«Диагностика самоопыляемости сортов яблони по содержанию флавоноидов в репродуктивных структурах цветков ...»

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Мичуринский государственный аграрный университет»

На правах рукописи

Молодцов Максим Андреевич

Диагностика самоопыляемости сортов яблони по

содержанию флавоноидов в репродуктивных структурах

цветков

Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Научный руководитель Доктор с.-х. наук Палфитов Виктор Федорович Мичуринск-наукоград РФ Оглавление Введение………………………………………………………………………….. Глава 1. Общие сведения о совместимости сортов яблони при самоопылении……………………………………………… 1.1 История изучения и значение самоплодных сортов для промышленных насаждений яблони………………………………………………………………. 1.2 Анализ факторов и причин несовместимости сортов яблони при опылении………………………………………………………………………… 1.2.1 Генетический контроль несовместимости при опылении……………… 1.2.2 Сведения о возможных способах преодоления самонесовместимости…………………………………………………………... 1.2.3 Не способность сортов яблони к самоопылению в связи с морфологическими особенностями цветка…………………………………… 1.2.4 Биохимическая природа несовместимости при опылении…………… 1.2.4.1 Биохимические особенности пыльцевых зерен яблони …………...… 1.2.4.2 Биохимические особенности пестиков цветков яблони……………… 1.2.4.3 Совместное влияние эндогенных факторов пыльцы и пестиков на совместимость растений при опылении……………………………………….. Глава 2. Цель, задачи, объекты методы и условия проведения исследований………………………………………………………… 2.1 Цель и задачи исследований……………………………………………..…. 2.2 Объекты исследований…………………………………………………....... 2.3 Методы и база исследований…………………………………………….… 2.4 Условия проведения исследований………………………………………... Результаты исследований Глава 3. Сопоставление исследованных сортов яблони по физиологобиохимическим особенностям репродуктивных структур цветков ….... 3.1 Характеристика пыльцы, исследованных сортов яблони………………… 3.1.1 Определение в пыльце процентного содержания водорастворимых веществ весовым методом с помощью стеклянных фильтров………………. 3.1.2 Количественное фотометрическое определение в пыльце флавонолов…………………………………………………………… 3.1.2.1 Определение флавонолов в пыльце на спектрофотометре СФ-26…………………………………………………………………………..… 3.1.2.2 Определение флавонолов в пыльце на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М………………………………………………………………………… 3.1.2.3 Сопоставление исследованных сортов яблони, по содержанию водорастворимых веществ и флавонолов в пыльце …………………….…… 3.1.3 Сопоставление сортов яблони по жизнеспособности пыльцы в зависимости от содержания в ней флавонолов ………………………………. 3.2 Сопоставление исследованных сортов яблони по содержанию флоризина в пестиках цветков и по самоопыляемости……………………………………. 3.2.1 Подготовка пестиков для анализа ……………………..………………... 3.2.2 Сопоставление сортов яблони по содержанию флоризина в пестиках... 3.2.3 Влияние количественного содержания флоризина в пестиках на самоопыляемость сортов яблони.……………………………………….…..… 3.3 Прогамное взаимодействие пыльцы и пестиков яблони с различным содержанием в них флавоноидов……………………………………………… Глава 4. Отбор и особенности самоопыляющихся сортов яблони.……. 4.1 Диагностика самоопыляемости сортов яблони………………………….... 4.2 Способ отбора сортов яблони, склонных к самоплодности……………… 4.3 Перекрестная плодовитость сортов яблони, склонных к самоплодности при опылении..………………………………………..…. 4.4 Влияние внекорневых подкормок на содержание флавоноидов в репродуктивных структурах сортов яблони…………..………………………. Глава 5. Экономическая эффективность сортов яблони, с различным содержанием флавоноидов в репродуктивных структурах цветков…… Выводы………………………………………………………………………….. Рекомендации для селекции и производства……………………………... Список использованной литературы……………………………………… Большинство сортов яблони являются перекрестно опыляемыми. Факт требовательности плодовых культур к перекрестному опылению был установлен полтора столетия назад в США. В эволюционном отношении перекрестное опыление, приводящее к обмену наследственными свойствами между сортами на генетическом уровне, является прогрессивным явлением.

Однако в промышленно-хозяйственном и научно-селекционном отношении представляет большой интерес выявление сортов, способных в значительных количествах завязывать плоды при опылении пыльцой от растений того же самого сорта. Такие сорта нужны для формирования односортных насаждений. Многие ученые – садоводы: В.О. Беляев (1898); К.Ф. Костина (1928); В.В. Пашкевич (1930; 1931); Ф. Кобель (1934; 1957); В.К. Заец (1939);

Е.Н. Седов, З.М. Серова (1980); Е.Н. Седов (2013); И.Г. Басина (1969 [б]); В.В.

Малыченко (1975); В.Н. Правдюк, Е.Н. Седов (1982); Л.М. Ро (1929 [б]); А.Е.

Сюбаров (1968); Е. С. Иванов, Е.П. Прибылова, (2003), на основании своих исследований пришли к выводу, что создание таких садов и уход за ними может сделать производство плодов более рентабельным, чем применение разносортных насаждений. Самоопыляемые1 (самоплодные) сорта лучше, чем перекрестноопыляемые, завязывают плоды при неблагоприятных погодных условиях и уменьшении числа пчелоопылителей вследствие ухудшения экологии. В селекции применение сортов, обладающих свойством самоопыляемости, дает возможность создания новых самоплодных сортов.

Однако выявление у того или иного сорта признака самоопыляемости и доказательство передачи этого признака потомственным формам является не простой задачей. Хотя в литературе и рассматривается существование Термин самоопыляемость, т.е. способность сортов яблони давать плоды от опыления собственной пыльцой, мы используем чаще, в отличие от самоплодности, где завязывание плодов может происходить и без опыления (партенокарпия, апомиксис) S-гена самонесовместимости (Малецкий, 1996; Алексеенко, 2001), судить о степени самоопыляемости того или иного сорта можно только после проведения с ним опытов по принудительному самоопылению. Но из-за недостатка влаги в засушливые годы (Ро, 1929 [а]), из-за весенних заморозков (Заец, 1939) или зимнего переохлаждения от сильных морозов, или от избыточного снегозадержания около плодовых деревьев (Круглов, 2009), при самоопылении одних и тех же сортов в течение ряда лет могут быть получены разные результаты.

Большие надежды ученые возлагают на молекулярно-генетическую идентификацию аллельного разнообразия S-гена методом ДНК-маркерного анализа, с проведением полимеразно-цепной реакции (ПЦР). Однако в научной литературе мы не нашли описания алгоритма определения у сортов яблони признака самосовместимости (самоопыляемости) как этим (Алексеенко, 2001; Супрун, 2010; Супрун, Степанов, Токмаков, 2012), так и другими косвенными методами.

При незыблемости положения о значении генотипа сорта не может вызывать возражений и то, что все свойства сорта имеют под собой биохимическую основу. В частности, из работ (Moewus, 1950; Бритиков, 1957; Минаева, 1978; Милованова, Кондратьев, Журавель, 1974; Острейко, 1988 и др.) следует, что на взаимоотношения пыльцы и пестиков растений в опылительных процессах играют важную роль природные вещества, содержащиеся в этих репродуктивных2 структурах. В.Ф. Палфитов (2003) на примере исследования количественного содержания водорастворимых веществ в пыльце и флоризина в пестиках сортов яблони с различной склонностью к самоплодности показал, что самоплодные сорта больше содержат водорастворимых веществ в пыльце и меньше флоризина в пестиках. В работе Н.Е. Козлова (2012 [б]) сделан вывод, что перекрестная плодовитость сортов яблони прямо пропорциональна содержанию Репродутивный (воспроизводящий) - этот термин больше подходит к растительным объектам, чем генеративный (рождающий), который ближе для животных организмов.

флавонолов в пыльце сорта опылителя и обратно пропорциональна содержанию флоризина в пестиках опыляемого сорта. Зависимость самоопыляемости сорта от совместного количественного содержания флавонолов в пыльце и флоризина в пестиках до настоящего времени ещё ни кем не рассматривалась.

В связи с вышеизложенным, представляет значительный интерес исследование биохимических и физиологических особенностей репродуктивных структур у сортов яблони, обладающих различной склонностью к самоопыляемости. При этом необходимо одновременное выполнение полевых опытов по их самоопылению и лабораторных опытов по определению физиолого-биохимических свойств пыльцы, установлению содержания в ней водорастворимых веществ и флавонолов, а также содержания флоризина в пестиках цветков, исследуемых сортов яблони.

Кроме этого требуется совершенствование и упрощение методик количественного определения содержания водорастворимых веществ и флавонолов в пыльце. Важно также выяснить возможность преодоления самонесовместимости у сортов яблони при опылении путем воздействия на растения азот и бор содержащими внекорневыми подкормками.

Полученные результаты явились основанием для написания данной диссертационной работы.

На защиту выносятся следующие основные положения:

жизнеспособности и жизнедеятельности их пыльцы.

2. Диагностика совместимости сортов яблони при самоопылении по содержанию флавонолов в пыльце и флоризина в пестиках.

исследованных сортов яблони.

Глава 1. Общие сведения о совместимости сортов яблони при 1.1 История изучения и значение самоплодных сортов для Достижение стабильного максимального плодоношения плодовыми насаждениями является актуальной задачей современного садоводства. В связи с этим интерес представляют самоопыляемые (самоплодные) сорта плодовых культур и их моносортные насаждения. В таких садах уменьшается вероятность периодичности плодоношения, упрощается уход, защита и уборка плодов, а это значит сокращаются затраты на производство высококачественных плодов. Самоопыляемые сорта лучше, чем перекрестноопыляемые, завязывают плоды при неблагоприятных погодных условиях и уменьшении числа пчелоопылителей в связи с ухудшением экологии. В селекции применение сортов, обладающих свойством самоопыляемости, дает возможность создания новых самоплодных сортов.

Однако применительно к яблоне существует проблема подавляющей самобесплодности ее сортов. Лишь немногие сорта способны формировать урожай при опылении цветков собственной пыльцой. В эволюционном отношении самоопыление не является прогрессивным признаком, так как при этом не происходит обмена наследственными свойствами на генетическом уровне, но в хозяйственном отношении эта особенность самоплодных сортов очень важна.

