е-селектинами, лишь замедляют движение, но не образуют прочных контактных связей. Под влиянием ФНО- эпителиальные клетки экспрессируют так же молекулы ICAM-1, которые взаимодействуют со своим лигандом – молекулами LFA-1, представленными на фагоцитирующих клетках (Astiz M.E., Rackow E.C., 1998). В результате происходит остановка движения фагоцитов по кровеносному руслу. После установления достаточно прочной связи между эндотелиальными клетками и фагоцитами, осуществляется проникновение последних через эндотелиальную стенку сосудов, которое реализуется взаимодействием тех же молекул LFA-1 и дополнительных молекул CD31, экспрессирующихся как на лейкоцитах, так и на эпителиальных клетках в местах плотного соединения клеток. Проникшие через эндотелиальную стенку фагоциты мигрируют непосредственно в очаг воспаления, перемещаясь по градиенту плотности, создаваемому ИЛ-8, что приводит к формированию отёка.

(Wagner J.G., Roth R.A., 1999).

В эндотелиальных клетках при воздействии ФНО- и ИЛ -1 запускается синтез и высвобождается индуцибельная NO-синтетаза iNOS, что приводит к увеличению системного уровня оксида азота (Astiz M.E., Rackow E.C., 1998), который вступает в реакцию со свободными кислородными радикалами с образованием пероксинитрита, обладающего цитотоксическим действием по отношению к различным клеткам. Оксид азота повышает проницаемость стенок микрососудов, а так же выступает в качестве главного медиатора системного расширения сосудов и развития артериальной гипотензии у больных в состоянии септического шока.

антикоагуляционную активность, оказывать фибринолитическое и антифибринолитическое действие. В норме сохраняется баланс между коагуляцией и фибринолизом. Избыточная концентрация ФНО- и ИЛ-1 может способствовать сдвигу баланса в сторону коагуляции индуцируя выделение тканевых факторов из эндотелиальных клеток и моноцитов, стимулирующих процессы коагуляции, что ведёт к избыточности последней (Billiau A., Vandekerckhove F., 1991).

Повреждение эндотелиальных клеток вызывает васкулиты и индуцирует высвобождении новых порций ФНО- и ИЛ -1, что ещё больше усугубляет повреждение эпителия, изменяет локальный баланс вазомоторов, клеточную трофику и гомеостаз. В итоге при сепсисе нарушение функций эндотелия в сочетании с работой коагуляционной системы способствует генерации сосудистого микротромбозы сосудов.

1.4.2. Гиперкоагуляция ЛПС способствует дезинтеграции системы коагуляции. При активации увеличивается тромбогенный потенциал сосудов: на цитоплазматических мембранах эндотелиальных клеток сосуда вырабатываются и экспонируются молекулы адгезии и агрегации тромбоцитов и других форменных элементов крови, а также стимуляторов фибриногенеза. ФНО- и ИЛ-1 индуцируют выработку эндотелиальными клетками. Тканевой фактор является связующим звеном между иммунной системой и коагуляцией. TF взаимодействует с фактором VIIа с превращением фактора IX в фактор IXa и фактора X в фактор Xa. Последний генерирует образование из фактора II (протромбин) фактора IIa (тромбин). Каждая из этих реакций происходит на активированной поверхности клеток. Тромбин (Rosenberg R.D., Arid W.C., 1997). В норме процесс коагуляции находится в равновесии с механизмами фибринолиза. При длительном персистировании эндотоксина в крови происходит сдвиг в сторону тромбообразования за счёт избыточного потребления факторов фибринолиза и тромбоцитов, система (Vervloet M.G. et al., 1998).

1.4.3. Синдром диссеминированного внутрисосудистого свёртывания крови При развитии септического процесса параллельно прогрессирует состояние коагулопатии, одним из проявлений которой является ДВС-синдром, заключающийся в повышенном отложении фибрина и тромбообразовании непосредственно в кровеносном русле (Mesters R.M. et al., 2000). Расстройство периферического кровообращения и микроциркуляции носят системный характер и ничем не компенсируются. В итоге развивается сосудистый коллапс, усиливается тромбоз микрососудов, нарушается тканевое дыхание, а следовательно падает потребление кислорода и прогрессирует тканевая гипоксия. В тканях, пострадавших от гипоксии, активизируются процессы некробиоза, ускоряются процессы апоптоза, что ведёт к преждевременной гибели клеток разных органов, повреждению тканей и, как следствие, развивается дисфункция многих органов и полиорганная недостаточность (van Gorp E.C. et al., 1999).

1.4.4. Полиорганная недостаточность Синдром полиорганной недостаточности определяется при повреждении/ дисфункции органов и систем органов, при которых организм не способен стабилизировать гомеостаз – не поддаётся самоизлечению и без адекватной терапии прогрессирует, - наступает фаза декомпенсации, сепсис переходит в летальную стадию. Когда СВО осложняется полиорганной недостаточностью уровень летальности может достигать более 50% (Matsuda N., Hattori Y., 2006), а при септическом шоке - 90% (Bone R.C., 1991).

Полиорганная недостаточность – это универсальное поражение всех органов и тканей агрессивными медиаторами воспаления с временным преобладанием симптомов той или иной органной недостаточности. Количество систем органов, вовлечённых в формирование ПОН, является важным прогностическим критерием смертности при сепсисе. Летальность увеличивается с ростом количества повреждённых органов и систем органов и составляет при диагностировании дисфункции одной органной системы 15%, двух – 32%, трёх – 59,4%, четырёх и более – 91,4% (Ruokonen E. et al., 1991; Руднов В.А., 2000).

Инфекция/ ЛПС Активация макрофагов Продукция провоспалительных цитокинов нейтрофильно-эндотелиальная адгезия Рис. 2. Патогенез сепсиса.

1.5. Клеточный механизм сепсиса 1.5.1. Распознавание ЛПС и активация рецепторного комплекса TLR4-MD- Ответ врождённой иммунной системы представляет собой первую линию защиты при инвазии микроорганизмов или попадании их эндотоксинов в общий кровоток. Основными участниками, главными эффекторными клетками врождённого иммунитета являются фагоциты: нейтрофилы, макрофаги (Akira S., 2003). Janeway предположил существование паттерн-распознающих рецепторов (ПРР). Он аргументировал это тем, что для выработки антител против патогена необходим вторичный сигнал от антиген-презентирующих клеток вдобавок к первичному сигналу от самого антигена. Этот вторичный сигнал обеспечивается путём распознавания консервативных структур, которые ассоциированы с патогенными организмами. Данные структуры получили название патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (ПАМП) (Janeway C.A. Jr., Medzhitov R., 2002; Bryant C.E. et al., 2010). Распознавание ПАМП через ПРР приводит к запуску защитного механизма, заключающегося в высвобождении (продукции) провоспалительных цитокинов и интерферонов I типа (ИФН-, ИФН-), которые препятствуют распространению инфекции. Ответ врождённой иммунной системы необходим не только для уничтожения патогена, но и для запуска специфического адаптивного иммунного ответа с участием Т- и Влимфоцитов (Beutler B.A., 2009).

