«НАСЛЕДСТВЕННЫЕ АНГИОНЕВРОТИЧЕСКИЕ ОТЕКИ: ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ, ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ...»

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР «ИНСТИТУТ

ИММУНОЛОГИИ» ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКО-БИОЛГИЧЕСКОГО

АГЕНСТВА

На правах рукописи

Дмитриева Алла Викторовна

НАСЛЕДСТВЕННЫЕ АНГИОНЕВРОТИЧЕСКИЕ ОТЕКИ:

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ, ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология 03.02.07 – генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Т.В. Латышева Доктор биологических наук, профессор А.В. Поляков МОСКВА - Оглавление Список сокращений Введение Глава I. Обзор литературы 1.1. Распространенность и этиопатогенез наследственного ангионевротического отека 1.1.1. С1-ингибитор 1.1.2. Ген SERPING1 1.2. Типы НАО 1.3. Клинические проявления НАО 1.4. Лечение НАО 1.5. Заключение Глава II. Материалы и методы исследования 2.1. Объекты исследования 2.2. Методы клинико-лабораторного обследования 2.2.1. Методы клинического обследования 2.2.2. Методы аллергологического обследования 2.2.3. Методы иммунологического обследования 2.3. Молекулярно-генетическое исследование Глава III. Результаты исследования 3.1. Общая характеристика пациентов с рецидивирующими ангионевротическими отеками 3.2. Формирование групп пациентов в зависимости от наличия изменений в системе компонентов комплемента 3.2.1. Характеристика второй группы пациентов 3.2.2. Характеристика первой группы пациентов 3.3. Молекулярно-генетический анализ 3.3.1. Анализ семей пациентов с НАО Глава IV. Обсуждение полученных результатов Практические рекомендации Выводы Список литературы Приложение 1 Список сокращений АД – артериальное давление АлАТ – аланинаминотрансфераза АсАТ – аспартатаминотрансфераза АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ГКС – глюкокортикостероиды ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота иАПФ – ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента ЛДГ – лактатдегидрогеназа МНО – международное нормализованное отношение НАО – наследственный ангионевротический отек ПЦР – полимеразная цепная реакция РНК – рибонуклеиновая кислота мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота СК – система компонентов комплемента СОЭ – скорость оседания эритроцитов ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота NCBI – National Center for Biotechnology Information OMIM – Online Mendelian Inheritance in Man SERPING1 – ген белка С1-ингибитора ТВЕ – трис-боратный буфер

ВЕДЕНИЕ

Актуальность темы диссертации. Первые упоминания об отеках были сделаны еще во времена Гиппократа (IV в. до н. э.) [1]. В 1882 г. Quincke описал «острый ограниченный отек кожи», а в 1894 г. Bannister описал эту форму – как «острый ангионевротический отек». В настоящее время рецидивирующие ангиоотеки представляют собою важную клиническую проблему, актуальность которой обусловлена не только недостаточными сведениями о механизмах развития, но и серьезным влиянием болезни на все стороны жизни пациентов, трудностями диагностики и лечения [2]. На сегодняшний день по данным различных публикаций встречаемость ангиоотека составляет примерно 1 случай на 10000 населения и не зависит от расы и пола [3].

Известно, что помимо иммунологического генеза причины развития ангиоотеков могут быть связаны с патологией ЖКТ, гепатобилиарной сердечнососудистой системы, нервной системы, опорно-двигательного Ангионевротические отеки могут быть эндокринного и метаболического генеза, а также возникать при гематологических заболеваниях и иммунодефицитных состояниях, при распространенных инфекционных и паразитарных инвазиях [1]. В связи с этим с данной группой заболевания встречаются врачи различных специальностей. Учитывая множество этиопатогенетических механизмов развития ангиоотеков, схемы лечения их различны [3]. Одной из форм ангиоотеков является наследственный ангиоотек, связанный с нарушением в системе комплемента. Наследственный ангионевротический отек (НАО) впервые описал Osler в 1888 г. а в 1963 г.

Donaldson и Evans описали причину этого заболевания как биохимический дефект - дефицит ингибитора С1-эстеразы. [4]. В последующем установлен аутосомно-доминантный тип наследования данного заболевание [5]. НАО и ранее изучался в нашей стране [6, 7], однако в связи с низкой выявляемостью данного заболевания и отсутствием регистра больных, до настоящего времени достоверных данных о распространенности НАО среди населения России нет. НАО относится к так называемым «сиротским» заболеваниям.

По данным зарубежных авторов НАО встречается достаточно редко и составляет около 2% от всех случаев ангиоотека [8, 9, 11]. Несмотря достаточно редкую встречаемость, НАО представляет серьезную проблему в практической медицине, в связи с тяжестью обострений и высокой вероятностью развития тяжелых осложнений, которые в некоторых случаях приводят к летальному исходу [5]. В ряде стран существуют общества пациентов, страдающих редкими тяжелыми врожденными заболеваниями. Во многих странах мира широко используются методы молекулярногенетической диагностики с целью верификации и изучения наследственных форм заболевания, в том числе НАО [8-12].

С целью проведения дифференциальной диагностики ангионевротических отеков, в случаях выявления наследственного генеза ангионевротического отека прогнозировать вероятность наследования данного заболевания и возможности выявления мутации на доклиническом этапе необходимо внедрять молекулярно-генетические методы обследования в клиническую практику. Изучение патогенеза наследственных форм ангиоотеков на молекулярно-генетическом уровне является чрезвычайно актуальным, подобные исследования позволят проводить не только дифференциальную диагностику, но и верифицировать НАО на досимптомной (доклинической) стадии. Это поможет врачам своевременно выставить правильный диагноз, определить дальнейшую тактику ведения пациента, подобрать адекватную терапию, тем самым предотвратив появление тяжелых, в том числе жизнеугрожающих ангиоотеков.

В России пациенты, страдающие НАО – это люди, длительное время остающиеся один на один с существующими проблемами: неправильными диагнозами, неоднократными госпитализациями, ограничением работоспособности, отсутствием должной медицинской и социальной поддержки и образовательных программ, информационной изоляцией. В нашей стране отсутствуют медицинские стандарты и методы молекулярногенетической диагностики НАО, информированность врачей других специальностях о заболевании недостаточная, что обуславливает трудности дифференциальной диагностики ангионевротических отеков в целом.

Принимая во внимание все трудности проведения дифференциальной диагностики ангиоотеков, существует настоятельная необходимость более глубокого изучения патогенеза различных форм ангиоотеков, в том числе наследственных, а так же разработки единых диагностических и лечебных алгоритмов НАО.

Цель исследования: Определить долю ангионевротических отеков, обусловленных нарушением в системе компонентов комплемента среди ангионевротических отеков торпидных к общепринятой антигистаминной и системной ГКС-терапии, разработать подходы к клинико-молекулярной диагностики наследственных ангионевротических отеков.

Задачи исследования:

1. Сформировать группу больных с наличием ангиоотеков в анамнезе торпидными к общепринятой антигистаминной и системной ГКС терапии, изучить особенности течения заболевания в данной группе.

2. Провести иммунологическое обследование пациентам с целью выявления нарушений в системе комплемента.

3. Провести молекулярно-генетический анализ пациентам с рецидивирующими ангиоотеками и наличием изменений в системе компонентов комплемента и их близким родственникам.

4. Провести анализ мутаций в гене SERPING1 и типов наследования 5. Усовершенствовать клинико-молекулярно-генетический алгоритм обследования пациентов с подозрением на наличие наследственного ангиоотека.

Научная новизна: впервые в России пациентам с рецидивирующими ангиоотеками проведено молекулярно-генетическое обследование, направленное на дифференциальную диагностику наследственных форм ангиоотеков. Показана высокая эффективность применения метода прямого секвенирования гена SERPING1 для молекулярно-генетической диагностики НАО I и II типов. В ходе проведения данного исследования выявлено ранее не описанных мутаций в гене SERPING1. Впервые среди населения РФ описан случай аутосомно-рецессивного наследования НАО, в зарубежной литературе описано лишь два случая подобного типа наследования. Ранее НАО рассматривалось как аутосомно-доминантное заболевание, таким образом, существенно расширяются представления о типах наследования НАО. Усовершенствован алгоритм обследования пациентов с подозрением на наследственную форму ангионевротического отека.

Практическая значимость: На основании полученных результатов усовершенствован диагностический алгоритм для пациентов с подозрением на НАО, позволяющий верифицировать наследственную форму заболевания и оптимизировать тактику ведения больных с НАО. Молекулярногенетическое обследование пациентов с рецидивирующими ангионевротическими отеками дает возможность точной дифференциальной диагностики НАО (I и II типа), также позволяет прогнозировать вероятность развития НАО на досимптомной (доклинической) стадии, включая проведение пренатальной диагностики данного заболевания.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Распространенность и этиопатогенез наследственного Наследственный ангионевротический отек (НАО) – это хроническое заболевание, относящееся к группе первичных иммунодефицитов с аутосомно-доминантным типом наследования, связанное с качественным или количественным генетически детерминированным дефектом С1-ингибитора.

Проявляется в виде рецидивирующих ангиоотеков кожи и слизистых оболочек [13]. Распространенность заболевания точно неизвестна, но она оценивается приблизительно как 1 на 50000, без различий для разных этнических групп [14]. Клинические проявления НАО у 34 – 35% больных впервые отмечаются в возрасте от 1 года до 5 лет, у 65% больных – в возрасте 12 лет и старше, и очень редко, когда симптомы проявляются в возрасте до 1 года, наиболее тяжелым периодом заболевания, считается пубертатный возраст. Обострения возникают в течение всей жизни, а течение НАО непредсказуемо по тяжести. Без соответствующей терапии рецидивы случаются в среднем каждые 7-14 дней, однако, у разных пациентов отмечается значительная вариабельность частоты возникновения обострений, даже среди близких родственников [15, 16].

Общей чертой патогенеза некоторых заболеваний является активация каскадных систем плазмы, таких как системы комплемента и контактного пути свертывающей системы. Провоспалительный эффект этих систем включает в себя, в том числе, и продукцию вазоактивных пептидов, таких как анафилотоксины (С3а,С5а) и брадикинина [17, 18]. С1-ингибитор играет решающую роль в контроле обеих каскадных систем [19-21] и определяет патогенез развития НАО.

С1-ингибитор – это гликопротеин, относящийся к семейству сериновых протеаз (серпинового семейства), является альфа-2-глобулином и вырабатывается преимущественно в гепатоцитах [22]. Серпиновое семейство – класс протеинов с разнообразными функциями. Сформированная молекула С1- ингибитора – сильногликозилированный белок, состоящий из аминокислот [23]. Молекулярная масса – приблизительно 76 кДальтон, а концентрация в плазме - 240 мг/мл [24, 25]. Серпиновый домен содержит аминокислот, а N-терминальный несерпиновый домен содержит аминокислот. Более гликозилирован N-терминальный домен, несущий десять гликозилированных сайтов, в то время как серпиновый домен несет только три таких сайта [26]. С1-ингибитор ингибирует протеазы за счет образования пептидной связи (P1: Arg444–P1:Thr445), расположенной на петле, экспонированной внутрь активного центра, который соответствует специфическому субстрату [20, 21, 27]. В результате воздействия протеаз на пептидную связь С1-ингибитора, формируется ковалентный комплекс между С1-ингибитором и протеазой, что приводит к сильным конформационным изменениям, в том числе к вставке петли активного центра в В-складчатый слой С1-ингибитора (см. рис. 1) [26]. Эти конформационные изменения приводят к связыванию С1-ингибитора и протеазы, что и является ингибированием реакции [23, 26]. Комплекс, содержащий С1-ингибитор и его субстрат, выводится из кровотока в основном за счет серпинспецифичных рецепторов печени (время клиренса: 20-47 минут) [28-32].