«Требовательность плодовых культур к перекрестному опылению была установлена полтора века назад на примере груши. В США один садовладелец в качестве будущего приданого для своей дочери заложил большой грушевый сад. При этом был использован лишь один сорт Вильямс на всей площади в 50 гектаров, считавшийся тогда самым урожайным и скороплодным.

Сад зацвел, как и ожидалось уже через три года, но плодов не дал.

Несмотря на все возрастающее цветение, урожая не было и в последующие годы. Приглашенный специалист по болезням плодовых культур никаких патологий на деревьях не выявил. Однако в одном месте сада небольшой участок все же плодоносил. Было выяснено, что несколько ошибочно попавших сюда деревьев другого сорта росли в центре этого участка. С урожаем были как они, так и деревья основного сорта Вильямс, расположенные рядом. Но урожай основного сорта уменьшался по мере удаления от случайных «гостей».

перекрестного опыления и причине пустоцветов, а в последствии подтверждены специально проведенными опытами, а потом и практикой.

Было выяснено, что самоплодностью сорта могут обладать из-за склонности к партенокарпии (плодоношению без опыления). Такими сортами из груш оказались Малгоржатка, Северянка, Бере Зимняя Мичурина, Чижовская, Бессемянка, Венера, Сентябрьская, Видная. Однако, этот признак оказался не постоянным и в зависимости от погодных условий, места выращивания, агротехники может варьировать. Поэтому даже лучшие самоплодные сорта всегда дают больший урожай при наличии сортовопылителей» (Ефимова, Н.).

самоплодности плодовых культур были выполнены в США Уэйтом (Waite, 1894; Waite, 1898). Им тоже был сделан вывод, что перекрестное опыление у груши дает лучшие результаты, чем опыление тем же самым сортом. Выводы Уэйта вызвали среди ученых многих стран огромный интерес к дальнейшему изучению само- и перекрестного опыления у различных сортов плодовых культур.

перекрестной совместимости, были проведены в 1911 г. по инициативе профессора В.В. Пашкевича. Полученные им данные позволили охарактеризовать степень самоплодности для 170 сортов яблони.

удовлетворительные урожаи в односортных насаждениях. Ряд авторов (Пашкевич, 1915; Колесников, 1927), отмечают значительную самоплодность таких сортов яблони как Джонатан, Мелба, Уэлси, Кальвиль Снежный, Ренет Симиренко. При самоопылении они могут обеспечить экономически эффективные урожаи. Аналогичного мнения придерживаются К.Ф. Костина (1928) и К.В. Кондрашова, Н. В. Конопко, И. А. Побединская, (1996).

Изучая самоопыление у ряда сортов яблони, Н.М. Куренной (1971[а];

1971 [б]) отметил их самонесовместимость и сделал вывод, что все сорта яблони в практическом садоводстве следует рассматривать как самобесплодные.

В последние четыре десятилетия исследованию самоплодности сортов яблони много внимания уделяли академик Е.Н.Седов и последователи его школы (Седов, Серова, 1980; Правдюк, Седов, 1982; Седов, Жданов, 1989;

Седов, 2005; Седов 2013).

На существование сортов яблони, способных образовывать высокий процент полезной завязи естественным и искусственным самоопылением указывают в своих работах В.В. Малыченко (Малыченко, 1975; 1979) и М.А.

Попов (Попов, 1986).

Перспективы самоплодности для решения проблем садоводства рассматривали в своих работах В.А. Колесников (1927), Л.М. Ро (1929 [а]), А.Е. Сюбаров (1968). На основе своих многочисленных исследований они пришли к выводу, что если сорта хорошо самоопыляются, то дают постоянно высокие урожаи, в отличие от сортов, не проявляющих самоплодности.

И.Н. Рябов (1932), в своей обширной сводке, после анализа свыше работ отмечает, что плодовитость сортов плодовых пород меняется в зависимости от условий внешней среды, поэтому результаты опытов по само- и перекрестному опылению у различных исследователей не сходны между собой и часто противоречивы.

По мнению Е.С. Иванова и Е.П. Прибыловой (Иванов, Прибылова, 2003) до сих пор нет однозначного ответа на вопрос, что дешевле, осуществлять тысячи исследований по выявлению и закреплению лучших комбинаций сортов взаимоопылителей и проводить их дорогостоящую апробацию перед внедрением в производство, или сосредоточиться на выявлении механизмов самоопыления яблони в односортных насаждениях и выведении автогенных сортов, используя достижения в области биологии, экологии, агрофитоценологии, генетики и биоэволюции.

«В.О. Беляев (1898) делает вывод о том, что односортные грушевые и яблоневые сады не осуждены на полное бесплодие, хотя должны приносить меньшие урожаи. Исследования В.Н. Правдюк и Е.Н. Седова, (Правдюк, Седов, 1982) показывают, что даже от скрещивания двух самобесплодных сортов в отдельных случаях можно получить самоплодные сеянцы. Они считают самоплодность ценным биологическим свойством яблони, определяющим направление ее селекции для получения сортов, меньше всего зависящих от непогоды во время цветения» (Иванов, Прибылова, 2006).

Кудрявец (1991) отмечает, что число и размещение сортов в пределах квартала должно определяться именно уровнем их самоплодности.

Работами А.С. Татаринцева (1954), Е.С. Иванова (1998; 1999) показана различная степень самоопыления яблони на уровне цветка, особи (дерева), клона и сорта.

самосовместимости сортов яблони уделяли: F. Lewis, S. Vincent, (1909); H.F.

Linskens, (1967); G.C. Martin, E. A. Stahly, (1967).

Кроме названных исследователей изучением самоплодности, наряду с перекрестной совместимостью плодовых культур занимались: А.В. Петров, (1925); Р.Р. Шредер, (1926); И.Н. Рябов (1927); И.Т. Гулаков (1933); Ф.Д.

Лихонос (1936); В.К. Заец (1939); В.В. Кичина (1967); П.В. Боев (1973); М.А.

Попов, (1985); И.С. Исаева, (1989); Ф. Кобель (1934; 1957); С.Ф. Черненко (1929); И.П. Черняев (1938) и многие другие ученые – селекционеры уделяли и продолжают уделять большое внимание изучению самоплодности плодовых культур. В селекции, как отмечают академик Е. Н. Седов и соавторы в книге Селекция яблони (1989), «использование сортов, склонных к самоплодности, открывает перспективу создания новых самоплодных сортов, внедрение которых в производство позволило бы получать стабильные урожаи плодов по годам, меньше зависящие от неблагоприятных погодных условий в период цветения» (Седов, Жданов, 1989).

1.2 Анализ факторов и причин несовместимости сортов яблони при Для большинства покрытосеменных, к которым относится и яблоня, характерны определенные механизмы, препятствующие самоопылению.

Наиболее распространенными приспособлениями, препятствующими самоплодности являются: геркогамия - при которой, благодаря взаимному положению рылец и пыльников, опыление собственной пыльцой в цветке оказывается невозможным; дихогамия - неодновременное созревание андроцея и генецея; самонесовместимость на стадиях роста пыльцевых трубок в пестиках (прогамная несовместимость) или слияния ядер пыльцевой трубки и яйцеклетки.

1.2.1 Генетический контроль несовместимости при опылении Внутривидовая самонесовместимость важнейшее свойство эффективную рекомбинацию генов в популяции (Алексеенко, 2001).

В научной литературе внутривидовая самонесовместимость впервые упоминается в трудах немецкого ботаника И. Кельрейтера. Исследования Ч.

Дарвина (Дарвин, 1939) изучавшего механизмы препятствующие самоопылению, а также работы основоположника генетики Г. Менделя, положили начало изучению самонесовместимости в растительном мире. В дальнейшем этому явлению уделяли внимание многие исследователи, однако причины самонесовместимости цветковых растений до сих пор изучены недостаточно.

перекрестноопыляемой культуры, характеризуются резко выраженной самобесплодностью, т.е. неспособностью к самооплодотворению. Пыльца таких форм растений, попав на рыльце пестика собственного цветка или на рыльца пестиков цветков того же растения, чаще всего прорастает, но вскоре самооплодотворению вследствие подавления роста собственных пыльцевых трубок в тканях пестиков, называют самонесовместимыми (Малецкий, 1996).

самонесовместимость, которая характеризуется однородностью популяции в отношении морфологических признаков цветка и наличием генетической системы, контролирующей прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок в тканях пестика таким образом, что пыльца сорта - перекрёстноопылителя получает преимущество при оплодотворении по сравнению с собственной (Алексеенко, 2001).

Этот механизм связан с существованием гена самонесовместимости (Sгена), совпадение аллелей которого в пестике и пыльце приводит к подавлению роста последней (Алексеенко, 2001). Таким образом, физиологобиохимические процессы у цветковых растений обусловленные как самонесовместимостью, так и межвидовой несовместимостью, контролируют процесс оплодотворения таким образом, что в популяции происходят только “полезные” скрещивания» (Алексеенко, 2001).

Однако существуют сорта яблони у которых завязывание плодов происходит от опыления собственной пыльцой, т. е. пыльцой того же сорта.

Их называют самоплодными, т.е. самоопыляемыми. По многочисленным литературным и нашим данным самоплодные и склонные к самоплодности сорта обычно хуже завязывают плоды от самоопыления по сравнению со свободным опылением. Эти факты, вероятно, обусловлены явлением инбредной депрессии.

«В процессе индивидуальной жизни растения и на протяжении поколений время от времени происходят мутации - изменения генов.

Большая часть мутаций - вредные, и если бы они немедленно проявлялись, то приводили бы к смерти (летальные мутации), уродствам, несоответствиям окружающей среде, и т.п. Однако большая часть мутаций в то же время имеет рецессивный характер, т.е. в комбинации с нормальным парным геном, благодаря двойному набору генов, не проявляется в гетерозиготном состоянии. Груз таких вредных, но не проявляемых, скрытых мутаций имеется у каждого гетерозиготного организма. Самоопыление растений является вариантом близкородственного скрещивания, т.е. инбридинга.

Инбридинг создает гомозиготность, в том числе и гомозиготность по вредным генам, и, следовательно, ведет к их фенотипическому проявлению в потомстве - гибели, уродствам, пониженной жизнеспособности и т.п. Это явление называется инбредной депрессией» (Инбридинг - Pro Et Contra).