Паттерн-распознающие рецепторы для липополисахарида относятся к I классу трансмембранных белков и известны как Toll-подобные рецепторы - TLR (toll-like receptors) (Medzhitov R. et al., 1997; Poltorak A. et al., 1998). У человека обнаружено 13 членов TLR семейства, распознающих широкий спектр микробных продуктов с консервативными структурными паттернами, присутствующими у бактерий, грибов и вирусов (Matsushima N. et al., 2007).

Toll-рецептор изначально был идентифицирован у насекомых в качестве рецептора, необходимого для дорзовентральной ориентировки во время эмбриогенеза. Toll-подобные рецепторы относятся к большому суперсемейству TIR-рецепторов, гомологичных по их цитоплазматическим участкам – Toll/IL- рецепторным доменам (TIR-домены), имеющих три консервативных блока, состоящих из аминокислотных остатков, ключевых для передачи сигнала.

Внеклеточный участок TLR-рецептора имеет форму соленоида и содержит богатые лейцином аминокислотные последовательноти - LRR (leucine-rich repeat). LRRдомены напрямую вовлечены в распознавание патогенов: лиганд связывается с внутренней поверхностью соленоида в участке лейциновых повторов, формирующих короткие параллельные Park B.S. et al., 2009).

Toll-подобным рецептором, специфичным к ЛПС, у млекопитающих является TLR4 (Leon C.G. et al., 2008). При картировании генома мышей, C57BL/10ScCr ген tlr4 был идентифицирован, как ген, кодирующий рецептор к ЛПС (Poltorak A. et al., 1998; Qureshi S.T. et al., 1999; Hoshino K. et al., 1999). При исследовании эндотоксинов E.coli и Salmonella spp. было показано, что TLR4, а не TLR2 является рецептором обеспечивающим активацию клеток в ответ на ЛПС (Tapping R.I. et al., 2000).

Распознавание липополисахарида происходит с участием четырёх молекул:

ЛПС-связывающего белка - LBP, CD14, TLR4 и MD-2. CD14 и MD2 экспрессируют многие клетки, включая моноциты, макрофаги, лимфоциты, эндотелиальные и эпителиальные клетки. TLR4 постоянно экспрессируются на полиморфоядерных лейкоцитах, моноцитах, макрофгах, лимфоцитах и дендритных клетках, а так же на эндотелиальных и эпителиальных клетках (Bosshart H., Heinzelmann M., 2007). В норме на моноцитах экспрессируется порядка 115000 молекул CD14 и молекул TLR4 (Visintin A. et al., 2001).

ЛПС-связывающий белок является белком острой фазы, его в основном вырабатывают гепатоциты печени (Jerala R., 2007). LBP циркулирует в общем кровотоке организма, где он распознаёт и связывается с высокой аффинностью с липидом А в составе молекулы ЛПС, что способствует экстракции мономера ЛПС и дезагрегации мицеллы, в которую собираются липополисахариды при выходе в 2006). Мономер ЛПС переносится посредством LBP к другому (Miyake K., вспомогательному белку – CD14, который может быть в форме заякоренного белка на поверхности миелоидных клеток (mCD14) (Heumann D., Roger T., 2002) или циркулировать в сыворотке крови в растворимой форме (sCD14) (Yu B., Wright S.D., 1996), осуществляя перенос ЛПС к клеткам, которые не имеют связанного с мембраной рецептора CD14, например, к эндотелиальным и эпителиальным клеткам (Pugin J. et al., 1993).

гидрофобный карман, в котором при связывнии ЛПС оказываются ацильные цепи липида А. У молекулы CD14 отсутствует эндоплазматический домен, и для передачи сигнала требуются трансмембранные белки, обладающие рецепторной активностью - TLR4 и MD-2 (Shizuo A., 2003).

Липополисахарид напрямую связывается с MD-2, причём обе молекулы должны быть в форме мономеров. Определённый размер и расположение ацильных цепей липида А молекулы ЛПС имеют принципиальное значение для изменения конформации MD-2, необходимое для активации TLR4 (подробнее об этом в разделе 1.6). Белковая молекула MD-2 имеет структуру -сэндвича, связывание ЛПС происходит за счёт интекаляции (вставки) ацильных цепей липида А внутрь гидрофобного кармана MD-2 (Gangloff M., Gay N.J., 2004).

MD-2 физически ассоциирован через внеклеточные LRR-домены с TLR4 с образованием гетеродимерного рецепторного комплекса MD-2-TLR4, способного к передаче сигнала через TLR4 (Akashi S. et al., 2000; Kobayashi M. et al., 2006;

Miyake K., 2006). Сам по себе TLR4-рецептор не обеспечивает клеточный ответ на ЛПС, (Shimazu R. et al., 1999). С другой стороны у MD-2-нокаутных мышей не развивается эндотоксический шок, опосредованный ЛПС (Nagai Y. et al., 2002).

Как и для других трансмембранных рецепторов I класса, для передачи сигнала через TLR4 необходима лиганд–опосредованная димеризация двух молекул рецептора (Gay N.J. et al., 2006). MD-2 помимо основной своей функции – связывания с лигандом (ЛПС), способствует димеризации активированных TLR (Dobrovolskaia M.A., Vogel S.N., 2002), что, в свою очередь, приводит к изменению конформации рецептора и димеризации двух цитоплазматических TIR-доменов, что как полагают, способствует привлечению специфичных адаптерных белков к внутриклеточным доменам TLR4, и запуску сигнальных каскадов, приводящих к активации транскрипционных факторов (Liu L. et al., 2008; Park B.S. et al., 2009).

После активации ЛПС комплекса TLR4-MD-2 в процесс передачи сигнала подключаются адаптерные белки, к которым относятся фактор дифференцировки миелоидов MyD88, TIR-содержащий адаптерный белок TIRAP, TIR-содержащая адаптерная молекула TRIF и TRIF-родственная адаптерная молекула TRAM (O’Neill L.A., Bowie A.G., 2007). TLR4 единственный представитель семейства Toll-подобных рецепторов, который активирует как ранний MyD88-зависимый, так внутриклеточного сигнала (Akira S., Takeda K., 2004; Akira S. et al., 2006; Barton G.M., Kagan J.C., 2009), которые, несмотря на разницу последующих событий, в конечном итоге приводят к активации транскрипционных факторов, в частности NFB и интерферон-регулирующего фактора 3 – IFR3 (Рис. 3).

ЛПС6 – эндотоксин, содержащий гексаацилированный липид А; LBP – ЛПСсвязывающий белок; IkB (ингибиторный белок IkB). Сортировочные адаптерные молекулы: TIRAP (TIR-содержащий адаптерный белок), TRAM (TRIF-родственная адаптерная молекула). Сигнальные адаптерные молекулы: MyD88 (фактор дифференцировки миелоидов 88), TRIF (TIR-содержащая адаптерная молекла).