Кроме того, показано, что возможно поглощения этого комплекса нейтрофилами и моноцитами [33].

Рис.1. Формирование комплекса серпин и протеазы [34]. Механизм ингибирования протеазы серпином проиллюстрирован на примере трипсина и нативного -1-антитрипсина. Предполагается, что механизм ингибирования протеазы С1 ингибитором является аналогичным.

С1 ингибитор является главным ингибитором нескольких компонентов комплемента (С1r,C1s и маноза-связанной лектин-ассоциированной сериновой протеазы (MASP 1 и 2), протеаз контактного пути активации свертывания (калликреина плазмы и фактора свертывания XIIa), а также является второстепенным ингибитором фибринолитического белка плазмина и фактора свертывания Xia (рис.2) [35]. С1-ингибитор – это мощный противовоспалительный протеин [34]. Недавно было показано, что помимо ингибирования классического пути комплемента, С1-ингибитор может ингибировать и альтернативный путь [36]. Но механизм ингибирования альтернативного пути пока до конца не определен.

Рис. 2. С1-ингибитор, пути ингибирования [37].

При классическом пути активации комплемента, активируется С компонент комплемента, а затем собирается С3 конвертаза. При контактном пути активации свертывающей системы, небольшое количество XIIa фактора свертывания дополнительно активирует XII фактор, а также прекалликреин.

Активированный фактор ХIIа активирует фактор XI в фактор XIIa, что в свою очередь приводит к повышению образования фибрина.

Активированный фактор XIIa и калликреин активируют друг друга, и калликреин плазмы расщепляет высокомолекулярный кининоген, что приводит к высвобождению брадикинина. При фибринолитическом пути плазминоген активируется в плазмин, который расщепляет фибрин.

Красными т-образными полосками показаны пути ингибирования процесса С1-ингибиторам.

гликозаминогликанами (ГАГ), такими как гепарин. ГАГ, в особенности декстрана сульфат, усиливает инактивацию С1s С1-ингибитором в 130 раз [38]. Точно так же, ГАГ (фракционированный гепарин, низкомолекулярный декстрана сульфат) значительно усиливают инактивацию фактора XIa С1ингибитором, в то время как минимальный эффект или его полное отсутствие было отмечено по отношению к другим протеазам контактной системы свертывания [39, 40]. Эти исследования говорят о том, что ГАГ селективно повышают инактивацию С1s и XIа фактора свертывания, никак не влияя на инактивацию XIIa фактора или каллекреина С1-ингибитором.

Во время обострения НАО, происходит неограниченная продукция компонентов активации системы комплемента (СК) (С4а, С2b, C3a, C5a – анафилотоксины), обладающих высокой хемотаксической, кининогенной, сосудорасширяющей активностью [41], активируется протеолитический плазменный каскад свертывания, в результате чего, также продуцируются несколько вазоактивных веществ. Таким образом, снижение концентрации или активности С1-ингибитора приводит к неконтролируемой активации системы комплемента, активации системы контактного пути свертывания и, как следствие, к накоплению большого количества кининов [42].

Исследования показали, что наиболее важным из кининов является брадикинин – преобладающий медиатор, увеличивающий проницаемость сосудистой стенки при развитии ангионевротического отека [43].

Брадикинин – это пептид, продуцируемый при активации контактного пути свертывания крови, который может увеличить проницаемость сосудистой стенки, связываясь с соответствующим рецептором (2-рецептор брадикинина) на эндотелии сосуда [44]. Это в свою очередь приводит к расширению и повышению проницаемости сосудов микроциркуляторного русла, и как следствие к интерстициальному отеку, набуханию коллагеновых волокон, сглаживанию сосочков дермы, что клинически проявляется отеком, иногда опасных для жизни [44, 45].

В настоящее время существует не так много работ по изучению генетических аспектов НАО и в большинстве случаев это работы зарубежных авторов. Известно, что структура С1-ингибитора закодирована на хромосоме 11, в гене SERPING1 (С1NH), который состоит из 8-ми экзонов ангионевротический отек наследуется по аутосомно-домининтному типу. По данным разных авторов в 20-25% случаев, является результатом спонтанной мутации, т.е. встречается у больных без семейного анамнеза [47, 48].

Больные, страдающие НАО, являются носителями мутаций в гетерозиготном состоянии, т.е. только в одном из двух аллелей гена SERPING1, отвечающего за синтез и функционирование С1-ингибитора, имеется мутация, в связи с чем, недостаточность С1-ингибитора у них не полная. У данной категории пациентов экспрессия информационной РНК с дефектного аллеля, как правило, отсутствует, нормальный аллельный ген обеспечивает синтез С1ингибитора на низком уровне [49]. В 1983 году Quastel изучал катаболизм С1-ингибитора при НАО I типа. Учитывая, что кодирование С1-ингибитора происходит с одного нормального аллеля, можно было ожидать, что концентрация С1-ингибитора в сыворотке крови у пациентов с НАО I типа будет составлять 50% от нормы, однако, на практике наблюдается более существенное снижение его количества. Как вывод проведенной работы, появилось предположение, что постоянная активация С1-ингибитора, приводит к еще большему снижению его уровня в сыворотке крови [50].

Однако, в 1993 году Kramer эту гипотезу подвергнул сомнению [51]. Для описания механизма столь выраженного снижения синтеза С1-ингибитора у пациентов с НАО I типа Kramer изучал синтез С1-ингибитора в фибробластах. Делеция в области экзона 7 гена SERPING1 приводила к появлению мутантной матричной РНК (мРНК). В клетках, несущих мутацию, обнаружено, что транскрипция мРНК осуществляемая с нормального аллеля гена SERPING1, составляет 52% от нормы, а транскрипция мРНК, осуществляемая с аллеля, несущего мутацию, составляет 27% от нормы.

Концентрация «дикого» и дефектного С1-ингибитора при этом была существенно ниже ожидаемого от указанного уровня мРНК. Повышения катаболизма С1-ингибитора в этом случае выявлено не было. Таким образом, данное исследование позволило Kramer и его соавторам предположить, что столь низкий уровень синтеза С1-ингибитора при НАО I типа не связан с изменением его катаболизма, а является следствием процесса трансингибирования трансляции С1-ингибитора с дикой мРНК из-за наличия мутации в мРНК и/или синтезированного дефектного С1-ингибитора [51].

Данный процесс называют доминантно-негативным эффектом.

Описано более 300 доминантных мутаций в гене SERPING1 [52]. В году Verpy E. с соавт. [53] описали первый случай аутосомно-рецессивного типа наследования НАО. В работе представлена большая родословная семьи в 5 поколений с тремя близкородственными браками и шестью случаями НАО. У двух исследованных больных обнаружена мутация c.-103С>T в гомозиготном состоянии (c.-689C>T по современной номенклатуре). У данных пациентов при лабораторном обследовании наблюдалось резкое снижение концентрации С1-ингибитора в сыворотке крови, а течение заболевания имело тяжелый характер с частыми обострениями. Четверо исследованных гетерозиготных носителей выявленной мутации и один член семьи без данной мутации не имели клинических проявлений НАО, концентрация С1-ингибитора была в пределах нормы. В 2011 году Kesim B. с соавт. в своей работе описали мутацию с.-687А>G: данная замена была выявлена в гомозиготном состоянии у больного НАО, в гетерозиготном состоянии – у здоровой сестры, родители детей – также здоровы [54]. К сожалению, в своей статье авторы не приводят описания клинического течения заболевания. Эти результаты подтвердили возможность аутосомнорецесивного типа наследования НАО [53, 54]. В 2003 году был описан случай гонадного мозаицизма при наследовании НАО [55]. Авторы описывают ангионевротическими отеками. При лабораторном обследовании у обоих братьев было выявлено значительное снижение концентрации и активности С1-ингибитора и снижение уровня С4 компонента комплемента, на основании чего был заподозрен диагноз НАО. При обследовании родителей и близких родственников данных за НАО не было получено. При генетическом обследовании у двух братьев выявлена мутация Y199X в экзоне 4. Эта мутация приводит к формированию стоп кодона, в результате синтез белка (С1-ингибитора) нарушается. В ходе исследования выявлено, что мутация произошла на материнской хромосоме. Так же проведен генетический анализ подтверждающий отцовство для обоих братьев. Однако при генетическом анализе ДНК клеток букального эпителия, лимфоцитов выделенных из мочи, клеток корней волос и фибробластов мутаций ни у отца, ни у матери не выявлено. На основании результатов данного исследования сделано предположение, что мать – имеет гонадный мозаицизм. Это исследование доказало возможность и данного типа наследования НАО, и так же должно приниматься во внимание при подозрениях на НАО у пациентов не имеющих семейного анамнеза.

По данным зарубежной литературы [56], в проведенных работах направленных на изучение спектра мутаций в гене SERPING1, чаще всего обнаруживаются миссенс- и нонсенс-мутации, однако встречаются и другие:

делеции, протяженные делеции, мутации сайта сплайсинга, дупликации.

Мутации в гене распределены достаточно равномерно, горячих точек не найдено. В связи с этим, наиболее оптимальным методом молекулярногенетической диагностики, является секвенирование всей кодирующей последовательности гена. Однако, мутации могут находится и в регуляторных областях гена SERPING1, а так же возможны протяженные делеции, которые не выявляются методом секвенирования, в литературе описаны такие редкие случаи. В связи с этим, для увеличения эффективности молекулярно-генетической диагностики НАО необходима разработка систем для анализа данных мутаций.

В настоящее время, в зависимости от клинического течения и результатов лабораторной диагностики, выделяют два основных типа НАО: Тип I (85% случаев) и тип II (15% случаев) [41]. Как правило, различные типы НАО, вызываются различными типами мутаций. Мутации, вызывающие HAО I типа, являются очень гетерогенными и распределены по всему гену. Как правило, это большие делеции/вставки и точечные мутации, которые приводят к нарушению синтеза и секреции белка [56]. В результате происходит укорочение и/или неправильное формирование пространственной структуры белка (С1-ингибитора) [57, 58], I тип НАО характеризуется значительным снижением концентрации С1-ингибитора, уровень которого может варьировать от 0% до 50% от нормального [41]. Как правило к HAО II типа, приводят миссенс мутации, которые затрагивают участки активного центра C1-ингибитора [53]. При НАО II типа мутации локализуются, в основном, в области экзона 8 и расположены в активном сайте белка или около него. В результате чего мутированный белок секретируется, но является функционально неполноценным. НАО II типа характеризуется функциональной недостаточностью С1-ингибитора при его практически нормальной концентрации в крови [55, 56].