Накопление летальных и полулетальных рецессивных генов при самоопылении неизбежно сказывается на потомстве, для которого характерно резкое ослабление и появление ряда нежизнеспособных растений (Малецкий, 1969; Скупова, 1971; Шумный, 2004).

1.2.2 Сведения о возможных способах преодоления самонесовместимости Генетически самонесовместимость представляет собой сложную физиологическую систему с полигенным контролем, поэтому данные о нарушениях в её функционировании имеют важное значение (Алексеенко, 2001).

Имеются сведения (Суриков, 1991), что мутации S-локусе могут восстанавливать фертильность гаметофита. Частота таких мутаций невелика, однако их закрепление существенно поддерживается отбором, который происходит в пестиках самонесовместимых растений на фоне обычной (несовместимой) пыльцы (Алексеенко, 2001).

Иногда у самонесовместимых видов происходит полиплоидизация, а полиплоидные растения и их пыльца с 3-х кратным и более хромосомным набором часто характеризуются способностью к самосовместимости (Суриков, 1991). Триплоидные сорта яблони по сравнению с диплоидными характеризуются большей самоплодностью (Haskell, 1955). Природные полиплойдные формы яблони с повышенной самоплодностью выявил Понаморенко В.В (1985). Высокая склонность к самоплодности показана у тетраплоидных форм яблони (Руденко, 1956; 1985).

Селекционную работу по созданию полиплоидных форм яблони, обеспечивающих хорошее завязывание плодов при любых погодных условиях, проводят во ВНИИСПК (г. Орел.) академик Е.Н. Седов и доктор сельскохозяйственных наук Г.А. Седышева (Седов, Седышева, 1985;

Седышева, Седов, 1994; 2003).

Имеются данные о преодолении самонесовместимости с помощью температурных воздействий на генеративные структуры цветков. Так, положительное влияние низких температур на самосовместимость отмечали Д. Льюис и Н. Я. Вайсман (Lewis, 1952; Вайсман, 1984; цит. по Алексеенко, 2001). Ряд авторов (Bali, 1964; Kendall, Taylor, 1969; Leffel, 1970; Matsubara, самонесовместимость прогревом пестиков либо зрелой пыльцы до 40-60 0С (Алексеенко, 2001).

Уменьшение самонесовместимости у капусты Brassicaoleracea L.

добивались путем повышения концентрации углекислого газа в теплице до 2Крючков, Крашенинник, Осько, 1989). Т. Виссер и Е. А. Ост (Visser, Oost, 1982; цит. по Алексеенко, 2001) обнаружили у Pyrus communis исчезновение фактора, вызывающего отторжение своей пыльцы, при обработке её - лучами, причём жизнеспособность такой пыльцы сохранялась (Алексеенко, 2001).

Е.М. Ист и А. Дж. Мангельсдорф (East, Mangelsdorf, 1925; цит. по Алексеенко, 2001) показали, что опыление цветков в фазе бутонизации приводит к успешному опылению пыльцой, собранной со зрелых цветков того же растения. Этот приём широко используется в генетике и селекции для получения инбредного потомства (Алексеенко, 2001).

Одним из способов преодоления самонесовместимости является нанесение на рыльце пестика, исследуемого сорта растения, веществ из пыльцы, пестиков или тканей вегетативных органов совместимых растений (Алексеенко, 2001).

1.2.3 Не способность сортов яблони к самоопылению в связи с морфологическими особенностями цветка По мнению Н.Г. Широковой, самонесовместимость и структурные особенности цветка - составляют эволюционно стабильную систему, которая поддерживает гетерозиготность в популяции. Оба эти уровня контролируются разными генетическими системами, эволюционировавшими независимо и затем совместившимися (Широкова, 2003).

Ученые, уделяющие внимание взаимосвязи между различными факторами, определяющими самостерильность у цветковых растений, (Шумный, и др., 1978; Шумный, 2004; Вишнякова, 1994) отмечают, что сочетание самонесовместимости с другими свойствами имеет глубокий эволюционный смысл.

Имеются литературные сведения (Вишнякова, 1987; Суриков, 1991), что наиболее самонесовместимыми сортами яблони, являются сорта, у которых длина столбиков пестиков превышает длину тычинок (лонгистилия).

М.А. Вишнякова и И.М. Суриков, объясняя этот факт, выдвигают гипотезу о том, что структура гена самонесовместимости, весьма сложна и помимо самонесовместимости, может включать также субъединицы, регулирующие длину столбиков и других элементов цветка. Было найдено (Lewis, 1952), что у гречихи имеется суперген, состоящий из шести субъединиц, ответственных за длину столбика, размер пыльцы, реакцию самонесовместимости, высоту тычинок и др. По мнению И.М. Сурикова (1991), мультиаллельный S-ген видов, полиморфных по длине столбиков, и диаллельный суперген гетеростильных видов, подобных гречихе, филогенетически связаны.

В то же время у некоторых видов связь между строением цветка и самонесовместимостью не выявлена. Так, согласно исследованиям (Правдюк, Седов, 1982), по установлению связи между завязыванием плодов от естественного самоопыления яблони и отношением длины тычинок к длине пестиков, показано, что даже при благоприятном их соотношении, плоды у этих гибридов не завязались. В связи с чем сделан вывод, что отбор самоплодных гибридов по завязыванию плодов при самоопылении, не может быть заменен отбором по морфологическому строению цветка.

Сходного мнения придерживаются и ряд других исследователей (Коваленко, Лаптев, Сметанин, 1983). Так, опыты на эспарцете показали, что у растений, обладающих одинаковой степенью лонгистилии, степень самофертильности, связанная с нарушениями самонесовместимости, может быть различной.

1.2.4 Биохимическая природа несовместимости при опылении Любые свойства живых организмов, в том числе и способность цветковых растений не допускать самоопыления, имеют под собой биохимическую основу. Известный исследователь роли фенольных веществ, содержащихся в элементах генеративной сферы кукурузы, С.И. Пашкарь (1974) отмечал «Какими бы углубленными теоретическими вопросами не селекционерами и генетиками, перед ними всегда вставал вопрос о возможности биохимической диагностики (прогнозирования) того или иного биологического явления, лежащего в основе селекционного метода».

Биохимические основы самонесовместимости при опылении могут проявляться на следующих стадиях: 1) взаимодействии пыльцы и рыльца; 2) росте пыльцевой трубки по направлению к яйцеклетке; 3) слиянии ядер (Linskens, 1967). Наиболее часто проявляется вторая стадия.

Природа и роль химических взаимодействий между пыльцевым зерном и поверхностью рыльца изучены только частично. Ряд авторов считает, что в основе этих взаимодействий лежат несколько причин (Шапиро, 1929;

Поддубная-Арнольди, 1964; Пашкарь, 1965; Банникова, Хведынич, 1982;

Кушнарев, 2009). Было показано, что секреты рыльца могут оказывать не только положительное, но и отрицательное влияния на процесс прорастания пыльцы. Отрицательное влияние проявляется как при самонесовместимых комбинациях, так и в комбинациях с чужой несовместимой пыльцой (HeslopHarrison, 1975). По наблюдениям Нокса (Нокс, 1985), у некоторых растений взаимодействие пыльца - рыльце зависит от химических реакций между «веществами узнавания» и веществами, образующими химические преграды, которые разрушаются ферментами, выделяемыми пыльцевыми зернами партнера при взаимодействии (у Brassica). Этот последний механизм объясняют тем, что механическое, электрическое или ферментативное воздействия на рыльце устраняют химические преграды и, таким образом, обеспечивают свободный путь для других типов пыльцы, несовместимых в обычных условиях.

Однако результаты, полученные при изучении роли поверхности рыльца, весьма противоречивы. Хеслоп-Харрисоны (Heslop-Harrison 1971;

Heslop-Harrison, 1975) показали, что у Caryophyllaceae белковоподобная оболочка сосочков рыльца играет определенную роль в активации фермента, необходимого для проникновения пыльцевой трубки. После удаления оболочки сосочков пыльцевые зерна прорастают, но пыльцевые трубки расти дальше не могут.

Вместе с тем у Camellia sasanqua после обработки рылец пестиков холодным ацетоном был вызван усиленный рост пыльцевых трубок (Iwanami, 1973), а Мартин (Martin, Mason, Forde, 1969) обнаружил, что так называемая стигматическая жидкость содержит очень мало углеводов и значительно больше липидов и фенолов. Последние могут действовать как ингибиторы и для их инактивации необходимы ферменты.

О существовании химического барьера можно судить и по таким фактам, как, например, «опыление в бутонах» или опыление в конце периода цветения. Некоторые необъяснимые пока эффекты обильного опыления несовместимой пыльцой могут быть также обусловлены химическим взаимодействием между пыльцой и рыльцем.

Высказывались предположения о том, что обильное опыление несовместимой пыльцой, своей собственной или пыльцой других видов, может, по-видимому, обладать и чисто механическим эффектом:

несовместимая пыльца занимает все воспринимающие участки на поверхности рыльца. Однако химические воздействия (несовместимая пыльца вызывает отрицательный эффект узнавания, блокирующий восприимчивость сосочков рыльца), вероятно, являются наиболее важными и сохраняются в течение некоторого времени после попадания несовместимой пыльцы, тем самым также предотвращая прорастание пыльцы, которая в другом случае была бы совместимой (Широкова, 2003).

Однако, даже если пыльцевые зерна успешно проросли, рост пыльцевых трубок может быть настолько замедленным, что оплодотворения не происходит до завядания цветка (Линскенс, Крох, 1970). При этом неподходящими могут быть не только скорость, но и направление:

несовместимые пыльцевые трубки теряют ориентацию и никогда не достигают семязачатка (Чеботарь, 1965; Цингер, Петровская - Баранова, 1967; Френкель, Галун, 1982). В связи с этим ученые обратили внимание на биохимические особенности составных частей пестиков, не только рылец, но и стилодиев и столбиков (Бритиков, Лащеникова, Виссарионова, 1955;

Поддубная-Арнольди, 1982). Однако биохимическая природа этих структур у плодовых культур, в том числе и яблони, изучена еще далеко не полно (Бритиков, 1952; Cамородова-Бианки, 1961; Басина, 1969 [а]; Острейко, Булатова, Дрожжачих, 1972; Острейко, 1988; Brazy, Dennis, 1978; Палфитов, 2003; Козлов, 2012 [а]).