Сигнальные киназы: IRAK-1, IRAK-4 (IL-1R-ассоциированные киназы 1, 4), TRAF (фактор 6, ассоциированный с рецептором фактора некроза опухоли), BTK (тирозин киназа Брутона), IKKs - IKK, IKK, IKK (ингибиторные киназы NFkB,,), IKK (ингибиторная киназа NFkB). Транскрипционные факторы: NF-kB (ядерный фактор В), IFR3 (интерферон-регулирующий фактор-3).

Рис. 3. Внутриклеточные пути передачи сигнала и активация транскрипционных факторов при взаимодействии рецепторного комплекса TLR4/MD-2 с лигандом – липополисахаридом грамотрицательных бактерий.

MyD88 и TRIF функционируют как сигнальные адаптерные белки, которые способствуют дальнейшей передаче сигнала от TLR4-рецептора. TIRAP и TRAM являются сортировочными адаптерными белками. Сортировочные адаптерные белки напрямую не взаимодействуют с киназами низлежащего сигнального пути, но благодаря взаимодействию с сигнальными адаптерными белками, способствуют их доставке к активированному рецептору TLR4. TIRAP и TRAM связываются с цитоплазматическим доменом TLR4 через образование связи между их TIRдоменами. Однако вопрос можно ли при однократной активации рецепторного димера стимулировать как MyD88- так и TRIF-зависимый ответ одновременно или активация адаптерных белков происходит независимо по принципу «или-или», остаётся открытым. Каждый из активированных рецепторов имеет два симметрично расположеных сайта связывания адаптерных белков (TIR-домены), поэтому обе гипотезы активации MyD88 и TRIF актуальны.

1.5.2. MyD88-зависимый путь передачи сигнала. Активация ядерного фактора NFB Запуск MyD88-зависимого сигнального пути начинается с привлечения MyD88 к активированному TLR4 с помощью TIRAP (Kagan J., Medzhitov R., 2006).

После образования комплекса TLR4-MyD88-TIRAP, к MyD88 присоединяются киназы IRAK-1 и IRAK-4 (IL-1R–ассоциированные киназы) (Cao Z. et al., 1996).

Молекула MyD88 состоит из С-концевого TIR-домена, через который она последовательностью N-концевого «домена смерти» - DD (death domain) через взаимодействие их DD-DD и TIR-TIR доменов и так, в качестве димера, направляются к рецепторному комплексу TLR4-MD-2. Киназы IRAK содержат Nконцевой «домен смерти» и центральный серин-треонин киназный домен (Ser/Thr).

обеспечивается при взаимодействии MyD88 с IRAK-4 посредством их «доменов смерти». Как только IRAK-4 соединяется с MyD88, он фосфорилирует IRAK-1, взаимодействие TRAF6 (фактор 6, ассоциированный с рецептором фактора некроза опухоли) с этим комплексом. Единожды активированный IRAK-1 способен автофосфорилировать аминокислотные остатки на N-конце собственной молекулы, в результате чего IRAK1-TRAF6 отщепляются от MyD88 и переносятся к цитоплазматической мембране, прикрепление к которой осуществляется через трансформирующий фактор роста ) и двух адаптерных белков TAB1 и TAB фосфорилируется и активирует TAK1, конститутивно связанную с адаптерным белком TAB1, которые затем транслоцируются в цитоплазму (Akira S., 2003).

NFB синтезируется в виде неактивного предшественника р105, который в результате протеолиза процессируется в функционально активную форму р50/p65.

Фосфорилирование р65 субъединицы необходимо для реализации транскрипции (Matsuda N., Hattori Y., 2006). При отсутствии стимуляции NFB находится в цитоплазме в неактивном состоянии в комплексе с ингибиторным белком IB.

Активация NFB начинается со сборки высокомолекулярного белкового комплекса – сигналосома, состоящего из ингибиторных киназ NFB - IKK, IKK, IKK.

TAK1 в цитоплазме в активирует сигналосом, который, в свою очередь, фосфорилирует IB. IB убиквитинируется, отсоединяется от NFB и подвергается деградации в протеасомах (Palsson-McDermott E.M., O’Neill L.A., 2004). Димеры NFB (р65/р50) перемещаются в ядро и активируют транскрипцию генов-мишеней (Zhong H. et al., 2002).

ЛПС активирует транскрипцию более 1000 различных генов в макрофагах (Bjorkbacka H. et al., 2004). Идентифицировано более 150 генов, которые имеют на своих промоторных участках сайт связывания с NFB. Среди них гены цитокинов и хемокинов (ИЛ-1, -2, -6, -8, -9, -11, 12, -15, ИФН-, ФНО), белков, обеспечивающих иммунологическое распознавание (МНС), презентацию антигенов, адгезию нейтрофилов (Dobrovolskaya M.A., Vogel S.N., 2002).

1.5.3. MyD88-независимый транскрипционного фактора IRF Исследования с использованием MyD88-нокаутных мышей показали, что передача сигнала от TLR4 происходит как по MyD88-зависимому, так и по MyD88независимому сигнальным путям. У мышей без MyD88 была отмечена слабая активация NFB, происходящая с задержкой по сравнению с группой мышей дикого типа, и они были устойчивы к летальному действию ЛПС. Более того, у MyD88-нокаутных мышей активация транскрипционного фактора IRF-3 и индукция ИФН- в ответ на ЛПС осталась неизменной ( Palsson-McDermott E.M., O’Neill L.A., 2004). Таким образом, по MyD88-независисмому пути происходит активация транскрипционного фактора IRF-3.

Сортировочный белок TRAM напрямую взаимодействует с TRIF и активированным TLR4, обеспечивая связывание и активацию сигнального адаптерного белка TRIF с TLR4 (Kagan J.C. et al., 2008). Адаптерный белок TRIF при гиперэкспрессии способен активировать NFB, х отя и не так сильно как по MyD88-зависимому пути. В экспериментах с использованием TRIF-нокаутных мышей активация NFB в ответ на ЛПС оставалась практически на том же уровне, что и у нормальных мышей, а при одновременном нокауте по TRIF и MyD88 не происходило активации NFB в ответ на ЛПС (Yamamoto M. et al., 2003).

Активированный TRIF связывается и активирует тирозин киназу Брутона BTK и протеин-киназу IKK, которая, в свою очередь, фосфорилирует IRF-3, что способствует его транслокации в ядро, где он связывается с промотером гена ИФН-. ИФН- через свои рецепторы активирует белок-супрессор проведения цитокиновых сигналов - SOCS-1, который ингибирует сигналосом, что, в свою очередь, ведёт к тому, что транскрипционный фактор NFB остаётся связанным с ингибиторным белком IB, а следовательно – подавляется транскрипция генов провоспалительных цитокинов.

присоединении к TRIF особой молекулы – RIP-1 (рецепторвзаимодействующий белок 1), которая играет ключевую роль в активации NFB через TRIF, хотя молекулярные механизмы, лежащие в основе такой активации неизвестны. При отсутствии RIP1 и MyD88 в клетках не происходит активация NFB в ответ на ЛПС (West A.P. et al., 2006).