Выделяют также III тип НАО. Ряд авторов определяет его, как наследственные эстроген-зависимые ангиоотеки [57], т.е. отмечается связь развития отека с высоким уровнем эстрогена в сыворотке крови, как у женщин, так и у мужчин [58]. В этом случае клиническая картина заболевания схожа с симптомами НАО I и II типа, при нормальной концентрации и активности С1-ингибитора. Обострения чаще происходят на фоне применения ингибиторов АПФ или эстроген-содержащих препаратов, на фоне беременности [41]. Предполагается Х-сцепленный доминантный или аутосомно-доминантный тип наследования заболевания. Некоторые исследователи выделяют группу пациентов с рецидивирующими ангиоотеками и семейным анамнезом заболевания. У этих пациентов была выявлена мутация в гене, локализованном на хромосоме 5 и кодирующем фактор XII свертывания крови. Наличие указанного генетического дефекта влечет за собой изменение его функциональной активности и, как следствие, нарушение кининового профиля, что приводит к повышению продукции брадикинина [41, 59]. Таким образом, до настоящего времени III тип НАО не выделен как самостоятельная нозологическая единица, т.к. не имеет четкого и единообразного описания этилогической и патогенетитческой картины [59].

В анамнезе больных НАО, как правило, обращает на себя внимание наследственный характер заболевания, когда рецидивирующие отеки прослеживаются в нескольких поколениях. Однако, наличие семейного анамнеза не может однозначно указывать на наследственный генез ангиоотеков. С другой стороны, отсутствие семейного анамнеза не исключает возможности возникновения спонтанной мутации, приводящей к клинической манифестации заболевания [60].

Для НАО характерно появление рецидивирующих плотных, холодных, сопровождающихся чувством распирания, а иногда жжения. На фотографии, см. рис. 3, представлена пациентка с отеком в области лица и рентгенограмма при развитии абдоминального синдрома. Возникновение ангиоотеков часто связано с механическим воздействием на кожу и слизистые, в т.ч. травмами, оперативными и инвазивными процедурами, а также с обострением респираторных инфекционных заболеваний и других воспалительных процессов, с гормональными изменениями менструального цикла и на фоне стрессовых ситуаций. Интервалы между обострениями у каждого больного индивидуальны: у некоторых больных отек возникает только после значительной травмы, у других заболевание обостряется значительно чаще, отеки могут развиваться без видимой связи с воздействием внешних факторов. Ангионевротический отек может возникать на любом участке кожи или слизистых оболочек, возникая в одной области, он затем распространиться на другую, без спада первичной локализации [11].

Беременность оказывает различный эффект на течение заболевания, но известно, что обострение НАО реже возникают во время родов [37].

Зачастую обострениям НАО предшествует продромальные явления (легкое покалывание), а приблизительно у трети пациентов развитие отека сопровождаются мигрирующей эритемой, незудящей, серпигинозной сыпью.

Нередко у больных наблюдается аура, в виде слабости, разбитости. Отек может возникать на любом участке кожи или слизистых оболочек [61].

Динамика развития отека: медленное нарастание, затем отек постепенно спадает в течение последующих 48 - 72 часов. Развитие ангионевротического отека в области желудочно-кишечного тракта, см. рис. 3, ротоглотки может приводить к летальному исходу [62] и являются жизнеугрожающими [37].

Рис. 3. Пациентка с отеком в области лица и рентгенограмма при развитии абдоминального синдрома [38].

При появлении отеков в области верхних отделов дыхательного и пищеварительного трактов наблюдается дисфагия, дисфония, симптомы обструкции дыхательных путей, напоминающие в ряде случаев бронхиальную астму, осиплость голоса, затруднение актов дыхания и глотания, признаки асфиксии. Несмотря на то, что надлежащая диагностика и лечение дает возможность предотвратить отек гортани, 30% от всех летальных исходов у больных с НАО происходит вследствие асфиксии. Даже в настоящее время бывают случаи, когда пациенты умирают от асфиксии, отчасти из-за отсутствия надлежащей диагностики НАО.

У ряда больных с НАО отмечается развитие абдоминального синдрома, который характеризуется появлением острых болей в животе, тошноты, рвоты, диареи [37]. Развитию приступов абдоминалгий при НАО часто предшествуют ощущения спазмов в околопупочной области, слабость, тошнота, спастические боли в эпигастрии. Характерна болезненность живота при пальпации, кишечная перистальтика обычно снижена, живот мягкий, что может наводить на мысль об отсутствии острой хирургической патологии. В этом случае тщательная диагностика позволит избежать ненужного хирургического вмешательства. Перемещение жидкости в интерстиции и брюшной полости во время отека кишечника может привести к клинически значимой гипотензии [15, 63]. Клинически болевой синдром проявляется в виде разлитой боли в брюшной полости, кишечных колик, возможна тонкокишечная непроходимость. Некоторые пациенты предъявляют жалобы на ощущения «отеков внутренних органов». Боли в животе бывают настолько интенсивными, что их иногда называют «брюшная мигрень», а сопровождающие болевой симптом общие явления (тахикардия, колебания АД, головокружение, головная боль и др.) — «вегетативная буря». Нередко пациенты с подозрением на острую патологию желудочно-кишечного тракта подвергаются оперативному вмешательству, в ходе которого выявляют ограниченный отек стенки кишечника, признаки асептического воспаления [1]. Weinstock и соавторы в 1987 году описали семью (мужчина 40 лет, два его брата, его мать и дочь), в которой абдоминальным синдром был единственным клиническим проявлением НАО [64].

При отеке слизистой мочевого пузыря возникает дизурия, анурия. Также возможно вовлечение в отек мозговых оболочек, слизистой внутреннего уха, что проявляется менингеальными симптомами (ригидность затылочных мышц, резкая цефалгия, рвота, иногда судороги), при поражении лабиринтных систем развивается синдром Меньера, что выражается головокружением, тошнотой, рвотой. Пациенты с наследственным ангионевротическим отеком до установления диагноза, как правило, имеют большое количество выписок с различными диагнозами, в том числе из стационаров хирургического профиля. Пациентам проводят лапаротомию, холецистэктомию, нефрэктомию, гинекологические операции), а также трахеотомию из-за невозможности купировать отек верхних дыхательных путей. У больных НАО даже описан феномен «географического живота» – результат операций, характеризующийся наличием многочисленных многолетнее и безуспешное лечение у врачей различных специальностей (терапевтов, гастроэнтерологов, гинекологов и др.). Заболевание может оставаться нераспознанным на протяжении десятков лет. В то же время подходы к лечению таких заболеваний различны, наблюдается отсутствие глюкокортикостероидов, диуретиков и др.) [1].

приобретенный характер ангионевротического отека (ПАО). Приобретенный дефицит С1-ингибитора может быть следствием его избыточного потребления при инфекционных заболеваниях [63], злокачественных и доброкачественных новообразованиях, лимфопролиферативных заболеваниях (лейкемия, хронический лимфоцитоз, миелома) [64], а так же в результате образования аутоантител к С1–ингибитору, блокирующих его функции [65]. Учитывая, что при ПАО также можно наблюдать снижение концентрации С1-ингибитора, а клинические проявления ПАО такие же, как и при НАО [63, 64], без проведения молекулярно-генетического обследования осуществить дифференциальную диагностику между двумя этими формами ангиоотеков весьма затруднительно. Диагноз НАО должен быть заподозрен у всех пациентов с рецидивирующими ангионевротическими отеками или рецидивирующим абдоминальным болевым синдромом, при выявлении сниженного количества С2- и С4-фракций комплемента в сыворотке крови [61].

Лабораторные методы исследования необходимы, чтобы подтвердить или опровергнуть диагноз. Практически у всех пациентов с НАО стабильно низкий уровень С4 компонента комплемента при нормальных уровнях С1 и С3 компонентов комплемента [46, 66]. Измерение уровня С4 компонента комплемента эффективно использовать как скрининг, чтобы исключить НАО, хотя в редких случаях уровень С4 остается нормальным в период между функционального С1-ингибитора может подтвердить диагноз и позволить различить I тип и II тип НАО [67, 68]. В редких случаях пациенты с НАО имеют нормальный уровень функционального С1-ингибитора.

Наиболее часто дифференциальную диагностику рецидивирующих ангиоотеков проводят с аллергическими ангиоотеками, связанными с наличием атопии, использованием лекарственных препаратов, пищевых продуктов и т.д. Пример дифференциальной диагностики наследственных форм ангиоотеков с аллергическими отеками представлены в таблице 1.

ангионевротических отеков Диагностически Функциональная ингибитора Уровень С4, С комплемента Семейный анамнез Эффект от антигистаминной, системной ГКС терапии Ранее в России диагностика наследственного ангионевротического отека основывалась исключительно на данных анамнеза заболевания и результатах клинико-лабораторного обследования. В результате проведенных нами работ, с 2008 года появилась возможность проведения медико-генетического обследования пациентов с рецидивирующими ангиоотеками и нарушением в системе комплемента с целью верификации наследственного генеза заболевания (НАО I и II типов). Изучение генетических аспектов наследственных ангиоотеков позволяет проводить дифференциальную, в том числе досимптомную диагностику данной патологии, и оптимизировать тактику лечения. Перед проведением генетического обследования, а так же по получению его результатов, пациенты нуждаются в квалифицированной консультации врача-генетика с целью прогноза вероятности передачи данного заболевания в следующих поколениях. Родители, в том числе ангионевротический отек», должны быть информированы о вероятности передачи данного заболевания по наследству, а так же о возможности проведения молекулярно-генетического анализа с целью выявления мутаций в гене SERPING1 детям и проведения пренатальной диагностики. В свою очередь, проведение молекулярно-генетического анализа поможет врачам своевременно выставить правильный диагноз, определить дальнейшую тактику ведения пациента и подобрать адекватную терапию, что предотвратит появление тяжелых, в том числе жизнеугрожающих, ангиоотеков.

Лечение НАО заключается в профилактике обострений заболевания, подборе адекватной базисной терапии и лечении обострения НАО.

С целью адекватной профилактики обострений НАО необходимо обучение пациентов, обеспечение их полной информацией о заболевании, его этиопатогенезе. Пациентам рекомендуется соблюдение правил, которые позволят предупредить обострение: избегать механического воздействия на мягкие ткани и слизистые оболочки (в том числе при занятиях спортом), воздействия холодового и теплового факторов, избыточной психоэмоциональной и физической нагрузки и других триггеров. Необходимо помнить о правильном оформлении медицинской документации с целью осуществления преемственности между врачами, которые будут в течение жизни наблюдать пациента, начиная с детского возраста. В документации, которая остается в медицинском учреждении и выдается пациенту должно быть указано заболевание, меры его профилактики, порядок проведения базисной терапии, объем премедикации перед инвазивными методами обследования и оперативными вмешательствами, мероприятия, направленные на купирование ангиоотеков при их возникновении. В медицинской и личной документации пациента должна быть обязательно зафиксирована его группа крови. В домашней аптечке больному необходимо иметь лекарственные средства, которые можно применить для купирования ангиоотеков. Пациентам с НАО противопоказаны ингибиторы ангиотензин превращающего фермента (иАПФ), так как данная группа препаратов замедляет катаболизм брадикинина. Экзогенные эстрогены (оральные контрацептивы, заместительная гормонотерапия) могут приводить к обострению НАО и должны применяться с большой осторожностью [15, 5].