Есть основания считать, что важным биохимическим фактором, регулирующим опылительные процессы у плодовых культур, являются флавоноиды, содержащиеся в их репродуктивных структурах - пыльце и пестиках.

Флавоноиды - это крупнейший класс растительных полифенолов.

Название флавоноиды означает - желтые вещества цветков растений.

Впервые такие желтые вещества были выделены в 1919 году из пыльцы амброзии (Heyl, 1919), злостного сорняка в агрокультурном производстве.

Впоследствии было установлено, что пыльца любых цветковых растений содержит в себе характерный для вида растения флавоноидный состав (Wiermann, 1973). Далее выяснили, что любые клетки растений содержат, характерный для вида растения флавоноид. Так, для всех клеток яблони, кроме клеток пыльцы, характерно содержание халкона-флоризина (Cарапуу, 1971).

С химической точки зрения, флавоноиды представляют собой гидроксипроизводные флавона (собственно флавоноиды); 2,3дигидрофлавона (флаваноны); изофлавона (изофлавоноиды;, 4фенилкумарина (неофлавоноиды;, а также флавоны с восстановленной карбонильной группой (флаванолы). К флавоноидам относят и другие соединения С6-С3-С6 ряда, в которых имеются два бензольных ядра, соединенных друг с другом трехуглеродным фрагментом — халконы, дигидрохалконы и ауроны (Запрометов, 1971).

Флавоноиды играют важную роль в растительном метаболизме и очень широко распространены в высших растениях. Многие флавоноиды придают разнообразную окраску растительным тканям. Так, антоцианы определяют красную, синюю, фиолетовую окраску цветков и плодов (Сорокопудов и др., 2005; Шапошник, Дейнека, Сорокопудов и др., 2011), а флавоны, флавонолы, ауроны, халконы - жёлтую и оранжевую.

Однако функции флавоноидов в организме растений изучены мало.

Предполагается, что они защищают растительные ткани от избыточной солнечной радиации, так как хорошо поглощают ультрафиолетовое излучение. Окраска цветочных лепестков помогает насекомым находить нужные растения и тем самым способствовать опылению. Флавоноиды обладают фунгицидной активностью, придавая устойчивость растениям к поражению некоторыми патогенными грибами.

Особая волна интереса к флавоноидам началась в 1990-х годах. Она млекопитающих флавоноиды способны изменять активность многих ферментов обмена веществ. Но животные не способны синтезировать соединения флавоноидной группы. Поэтому считается, что флавоноиды (наряду с другими растительными фенолами) являются незаменимыми компонентами пищи человека и других млекопитающих.

рассматривается с 1950 года (Moewus, 1950). Значение флавоноидов в опылительных процессах плодовых культур, в частности, яблони впервые исследовано в работах (Палфитов, 2003; Козлов, 2012 [б]).

компонентой пыльцы растений. Так исследованием 132-х видов растений (Wiermann, 1973) установлено, что в пыльце всех исследованных видов из распространенных в растительном мире флавоноидов в основном содержатся флавонолы, такие, как кверцетин, кемпферол и изорамнетин (рис.1).

Различные группы растений или их отдельные виды характеризуются присутствием в пыльце определенного флавоноида или определенным флавоноидным составом. Показано, что пыльца семейства Rosaceae, к которому принадлежит яблоня, из флавонолов в большей мере содержит изорамнетин.

Рис.1- Структурная формула молекул флавонолов В.Ф. Палфитов (2003), исследуя пыльцу различных сортов яблони, установил, что сорта яблони могут существенно отличаться друг от друга по количественному содержанию водорастворимых веществ в пыльце. При этом было обнаружено, что пыльца сортов, склонных к самоплодности, по самобесплодных сортов в среднем на 30%, а в отдельных случаях это превосходство может быть в 1,5-1,8 раза. На основании наблюдений и литературных сведений было сделано заключение, что основными веществами, водных экстрактов пыльцы яблони являются производные никотиновой кислоты и флавонола – изорамнетина. Это заключение сделано на основании того что из водных экстрактов пыльцы яблони методом колоночной хроматографии на анионите АВ-16 ГС были выделены вещества, которые обладают спектрами поглощения ультрафиолетового излучения флавонолов. Преобладающим является содержание флавонолов, так как УФспектры водных экстрактов пыльцы всех исследованных сортов имели максимум поглощения при 270 нм., т.е. также как у флавонолов (например, у рутина). Максимум поглощения в УФ-спектрах водных растворов никотиновой кислоты находится в близи 260 нм.

Флавонолы, придают пыльце светло-жёлтый или жёлтый цвет.

Это самые окисленные соединения в ряду флавоноидов. Они мало стабильны в присутствии кислорода (Шапиро, Анихановская, Нарижная, 1982). Флавоноиды пыльцы растений способны оказывать существенное влияние на рост пыльцевых трубок. Они способны образовывать полигидроксилированные и полиметаксилированные соединения. Это свойство флавонолов является важным для пыльцы при формировании ею пыльцевых трубок (Минаева и др., 1967). Для биологического функционирования пыльцы существенным является также свойство флавонолов активировать окисление наиболее восстановленных флавоноидов, таких как глюкозид дигидрохалкона флоретина – флоризин.

Продукты окисления флоризина способны самопроизвольно и быстро поликонденсироваться в полимерную пленку (Сарапуу, 1971; Мийдла, 1972).

Способность флоризина при окислении образовывать полимерные пленки позволяет предположить, что при прорастании пыльцы в пестиках яблони он расходуется на образование оболочек пыльцевых трубок, чем и способствует их росту (Палфитов, 2003). Но по данным Сарапуу (1964, 1971), флоризин окисляется и полимеризуется только тогда, если в системе на одну молекулу флоризина приходится одна молекула флавонола. Видимо поэтому, для успешного своего прорастания пыльца должна содержать много флавонолов.

В работе (Козлов, 2012 [б]) показано, что содержание флавонолов в пыльце является сортовым признаком яблони и с ростом содержания флавонолов в пыльце её жизнеспособность и жизнедеятельность усиливаются, а перекрёстноопылительные свойства сорта увеличиваются. Однако конкретных исследований, показывающих зависимость самоопыляемости сорта яблони от содержания флавонолов в пыльце, в литературе мы не обнаружили.

1.2.4.2 Биохимические особенности пестиков цветков яблони Причины, вызывающие рост пыльцевых трубок в направлении завязи, плодовых культур до сих пор еще полностью не раскрыты. Хотя многие авторы давно пришли к выводам, что направление прорастания пыльцы и рост пыльцевых трубок определяются химической природой ткани потреблением веществ столбика, но что это за вещества полной ясности еще нет (Кобель, 1934; Голубинский, 1982; Банникова, Хведынич, 1985). Нет однозначной ясности также в том, какие вещества в пестиках вызывают замедление или полную остановку прорастания пыльцевых трубок в тканях столбиков, вызывая прогамную несовместимость в процессе оплодотворения яблони (Кобель, 1934). Тем не менее, в науке происходит процесс постепенного накопления знаний об особенностях оплодотворения растений и их репродуктивных структур.

Исследуя, характер и причины самонесовместимости сортов яблони ряд авторов нашли, что на рост пыльцевых трубок оказывает существенное влияние физиологически активные фенольные вещества пестиков цветков (Милованова, Кондратьев, Журавель, 1974; Острейко, 1988). Было показано, что в пестике яблони содержится значительное количество таких фенольных веществ, как хлорогеновая кислота (0,1%) и флоризин (1%). Роль фенольных соединений и их метаболизм в жизнедеятельности растений подробно изучались М.Н. Запрометовым (Запрометов, 1971) и его школой.

В.Т. Минаева (1970) на основании проведенных ею опытов над володушкой предположила, что флавоноидные вещества гинецея (пестика) используются на построение оболочки пыльцевых трубок при их росте. Этот вывод согласуется и с другими литературными сведениями о возможной роли полифенолов в формировании оболочки пыльцевой трубки (Labraca, Loewus 1973).

Изучая прорастание пыльцевых трубок в пестиках 30 видов растений, в том числе и яблони, авторы (Бритиков, 1954; Бритиков, Мусатова, 1964) показали, что рыльца пестиков имеют повышенную кислотность, которая снижается в направлении к семяпочкам, в то время как содержание азота в основаниях пестиков больше, чем в вершинах. На основании этого был (физиологическая) неравномерность является причиной хемотропизма, т.е.

роста пыльцевых трубок в направлении к завязи.

Х. Пашеко (Pacheco, 1957), в своих работах отмечал способность различных фенольных соединений, содержащихся в гинецее крестоцветных, как стимулировать, так и подавлять процесс опыления.

В.Ф. Палфитов (2003) выявил, что они в значительных количествах (от 4 до 30% от сухой массы) содержат флавоноид – флоризин, отличающийся от флавонолов пыльцы меньшей окисленностью (рис.2).

количественное содержание флоризина в пестиках яблони является сортовой особенностью, например, сорта склонные к самоплодности в основаниях столбиков содержат флоризина в 1,5-2,0 раза меньше чем самобесплодные.

При этом показано, что флоризин в пестиках распределен не равномерно, а градиентно, т.е. «его содержание увеличивается от рылец к основанию завязи согласно закономерности, соответствующей следующему математическому Сx – процентное содержание флоризина в тканях столбика на высоте x от их основания, %;

h – полная высота столбиков, мм;

x – высота точки от основания столбиков, в которой в их ткани флоризина, мм;

Со – содержание флоризина в основаниях столбиков, %;

Ср – содержание флоризина в рыльцах столбиков, %.

Для определения содержания флоризина на поверхности рылец (Ср) и основаниях столбиков на границе их с завязью (Со), необходимо построение графиков распределения флоризина по высоте столбиков.

Проекция верхней точки графика на ось концентрации флоризина в ткани столбиков (С%) соответствует содержанию флоризина в рыльцах пестиков (Ср). Точка пересечения графика с осью С % соответствует содержанию флоризина в основании столбиков (Со).

При сопоставлении самоплодных и самобесплодных сортов яблони рыльцах их пестиков не наблюдается» В.Ф. Палфитов (2003). Далее отмечается, что сорта яблони известные как склонные к самоплодности (Народное, Мелба, Пепин шафранный, Зоренька, Уэлси, Северный синап) отличаются от самобесплодных сортов (Папировка, Боровинка, Коричное самоплодных, 14 – 20 % от сухой массы ткани. Поэтому при диагностике (Палфитов, 2003).