В заключение отметим, что активация TIRAP-MyD88 сигнального пути приводит к продукции широкого спектра провоспалительных цитокинов, тогда как активация TRAM-TRIF сигнального пути стимулирует иммунный ответ, проявляя адъювантные свойства, и способствует индукции эндотоксической толерантности за счёт подавления транскрипции ФНО- (Mata-Haro V. et al., 2007). Наличие альтернативных сигнальных путей позволяет рассматривать их как терапевтическую мишень, открывая подход к разработке препаратов, которые бы «переключали» TLR4 рецептор с воспалительного пути (активация NFB) на путь индукции эндотоксической толерантности (активация IRF-3).

1.5.4. Особенности функционирования системы врождённого иммунитета при септическом шоке При эндотоксическом шоке, связанном с попаданием в общий кровоток чистого эндотоксина грамотрицательных бактерий без заражения, развитие ответа врождённой иммунной системы соответствует классическому пути клеточной активации. Однако при септическом шоке имеется ряд особенностей, отличающих развитие последнего от классических путей активации врождённого иммунного ответа.

Мыши C3H/HeJ и С57Bl/10ScCr несущие миссенс-мутацию по TIR-домену TLR4 и null-мутацию TLR4-рецептора, соответственно, устойчивы к эндотоксиновой нагрузке, но высоко восприимчивы к грамотрицательной инфекции (Poltorak A., et al., 1998). Мыши, у которых отсутствуют MyD88 и TRIF, также не восприимчивы к ЛПС и у них не развивается септический шок, что свидетельствует о важнейшей роли данных адаптерных белков в развитии ЛПСобусловленного воспалительного ответа.

В лабораторных условиях можно смоделировать послеоперационный сепсис, индуцируя посредством хирургического вмешательства постоянный приток кишечных бактерий в перитонеальную полость (стентирование брыжейки ободочной восходящей кишки – CASP-модель или метод перевязки и прокола слепой кишки – CLP-модель). На обеих моделях экспериментального перитонита было показано развитие воспалительного процесса, обусловленного обсеменением перитонеальной полости различными видами кишечных бактерий (Weighardt H., Holzmann B., 2008).

На CASP-модели было показано, что выживаемость мышей, у которых отсутствовали оба или по-отдельности рецепторы TLR4 (распознаёт ЛПС грамотрицательных бактерий) и TLR2 (распознаёт липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий), была сравнима с таковой у мышей дикого типа (Weighardt H., et al., 2002). Эти данные указывают на то, что даже отсутствие TLR и TLR2 не оказывает значительного влияния на патогенез полимикробного инфекционного процесса. На CLP-модели также не была выявлена разница между выживаемостью мышей дикого типа и мышей C3H/HeJ (имеют мутантный ген TLR4) и BALB/c (невосприимчивы к ЛПС) (Echtenacher B., et al., 2001). Эти результаты сравнимы с данными, полученными при исследовании выживаемости септических больных, имеющих мутантные TLR4 рецепторы: корреляция между потерей активности TLR4 и снижением уровня смертности от полимикробного сепсиса не была выявлена (Feterowski C., et al., 2003).

Сепсис характеризуется чрезвычайно сильным воспалительным процессом и угнетением системы адаптивного иммунитета. Во время полимикробного сепсиса благодаря присутствию большого количества патогенов, активирующих клетки врождённой иммунной системы через разные Toll-подобные рецепторы, которые могут действовать как синергисты: порог чувствительности врождённой иммунной системы к бактериальной нагрузке снижается и происходит усиление воспалительного процесса (Feterowski C., et al., 2005). Таким образом, при сепсисе другие рецепторы могут компенсировать потерю функциональной активности TLR4 (Feterowski C., et al., 2003). Было показано, что неметилированная бактериальная CpG-ДНК через TLR9 также может индуцировать септический шок (Hemmi H., et al., 2000), активируя по MyD88-зависимому сигнальному пути NFB, что приводит к выработке провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ФНО-) и фактора ингибирования миграции макрофагов, который стимулирует экспрессию ФНО- и TLR4 (Hanten J.A., et al., 2008).

Активированные макрофаги секретируют большое количество ФНО-.

Тяжесть шоковых состояний коррелирует с плазматическим уровнем ФНО-.

ФНО- передаёт трансмебранный сигнал через ФНО-рецепторы - ФНО-Р1 и ФНО-Р2. ФНО-Р1 присутствуют на поверхности большинства клеток, тогда как ФНО-Р2 – в основном на мембранах иммунных клеток. Через ФНО-рецепторы происходит активация NFВ, приводящая к продукции ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, NO-синтетазы, молекул клеточной адгезии, что способствует усилению воспаления (Jean-Baptiste E., 2007).

Таким образом, даже при функциональной дезактивации TLR4 рецептора, что наблюдается при сепсисе, когда данные рецепторы фактически «ослепляются»

гигантским количеством бактериальных эндотоксинов, сепсис будет развиваться благодаря активации TLR9 и выработанным ранее медиаторам воспаления, прежде всего ФНО-, которые че рез свои собственные рецепторы могут также активировать транскрипционный фактор NFВ, ответственный за транскрипцию генов основных медиаторов воспаления (петля усиления). Учитывая особенности раннего индуцибельного иммунного ответа при септическом шоке, коррекция уже сформировавшегося септического процесса представляется трудноразрешимой задачей, что подчёркивает важность подхода, направленного на профилактику септического шока за счёт индукции анти-эндотоксинового статуса.

1.6. Агонисты и антагонисты TLR TLR4/MD-2 рецепторный комплекс проявляет специфичность ко многим лигандам: он может быть активирован разными по структуре молекулами ЛПС.

Разнообразие биологической активности ЛПС обусловлено различием структуры липида А, которая может варьироваться по числу и длине жирных кислот, наличию и числу фосфатных остатков. Оптимальной биологической активностью липид А обладает когда его молекула бифосфорилирована и гексаацилирована (Raetz С.R., Whitfield C., 2002). Любое изменение структуры липида А по этим параметрам (число жирных кислот, фосфорилирование) может привести к существенной потере эндотоксической активности (Johnson A., 1994; Alexander C., Rietschel E.T., 2001). Структура липида А, проявляющая высокую биологическую активность должна содержать следующие структурные компоненты: два 1(1’-6)связанных остатка D–глюкозамина, фосфорилированные в положениях 1 и 4’, и (Kumazawa Y. et al., 1998). Указанные структуры, вносящие наибольший вклад в эндотоксические свойства липида А, являются высококонсервативными рассматриваются в качестве элементов «канонической структуры» липида А.

Структурный анализ ЛПС, выделенных из различных бактериальных видов, синтетических производных и аналогов липида А выявил, что длина и число ацильных цепей является решающим параметром для активации TLR (Hajjar A.M. et al., 2002; Kusumoto S. et al., 2003). Связывание с молекулой липида А с определённым числом, размером и расположением ацильных цепей вызывает изменение конформации MD-2, необходимое для активации TLR4 и последующей передачи внутриклеточного сигнала (Jerala R., 2007; Park B.S. et al., 2009).