Недавние исследования показали, что использование только прогестинсодержащих оральных контрацептивов не приводит к ухудшению течения НАО у больных [69].

Перечень препаратов, предназначенных для купирования наследственных ангиоотеков и проведения премедикации, в настоящее время в России ограничен. Основными являются свежезамороженная плазма крови, антифибринолитики (аминокапроновая кислота, транексамовая кислота).

Реже используются антигонадотропные препараты (даназол), метилтестостерон. Применение указанных групп препаратов имеет определенные особенности. Парентеральное введение аминокапроновой кислоты и свежезамороженной плазмы крови требует обязательного участия медицинского персонала. При введении плазмы всегда присутствует риск переноса жизнеопасных инфекций и развития реакций, которые могут возникнуть у пациентов при переливании компонентов крови. Так же необходимо помнить, что свежезамороженная плазма содержит протеины контактной системы (contact-system proteins), что может способствовать дополнительной продукции брадикинина, и в свою очередь у некоторых пациентов способно усилить отек. Это особенно важно по отношению к больным с отеком гортани, которым может потребоваться экстренная интубация [70]. В России переливание свежезамороженной плазмы крови возможно только в условиях стационаров, имеющих лицензию на проведение подобных трансфузиологических процедур. Это ограничивает возможность своевременного применения плазмы крови в ургентных ситуациях и делает крайне затруднительным ее использование с целью профилактики ангиоотека при проведении медицинских инвазивных диагностических и оперативных вмешательств, в том числе оказании амбулаторной стоматологической антифибринолитиков, а также гормональных (метилтестостерон) и антигонадотропных лекарственных средств в случае развития ангиоотека оправдано, но может приводить к развитию побочных эффектов, особенно при частом их применении и не позволяет получить быстрый эффект при отеке в жизнеугрожающей зоне [71, 72]. В связи с этим, необходимо внедрение новых, обладающих хорошим эффектом, но, в тоже время, более купирования обострения НАО.

применением существующих на данный момент в России лекарственных средств, особого внимания заслуживают новые препараты для купирования обострения НАО, которые были разработаны в европейских странах, но, к сожалению, еще не все вышли на отечественный рынок лекарственных зарегистрирован в Европе в 1979 году. Однако, из-за опасности переноса вирусных заболеваний Управление контроля качества продуктов и лекарств (Food and Drug Administration, FDA, US FDA) не одобрило использование C ингибитора для клинической практики в США. Появились статьи, посвящённые проблеме использования новых препаратов по отношению к риску быть заражённым инфекционными заболеваниями и получению более действенных способов лечения острых приступов и профилактики [73, 74].

В 1985 году первоначальные препараты C1 ингибитора были вытеснены его пастеризованным концентратом Berinert P, (CSL Behring). За последние 25 лет многочисленные исследования и попытки лечения предоставили исчерпывающие доказательства безопасности и эффективности Проведённая недавно в США программа International Multicentre Prospective Angioedema C1-Inhibitor пастеризованного C1 ингибитора, как безопасного для острых приступов, так и в качестве профилактики, препарата [75, 76]. В 2009 году применение Berinert-P было одобрено FDA для лечения острых приступов.

Тем временем, предпринимались попытки ещё больше снизить риск улучшеный концентрат C1 ингибитора, полученный в результате нанофильтрации, что позволяет избавиться от большинства вирусов. Было проведено два контролируемых испытания, которые подтвердили эффективность улучшенного концентрата C1 ингибитора, полученного на основе нанофильтрации [77]. В результате простых внутривенных инъекций продолжительность симптомов во время острых приступов была значительно уменьшена. Так же было отмечено 50-ти процентное уменьшение частоты приступов у «тяжёлых» пациентов. В 2008 году Cinryze был одобрен FDA, как препарат для профилактики наследственного ангиоотёка, однако это лекарство всё ещё не одобрено, как средство для лечения острых приступов.

Проблема возможной передачи вирусов послужила толчком к разработке так называемого рекомбинированного C1 ингибитора (Rhucin, Pharming), находящегося в кроликах и добываемого из их молока. Этот препарат уже был оценён в клинических испытаниях в качестве лечения острых приступов наследственного ангиоотека. Теперь, когда основные вопросы безопасности использования концентрата C1 ингибитора решены, возникает вопрос о дороговизне рекомбинированного протеина.

Если говорить о безопасности, то C1 ингибитор не является идеальным препаратом. Лиофилизированный протеин должен храниться с обязательным соблюдением всех условий хранения, и, в случае надобности, должен быть правильно приготовлен и введён внутривенно, а всё это подразумевает использование препарата для купирования острых приступов лишь в стационарных, клинических условиях. В настоящее время проводятся эксперименты по использованию лекарства в домашних условиях пациентами или медицинскими работниками, как для острых приступов, так и для профилактики, однако, сама процедура не является простой [78]. Таким образом, всё ещё необходимы альтернативные способы лечения.

Ecallantide (торговое название Kalbitor, название во время исследований Dyax) – это ингибитор калликреина протеина, который не оказывает влияния на комплемент и на систему свёртывания. На начальном этапе испытаний было исследовано более чем 100 пациентов с наследственным ангиоотёком.

Ecallantide показал себя эффективным препаратом для лечения острых приступов и не выявил каких либо серьёзных побочных эффектов [78, 79].

Ecallantide был одобрен FDA для лечения острых приступов в 2009 году.

Эффективность ингибиторов калликреина при наследственном ангиоотёке подтверждает большую роль кининов в патофизиологии этого заболевания. С июля 2008 года в странах ЕС применяется новый лекарственный препарат:

10-аминокислотный пептид ингибитор рецепторов 2 к брадикинину под названием Icatibant (торговая марка Firazyr, Jerini). Конкурентное связывание рецепторов позволяет избежать негативного воздействия брадикинина на ткани и предупредить развитие отека. Icatibant выпускается в виде готового к применению раствора для подкожного введения, помещенного в шприц. Эта удобная форма в значительной степени упрощает его использование, как медицинскими работниками, а во многих странах и больными, что обеспечивает быструю помощь пациентам, в том числе при необходимости его введения вне медицинского стационара [80]. В России, как и в других странах Европы и в США, продолжается проведение клинических исследований, направленных на оценку эффективности Icatibant у пациентов с различными формами ангиоотека. В настоящий момент препарат прошел государственную регистрацию в России, однако на широкий фармакологический рынок в России он в настоящее время не поступил.

Несмотря на то, что каждое из выше перечисленных лекарств, уменьшает продолжительность приступов, а так же риск развития отёка жизнеугрожающей локализации, в России, в настоящее время, применение данных препаратов практически не доступно. Практические вопросы, т.е.

простота препарата и способ его применения, будут иметь решающее значение, т.к. оптимальная терапия требует незамедлительных действий при первом же намёке на приступ. В таблице 2 представлены новые препаратов, которые, в настоящее время, в России не используются.

Таблица 2. Группы лекарственных препаратов применяемых при НАО [38] полученный из обострения, каллекреина плазмы, анафилаксия плазмы крови базисная фактора коагуляции XIIa (Cinryze, Lev Pharmaceuticals) полученный из обострения, каллекреина плазмы, плазмы крови базисная фактора коагуляции XIIa Теоретический:

(Berinert-P, CSL Behring) Рекомбинантный Купирование каллекреина плазмы, С1-ингибитор обострения, фактора коагуляции XIIa (Rhucin, Pharming) Ecallantide В России, в качестве базисной профилактической терапии НАО используются те же группы препаратов, что и для купирования обострения, за исключением плазмы крови. Вопрос о назначении данной терапии решается индивидуально для каждого пациента. Выбор препарата, дозы и частоты его приема проводится с учетом пола, возраста пациента, массы тела, частоты и локализации ангиоотеков, сопутствующей патологии и других индивидуальных особенностей больного [66]. При выборе дозы препаратов и схемы лечения необходимо руководствоваться правилом минимальной эффективной дозы лекарственного средства, контролирующей ориентироваться на клинический эффект этих доз. Основные побочные «peliosis» гепатит, гепатоцеллюлярная аденома и липидные нарушения;

антифибринолитических препаратов: мышечные спазмы (судороги), потенциальный риск тромболизиса. У пациентов, использующих 17-альфаандрогены (антигонадотропные препараты) должен постоянно контролироваться уровень печеночных ферментов, а также липидный спектр.

Пациентам с повышенным уровнем печеночных ферментов необходимо проведение ультразвуковой диагностики, т.к. есть данные о связи длительного приема этих препаратов с развитием аденомы или карциномы печени [73]. Риск развития осложнений точно не определен, но является важным критерием при выборе препаратов базисной терапии.

долгосрочной профилактике, должны быть антифибринолитики. Применение 17-альфа-алкилированных андрогенов негативно влияет на беременных и детей страдающих НАО, вызывает ряд побочных явлений: влияет на развитие и рост, проявляясь в преждевременной маскулинизации плода, преждевременном половом созревании, преждевременном закрытии эпифизальных зон [71, 74].

Фармакологическое лечение детей с наследственным ангионевротическим отеком в основном ориентировано на купирование обострений заболевания.

От применения базисной ежедневной терапии воздерживаются, учитывая побочные эффекты препаратов. Вопрос о назначении базисной терапии у детей рассматривается индивидуально и только при наличии частых рецидивов ангиоотеков с локализацией в жизнеугрожающей зоне.

Препараты, относящиеся к группе андрогенов, не используются, а антигонадотропные препараты применяются крайне редко по жизненным показаниям. При лечении детей с НАО особое внимание уделяют немедикаментозной и краткосрочной медикаментозной (премедикация) профилактике обострений, позволяющей уменьшить частоту и тяжесть обострений заболевания [74-76].

При проведении профилактического лечения всем пациентам с НАО необходимо осуществлять постоянный динамический контроль с целью оценки адекватности базисной терапии и мониторинга возможных побочных эффектов лекарственных препаратов. Поэтому лечение пациентов с наследственным ангионевротическим отеком – это процесс, который не состоит из краткосрочных госпитализаций или эпизодических обращений в поликлинику. Он подразумевает под собой постоянное пожизненное наблюдение больных, анализ эффективности и безопасности лечения, проведение профилактики и активной разъяснительной работы. Все еще требуется определить оптимальную тактику ведения пациентов с НАО во время обострения [81]. Также необходимы дополнительные исследования, направленные на определение значимости профилактической терапии в сравнении с терапией направленной на купирование острого состояния «по требованию», и, кроме того, необходимо рассмотреть выгоду и всевозможные риски при использовании этих препаратов пациентами в домашних условиях на ранних этапах развития атаки НАО [82].

Несмотря на прогресс в изучении биохимических и молекулярных процессов при НАО, механизмы, лежащие в основе инициации и разрешения отека, остаются неизвестными. Выраженность симптомов НАО весьма вариабельна и не коррелирует с уровнем С1-ингибитора в плазме крови [83].