Самоплодные и самобесплодные сорта различиаются между собой и по содержанию флоризина в среднем на единицу массы целых, не поделенных на части столбиков. При этом суммарное содержание флоризина в целых (не поделенных на части) пестиках самобесплодных сортов яблони, по данным В.Ф. Палфитова, выше чем у сортов, склонных к самоплодности, на 7-10%.

Зрелые цветки разных сортов яблони, могут отличаться по длине столбиков пестиков. Отмечено (Палфитов, 2003), что короткие столбики характеризуются более высоким содержанием флоризина. Например, сорт Бессемянка мичуринская имеет пестики длиной 4-5 мм, а содержание флоризина в их основании около 30% вес. «В столбиках с бльшим содержанием флоризина при их опылении следует ожидать худшего прорастания пыльцевых трубок. Следовательно и цветки с такими столбиками будут хуже завязывать плоды. Поэтому при определении особенностей распределения флоризина в пестиках конкретного сорта яблони необходимо учитывать разнокачественность столбиков по их высоте (по длине). При характеристике сорта для анализа следует выбирать столбики по длине такие, которые присутствуют у растений данного сорта в наибольшем количестве» (Палфитов, 2003).

Н.Е. Козлов (2012 [б]) выяснил, что с увеличением содержания флоризина в пестиках яблони перекрестная плодовитость сортов снижается.

В дальнейшем, представляет интерес изучение зависимости самоопыляемости тех же сортов яблони от содержания флоризина в столбиках пестиков.

1.2.4.3 Совместное влияние эндогенных факторов пыльцы и пестиков В исследовании (Палфитов, 2003), на примере анализа репродуктивных структур 12 сортов, показано, что сорта яблони, склонные к самоплодности, отличаются бльшим содержанием водорастворимых веществ в пыльце и меньшим содержанием флавоноида флоризина в пестиках. В число исследуемых сортов яблони входили сорта селекции И.В. Мичурина и его учеников, а также народной и зарубежной селекции. Совместное влияние количественного содержания флавонолов в пыльце и флоризина в пестиках на перекрестную плодовитость сортов яблони показал в своём исследовании плодовитость прямопропорционально возрастает с увеличением содержания флавонолов в пыльце сорта опылителя и обратнопропорционально уменьшается с увеличением содержания флоризина в столбиках пестиков опыляемого сорта.

Зависимость самоопыляемости сорта от совместного количественного содержания флавонолов в пыльце и флоризина в пестиках до настоящего времени ещё ни кем не рассматривалась.

ограничивающих самоопыляемость сортов яблони, и для совершенствования инструментальное исследование роли биохимических и физиологических особенностей репродуктивных структур в завязывании плодов, сортами яблони современной селекции, используемых в ареале садоводства в настоящее время, с одновременным проведением полевых опытов по самоопылению подопытных деревьев яблони и лабораторных опытов по Дополнительно к этому необходимо сопоставить перекрестную плодовитость сортов яблони с различной степенью самоплодности, упростить методику количественного определения флавонолов пыльцы. Особый интерес вызывает поиск способа преодоления самонесовместимости у сортов яблони на основе внекорневых подкормок растений азот и бор содержащими препаратами. Стремление выполнить такой план исследований явилось основой для выполнения данной диссертационной работы.

Глава 2 Цель, задачи, объекты, методы и условия Цель наших исследований – диагностика самоопыляемости сортов яблони по биохимическим маркерам их пыльцы и пестиков.

Программа исследований включала решение следующих основных задач:

1. определить в пыльце, изученных сортов яблони, содержание водорастворимых веществ и флавонолов, выяснить степень влияния их на способность к самоопылению;

2. изучить зависимость жизнеспособности пыльцы от содержания в ней ВРВ и флавонолов, путем проращивания её на искусственной питательной среде.

3. определить количественное содержание флоризина в тканях пестиков, исследуемых сортов и выяснить степень его влияния на склонность сортов яблони к самоопыляемости;

4. провести полевые опыты по изучению завязываемости плодов исследуемыми сортами при искусственном самоопылении и естественном опылении;

5. исследовать характер прорастания пыльцевых трубок в тканях пестиков, контрастных по склонности к самоопыляемости сортов яблони, методом люминесцентной микроскопии;

7. выявить роль соотношения флавонолов в пыльце и флоризина пестиков в проявлении склонности сортов яблони к самоопыляемости;

флавоноидов в генеративных структурах цветков и завязываемость плодов сортами яблони от самоопыления.

9. сопоставить самоплодность и перекрестную плодовитость изученных сортов яблони 10. усовершенствовать и упростить количественное определение содержания водорастворимых веществ (ВРВ) и флавонолов в пыльце растений.

Объектами исследований являлись цветки сортов яблони: Зеленый май, Мартовское, Лобо, Спартан, Орлик, Синап орловский, Антоновка обыкновенная, Бессемянка мичуринская, Мелба, Уэлси, обладающие различной склонностью к самоплодности. Деревья этих сортов были привиты производственных насаждениях Всероссийского научно-исследовательского института генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина (ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина), заложенных в 2001 г. со схемой посадки 6х4.

Исследования включали в себя полевые опыты по опылению и лабораторный анализ генеративных тканей сортов яблони. Полевые опыты по опылению, отбор цветков, заготовка пыльцы и пестиков, как объектов изучения, проводились в соответствии с общепринятой «Программой и методикой сортоизучения плодовых, ягодных и орехоплодных культур»

(Орел, 1999).

Организация получения экспериментальных данных и последующая их математическая обработка выполнялась согласно методикам Б.А. Доспехова (1985).

усовершенствованным нами весовым способом с применением стеклянных фильтров (Молодцов, Козлов, Палфитов, 2011).

Количественное определение флавоноидов в пестиках и пыльце проводилось на основании способности растворов флавонолов поглощать УФ-излучение при 270 нм. и способности флоризина поглощать УФ при нм по методикам, описанным в (Палфитов, 2003). Нами была разработана оригинальная методика количественного определения флавонолов пыльцы на фотоколориметре (Молодцов, Гречушкин, Палфитов, 2012). Её детали изложены в последующем тексте данной работы. Флуоресцентная микроскопия пыльцевых трубок в пестиках и заготовка образцов для нее выполнялась по методике А.И. Литвак (1978).

Исследования проводились с осени 2010 г. по 2013 год в лаборатории кафедры химии Мичуринского государственного аграрного университета.

Использовались так же возможности лаборатории цитологии ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина. Полевые опыты по вариантам опыления были проведены в садах ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина.

эксикаторах; аналитические весы ВЛР-20; лабораторная медицинская центрифуга ОПн-8, для осаждения взвесей в растворах; спектрофотометр СФ-26 и фотоколориметр ФЭК-56М, для измерения оптической плотности целевых растворов; люминесцентный микроскоп OPTON IM 35, для изучения прорастания пыльцевых трубок в пестиках.

Исследования проводились с осени 2009 г. по 2012 год в садах государственного аграрного университета. Использовались так же возможности лаборатории цитологии ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина.

ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина, произраставших в равнозначных агроклиматических условиях. Агротехнические приемы возделывания изучаемых сортов яблони являлись общепринятыми для средней зоны плодоводства. Почвы под садами характеризуются как выщелоченные черноземы средней мощности, по механическому составу тяжело суглинистые с благоприятным для садоводства физическими свойствами.

Полевая влагоемкость их около33-34%, грунтовые воды залегают на 2,5- метра, перегнойный горизонт составляет 50-70 см. Содержание гумуса в почвах 4,5%, pH солевой вытяжки верхних горизонтов слабокислое (5-6). По содержанию доступных элементов питания почвы относят к среднеобеспеченным (азот – 4,3 мг., фосфор – 7-10 мг., калий – 17-18 мг на 100 г почвы), (Палфитов, 2003).

Почва в садах содержится под черным паром. Раз в три года в садах проводят омолаживающую обрезку. При борьбе с вредителями и болезнями проводят пятикратное опрыскивание за сезон.

Климатические условия Мичуринского района Тамбовской области умеренно-континентальные с неустойчивым увлажнением. По данным Мичуринской метеостанции среднегодовая температура воздуха составляет 6-11 °С. Относительная влажность воздуха колеблется около %. Сумма активных температур (выше 10 °С) равна 2500-2600 °С. В году около 150 дней с активными температурами. Годовая сумма осадков составляет 400 -700 мм. Выпадение их неравномерно, как в течении года, так и по годам.

Резкие колебания температур воздуха, его влажности и суммы осадков за годы исследований могли оказать влияние на формирование генеративных и вегетативных структур, приводящие к особенностям в биохимическом составе исследуемых объектов, которые не всегда могут быть учтены при интерпретации результатов исследований.

Таблица 1 – Среднесуточная температура воздуха по месяцам за 2010гг.

I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII

Таблица 2 – Средняя относительная влажность воздуха (%) по месяцам Годы

I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII

Таблица 3 – Количество осадков по месяцам (мм) за 2010-2012 гг.

Годы

I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII

Как видно из таблиц, погодные условия по годам исследования различаются существенно. Зима 2009-2010 гг. характеризовалась необычно низкими температурами, что сказалось на дифференциации и состоянии генеративных почек, и как следствие низким числом цветков на деревьях.

Однако, на изучаемых особенностях генеративных тканей цветков яблони зимний холод существенно не отразился, и на результатах проведенных целевых опытов практически не сказался. Весенние условия по годам исследования для завязывания плодов яблонею были благоприятными.

Глава 3. Сопоставление исследованных сортов яблони по физиологобиохимическим особенностям репродуктивных структур цветков 3.1 Характеристика пыльцы, исследованных сортов яблони В работах (Палфитов, 2001; 2003; Ермачкова, Козлов, 2009), в том числе и с нашим участием (Молодцов, Козлов, 2012; Молодцов, Палфитов, 2012; Молодцов, Палфитов, 2013), было показано, что самоплодность и перекрестная плодовитость сортов яблони в сильной мере зависит от содержания в их репродуктивных структурах экстрагирующихся водой веществ. При этом важно чтобы экстрагирующиеся вещества не удалялись от пыльцевых зерен, а находились бы в той же среде в которой прорастает пыльцевая трубка.