Гексаацилированный липид А эндотоксина E.coli максимально стимулирует TLR4, и изменение числа или длины остатков жирных кислот или изменение заряда липида А может снизить его биологическую активность. Молекулы липида А, содержащие 4-5 ацильных групп, не проявляют агонистической активности, но действуют как антагонисты по отношению к TLR4 (Hajjar et al., 2002). Ацильные цепи длиной в 12-14 атомов углерода обладают максимальной биологической активностью, тогда как при длине ацильных цепей менее 10 и более 16 атомов углерода даже для гексаацилированного липида А наблюдается резкое снижение биоактивности (Johnson D.A. et al., 1999; Stover A.G. et al., 2004).

Фосфатные группы в составе липида А также оказывают большое влияние на эндотоксическую активность ЛПС (Rietschel E.T. et al., 1994). При удалении обеих фосфатных групп активность падает примерно в 100 раз (Caglar C. et al., 2009).

Канонический липид А E.coli активирует как TIRAP-MyD88-, так TRAMTRIF-опосредованную передачу сигналов. Нетоксичное производное липида А, полученное в результате мягкого кислотного гидролиза (отщепление одной фосфатной группы), - монофосфорил липид А (MPL) - эффективно активирует TRAM-TRIF сигнальный путь и слабо - TIRAP-MyD88 путь. Адъювантная активность MPL преобладает над провоспалительной активностью, характерной для гексаацилированного липида А (Mata-Haro V. et al., 2007). Таким образом, можно сделать вывод, что различные структуры липида А индуцируют активацию разных сигнальных путей TLR4 (Bryant C.E. et al., 2010), причём одни из них действуют как агонисты, а другие - как антагонисты.

Итак, по типу связывания с комплексом TLR4-MD-2 и биологической активности лиганды можно объединить в следующие группы:

• Агонисты (например, гексаацилированный липид А): лиганд связывается с TLR4-MD-2, инициирует изменение конформации рецептора, ассоциацию TIR-доменов, привлечение адаптерных белков и запуск сигнальных путей, приводящих к активации NFB и синтезу провоспалительнх цитокинов.

• Антагонисты (например, тетра- или пентаацилированный липид А): лиганд связывается с рецептором, но не приводит к изменению конформации рецептора и активации сигнальных путей. Антагонисты ингибируют клеточный ответ, перекрывая доступ агонистов к своим сайтам связывания.

Каких-либо других воздействий на рецептор антагонисты не оказывают.

связывается с рецептором, индуцирует небольшое изменение конформации без полноценной активации рецептора, что в свою очередь приводит к недостаточной передаче сигнала. В отличие от канонического липида А MPL не содержит фосфатной группы в положении 1, что делает невозможным взаимодействие с положительно заряженными аминокислотными остатками на поверхности MD-2 и TLR4. В присутствии частичного агониста полноценный агонист не способен связаться с рецептором; таким образом, частичный агонист действует как антагонист.

Было описано несколько антагонистов ЛПС. Липид IVa тетраацилированный предшественник липида А ЛПС E.coli является мощным антагонистом канонического ЛПС E.coli, что проявляется в снижении продукции ФНО- моноцитами человека in vitro, причём наблюдается зависимость доза – эффект. (Golenbock D.T. et al., 1991). Тетраацилированный ЛПС Porphyromonas gingivalis и пентаацилированный ЛПС мутантного штамма mcbB E.coli (mcbB ЛПС) действуют как антагонисты по отношению к гексаацилированному ЛПС E.coli, блокируя связывание последнего с TLR4-MD-2 рецепторным комплексом на эндотельных клетках человека (Coats S.R. et al., 2003).

Различия в строении липида А могут быть распознаны на этапе презентации ЛПС. Ещё до открытия Toll-подобных рецепторов, было обнаружено, что распознавание специфических структур липида А происходит после связывания с CD14 (Delude R.L. et al., 1995). Липид IVa ингибирует человеческий, но активирует мышиный ответ моноцитов на ЛПС. При трансфекции человеческих клеток мышиным CD14 и vice versa было показано, что трансфецированные клетки отвечают на ЛПС согласно их клеточному типу (видовой принадлежности), а не типу CD14. СD14 является объединяющим компонентом в TLR4-зависимом сигнальном каскаде и необходим для эффективного переноса ЛПС к рецепторному трансфецированных рекомбинантными человеческими белками TLR4, MD-2 и CD14 клеток линии НЕК293, кото р ы сами не экспрессируют данные белки, при использовании растворимого sCD14, и активация NFB значительно усиливается, (Darveau R.P. et al., 2004). Также было показано, что наличие TLR4 не является необходимым для взаимодействия ЛПС P.gingivalis и mcbB ЛПС E.coli с MD- (Coats S.R. et al., 2005). Таким образом, MD-2 является главной молекулой, связанной с антагонизмом по отношению к TLR4, в пользу чего говорит тот факт, что MD-2 селективно связывается с гексаацилированным липидом А, но не с его синтетическим предшественником - липидом IVa (Akashi S. et al., 2001).

При исследовании кристаллической структуры комплекса TLR4-MD-2-ЛПС было выявлено, что присоединение ЛПС индуцирует формирование рецепторного расположенных симметрично. Белковая молекула MD-2 состоит из двух антипараллельных -складок, изогнутых в виде подковы, формирующих гидрофобные карманы для связывания лигандов. Связывание ЛПС происходит за счёт вставки ацильных цепей липида А внутрь гидрофобного кармана MD- (Gangloff M., Gay N.J., 2004). При взаимодействии с MD-2 тетраацилированных липида IVa или эриторана (синтетический аналог липида А) 4 ацильных цепи полностью оказываются внутри кармана MD-2, однако в структуре комплекса эриторан-TLR4-MD-2 не было обнаружено прямого взаимодействия между лигандом (эриторан) и рецептором (TLR4), а также не происходило изменений конформации и димеризации рецепторов (Kim H.M. et al., 2007). С другой стороны Park с коллегами продемонстрировал, что при отсутствии лиганда TLR4 и MD- соединяются, но димеризация одного комплекса TLR4-MD-2 с другим происходит только после связывания с ЛПС (Park B.S. et al., 2009). В пределах комплекса TLR4/MD- спрятанными внутри гидрофобного карман MD-2, как и у эриторана, а оставшиеся ещё 2 ацильные цепи частично оказываются снаружи MD-2 и могут гидрофобно взаимодействовать с положительно заряженными остатками фенилаланина двух TLR4 молекул, способствуя таким образом их димеризации и активации.

Взаимодействие с ЛПС приводит к изменению структуры рецептора в пределах петли MD-2 (Phe126), что необходимо для гидрофильного взаимодействия между TLR4 и MD-2 и стабилизации комплекса. Структурное изменение (Phe126) вслед за стимуляцией эндотоксином необходимо для образования рецепторных димеров и последующей активации (инициации) сигнальных каскадов (Park B.S. et al., 2009).