Другие факторы, такие как полиморфизм брадикининовых рецепторов и белков контактного пути активации свертывания крови, вариабельность уровня кининаз в плазме или их функциональной активности, возможно, могут влиять на выраженность симптомов НАО [84, 85], но роль данных факторов остается не полностью понятой.

Как правило, пациенты с НАО обращаются, прежде всего, к врачуаллергологу, несмотря на то, что НАО не является аллергическим заболеванием. Это обусловлено сходством клинической картины заболевания с отеком Квинке и отеками другого, в том числе аллергического генеза [13].

Отсутствие достаточной информированности врачей других специальностях и ограниченность методов молекулярной диагностики НАО обуславливает трудности дифференциальной диагностики ангионевротических отеков в целом. Необходимо отметить, что и лечение пациентов с НАО – процесс, который состоит не из краткосрочных госпитализаций или эпизодических обращений в поликлинику, а длительное пожизненное наблюдение пациентов для оценки эффективности и, по необходимости, коррекции базисной терапии, профилактики и лечения осложнений, приема лекарственных препаратов, активная разъяснительная работа. Отсутствие преемственности, связанное с отсутствием информации о НАО у врачей других специальностей, прежде всего у врачей скорой медицинской помощи, оториноларингологов, хирургов, реаниматологов и др., очень затрудняет ведение пациентов с НАО.

Для оптимизации диагностики и лечения пациентов с НАО необходимо продолжать разработку государственной стратегии в отношении малых «сиротских» заболеваний, создавать государственные программы, предполагающие обеспечение указанной категории больных соответствующей медицинской и социальной помощью, которая может оказать значительное положительное влияние на качество жизни больных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

За период с 2008 по 2011 года в работе было обследовано 80 больных и клинически здоровых родственников больных.

рецидивирующими ангионевротическими отеками, представляющий: семейных (54 пациента) и 26 изолированных случаев заболевания.

Пробанд (Proband) — человек, с которого начинается составление родословной, т.е. лицо первое, попавшее в поле зрения исследователя, для изучения процесса наследования какого либо заболевания среди членов одной семьи. Семейными случаями заболевания называют пробандов, родственников. Изолированные случаи заболевания – это пробанды, у которых нет кровных родственников, страдающих данным заболеванием.

отсутствие клинического эффекта от применения антигистаминной и системной ГКС терапии при попытках купирования отека, а также схожесть течения заболевания с клинической картиной отеков связанных с нарушением в системе комплемента (в том числе, как правило, отсутствие крапивницы).

Среди обследуемых пациентов 52 женщины, 28 мужчин. Возраст пациентов на момент обращения варьировал от 9 месяцев до 70 лет.

В ходе данной работы молекулярно-генетическое обследование проведено 35 пациентам.

2.2. Методы клинико-лабораторного обследования Клиническое и лабораторное обследование пациентов проводилось в ФГБУ «ГНЦ Института Иммунологии ФМБА России» отделении 2.2.1 Методы клинического обследования Клиническое обследование включало:

Анамнез, катамнестический анализ (для более детального сбора анамнеза разработана анкета-опросник).

Данные физикального обследования.

Лабораторные методы исследования:

клинический анализ крови (гемоглобин, лейкоциты, лейкоцитарная формула, тромбоциты, эритроциты, цветной показатель, гематокрит, СОЭ);

биохимический анализ крови (общий белок, белковые фракции, мочевина, креатинин, холестерин, билирубин, трансаминазы (АлАТ, АсАТ, ЛДГ, щелочная фосфотаза), сывороточное железо, глюкооза);

коагулограмма (МНО, протромбиновый время, протромбиновый индекс по Квику, АЧТВ);

реакция Вассермана, антитела к ВИЧ, Нвs-антиген, определение антител к вирусу гепатита С.

Инструментальные методы обследования (по показаниям):

ультразвуковое исследование (УЗИ) органов брюшной полости, почек, щитовидной железы Функциональные методы исследования:

Консультации специалистов:

оториноларинголог, эндокринолог, гастроэнтеролог, врач генетик (по показаниям).

2.2.2. Методы аллергологического обследования Аллергологическое обследование включало:

Сбор аллергологического анамнеза по схеме:

Анамнез аллергических заболеваний;

Кожные скарификационные тесты с основными ингаляционными аллергенами (по показаниям) Количественное определение общего IgE и специфического IgE (по показаниям) в сыворотке крови проводилось в лаборатории клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России (заведующий лабораторией д.м.н. профессор Пинегин Б.В.) методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест систем LabdiaХема (Швейцария Россия).

2.2.3. Методы иммунологического обследования Иммунологическое исследование проводилось в ООО «Многопрофильной Диагностической Лаборатории» на базе ФГБУ «ГНЦ Института иммунологии» ФМБА России (заведующая лабораторией врач клинико-лабораторной диагностики Кольченко Ольга Львовна).

1. Определение уровня С1-ингибитора в сыворотке крови проводилось с помощью набора «C1 Esterase Inhibitor» фирмы 2. Определение функционального С1-ингибитора в крови проводилось с помощью набора «Berichrom C1 - Inhibitor»

3. Определение уровня С3 и С4 компонентов комплемента в сыворотке крови проводилось с помощью набора «Complement C3» и «Complement C4» соответственно фирмы «Randox» (Великобритания) 4. Определение циркулирующий иммунных комплексов IgG к C1q в сыворотке крови проводилось с помощью набора «C1q (IgG) – CIC-C1q ELISA(IgG) фирмы «EUROIMMUN AG».

Для обработки статистических данных использовалась программа STATISTICA 6.0.

2.3. Молекулярно-генетическое исследование Молекулярно-генетическое исследование проводилось в лаборатории ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра РАМН, заведующий лабораторией профессор д.б.н. Поляков А.В.

Для исследования использовались образцы венозной крови, взятых у больных с рецидивирующими ангионевротическими отеками и их близких родственников, а также ворсины хориона плода, взятые в ходе хориоцентеза.

Исследование гена SERPING1 проводили с помощью прямого автоматического секвенирования кодирующих областей гена и экзонинтронных соединений.

1. Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови и из ворсин хориона выполняли с помощью набора реактивов Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, США) no протоколу производителя.

2. Для поиска мутаций в гене SERPING1 были подобраны пары праймеров, фланкирующие транслируемые области данного гена, включающие экзоны 1-8 гена, а также последовательности соответствующих экзон-интронных соединений. Использовалась референсная последовательность мРНК из Genebank (NM_000062.2); 5'последовательность праймеров представлена в таблице 3.

Таблица 3. Последовательность праймеров экзон Последовательность

1F GAAGACCAAGCGGTCAGTCC

1R GACCTCTTCACTCCATGCTTTCC

2PREF GAGGGAATTCGCTAAGAGGGAC

2F CCCAGGGTGGGAGCTGGCTC

2R CATCCCGCCTCCCGTCTCCAC

3F GAGGACTGTGCCTCGTAGTAAG

3R CTTATGGGAGTGTCCAACAAATGAC

4F CCCGACTCATCCTGCAAGTATC

4R TCAGGACCCTCCTCTGCAGAC

5F ACGACGTGTTCAGGACTCATGC

6R CAGGAGACTCAAGTAGGTTTCAAAC

7F GAGAGAGATGCGGTAGGAAGAC

7R CCTCTGATGGCCTGGGAGTAAC

8F GGTATCATGCTGGCTTCTGACTC

8R GAGGCTGGAGAGGTAGCGCTC

3. Нумерация нуклеодидов производилась с нуклеотида А инициирующего кодона ATG в экзоне.

последовательности гена SERPING1 осуществляли в соответствии с международной номенклатурой HGVS (http://www.hgvs.org/mutnomen/) [86].

проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере МС фирмы «ДНК-технология» (Россия) в 25µl объеме реакционной смеси следующего состава: 0.1-1.0 µg геномной ДНК; по 0.25 µМ каждого нуклеозидтрифосфата ("SYNTOL", Россия); 1.0 единица активности ДНК-полимеразы Biotaq («БиоМастер»); буфер для ПЦР (67 mM TrisHCl; 16.6 mМ (NH4)2SO4; MgCl2 1-3 mМ, 0.01% Twin-20; рН 8.8; 1,6 mM бетаин); 20-30 µl минерального масла. В ходе ПЦР проводили циклов амплификации, каждый цикл включал инкубирование образцов при 940С – 450С, 650С – 450С и 720С – 450С.

6. Фрагменты ДНК, полученные в ходе ПЦР анализировались методом прямого секвенирования по Сенгеру с применением набора реактивов ABI Dye Terminator, version 1 (Applied Biosystems) на приборе 3130 ABI genetic analyzer (Applied Biosystems, США).

7. Анализ выявленных изменений в гене SERPING1 проводился с (http://www.hgmd.cf.ac.uk [87], http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/ [88]) и из базы данных по однонуклеотидным полиморфным локусам SNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp [89]).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Общая характеристика пациентов с рецидивирующими За период с 2008 по 2011 года было обследовано 80 больных и клинически здоровых родственников больных, представленных неродственным пробандом (35 семейных (54 пациента) и 26 изолированных случаев заболевания).

Принимая во внимание, что даже у пациентов из одной семьи клиническое течение заболевания может быть различным по тяжести (частоты обострений в год, локализация отеков и др.) и по возрасту появлений первых клинических симптомов, анализ некоторых клинически значимых критериев течения рецидивирующих ангионевротических отеков проведен пациентам, вне зависимости от их родственных связей.

ангионевротическими отеками, торпидными к общепринятой антигистаминной и системной ГКС терапии, при попытках купирования отека. При обострении заболевания, у пациентов наблюдался плотный отек без выраженной гиперемии, безболезненный, сопровождающийся чувством распирания, а иногда – жжения. Зудом отеки не сопровождались и купировались самостоятельно примерно, через 2 – 3 дня. В 23% (18 из ангионевротическими отеками, отмечали развитие крапивницы (см. рис. 4), что не характерно, но не исключало диагноз ангионевротический отек связанный с нарушением в системе комплемента.

Рис. 4. Наличие сопутствующей крапивницы у пациентов в исследуемой группе.

Возникновение ангиоотеков больные часто связывали с механическим воздействием на кожу и слизистые, в т.ч. с травмами, оперативными и инвазивными процедурами, с гормональными изменениями менструального цикла и на фоне стрессовых ситуаций или без видимой связи воздействия внешних факторов. Так среди больных в набранной группе (n=80) в 70% случаев, наблюдалась четкая связь появления ангионевротических отеков с механическим воздействием, физической и психоэмоциональной нагрузкой.

В 20% случаев у женщин развитие отека чаще наблюдалось во время менструации или заболевание имело более тяжелое течение во время беременности. Интервалы между обострениями у каждого больного индивидуальны. Ангионевротический отек мог возникать на любом участке кожи или слизистых оболочек.

Пример анамнеза пациентки страдающей рецидивирующими ангионевротическими отеками: «…впервые отметила появление отека с локализацией в области кистей рук в возрасте 10 лет на фоне стрессовой ситуации (ДТП) и падения на руки. Отек купировался самостоятельно через двое суток. Второй отек с локализацией в области лица после травмы.