продолжительных моросящих дождей, лишённые этих веществ не прорастают не только на искусственных питательных средах, но и на рыльцах пестиков (Branscheidt, 1930; Якушкина, 1947; Голубинский, 1974). Пыльца тем лучше прорастает, чем больше в питательную среду из неё диффундирует Выделяющиеся из пыльцевых зерен перед их прорастанием в пестиках водорастворимые вещества, связывают с реакциями распознавания между пестиком и пыльцевыми зернами (Нокс, 1985).

В последние годы было обнаружено, что сорта яблони, склонные к самоплодности, имеют повышенное содержание водорастворимых веществ в пыльце (Палфитов, 2003). Им было показано, что по соотношению водорастворимых веществ пыльцы, в состав которых входят флавонолы и флоризин в пестиках, различных сортов яблони можно судить и о степени самоплодности сорта.

Водные экстракты из пыльцы растений представляют собой сложный комплекс смеси физиологически активных веществ (Голубинский, 1974), в состав которого входят флавонолы – гликозиды (Heyl, 1919; Гусева, Нестюк, 1953; Дерюгина, Максютина, Кривенчук, 1968; Harborn, Williams, Greenham, 1974). Они определяют активность ферментных систем, в том числе и активность содержащихся в пыльце ферментов, расщепляющих флавоноиды содержания ВРВ в пыльце может зависеть жизнеспособность пыльцы и уровень завязываемости плодов (Палфитов, 2003).

В связи с выше изложенным, важно уметь точно определять содержание ВРВ, т.е. необходимо применять аналитически надежный и технически удобный способ определения водорастворимых веществ пыльцы.

3.1.1.Определение в пыльце процентного содержания водорастворимых веществ весовым методом с помощью стеклянных водорастворимых веществ складывается из двух этапов:

1. Предварительная заготовка цветков яблони (аналогично проводится заготовка цветков и при анализе пыльцы на флавонолы) 2. Лабораторный анализ Во время цветения яблони, в фазу розового бутона собирали по 200± цветков исследуемых сортов, для последующего лабораторного анализа. Для усреднения пробы и минимизации физиологической разнокачественности цветков отбор их производили с разных сторон кроны, с нескольких деревьев, одного сорта. Из цветков выбирали пыльники на лист гладкой бумаги, и подсушивали их при комнатной температуре, в затененном месте, до полного отделения от пыльников пыльцевых зёрен (1 - 2 дня). Затем бумагу с пыльцой сворачивали в пакетики, взвешивали их с точностью до десятых долей миллиграмма и помещали над хлористым кальцием в эксикатор. После выдерживания в эксикаторе не менее суток пакетики снова взвешивали и снова помещали выдерживаться в эксикатор. Если после второго взвешивания вес не изменился, то считали, что пыльца готова к исследованию. В противном случае пыльцу снова выдерживали над хлористым кальцием до постоянного веса. Перед непосредственным исследованием пыльцевые зёрна отделяли от пыльников с помощью мелкого металлического сита.

В первых работах по определению экстрактивных веществ в генеративных структурах цветков яблони водорастворимые вещества пыльцы определялись двумя способами: а) измерением их оптической плотности, т.е. объёмным фотометрическим методом (Палфитов, 2003), а также б) весовым методом, с применением бумажных фильтров (Ермачкова, Палфитов, 2008). Но они имеют ряд недостатков.

а) Фотометрический метод требует предварительной калибровки применяемого спектрофотометра по растворам водорастворимых веществ с известной концентрацией. Чтобы приготовить такие растворы нужно иметь экстрактивные вещества пыльцы в чистом сухом виде. Получение таких веществ является весьма трудно выполнимой задачей.

Таблица 4 - Оптическая плотность водных растворов веществ пыльцы разных сортов яблони при одинаковых концентрациях Черненко синап Кроме этого растворы водорастворимых веществ пыльцы разных сортов яблони, но одинаковой концентрации, имеют значительные различия по оптической плотности (см. табл.4). Оптическая плотность водных флавонолами. Следовательно, экстракты пыльцы разных сортов яблони содержат в разных пропорциях флавонолы и сопутствующие им вещества, обладающие массой, но не поглощающие ультрафиолет при = 240-300 нм.

В противном случае зависимость оптической плотности (D) от концентрации ВРВ пыльцы для разных сортов яблони должна быть одинаковой. Из этого следует, что водорастворимые вещества пыльцы нельзя использовать в качестве калибровочных, ни для определения всей суммы водорастворимых веществ, ни для количественного определения флавонолов, т.к. это неизбежно приведет к ошибкам определения их содержания в пыльце.

б) Недостатком определения ВРВ пыльцы весовым методом с применением бумажных фильтров является сложность определения точного веса фильтров. Сухие фильтры быстро впитывают атмосферную влагу, а при их высушивании много времени тратится на достижение постоянного веса.

Таких недостатков лишены стеклянные фильтры. Их применение позволяет в 2-3 раза сократить время определения водорастворимых веществ (ВРВ) в пыльце растений, за счет уменьшения времени на высушивание и получение стабильного веса фильтров. Поэтому определение водорастворимых веществ пыльцы мы проводили весовым способом, с применением стеклянных (Молодцов, Козлов, Палфитов, 2011) фильтров.

Для анализа водорастворимых веществ пыльцы методом стеклянных фильтров из оборудования необходимы: аналитические весы, сушильный шкаф и эксикатор, а из реактивов гидроксид натрия в качестве осушитель и хромовая смесь для очистки фильтров.

Стеклянные фильтры мы изготавливали путем впаивания в стеклянную трубку обточенного по размеру внутреннего диаметра трубки стеклянного фильтра Шотта №2 (Чмутов, 1954). Длина трубки составляла около 8 см, а внутренний диаметр 7-8 мм. Фильтр впаивался с одного края трубки. Конец трубки около фильтра оттягивался. Такие фильтры позволяют отделять нерастворимую часть пыльцевых зерен, от растворимой. Изготовленные фильтры промывали хромовой смесью и дистиллированной водой. Затем их сушили в сушильном шкафу при температуре 60С до постоянного веса ( часа). Высушенные фильтры взвешивали с точностью до 0,005 мг и помещали в эксикатор над гидроксидом натрия. Через сутки проводили повторное взвешивание, если вес не изменился, считали, что фильтры готовы к работе. Для проведения фильтрования собирали фильтровальную установку. Общая схема технологии анализ пыльцы на содержание ВРВ представлена на рис 2.

Рис. 2 - Схема технологии определения содержания водорастворимых веществ пыльцы растений фильтрованием Общая схема определения водорастворимых веществ в пыльце:

1. Подготовка стеклянных фильтров для анализа – выдерживание в эксикаторе над осушителем до постоянного веса и подсоединение его к бюретке. Закрепление бюретки.

2. Взятие навески пыльцы.

3. Замачивание навески пыльцы дистиллированной водой в химическом стаканчике.

4. Перенос водно-пыльцевой смеси в бюретку и пропускание воднопыльцевой смеси через стеклянный фильтр.

5. Промывание остатков пыльцы на фильтре дистиллированной водой.

6. Сбор фильтратов в мерную колбу.

7. Отделения фильтра от бюретки и высушивание его, т.е. выдерживание его в эксикаторе над осушителем до постоянного веса.

8. Взвешивание фильтра.

9. Расчет процента содержания водорастворимых веществ в пыльце.

Более подробно ход анализа состоял из следующих действий.

В период цветения собирали готовые к распусканию цветки исследуемых сортов. Из цветков, находящихся в состоянии нераскрытых бутонов, пыльники отделяли на лист белой бумаги, на которой они сушились в тени при комнатной температуре до отделения пыльцевых зерен от пыльников. Далее бумагу с пыльцой сворачивали в пакетики и помещали в эксикатор над хлористым калием, где пакетики с пыльцой выдерживались до постоянного веса. Перед исследованием, пыльцевые зерна отделяли от пыльников, с помощью металлического сита с очень мелкой сеткой, и хранили их в пакетиках из кальки в эксикаторе над хлористым кальцием.

На аналитических весах брали навеску пыльцы массой в пределах 4- мг с точностью 0,005 мг. Если навеска была больше, чем 6 мг, время фильтрования очень сильно увеличивалось из-за забивания фильтров остатками пыльцевых зерен. Затем навеску переносили в химический стакан на 50 мл, приливали туда же 5 мл воды и в течение 15-20 минут периодически помешивая, добивались гомогенного состояния смеси. Далее воду с пыльцой переливали в бюретку на 25 мл с подсоединенным к ней, через отрезок резинового шланга, стеклянным фильтром. Свободный нижний конец стеклянного фильтра фиксировали над воронкой, вставленной в мерную колбочку, так чтобы раствор из бюретки, проходил сквозь фильтр и беспрепятственно стекал в колбочку, а остатки пыльцевых зерен оставались на фильтре. Раствор, выходящий из фильтра собирали в мерную колбу на мл и доводили объем фильтрата до метки, для последующего анализа на флавонолы. Химический стаканчик и бюретку ополаскивали порциями дистиллированной воды по 2 мл 3-4 раза от остатков пыльцевых зерен, которые полностью переносили в бюретку с фильтром. Фильтр с остатками пыльцы промывали дистиллированной водой, до полного отсутствия в промывочной воде оптической плотности при длине волны 270 нм. Для этого было достаточно промывание фильтра 3 раза порциями по 5 мл дистиллированной воды, но так чтобы общий объем прошедшей через фильтр жидкости не превосходил объем мерной колбочки. Отсутствие оптической плотности при 270 нм. указывает на то, что все водорастворимые вещества перешли в фильтрат.

Затем стеклянные фильтры с остатками пыльцевых зерен отделяли от бюретки и сушили в сушильном шкафу при 60 C до постоянного веса. При этой температуре (60°С), смоченные водой фильтры полностью высушиваются и восстанавливают свой первоначальный вес. Мы посчитали, что и органические остатки пыльцевых зерен при 60 °С также полностью теряли только воду. После сушки в шкафу стеклянные фильтры остывали в эксикаторе над гидроксидом натрия. Остывшие стеклянные фильтры взвешивали и рассчитывали массу водорастворимых веществ по формуле:

mврв = mп. — (mф.п. — mф.) mврв – масса водорастворимых веществ пыльцы где:

mп. – масса пыльцы mф.п. – масса фильтра с пыльцой mф. – масса фильтра Результаты взвешивания и сделанные расчеты, соответствующие логике анализа заносили в таблицу. Определение водорастворимых веществ в пыльце для каждого сорта повторяли три раза. Расхождение между параллельными определениями для каждого сорта было не более 2%.