Важно отметить, что при совместной экспозиции трансфецированных клеток НЕК293 с ЛПС E.coli и ЛПС P.gingivalis, было отмечено подавление ЛПС E.coli– опосредованной активации NFB. Однако ЛПС P.gingivalis никак не влияет на ИЛ-1-опосредованную активацию NFB через рецептор ИЛ-1 (ИЛ-1Р), что свидетельствует о том, что антагонизм не происходит на пострецепторном уровне, имеющем общие промежуточные пути передачи сигнала от TLR4 и ИЛ-1Р к NFB (Coats S.R. et al., 2005).

Таким образом, антагонисты TLR4-рецепторов можно рассматривать как потенциальные агенты для разработки препаратов для профилактики (коррекции) эндотоксичсекого шока и эндотоксикозов различного генеза, основываясь на их способности связываться с рецепторным комплексом TLR4-MD-2 и блокировать сайты связывания для гексаацилированных бактериальных ЛПС.

1.7. Современные подходы к терапии и профилактике эндотоксического и септического шока 1.7.1. Терапия сепсиса в клинике В отношении выбора оптимальной хирургической тактики при сепсисе в настоящее время придерживаются принципа радикального оперативного лечения.

дренирование гнойников. В случае абдоминального сепсиса необходимо выполнение ранней и адекватной ликвидации или отграничения всех основных, дополнительных и потенциальных источников (очагов) эндогенной инфекции. Эти методики сочетаются в обязательном порядке с различными способами декомпрессии, детоксикации и деконтаминации желудочно-кишечного тракта (Гельфанд В.Р. и др., 1995; Савельев В.С., Гельфанд Б.Р., 1990).

В настоящее время считается, что лечение сепсиса без интенсивной антибактериальной терапии невозможно. При выборе и назначении антибиотика в первую очередь необходимо установить природу инфекционного агента. При отсутствии информации о возбудителе после постановки клинического диагноза в первые несколько суток есть возможность назначить антибактериальные средства, учитывая локализацию инфекционного очага и наиболее типичную для данной анатомической области микрофлору. Стандартом в применении антибиотиков при сепсисе является деэслакационная терапия, принцип которой состоит в том, что с момента начала лечения назначаются самые мощные бактерицидные препараты, которые должны перекрывать возможный спектр возбудителей хирургической инфекции (карбопенемы, цефалоспорины IV поколения, аминогликозидамы).

Далее, по мере улучшения состояния, возможны два варианта: бактериологическая диагностика возбудителя и назначение препаратов узкого спектра действия или назначение малотоксичных бактериостатических препаратов с меньшей широтой действия для предотвращения ре- и суперинфекции (спарфлоксацин, ципрофлоксацин) (Столяров Е.А. и др., 2004).

Применение подходящих антибиотиков на ранних стадиях сепсиса позволяет снизить вероятность развития септического шока и коэффициент смертности на 50% (Bone R.C., 1993). Однако антибиотики не предотвращают выход ЛПС в кровоток; более того, после использования некоторых видов антибиотиков концентрация ЛПС в крови возрастает. Этот эффект может объяснить тот факт, что несмотря на эффективную элиминацию бактерий, не происходит существенного грамотрицательными бактериями (Muller-Loennies S. et al., 2007).

В качестве инфузионной среды широко применяются плазмозамещающие растворы, что связано с их возможностью поддерживать гемодинамику, восстанавливать коллоидно-осмотическое давление, выполнять детоксикационную функцию, а также с отсутствием необходимости подбора препарата по групповым антигенам и резус-фактору. Кроме того, по сравнению с препаратами крови плазмозамещающим растворам присуща низкая сенсибилизирующая активность и возможность в связи с этим многократных инфузий, хорошая переносимость и низкое число побочных и анафилактических реакций, отсутствие возможности передачи инфекций, высокая лечебная эффективность и направленность действия, возможность заблаговременного производства и низкая стоимость (Костюченко А.Л., 2000; Елагин Е.В. и др., 2006;). Необходимо помнить также о таком осложнении при сепсисе как коагулопатия, поэтому при инфузионной терапии, наряду с введением ионотропных и вазоактивных препаратов, обеспечивающих гемодинамическую поддержку при тяжёлом сепсисе и септическом шоке, необходимо вводить препараты, снижающие вязкость крови и как, следствие, возможность развития тканевой гипоксии.

Низкое перфузионное давление требует немедленного включения препаратов, повышающих сосудистый тонус. Допамин или норадреналин являются препаратами первоочерёдного выбора коррекции гипотензии у больных с септическим шоком. В качестве ионотропных препаратов предпочтительно периферическую микроциркуляцию (Столяров Е.А. и др., 2004).

Острая дыхательная недостаточность является наиболее частой и опасной органной дисфункцией при сепсисе: в условиях гипоксии резко возрастает скорость реакции септического каскада и тяжесть патологических процессов (Пивоварова Л.П. и др., 1997). С другой стороны, дисфункция любого другого органа усугубляет нагрузку на лёгкие, нарушает их газообменную функцию, что говорит о важности респираторной поддержки у больных с тяжёлым сепсисом или септическим шоком. Варианты респираторной поддержки могут варьировать от ингаляции увлажнённого кислорода через носовые катетеры до искусственной вентиляции лёгких, которая показана большинству септических больных.

Синдром системного воспалительного ответа представляет собой патологию внутривенных иммуноглобулинов является одним из подходов к терапии сепсиса в клинической практике (Tugrul S. et al., 2002). Поликлональные внутривенные микроорганизмов (нейтрализация экзо- и эндотоксинов), сильнодействующим иммуномодулирующим действием (стимуляция опсонической и бактерицидной активности сыворотки крови), снижают уровень про- и повышают уровень многочисленных клинических испытаниях было показано, что применение поликлональных внутривенных иммуноглобулинов повышает выживаемость Nelson A.R. et al., 2005; Turgeon A.F. et al., 2007). Тем не менее, по результатам ряда исследований данной терапии, а также из-за высокой стоимости и ограниченного предложения её использование не рекомендуется к широкому применению (Hartung H.P. et al., 2009).

При применении Пентаглобина (препарат иммуноглобулинов, обогащённый донорскими полиспецифическими антителами IgM для внутривенного введения) его антитоксическая эффективность оказалась выше в 16-32 раза по сравнению с действием других иммуногобулиновых препаратов при сепсисе, вызванном E.coli, P.aeruginosa, K.pneumoniae, S.aureus. Пентаглобин при введении в течение первых 24-96 часов течения тяжёлого сепсиса повышал выживаемость больных на 28%.

(Schedel I. et al., 1991). Однако при тяжёлой хирургической патологии, тяжёлой травме, ожоговой болезни, вводимые иммуноглобулины не способны полноценно корректировать иммунодисфункцию.

Неэффективность лечения сепсиса в клинике диктует необходимость поиска новых подходов не только к терапии сепсиса, но и к предотвращению, профилактике, подготовке пациента к возможному септическому состоянию.