Пациентка принимала супрастин – без эффекта. Отек купировался через двое суток уже после отмены антигистаминных препаратов. До 15 лет отеки возникали не чаще 1 раза в год после травмы, сильного психоэмоционального напряжения или без видимой причины, с локализацией в области лица, кистей рук, на стопах. Зудом отеки не сопровождались и купировались самостоятельно через 2 – 3 дня. С 15 лет отеки беспокоили 2 – 3 раза в год. С 20 лет отеки появлялись, примерно, 1 раз в месяц, имели разную локализацию, на высоте отека стали беспокоить приступы болей в животе, которые сопровождались рвотой, диареей. Длительность приступа – 16 часов. Положительного эффекта от приема антигистаминных препаратов, ГКС не отмечала…».

Больным, включенным в нашу выборку, проводилось общеклиническое, аллергологическое обследование в клинике ФГБУ «ГНЦ Института иммунологии» ФМБА России, однако, некоторые пациенты обращались на консультацию, уже имея большое количество результатов обследования и выписок из других медицинских учреждений по месту жительства. По результатам обследования и анализа предоставленной медицинской документации в набранной группе пациентов, данных за атопию не получено, обострения сопутствующей патологии и хронических заболеваний, которые могли бы обуславливать появление рецидивирующий ангиоотеков, не выявлено.

Среди обследуемых пациентов 52 женщины (65%), 28 мужчин (35%).

Возраст пациентов на момент обращения варьировал от 9 месяцев до 70 лет.

При обращении в ФГБУ ГНЦ Института иммунологии ФМБА России пациенты с рецидивирующими ангиоотеками находились, как в фазе ремиссии 62,5% (50 больных), так и в фазе обострения 37,5% (30 больных).

Как правило, в анамнезе пациентов обращал на себя внимание отягощенный семейный анамнез. Однако, необходимо отметить, что больным по ряду различных причин (не помнят, не знают о родственниках в прошлых поколениях, не имеют информации о родных по линии одного из родителей и т.д.) не всегда удавалось достоверно указать семейный анамнез.

В исследуемую группу вошли 35 семейных случаев, включающих пациента, которые указали на наличие в семье родственников, страдающих рецидивирующими ангионевротическими отеками и 26 изолированных случаев, т.е. те больные, у которых семейный анамнез не отягощен.

Таблица 4. Анализ семейного анамнеза (n=80) (35 семейных случаев) (26 изолированных случаев) Наличие отягощенного семейного анамнеза для большинства наследственных форм заболевания играет ключевую роль в постановке диагноза, в том числе НАО. Анализ наличия отягощенного анамнеза позволил нам выделить когорту больных из обследуемой группы с более вероятным наличием ангионевротического отека, связанным с нарушением в системе комплемента и заподозрить у них наследственную форму заболевания. Однако, учитывая, что отсутствие семейного анамнеза не исключает возникновения мутации, приводящей к манифестации заболевания, мы проводили исследование системы компонентов комплемента всем больным.

Как правило, для рецидивирующих ангионевротических отеков характерен более ранний дебют заболевание. Распределение больных (n=80) с ангионевротическим отеком с учетом дебюта заболевания, представлено на рисунке 5.

Рис. 5. Дебют заболевания в общей группе больных.

ангионевротическими отеками, мы выяснили, что значительная их часть имеет достаточно ранний дебют заболевания. В 59% (47 пациентов) случаев впервые ангионевротические отеки возникают в возрасте от 5-25 лет, в 31% (25 пациентов) - от 9 месяцев до 5, и в 10% (8 пациентов) - старше 25 лет. У 1-го пациента в данной группе дебют заболевания произошел в возрасте до года (9 месяцев).

Интересно заметить, что в семейных случаях, по сравнению с изолированными случаями заболевания, появления первых клинических симптомов в возрасте старше 25 лет встречается в 12 раз реже (см. рис. 6, 7).

Несмотря на наличие отягощенного семейного анамнеза и достаточно ранний дебют заболевания, большинство пациентов впервые обследованы на наличие изменений в системе комплемента только в ФГБУ ГНЦ Института иммунологии ФМБА России. Как правило, ранее настороженности врачей в отношении наличия у данных пациентов отеков связанных с нарушением в системе компонентов комплемента, не возникало. В связи с этим время между дебютом заболевания и обследованием пациентов направленным на выявление изменений в системе компонентов комплемента зачастую составляло несколько лет (см. рис. 8).

Рис. 8. Распределение пациентов в зависимости от временного периода между появлением клинических симптомов и обследованием направленного на выявление изменений в системе комплемента (n=80).

В 71% случаев время между появлением первых клинических симптомов и постановкой диагноза составляло более 5 лет.

Для оценки наиболее частой локализация ангионевротических отеков в исследуемой группе, были учтены следующие показатели: локализация в области верхних и нижних конечностей, туловища, головы, гортани, наличие абдоминальных болей (см. рис. 9).

За время течения заболевания локализация отеков могла быть различной и, как правило, не ограничивается одной областью. Возникая в одной, возможно было распространение отека на другую область. В связи с этим каждый пациент умел в анамнезе возникновение отеков нескольких локализаций. Только у девяти пациентов рецидивирующие ангионевротические отеки имели монолокализацию: у пяти пациентов в отеки возникали только в области верхних и нижних конечностях; у трех пациентов локализация в области головы; одного пациента беспокоил рецидивирующий абдоминальный синдром.

Рис. 9. Распределение пациентов с учетом количества зон локализации ангионевротического отека (n=80).

Таким образом, отек у одного и того же больного может возникать на любом участке кожи или слизистых оболочек. Зачастую обострение ангионевротического отека приводит к нетрудоспособности пациента, а появление отека в области гортани и развитие абдоминального синдрома являются жизнеугрожающими и могут приводить к летальному исходу, что в ряде случаев определяет тяжесть течения заболевания даже при отсутствии частых обострений заболевания. Распределение пациентов с учетом развития отека жизнеугрожающей локализации в группе пациентов, представлено на рисунке 10.

Рис. 10. Доля встречаемости ангионевротических отеков жизнеугрожающей локализации (n=80).

Таким образом, среди пациентов набранной группы в 62% случаев хотя бы однократно отмечалось развитие ангиоотека жизнеугрожающей локализации.

У 28 больных отмечалось развитие ангиоотека в области гортани, из них абдоминалььного синдрома, у 22 больных наблюдался абдоминальный синдром.

Частота обострений ангионевротических отеков за год, в исследуемой группе представлена на рисунке11.

Рис. 11. Частота обострений рецидивирующих ангионевротических отеков в исследуемой группе.

Как правило, частота обострений в год и локализация рецидивирующих ангионевротических отеков определяют тяжесть течения заболевания. В локализации ангионевротического отека и частоты обострения заболевания в год.

Таблица 5. Определение тяжести течения заболевания с учетом локализации ангионевротического отека и частоты обострения в год (n=80) Локализация ангионевротических отеков (кол-во пациентов).

Частота Область гортани Область гортани и Абдоминальный Не в год Рассмотрев локализацию ангионевротических отеков в исследуемой группе и частоту обострений заболевания в течение года, мы определили, что в исследуемой группе тяжелое течение заболевания встречается в 66,25% случаев (53 пациента), сюда же включены больные, у которых отсутствовали частые обострения, однако отеки локализовались в жизнеугрожающей области, что также определяет тяжесть течения заболевания.

сопутствующей крапивницы не характерно для набранной нами группы пациентов (n=80) и встречается только в 23% случаев. В большинстве случаев дебют заболевания происходил в возрасте до 25 лет. Необходимо отметить, что в семейных случаях заболевания, возраст появления первых клинических симптомов, лишь в единичных случаях превышал 25 лет.

разнообразной, и в большинстве случаев не ограничивалась одной областью, а локализация отека наряду с частотой обострения определяла тяжесть течения заболевания. В набранной группе в 66,25% больные имели тяжелое течение заболевания. Несмотря на достаточно ранний дебют заболевания, наличие у большей части больных отягощенного семейного анамнеза, определенные анамнестические и клинические критерии течения заболевания, на основании которых уже можно было заподозрить диагноз рецидивирующие ангионевротические отеки связанные с нарушением в системе компонентов комплемента, время между дебютом заболевания и исследованием системы компонентов комплемента в набранной группе больных, в 71% случаев составлял более 5 лет. Вследствие этого, на момент обращения многие пациенты имели длительный «стаж» безуспешного лечения рецидивирующих ангионевротических отеков у врачей различных специальностей.

3.2. Формирование групп пациентов в зависимости от наличия изменений в системе компонентов комплемента Всем пациентам набранной группы (n=80), при обращении проводилось иммунологическое обследование, направленное на выявление изменений в иммунологическом обследовании выявлены изменения в системе комплемента.

В таблице 6, представлено распределение пациентов семейных и изолированных случаев с учетом выявленных изменений в системе компонентов комплемента.

Таблица 6. Распределение пациентов с учетом выявленных изменений в системе Семейные случаи заболевания.

Изолированные случаи заболевания Всего случаев 49 случаев (67 пациентов) 12 случаев (13 пациентов) сформированы группы:

1 группа – 67 пациентов (33 семейных и 16 изолированных случаев) выявлены снижение концентрации и/или функциональной активности С1ингибитора.

2 группа – 13 пациентов (2 семейных и 10 изолированных случаев) с рецидивирующими ангионевротическими отеками неясной этиологии показатели системы комплемента в пределах нормы.

1-ую группу пациентов в отличие от 2-ой группы составляют семейные случаи заболевания (рис. 12).

Рис. 12. Соотношение семейных и изолированных случаев заболевания в 1-ой и 2-ой группе.

Среди всех семейных случаев заболевания (n=35), изменения в системе комплемента выявлено в 61,5% случаев. Таким образом, среди семейных случаев снижение уровня С1-ингибитора и/или его функциональной активности выявляется в 1,5 раза чаще по сравнению с изолированными случаями заболевания (рис. 13).

Рис. 13. Процент выявленных изменений в системе комплемента среди семейных и изолированных случаев заболевания.

3.2.1. Характеристика второй группы пациентов Вторая группа (n=13) - это пациенты, страдающие рецидивирующими ангиоотеками неясной этиологии, показатели системы компонента комплемента у которых в пределах нормы. В данную группу больных вошло лишь два семейных случая заболевания, т.е. только 3 больных из этой группы указали на наличие отягощенного семейного анамнеза. Все остальные данной группе пациентов наблюдалось в 38,5% случаев (у пяти из 13-ти пациентов). Только у 3-х пациентов из данной группы прослеживалась четкая связь появления ангионевротических отеков с механическим воздействием и физической нагрузкой. Среди пациентов данной группы отмечался достаточно поздний дебют заболевания. У 8-ми пациентов первые клинические симптомы заболевания появились в возрасте более 25 лет, из них пять пациентов в возрасте более 40 лет. Только у пяти пациентов дебют заболевания произошел в возрасте до 10 лет, рисунок 14.

Рис. 14. Дебют заболевания в группе (n=13).