В качестве примера в таблице 5 приведены результаты определения процентного содержания водорастворимых веществ в пыльце ряда сортов яблони.

Таблица 5 — Результаты взвешивания и расчетов (2010г) (Молодцов, Сорт яблони mч.с.п mч.с. mп. mф.о.п. mф. mо.п. mр.п. n% мичуринская Синап орловский где: mч.с.п-масса часового стекла с пыльцой, мг;

mч.с. - масса часового стекла, мг;

mп. - масса пыльцы, мг;

mф.о.п- масса стеклянного фильтра с остатками пыльцы, мг;

mф. - масса стеклянного фильтра, мг;

mо.п. - масса остатка пыльцы на фильтре, мг;

mр.п. - масса растворенной части пыльцы, мг;

% = 100%- процент водорастворимых веществ в пыльце.

В таблице 6 приведены средние данные на основании трех повторностей по определению водорастворимых веществ в пыльце сортов яблони, проведенных в 2009 с помощью бумажных фильтров, и проведенных в 2010-2012 г. с помощью стеклянных фильтров.

Таблица 6 - Содержание водорастворимых веществ в пыльце разных мичуринская Рис. 3 - Сопоставление процентных содержаний водорастворимых веществ в пыльце исследованных сортов яблони (2009-2012 гг.) Как видно из таблицы 6, результаты определения водорастворимых веществ в пыльце, одних и тех же сортов яблони, весовым методом на стеклянных фильтрах и методом, основанном на применении бумажных фильтров, схожи.

водорастворимых веществ весовым методом на стеклянных фильтрах заключается в быстроте выполнения. Он в 2-3 раза быстрее, чем метод бумажных фильтров, кроме того обладает лучшей воспроизводимостью измерений и существенной экономией расходных материалов, т.к.

стеклянные фильтры могут использоваться многократно.

3.1.2 Количественное фотометрическое определение в пыльце Обоснование применения спектрофотометрического метода определения флавонолов в пыльце.

Водорастворимые вещества пыльцы яблони характеризуются свойством поглощать ультрафиолетовое (УФ) излучение в пределах 240- нм. Причем максимум этого поглощения близок к 270 нм. (рис.6). При этом следует особенно отметить, что в состав водных экстрактов из пыльцы, несомненно, входят такие важнейшие биологические вещества, как белкиферменты, углеводы, азотистые основания, аминокислоты, но не они определяют характерный для ВРВ УФ-спектр. Указанные вещества не обладают значительной способностью поглощать УФ-излучение в рассматриваемых здесь пределах измерений. Сопоставление физикохимических свойств веществ, содержащихся в экстрактах из пыльцы, позволяет прийти к выводу, что их УФ-спектр с максимумом 270 нм создается только фенольными соединениями (табл. 4), схожими с флавонолгликозидом рутином (рис. 4).

Рис. 4 – УФ спектры: 1- водный экстракт из навески пыльцы яблони (10мг);

2-раствор 0,55мг чистого рутина на 50мл воды; 3- раствор нуклеазы 25 мг в 50 мл воды; 4 - раствор глюкозы (Козлов, 2012 [б]).

Все это позволяет проводить количественное определение флавонолов в экстрактах пыльцы путем измерения на спектрофотометре их оптической плотности при 270 нм. Но перед этим спектрофотометр нужно откалибровать по стандартным растворам чистых флавонолов. Однако приготовить растворы с известной концентрацией тех флавонолов, которые содержатся в содержащихся в пыльце растений, приобрести невозможно. Они в России не производятся и не продаются. Схожесть спектров поглощения на рисунке дает возможность проводить калибровку спектрофотометра для определения флавонолов по рутину (Ерина, Мокшина, 2005). Рутин продается в аптеке.

В пыльце растений наиболее распространены три вида гликозидов, в основе которых находятся флавонолы - агликоны: кверцетин, кемпферол и изорамнетин, и они могут образовывать гликозиды с разными моносахарами:

глюкозой, рамнозой, маннозой, арабинозой и т.д. (рис. 5,6,7,8). Причем в пыльце эти гликозиды, по всей видимости, являются трисахаридами, так как только гликозиды трисахаридов хорошо растворимы в воде (Харборн, 1968).

Рис. 5 - Структурная формула кверцетина, связанного с трисахаридом Рис. 6 - Структурная формула кемпферола, связанного с трисахаридом Рис. 7 - Структурная формула изорамнетина, связанного с трисахаридом Рис. 8 - Структурная формула рутина, т.е. кверцетина, связанного с дисахаридом (рамноглюкозид кверцетина) Рутин является рамногликозидом кверцетина. По своему химическому составу и строению (рис. 8) названные агликоны ( кверцетин, кемпферол, изорамнетин) очень близки (Ветчинкин, 1966; Запрометов, 1962; 1967) и спектр поглощения определяют они, а не «привязанные» к ним радикалы сахаров (рис. 4 спектр 2). Это ещё раз подтверждает то, что суммарное определение флавонолов в пыльце растений мы вправе проводить, пользуясь калибровочным графиком на основе рутина, который является доступным для работы.

3.1.2.1 Определение флавонолов в пыльце на спектрофотометре СФ- Выше, в таблице 4, приведены величины оптических плотностей (D) для растворов ВРВ от разных сортов яблони, но при одинаковых концентрациях. Для одной и той же концентрации, но для разных сортов эти величины оптических плотностей (D) не совпадают, т.е. имеют разное значение, потому, что флавонолам разных сортов яблони сопутствуют разные количества растворимых веществ, обладающих массой, но не поглощающих ультрафиолет при = 240-300 нм. Без этих веществ зависимость оптической плотности (D) от концентрации флавонолов пыльцы разных сортов яблони должна быть одинаковая и в идеале, совпадать с калибровочным графиком по рутину. Поэтому, водорастворимые вещества пыльцы сортов яблони нельзя использовать в качестве калибровочных, для количественного определения флавонолов.

Для определения содержания флавонолов в пыльце прежде необходимо установить концентрацию флавонолов в водных экстрактах, полученных от навесок исследуемой пыльцы. Как было доказано выше, эту концентрацию можно устанавливать на фотометрических приборах, откалиброванных по рутину. Затем производят логически обоснованный расчёт. Методика определения флавонолов в пыльце, впервые освоена в нашей лаборатории (Козлов, Ермачкова, 2009). Она состоит из следующего уточненного порядка действий.

А) Получение калибровочного графика для СФ-26 по рутину:

1. Взять навеску рутина массой 5,5 мг.

дистиллированной водой в мерную колбу на 50 мл.

3 Раствор в колбе довести водой до метки 50 мл.

4 Калиброванной пипеткой отобрать необходимые объемы раствора и перенести их в мерные колбы на 25 мл, и дальнейшим разбавлением их дистиллированной водой получить калибровочные растворы рутина с концентрациями: 0,040; 0,030; 0,020; 0,015; 0,010; 0,005 мг/мл. Эти растворы устойчивы в течении двух часов.

5 На СФ-26 при длине волны = 270 нм. измерить оптическую плотность (D) калибровочных растворов.

6 Построить калибровочный график (рис. 9) соответствия концентраций оптическим плотностям.

Рис. 9 - Калибровочный график для СФ-26 по рутину Б) Определение суммы флавонолов на СФ- 1.Взять навеску пыльцы, выдержанной в эксикаторе над CaCl2 до постоянного веса, в пределах 5-10 мг. Навеску аккуратно перенести в мерную колбу на 50 мл и добавить дистиллированную воду до метки. Смесь периодически перемешивать.

2. Отстоявшуюся (через час) светлую часть раствора пипеткой отбирают и переносят в кювету спектрофотометра. Осветлить раствор можно центрифугированием.

3. При длине волны 270 нм. на спектрофотометре определяют оптическую плотность раствора.

4. По оптической плотности (D) на калибровочном графике (рис. 9), для рутина, находят концентрацию флавонолов, мг/мл.

5. Расчет процента содержания флавонолов, проводят по формуле:

с – концентрация рутина, мг/мл; 50 – объем колбы, мл;

а – навеска пыльцы, мг.

Определение флавонолов в пыльце некоторых исследуемых сортов мы проводили по растворам, получающимся после фильтрования для оценки содержания водорастворимых веществ в пыльце.

Данная методика определения флавонолов основана на применении дорогостоящего прибора – спектрофотометра, малодоступного широкому кругу исследователей.

Поэтому мы попытались выяснить возможность определения флавонолов на фотоэлектроколориметре. Эти приборы широко используются сельскохозяйственными лабораториями.

3.1.2.2 Определение флавонолов в пыльце на фотоэлектроколориметре Фотоэлектроколориметр (ФЭК) - достаточно простой в применении и доступный прибор, но он позволяет измерять оптическую плотность только у окрашенных растворов. Бесцветные растворы исследуемых флавонолов можно перевести в окрашенное состояние путем реакции с катионами ряда металлов (Анисимова, 2009).

В связи с этим мы изучили возможность количественного определения флавонолов пыльцы яблони по интенсивности окраски, полученной при взаимодействии с катионами меди раствора Фелинга (Молодцов, Гречушкин, Палфитов, 2012). Раствор Фелинга (фелингова жидкость), это смесь равных объёмов 7%-ного раствора сульфата меди и 34,6%-ного раствора сегнетовой соли в 10%-ном растворе едкого натра. (Большая советская энциклопедия 1969-1978) Сущность нашего опыта заключается в том, что гидроксильные группы молекул гликозид – флавонолов раствора от пыльцы и раствора рутина способны с катионом Cu+2 фелинговой жидкости образовывать схожие по цвету окрашенные комплексы, интенсивность окраски которых зависит от концентрации молекул гликозид – флавонолов. Измерение оптической плотности (D) таких комплексов при 560-575 нм. (фиолетовый светофильтр) на фотоэлектроколориметре позволяет определить концентрацию флавонолов по калибровочному графику, построенному по стандартным растворам рутина, а затем рассчитать процент содержания флавонолов в пыльце. Образующиеся между гликозидами-флавонолов и ионами меди окрашенные комплексы устойчивы в течении часа.

А). Подготовка калибровочного графика для ФЭК-56М по стандартным растворам рутина.