1.7.2. Нейтрализация провоспалительных цитокинов в кровотоке На основании доклинических исследований сывороток крови септических больных, медиаторы воспаления, включая провоспалительные цитокины (прежде всего ФНО- и ИЛ -1) были идентифицированы как основные мише ни для проведения противосептической терапии. Подходы к подавлению биологической активности провоспалительных цитокинов могут быть связаны с применением «перехватывающих» агентов: ФНО-/ИЛ-1–специфических антител, растворимых рецепторов или антагонистов рецепторов, специфичных к ФНО- и ИЛ-1, соответственно.

Клинические исследования, связанные с применением моноклональных антител против ФНО- не увенчались успехом: анти-ФНО--антитела защищают от гибели при эндотоксиновой нагрузке, но не при полимикробном сепсисе (Salkowski C.A. et al., 1998).

Рецепторы для фактора некроза опухоли (ФНО-Р) в норме находятся на поверхности клеток, с ними связываются циркулирующие молекулы ФНО- и осуществляют запуск клеточного ответа. Однако после протеолитического отщепления от клеточной поверхности ФНО-Р обнаруживаются и в свободном состоянии в плазме крови. Циркулирующие рецепторы могут «перехватывать»

свободные молекулы ФНО- и таким образом предотвращать их связывание с поверхностью клетки и стимуляцию клеточного ответа. При экспериментальном использовании растворимого рецептора к ФНО- не наблюдалось снижения уровня летальности (Remick D.G., Ward P.A., 2005).

Антагонист рецептора ИЛ-1 (ИЛ-1РА) естественный ингибитор биологической активности ИЛ-1. В отличие от ФНО-Р, ИЛ-1РА был генетически создан в качестве коммерческого препарата для лечения ревматоидного артрита.

ИЛ-1РА является структурным гомологом ИЛ-1 и ИЛ -1 и, связываясь с рецептором для ИЛ-1, действует как антагонист: конкурентно занимает свободные рецепторы без их активации, тем самым снижая биологическую активность ИЛ-1.

Во всех проводимых клинических испытаниях применение ИЛ-1РА не привело к существенному снижению смертности среди септических больных (Remick D.G., Ward P.A., 2005).

Более того, было выявлено, что при введении как растворимого ФНО-Р, так и ИЛ-1РА возрастает риск развития инфекции (Olsen N.J., Stein C.M., 2004). Таким образом, терапия, направленная на нейтрализацию провоспалительных цитокинов ФНО- и ИЛ-1 у се птических больных оказалась неэффективной: летальность не только не снижалась, но в некоторых группах даже возрастала (Zeni F. et al., 1997;

van Amersfoort E.S. et al., 2003).

септического шока оказались неэффективны, поэтому внимание исследователей переключилось на поиск подходов к иммунопрофилактике эндотоксического и септического шока и разработку препаратов, применение которых позволит создать устойчивость организма к последующему массивному попаданию грамотрицательных бактерий и их эндотоксинов в кровоток.

1.7.3. Антагонисты бактериальных эндотоксинов Антагонисты бактериальных эндотоксинов, изучение которых находится в начальной стадии, заслуживают особого внимания как потенциальные агенты для профилактики эндотоксического и септического шока (Coats S.R. et al., 2005). В качестве таких антагонистов исследовали синтетические аналоги липидов А из пентаацилированный липида А (E5531) и тетраацилированный липид А (Е5564 или эриторан), соответственно (Palsson-McDermott E.M., O’Neill L.A., 2004;

Leon C.G. et al., 2008).

In vitro Е5564 в наномолярных концентрациях дозозависимо ингибирует активацию гексаацилированным бактериальным ЛПС культуры миелоидных клеток человека и культуры макрофагов мыши. Е5564 также блокирует способность грамотрицательных бактерий стимулировать продукцию цитокинов в цельной крови человека. In vivo при профилактическом введении Е5531 и Е блокируют продукцию ЛПС-индуцированных цитокинов и снижают гибель мышей от ЛПС или бактерий. (Kawata T. et al., 1999; Leon C.G. et al., 2008).

В рандомизированном контролируемом исследовании 32-м здоровым добровольцам внутривенно (в/в) в руку в течение 30 минут вводили Е5531 в дозах 100, 250, 500 или 1000 мкг или плацебо. Через 15 минут после начала введения Е5531 в другую руку в/в начали вводить эндотоксин (4 пг/кг). Е5531 снижал проявление симптомов, возникающих при введении ЛПС и уровень ФНО- и ИЛ- (Bunnell E. et al., 2000). Схожие результаты были получены при использовании Е5564 по той же схеме в дозах 50, 100 и 250 мкг. (Lynn M. et al., 2003). В другом рандомизированном исследовании приняло участие 300 пациентов с тяжёлым сепсисом. Через 12 часов после манифестации тяжёлоге сепсиса пациентам вводили плацебо или эриторан в дозах 45 или 105 мг каждые 12 часов в течение дней. При использовании обеих доз препарата уровень летальности пациетов не понизился и был сопоставим с таковым в группе пациентов, которым было введено плацебо (Tidswell M. et al., 2010). В результате исследований стало чевидно, что для эффективного лечения сепсиса важна не только доза, но и время введения препарата: в последнем исследовании эриторан начали вводить слишком поздно, т.к. несмотря на гипердозы E5564 не оказывал положительного влияния на выживаемость пациентов. Таким образом, разработка схем терапевтического применения противошоковых препаратов является важной задачей для успешной борьбы с септическими осложнениями.

Другой известный антагонист эндотоксина – нетоксичное производное 4’монофосфорил липид А был получен в результате мягкого кислотного гидролиза ЛПС из Salmonella enterica sv Minnesota.

Профилактическое введение MPL позволяет индуцировать состояние эндотоксической толерантности и сгладить септический синдром у мышей после экспериментального перитонита (процедура перевязки и прокола слепой кишки – CLP-модель). При профилактическом введении MPL за три дня до инъекции ЛПС E.coli было отмечено значительное снижение в сыворотке уровня ФНО-, ИЛ-6 и ИФН- (Salkowski C.A. et al., 1998). При экспериментальном перитоните у мышей предварительное внутривенное введение 100 мкг MPL повышало выживаемость мышей до 20%, а внутрибрюшинное - до 70% (Astiz M.E. et al., 1994).

внутривенно вводился MPL в дозах 20 мкг/кг, либо его растворитель в качестве контроля. Через сутки испытуемым вводили внутривенно национальный стандарт эндотоксина США из E.coli Ес5 в дозе 20 отн.ед./кг. В группе плацебо были отмечены общие эндотоксические реакции (озноб, головокружение, тахикардия) и повышение температуры до 38 В группе привитых реакции не были ярковыраженными, а температура и учащение ритма сердца были существенно ниже, чем в группе плацебо. Уровни ФНО-, ИЛ -6, ИЛ-8 в сыворотках крови добровольцев, получивших препарат МРL, были ниже, чем в контрольных сыворотках (Astiz M.E. et al., 1995).

Данные клинических испытаний являются серьезным поводом для размышлений относительно стратегии разработки липополисахаридной толерогенной вакцины. Было получено прямое доказательство возможности профилактики эндотоксического шока у человека.