У четырех пациентов из 13-ти (31%) в данной группе хотя бы однократно отмечалось развитие отеков в жизнеугрожающей области, однако частых обострений заболевания в данной группе больных не отмечается (рис. 15).

жизнеугрожающей локализации (n=13).

Учитывая, что иммунологические причины развития ангионевротических отеков были исключены, с целью уточнения генеза заболевания алгоритм обследования данной группы пациентов был расширен.

Клинический разбор пациентов данной группы:

1-й случай У пациентки дебют заболевания в 41 год, отеки в большинстве случаев имели локализацию в области суставов (коленных, мелких суставов кистей), пациентка консультирована и в настоящее время наблюдается у врача – ревматолога.

2-й случай Дебют заболевания в 61 год. У пациентки отеки рецидивировали в параорбитальной области. Стойкая ремиссия достигнута после коррекции выявленной эндокринной и неврологической патологии (в том числе шейного остеохондроза).

3-й, 4-й и 5-й случаи У 3-х пациентов (подросткового возраста 21-го года, 20 и 14-ти лет) после проведенной коррекции сопутствующей патологии органов желудочнокишечного тракта, в том числе противопаразитарной терапии и соблюдения гипоаллергенной диеты отеки не рецидивировали. Двум из этих пациентов по личной настоятельной просьбе был проведен молекулярно-генетический анализ, направленный на поиск мутации в гене SERPING1, в результате данного анализа мутаций не обнаружено.

6-ой случай У пациентки при дополнительном углубленном аллергологическом обследовании (определение уровня специфического IgE в сыворотке крови), выявлена сенсибилизация к бытовым аллергенам. После проведения курса аллерген - специфической терапии и мероприятий направленных на элиминацию аллергена отеки не рецидивировали.

Более подробно рассмотрим следующие три клинических случая.

7-ой случай У пациентки, с детского возраста эпизодически отмечались интенсивные боли в животе без очевидной причины. В 16 лет впервые появился отек в области стопы, сопровождающийся зудом и купировавшийся самостоятельно в течение суток. Накануне появления отека перенесла респираторную инфекцию с проведением антибактериальной терапии несколькими препаратами. С этого времени неоднократно отмечались отеки в области верхних и нижних конечностей, лица, гортани, а также периодическое появление высыпаний, сопровождающихся зудом. Провоцирующими факторами могли служить механическое раздражение, стрессовая ситуация.

При обследовании показатели системы компонентов комплемента в пределах нормы. На фоне наступления беременности пациентка отмечала учащение рецидивов отеков. С учетом данных анамнеза (дебют заболевания в пубертатном возрасте и тенденции к утяжелению течения заболевания на фоне беременности и эстрогенемии, характерное клиническое течение заболевания, наличие в анамнезе абдоминальных болей без «очевидной причины», эффективность парентерального введения аминокапроновой кислоты при обострении заболевания) не исключен диагноз НАО III типа.

Пациентке назначен ежедневный прием аминокапроновой кислоты, на фоне применения которой отеки не рецидивируют. Пациентка продолжает наблюдаться в ФГБУ ГНЦ Института иммунологии ФМБА России, также ей предложено пройти молекулярно-генетическое обследование для исключения мутации в гене определяющем ХII фактор свертывания.

8-ой случай Дебют заболевания в возрасте 50 лет, когда пациент стал отмечать появление рецидивирующих отеков различной локализации, высыпания сопровождающиеся зудом. В некоторых случаях отмечал связь появления отеков с механическим раздражением кожи. Развитие и регресс отеков от нескольких часов до нескольких суток. Прием антигистаминных препаратов с плохо выраженным эффектом. Отмечается положительный эффект от применения аминокапроновой кислоты, при её парентеральном введении – быстрое достижение положительного эффекта. При обследовании у пациента выявлена эндокринная патология (наличие гиперэстрогенемии), патология органов желудочно-кишечного тракта. В связи с чем, несмотря на отсутствие изменений в системе компонентов комплемента, но учитывая данные анамнеза, локализацию отеков, частоту и длительность обострений, отсутствие полного терапевтического эффекта антигистаминных препаратов, положительный эффект применения аминокапроновой кислоты, наличие сопутствующей эндокринной патологии, ex juvantibus был назначен ежедневный прием даназола 200 мг в сутки. На фоне применения даназола отмечается отсутствия рецидивов отеков (до этого момента симптомы отмечались практически ежедневно). Пациент продолжает наблюдаться в ФГБУ ГНЦ Института иммунологии ФМБА России.

9-й случай Пациентка с 11 лет отмечала появление отеков в области кистей рук, стоп, провоцирующиеся механическим воздействием. В течение последних 1,5 лет применение эстрогенсодержащих препаратов (в связи с гормональной дисфункцией), на фоне которых отмечает учащение отеков различной локализации, с продолжительностью симптоматики до 1-2 суток, периодически стали беспокоить абдоминальные боли, сопровождающиеся тошнотой, рвотой, диареей. Госпитализирована в ФГБУ ГНЦ Института иммунологии ФМБА России с отеком в области лица. Получала лечение:

аминокапроновой кислоты – с положительным эффектом. Несмотря на отсутствие данных за наличие ангиоотеков связанных с нарушением в системе комплемента (показатели системы компонентов комплемента в пределах нормы), принимая во внимание характер клинической картины, негативное влияние эстроген-содержащих препаратов на течение заболевания, наличие в анамнезе данных об эффективности применения аминокапроновой кислоты для купирования обострения, можно предположить активное участие кининов в патогенезе ангиоотеков. В связи с этим пациентке рекомендовано применение аминокапроновой кислоты в качестве базисной терапии, а также ее использование для профилактики отеков при проведении инвазивных и оперативных вмешательств, а также при лечении обострений. Данной пациентке, по ее настоятельной просьбе, проведен молекулярно-генетический анализ, направленный на поиск мутации в гене SERPING1, в результате данного анализа мутаций не обнаружено.

В 4-х случаях заболевания диагноз «ангионевротический отек, связанный с нарушение в системе компонентов комплемента» исключен, дальнейшее обследование пациенты продолжали в многопрофильных стационарах.

Таким образом, данная группа больных (n=13) состоит преимущественно из изолированных случаев заболевания, т.е. пациенты не имели отягощенного семейного анамнеза. В 54% случаев дебют заболевания происходил в возрасте старше 25 лет. В 38,5% случаев в данной группе отмечалось развитие сопутствующей крапивницы. В 31% случаев ангионевротический отек развивался в жизнеугрожающей области. Как правило, при углубленном общеклиническом и аллергологическом обследовании выявлялась сопутствующая патология, которая также могла приводить к развитию рецидивирующих ангионевротических отеков, однако, после коррекции выявленной патологии и/или подбора адекватной базисной терапии по сопутствующей патологии, наблюдалась стойкая ремиссия ангиоотеков.

Заметим, что трое пациентов в данной группе вероятнее всего имеют рецидивирующие ангионевротические отеки III типа, так называемые эстроген зависимые отеки. В настоящее время мы не имеем возможности обследования данных пациентов для исключения патологии связанной с ХII фактором свертывания крови, которая также может приводить к рецидивирующим ангионевротических отеков. Но, с учетом данных анамнеза, локализации отеков, частоту и длительность обострений, отсутствие терапевтического эффекта антигистаминных препаратов, ex juvantibus данным пациентам были назначены антигонадотропные (даназол) и антифибринолитические (аминокапроновая кислота) препараты. На фоне применения данных препаратов была достигнута стойкая ремиссия заболевания, однако, эти больные требуют дальнейшего динамического наблюдения. Необходимо также отметить, что по настоятельной просьбе, трем пациентов из данной группы, т.е. пациентам без изменений в системе комплемента, проведен молекулярногенетический анализ, направленный на поиск мутации в гене SERPING1, в результате данного анализа мутаций не обнаружено. Это свидетельствует в пользу того, что необходимости в молекулярно-генетическом обследовании пациентов без изменений в системе комплемента нет.

3.2.2. Характеристика первой группы пациентов В первую группу вошло 67 пациентов у которых выявлено снижение уровня и/или функциональной активности С1-ингибитора. На основании данных иммунологического обследования, анамнеза заболевания, в том числе семейного, всем пациентам данной группы (n=67) был выставлен диагноз: рецидивирующий ангионевротический отек, связанный с нарушением в системе комплемента. Снижение уровня С1-ингибитора и/или его функциональной активности наблюдалось на 30% или более от нормы (см. табл. 7).

Таблица 7. Значения при оценке лабораторных показателей системы компонентов комплемента в исследуемой группе До настоящего времени постановка диагноза «наследственный ангионевротический отек», как правило, основывалась на данных семейного анамнеза и лабораторной оценки показателей системы компонентов комплемента.

Большая часть пациентов, у которых было выявлено изменение в системе комплемента, составила семейные случаи заболевания (т.е. пациенты имели отягощенный семейный анамнез). Полученные данные, свидетельствовали в пользу наследственного генеза рецидивирующих ангиоотеков. Среди изолированных случаев заболевания также выявлены изменения в системе комплемента. Несмотря на то, что эти пациенты не имели отягощенного семейного анамнеза, у них также не исключена наследственная форма рецидивирующих ангионевротических отеков.

Необходимо отметить, что снижение уровня С1-ингибитора и/или его функциональной активности в семейных случаях заболевания выявляется в 1,5 раза чаще по сравнению с изолированными случаями заболевания (семейные случаи - 94% (у 51 из 54 больных), изолированные случаи заболевания - в 61,5% (у 16 из 26 больных) (см. табл. 8).

Таблица 8. Распределение пациентов семейных и изолированных случаев комплемента Выявленные нарушения в системе компонентов комплемента Семейные заболевания Изолированные пациентов Для доказательства того, что среди семейных случаев заболевания изменения в системе компонента комплемента выявляется чаще, по сравнению с изолированными случаями заболевания, рассчитан показатель хи-квадрат:

2=13, Сравнив это значение с критическими значениями уровней значимости, для первой степени (=1) увидим, что уровень значимости p < 0,005, что статистически достоверно доказывает более высокую вероятность выявление рецидивирующих ангионевротических отеков, связанных с нарушением в системе комплемента среди пациентов с отягощенным семейным анамнезом.

Наличие сопутствующей крапивницы не характерно для данной группы больных и выявлено только в 19% случаев (у 13 из 67 больных).

Анализируя возраст появления первых клинических симптомов заболевания в первой группе пациентов (n=67), рисунок 16, получили, что в 97% случаев дебют заболевания происходил в возрасте до 25 лет и лишь в 3% случаев старше 25 лет. Большая часть пациентов имеющих снижение уровня С1-ингибитора и/или его функциональной активности составляют семейные случаи заболевания.

Рис. 16. Дебют заболевания в 1-ой группе (n=67).

Среди пациентов первой группы с нарушением в системе комплемента, более чем в половине случаев в 67% заболевания отмечалось развитие ангионевротического отека жизнеугрожающей локализации (см. рис. 17).

Полученные результаты подтверждают всю серьезность данной патологии.

жизнеугрожающей локализации (n=67).

Тяжесть течения рецидивирующих ангионевротических отеков, связанных с нарушением в системе комплемента, оценивалась по двум критериям:

частота обострений заболевания в год и локализация отека во время обострения. Характеристика пациентов первой группы (n=67) с учетом локализации отеков и частоты обострений заболевания в год представлена на рисунке 18.