1.7.4. Модификация анти-эндотоксинового статуса Неудачи в области терапии сепсиса привлекли особое внимание к изучению иммунологического статуса пациентов с различными исходами септических состояний. Многочисленными исследованиями была установлена взаимосвязь между уровнем анти-ЛПС-антител при развитии сепсиса и исходом заболевания:

снижение уровня анти-ЛПС-антител во время сепсиса является прогностическим признаком неблагоприятного исхода (Nys M. et al., 1993; Goldie A.S. et al., 1995).

ЛПС, попадая в кровоток, вызывает системный воспалительный ответ, который идёт на убыль только при появлении ЛПС-специфических антител. Schedel I.

продемонстрировал, что при введении поликлональных иммуноглобулинов IgA, IgG и IgM смертность при сепсисе снижается (1/27 против 9/28), что коррелирует со снижением уровня и активности циркулирующих эндотоксинов (Schedel I. et al., 1991). Также была продемонстрирована прямая зависимость между присутствием антител, специфичных к олигосахариду кора ЛПС, в сыворотке и выживаемостью пациентов с грамотрицательным сепсисом (Pollack M. et al., 1983).

Таким образом, антитела, которые могут эффективно нейтрализовать широкий спектр грамотрицательных бактерий, должны быть специфичны к общему эпитопу в составе консервативных участков ЛПС.

ЛПС является хорошим иммуногеном, а антительный иммунный ответ против антигенных детерминант О-ПС и кора молекулы ЛПС является важным, а при ряде инфекций практически единственным установленным протективным механизмом (Robbins J.B. et al., 1992). При введении бактериального эндотоксина животным доминантным оказывается иммунный ответ, направленный против Оантигена липополисахарида; он обеспечивает защиту организма от определённого бактериального серовара, т.е. является видоспецифичным. Индукция антител, специфичных к определённому микроорганизму, неэффективна для лечения сепсиса, носящего полимикробный характер. Антитела к липиду А также были описаны, но они не обладали ЛПС-нейтрализующей активностью in vivo (Kuhn H.M. et al., 1992), При введении эндотоксина также вырабатывается относительно небольшое количество кор-специфических антител. Увеличивая нагрузку эндотоксином с определённым типом кора можно индуцировать/ усилить выработку кор-специфических антител, которые, учитывая наличие консервативных участков в структуре кора ЛПС большинства представителей семейства Enterobacteriaceae, могут обеспечить защитный эффект от действия широкого спектра грамотрицательных энтеробактерий, с этим же типо м ко р ав составе их эндотоксинов (Gibbs R.J. et al., 2004; Cross A.S. et al., 2004).

R-ЛПС, с отсутствующим О-полисахаридом, обеспечивают массированную выработку антител к области кора молекулы ЛПС и защищают от летальных инфекций, вызванных различными энтеробактериями (Cross A., 2010). Эти данные легли в основу разработки эндотоксиновых вакцин широкого спектра действия с перекрёстной активностью. Был выбран мутантный штамм J5 E.coli O111:B (J5 E.coli), Rc-хемотипа, без О-полисахаридной цепи. При иммунизации термически убитыми бактериями J5 E.coli были получены антитела, которые были специфичны не только к кору ЛПС J5 E.coli (анти-J5-антитела) но и к корам других грамотрицательных бактерий. Было определено, что человеческие IgG-антитела к J5 E.coli не ослабляют септические осложнения, и защитную активность антисыворотки всецело приписывали IgM-антителам (McCabe W.R. et al., 1988).

Однако при введении добровольцам, находящимся в ОРИТ с септическим диагнозом, сыворотки, содержащей анти-J5-антитела, не наблюдалось улучшения течения и исхода заболевания. Недостаток пассивной терапии кор-специфическими антителами можно объяснить тем, что антитела были введены пациентам в неподходящем количестве (больше или меньше, чем нужно), или концентрацию (Cross A.S. et al., 1999; Cross A.S. et al., 2001).

При использовании бактериальных клеток E.coli со всеми типами кора (R1, R2, R3, R4, K12) в составе их Ra-ЛПС, были получены моноклональные антитела (МАТ) WN1 222-5, подкласса иммуноглобулинов G2a, которые связывались с S- и R-хемотипами изолированных ЛПС из E.coli, Salmonella spp. и Shigella spp.

Сходство структуры кора и наличие общего эпитопа в его составе у различных ЛПС представителей семейства Enterobacteriaceae, определяло способность к перекрёстному реагированию антител WN1 222-5. То, что WN1 222-5 способны реагировать как с R- так и S-липополисахаридами, указывает на то, Ополисахаридная цепь не экранирует сайт связывания в области кора. По данным иммуноферментного анализа было выявлено, что антитела WN1 222-5 эффективно связываются со всеми клиническими бактериальными изолятами E.coli и Salmonella spp., c некоторыми Citrobacter spp., слабо - с некоторыми Enterobacter spp., но не с Klebsiella spp. и Pseudomonas aeruginosa. Также была определена нейтрализующая активность WN1 222-5 по отношению к бактериальным ЛПС (Muller-Loennies S. et al., 2007). Однако никаких клинических исследований с использованием данных антител так и не было проведено (Cross A.S., 2010).

В научной группе под руководством Cross A.S. при помощи кислотной обработки осуществляли детоксикацию эндотоксина J5 E.coli с получением активностью. При нековалентном присоединении дЛПС J5 к белку внешней мембраны Neisseria meningitidis - OMP (outer membrane protein) получили образец конъюгированной вакцины - дЛПС J5/OMP, который при иммунизации мышей обеспечивал 37-142 кратный подъём титра антител через 4 недели после введения первой дозы (Cross A.S., 2010).

дЛПС J5/OMP внутримышечно в дозах 5, 10 или 25 мкг не было выявлено лихорадки, ломоты в суставах, дисфункций печени, почек и нарушения гематологических показателей. В группах добровольцев, иммунизированных 10 мкг препарата, наблюдалось 3-х кратное возрастание уровня антител IgG и IgM;

в группах, получивших 5 и 25 мкг вакцины, антительный ответ был ниже. Во всех группах был отмечен высокий, по сравнению с контролем, уровень IgM-антител к области кора молекулы ЛПС. Иммунизация конъюгированной вакциной поликлональный анти-ЛПС иммунный ответ: бустерная вакцинация через месяцев не привела к повышению уровня антител (Cross A.S. et al., 2004).

Группой польских учёных была создана конъюгированная вакцина, состоящая из олигосахаридов коров E.coli разных типов (R1, R2, R3), Rc-ЛПС E.coli и Ra-ЛПС Salmonella spp. ковалентно «пришитых» к столбнячному токсину (Lugowski C. et al., 1996a; Lugowski C. et al., 1996b). При иммунизации мышей в сыворотке были выявлены антитела, специфичные к консервативным эпитопам в составе олигосахарида кора S-ЛПС и наблюдалась 100% защита от заражения P.aeruginosa. Несмотря на обнадёживающий результат, полученный на животных, при введении человеку вакцина оказалась неэффективной.