кол-во больных Рис. 18. Распределение пациентов 1-й группы в зависимости от локализации ангионевротического отека и частоты обострений заболевания в год (n=67).

В связи с тем, что за период заболевания у одного и того же пациента отеки рецидивировали с различной частотой, нами оценивалось количество обострений за последний год. Локализация отеков при обострении учитывалась за весь период заболевания. Подробный анализ распределения пациентов с учетом локализации ангионевротического отека и частоты обострений заболевания представлен в таблице 9.

ангионевротического отека, частоты обострений заболевания в год Количество больных Отек в области гортани отмечался у 26 больных. Восем из 26 пациентов с локализацией отеков в области гортани страдали от обострения заболевания 10 и более раз в год. Развитие абдоминального синдрома наблюдалось у больных, у четырех больных из них обострение заболевания – ежемесячно.

Только у одного из 22 пациентов, локализация отеков у которых не заболевания до 10 раз в год и более. Из полученных данных, видно, что в 68,6% случаев (46 из 67) пациенты первой группы имели тяжелое течение заболевания.

В 68,6% (46 из 67 больных) у больных первой группы прослеживалась связь возникновение ангиоотеков с механическим воздействием на кожу и слизистые, в т.ч. травмами, оперативными и инвазивными процедурами, на фоне стрессовых ситуаций.

В 23% случаев (у 10 из 43 женщин 1-ой группы) обострение заболевания возникало на фоне гормональных изменений менструального цикла и беременности.

Таким образом, 1-ю группу в большинстве случаев (51 из 67) составляют больные, имеющие отягощенный семейный анамнез (33 семейных случая), и 16 изолированных случаев. Однако, вне зависимости от наличия отягощенного семейного анамнеза начало заболевания в 97% случаев происходит в детском и юношеском периоде, т.е. до 25 лет. В 68,6% случаев (46 из 67 больных) обострение заболевания связано с механическим воздействием на кожу и слизистые, на фоне стрессовых ситуаций и в 23% случаев у женщин (у 10 из 43 женщин) с гормональными изменениями менструального цикла и беременности. Более половины больных 68,6% ( из 67) 1-ой группы пациентов имеют тяжелое течение заболевания.

Анализируя лабораторные показатели уровня и функциональной активности С1-ингибитора (см. табл. 7), можно предположить, что из больных (33 семейных случая и 16 изолированных) 56 пациентов ( семейных и 13 изолированных случаев) страдают НАО I типа и 11 ( семейных и 3 изолированных случая) пациентов с НАО II типа. У пациентов семейных случаев заболевания вероятность наследственного генеза рецидивирующих ангионевротических отеков выше, однако, до проведения молекулярно-генетического анализа, мы можем подозревать наследственную форму заболевания, но только наличие выявленной мутации в ходе молекулярно-генетического анализа дает право выставить диагноз НАО.

Молекулярно-генетическое обследование проведено 24-м неродственным пробандам: 15 семейных случаев (26 пациента), 9 изолированных случаев. Из них молекулярно-генетический анализ проводился 3-м пациентам из 2-ой группы, остальные пациенты из 1-ой группы.

На молекулярно-генетический анализ направлялись пациенты, у которых выявлялось снижение уровня и/или функциональной активности С1ингибитора. В ходе молекулярно-генетического обследования, проведенного методом прямого секвенирования гена SERPING1, рисунок 19, выявлено различных мутаций, в 10 семейных (17 пациентов) и 6 изолированных случаях. 14 мутаций у пациентов с НАО I типа и 2 – с НАО II типа (см. рис.

19). Из обнаруженных мутаций 12 ранее в литературе не описаны (см. табл.

10).

Рис. 19. Фрагменты результатов секвенирования гена SERPNG1.

Таблица 10. Спектр выявленных мутаций в гене SERPING В результате молекулярно-генетического анализа установлено, что мутации в гене SERPING1 распределены достаточно равномерно по всей кодирующей последовательности гена. Однако, необходимо отметить, что чаще мутации встречались в экзоне 4 (из 16 выявленных 5 мутаций локализованы в экзоне 4).

В результате проведенной работы не обнаружено мутаций в экзоне 2.

Вероятнее всего это связано с тем, что его длина составляет всего 73 п.н. и вероятность появления мутаций в нем мала. Из полученных данных следует, что в гене SERPING1 встречаются все типы мутаций. Выявлено: четыре миссенс-мутации в экзонах 4, 5 и 8, приводящие к замене одной аминокислоты на другую; нонсенс-мутация в экзоне 3, приводящая к образованию стопкодона; инсерции нуклеотидов в экзоне 4 и 6, приводящии в сдвигу рамки считывания с образованием преждевременного стоп-кодона; комбинированные мутации в экзонах 3 и 7; делеции обнаружены в экзонах 4, 7 и 8; мутации сайта сплайсинга которые нарушают процессинг первичного РНК-транскрипта, обнаружены в интронах 3, 4 и 7. В ходе исследования была обнаружена мутация с.-687А>G, у родных брата и сестры в гетерозиготном состоянии, при аутосомно-рецессивном типе наследования НАО, предположительно данная мутация находится в регуляторной области гена и, вероятно, приводит к снижению уровня синтеза белка.

В 5-ти семейных случаях заболевания, при наличии изменений в системе комплемента, мутаций в гене SERPING1 у пациентов не обнаружено. Однако, учитывая наличие у этих больных характерной клинической картины, диагноз НАО не исключен. Можно предположить, что у этих пациентов мутация находится в регуляторных областях гена SERPING1, или возможно наличие протяженной делеции. Подобные мутации не выявляются методов секвенировая (в литературе описаны такие редкие случаи [10]). 3-м пациентам, страдающим рецидивирующими ангионевротическими отеками без изменений в системе комплемента (из 2-ой группы), по их настоятельной просьбе проведен, молекулярно-генетический анализ, направленный на поиск мутации в гене SERPING1, в результате данного анализа мутаций не обнаружено.

3.3.1. Анализ семей пациентов с наследственным ангионевротическим На представленных ниже рисунках: кругом обозначены женщины, квадратом мужчины, голубой цвет указывает на наличие клинических проявлений у пациентов, ярко розовым обозначены пациенты с НАО, у которых в ходе молекулярно-генетического анализа выявлена мутация в гене SERPING1.

Первая семья: пациенты родные брат и сестра с разницей в возрасте года. Отец детей погиб вследствие отека гортани, рисунок 20. У обоих пациентов дебют заболевания в детском возрасте 11 и 10 лет соответственно, с обострениями 3-4 раза в год, локализация отеков верхние и нижние Рис. 20. Первая семья.

функциональной активности до 26%, у брата С4компонент комплемента менее 8 мг/дл (норма 12-36). Выставлен диагноз НАО I типа. Молекулярно-генетическое обследование проведено только сестре, брат от проведения подобного исследования отказался. В ходе обследования выявлена миссенс-мутация c.706T>G в гетерозиготном состоянии, приводящая к аминокислотной замене Phe236Val в белке, локализованная в экзоне 5. Данная мутация ранее в литературе не описана.

Учитывая кровную связь пациентов, схожесть клинической картины и изменения в системе комплемента, вероятнее всего брат и отец так же являются носителями вышеуказанной мутации.

Вторая семья: пациенты мать и дочь, выставлен диагноз НАО I типа.

Рис. 21. Вторая семья. связано с механическим раздражением, физической нагрузкой, психоэмоциональным напряжение, а так же без видимой причины. При иммунологическом обследовании у матери снижение уровня С1-ингибитора до 0,01 мг/дл, снижение функциональной активности до 42%.

У дочери снижение уровня С1-ингибитора до 2,0 мг/дл, функциональной активности до 12%. В ходе проведенного молекулярно-генетического c.1108A>G,1109_1114del6,1116G>T,1118_1159dup42 у матери и дочери в гетерозиготном состоянии в области экзона 7, приводящая к значительному изменению структуры белка. Данная мутация ранее в литературе не описана.

Рис. 22. Третья семья. детальном расспросе отца девочки, выяснилось, длительного времени отец девочки свое заболевание от супруги скрывал по иммунологическом обследовании выявлено значительное снижение уровня и функциональной активности С1-ингибитора. При молекулярно-генетическом обследовании, выявлена миссенс-мутация c.578T>C, приводящая к аминокислотной замене Leu193Pro в белке, локализованная в экзоне 4.

Выставлен диагноз НАО I типа. Отец от проведения обследования отказался.

На данном клиническом примере продемонстрировано, что пациенты по различным причинам не всегда могут однозначно указать на наличие отягощенного семейного анамнеза, наличие которого в большинстве случаев определяет дальнейшую тактику ведения пациентов.

Четвертая семья: мать, её дочь и сын (см. рис. 23), выставлен диагноз Рис. 23. локализация отеков в области верхних и нижних Четвертая семья.

год, базисной терапии не получает. У сына дебют заболевания в 19 лет, отеки возникают без видимой причины, на фоне механического раздражения, физической нагрузки и психоэмоционального напряжения. Локализация в области верхних и нижних конечностях, в области гениталий, обострения до 10 раза в год, базисной терапии не получает. При иммунологическом обследовании выявлено снижение уровня С1-ингибитора у дочери до мкг/мл (норма 150-350), у сына 28 мкг/мл, у матери 42 мкг/мл. Из всей семьи только сыну проведено молекулярно-генетическое обследование, в ходе которого обнаружена инсерция c.623_624insA в гетерозиготном состоянии в экзоне 4, приводящая в сдвигу рамки считывания с образованием преждевременного стоп-кодона. Данная мутация ранее в литературе не описана. Учитывая кровную связь пациентов, схожесть клинической картины и изменения в системе комплемента, вероятно, что и мать и его сестра так же является носителем вышеуказанной мутации.

Пятая семья: мать, её дочь и сын (см. рис. 24). Выставлен диагноз НАО I типа. У всех членов данной семью дебют заболевания произошел примерно в сын дочь гортани), у дочери в анамнезе эпизод появления отеков Рис. 24. Пятая туловища. Обострения до 5 раз в год у всех членов семья.

иммунологическом обследовании выявлено снижение уровня С1-ингибитора у матери до 5,24 мг/дл, у дочери 0, 01 мг/дл, у сына 0, 01; функциональной активности С1-ингибитора у матери 42%, у дочери 42%, у сына 43%. Всем членам данной семьи проведено молекулярно-генетическое обследование, в ходе которого выявлена миссенс- мутация с.1466С>G в гетерозиготном состоянии, в экзоне 8, приводящая к аминокислотной замене p.Pro489Arg в белке. В литературе данная мутация описана.

ангионевротическими отеками. При иммунологическом обследовании уровень сестра Рис. 25. Шестая семья.

семейный анамнез отсутствует. Однако, для исключения наличия выявленной мутации у близких родственников, по настоятельной просьбе пациентки, родной сестре и родителям, которые клинически здоровы, также проведено молекулярно-генетический анализ. У членов семьи показатели системы комплементов в пределах нормы, мутации в гене SERPING1 не выявлено.