1. На аналитических весах, на часовом стекле берут точную навеску рутина, массой 10 мг и переносят в мерную колбу на 100 мл. Часовое стекло промывают от остатков рутина небольшими порциями дистиллированной воды и добавляют 1 каплю 2н раствора щелочи, для создания слабощелочной среды, необходимой для его растворения.

2. Полученный раствор доводят водой до метки. Из этого маточного раствора с концентрацией 0,10 мг/мл калиброванной пипеткой отбирают 18,75; 12,5;

6,25; 3,12 мл раствора, которые переносят в мерные колбы на 25 мл, чтобы дальнейшим разбавлением приготовить стандартные растворы рутина с концентрациями: 0,075, 0,05, 0,025, 0,0125 мг/мл (рис.10).

3. Далее в колбы добавляют по 1 мл раствора Фелинга, а затем раствор доводят дистиллированной водой до метки.

4. Раствор Фелинга готовят смешиванием равных объемов 7%-ного раствора сульфата меди и 34,6%-ного раствора сегнетовой соли в 10%-ном растворе едкого натра.

5. На фотоэлектроколориметре – ФЭК-56М устанавливают фиолетовый светофильтр и измеряют оптическую плотность калибровочных растворов.

6. По соответствию концентраций рутина оптическим плотностям строят калибровочный график (рис. 11) Рис. 10 Окраска калибровочных растворов в зависимости от количественного содержания флавонола рутина: 1-0,075 мг/мл; 2- 0, Рис. 11 Калибровочные графики по рутину Б). Определение флавонол – гликозидов в пыльце на ФЭК-56М 1. На аналитических весах берут навеску пыльцы массой 10 мг с точностью 0,05 мг.

2. Навеску тщательно переносят в химический стакан на 50 мл, добавляют каплю 2н. щелочи, приливают туда же 10 мл воды и перемешивая в течение 5-10 минут добиваются гомогенного состояния смеси.

3. Затем смесь фильтруют в пикнометр на 25 мл через воронку с вложенным в нее бумажным фильтром «синяя лента». Химический стакан и фильтр промывают дистиллированной водой от остатков пыльцевых зерен порциями по 2 мл 4 раза.

4. К фильтрату пыльцы добавляют 1 мл раствора Фелинга и доводят объем раствора до метки 25мл. Исследуемый раствор пыльцы в ходе химической реакции с реактивом Фелинга приобретает желто-зеленый 5. Раствор из пикнометра переносят в кювету фотоэлектроколориметра.

ФЭК-56М. При фиолетовом светофильтре определяют оптическую плотность раствора.

6. По оптической плотности (D) на калибровочном графике находят концентрацию рутина, мг/мл.

7. Далее рассчитывают процент содержания суммы флавонолов по рутину в пыльце по формуле:

n% - процент содержания флавонолов в пыльце;

С – концентрация флавонолов по графику рутина, мг/мл;

25 –объем пикнометра, мл;

m–масса навески пыльцы, мг.

С целью проверки получаемых на ФЭК-56М данных, у раствора от той же пыльцы, но без добавления раствора Фелинга, снимали оптическую плотность на спектрофотометре (СФ-26) и определяли концентрацию флавонолов по его калибровочному графику. Концентрация флавонолов по графику рутина для СФ-26 была близка с концентрацией по графику рутина для ФЭК-56М.

Таблица 7 – Параллельное определение содержания флавонолов в орловский ское Из таблицы 7 видно, что показания на ФЭК по отношению к показаниям на СФ завышены на 7-8%. Тем не менее, показания на ФЭК могут быть использованы для относительного сопоставления пыльцы сортов яблони по содержанию флавонолов, ввиду того, что показания на СФ тоже относительны, т.к. калибруют его по рутину.

В своей работе для определения флавонолов в пыльце яблони мы в основном использовали спектрофотометр.

Фотометрический анализ мы совмещали с параллельным определением ВРВ весовым методом на стеклянных фильтрах.

3.1.2.3 Сопоставление исследованных сортов яблони, по содержанию водорастворимых веществ и флавонолов в пыльце В таблице 8 и на рисунке 12 представлены результаты определения флавонолов, у основных объектов нашего исследования.

Таблица 8 - Содержание флавонолов и ВРВ в пыльце исследованных мичуринская Рис. 12 - Содержание флавонолов и ВРВ в пыльце сортов яблони (средние Из этой таблицы следует, что хотя по годам содержание флавонолов в пыльце несколько меняется, но расположение сортов относительно друг друга, в связи с содержанием флавонолов, так же остается постоянным, как и для водорастворимых веществ. Это говорит о том, что содержание флавонолов и ВРВ в пыльце является сортовой особенностью, т. е.

обусловлено генетически.

Таким образом, содержание ВРВ и флавонолов в пыльце является эндогенным признаком сорта яблони и его следует использовать при составлении помологической характеристики сорта.

Из сопоставления содержаний водорастворимых веществ (табл. 8 и рис.

12) и флавонолов видно, что содержание последних может быть в 5-10 раз меньше, чем вся сумма ВРВ.

Флавонолы в целом являются активаторами окисления флоризина в результате которого происходит образование полимерных пленок (Сарапуу, 1965). Основным флавонолом семейства Rosaceae, к которому относится яблоня, является изорамнетин (Wiermann, 1968). Изорамнетин же нужен как донор метильной (-СН3) группы, необходимой на конечных этапах биосинтеза пектина из которого строится растущая пыльцевая трубка. Если пектин будет деметилизирован, то он становится менее пластичным. В результате прорастание пыльцевой трубки затрудняется (Бардинская, 1964;

Steward, 1968; Labraca, Loewus, 1973).

Полезность содержания флавонолов в пыльце растений можно видеть в «полигидроксилированные и полиметаксилированные соединения». Это свойство считается важным условием для начала образования пыльцой пыльцевых трубок при её прорастании. (Минаева, Горбалева, 1967). Для прорастания пыльцы в пестиках яблони, по-видимому, ценным является также способность флавонолов активировать окисление других, более восстановленных флавоноидов, таких как дигидрохалкон – флоризин (Сарапуу, 1971).

Из наших исследований видно, что зависимость жизнедеятельности пыльцы яблони от содержания водорастворимых веществ аналогична зависимости от содержания флавонолов. Поэтому дальнейшее сопоставление жизнеспособности и жизнедеятельности пыльцы сортов яблони проводится нами, в основном, в зависимости от содержания флавонолов.

3.1.3 Сопоставление сортов яблони по жизнеспособности пыльцы в зависимости от содержания в ней флавонолов Количественное содержание водорастворимых веществ, а также количественное содержание суммы флавонолов в пыльце исследованных жизнеспособностью прежде всего понимается способность пыльцы к прорастанию, а так же на длина и качество образующихся пыльцевых трубок.

Опыты по проращиванию пыльцы на искусственной питательной среде осуществлялись по методике рекомендованной в (Программа…, 1999). В фазу рыхлого бутона заготавливались цветки. Для уменьшения влияния на результаты исследования фактора биохимической и физиологической разнокачественности цветков их отбирали с разных сторон кроны, с нескольких деревьев (не менее 200 цветков каждого исследуемого сорта). Из цветков, с помощью скрепок, выбирали пыльники на лист гладкой бумаги.

Затем в течение 1-2 дней пыльники подсушивали при комнатной температуре в тени до полного отделения пыльцевых зёрен.

Для проращивания пыльцы применялась методика в «висячей капле», наиболее рекомендуемая профессором А.С. Татаринцевым (1954). Для этого использовались промытые дистиллированной водой и стерилизованные при 110 оС чашки Петри. На кипяченой дистиллированной воде готовился 15%ный раствор сахарозы. Затем, на внутреннюю поверхность крышки чашки Петри стеклянной палочкой наносили 8-10 капель питательной среды. На дно чашки клали смоченную дистиллированной водой фильтровальную бумагу, чтобы в закрытой чашке был влажный воздух и капли быстро не высыхали.

Пыльца высевалась на каплю, равномерно стряхиванием с кончика иголки, к которому она прилипала при опускании иголки в стаканчик с пыльниками. Результаты проращивания проверялись через 4 часа после высевания, при восьмидесяти кратном увеличении с помощью микроскопа МБИ-1 с вложенным в окуляр разлинованным на сектора по 0,5 мм стеклом, для удобства подсчета.

Затем, на каждую каплю высевались пыльцевые зерна путём равномерного стряхивания их с конца препаровальной иглы. Плотность посева пыльцы в среднем составляла 4-7 пыльцевых зерна на мм2. Далее крышкой с каплями и пыльцой на них осторожно накрывали чашку с фильтровальной бумагой. Опыты по проращиванию пыльцы каждого сорта, в один сезон, повторялись троекратно. Подсчет процента проросших пыльцевых зерен проводился от общего числа пыльцевых зерен, высеянных на 24-30 капель. Результаты опытов по проращиванию пыльцы содержатся в таблице 9, а так же представлены в виде диаграмм на рис.13.

орловский Бессемянка мичур.

% проросших пыльцевых зерен Рис. 13 - Прорастаемость пыльцевых зерен сортов яблони на 15%ном растворе сахарозы, (средние значения за период 2009-2012 гг.) Проведенное нами определение жизнеспособности пыльцы, показало что, пыльца яблони, содержащая флавонолов более 4%, от своей сухой массы, лучше прорастает на искусственной питательной среде, чем пыльца содержащая флавонолов меньше 4% вес..

Так из таблицы 9 следует, что при увеличении содержания в пыльце флавонолов возрастает и процент прорастания пыльцы, исследуемых сортов.

Демонстрация этой зависимости в виде диаграмм (рис.14) более эффектна.

Зависимость процента прорастания пыльцы яблони на искусственной питательной среде от процентного содержания в ней флавонолов является практически прямолинейной и прямопропорциональной содержанию флавонолов (рис. 14).

Рис. 14 – Графическая зависимость прорастания пыльцевых зерен в искусственной питательной среде от содержания флавонолов в пыльце сортов яблони (Палфитов, Козлов, Молодцов, 2010).

Количественное содержание флавонолов в пыльце оказывает значительное влияние так же на длину и качество образующихся пыльцевых трубок (рис.15).

Пыльцевые трубки сортов Бессемянка мичуринская, Синап орловский, Орлик, имеющих малое содержание в пыльце флавонолов 2-3% вес., после четырех часов проращивания были короткими и как правило не превышали длину равную трем диаметрам пыльцевого зерна. Пыльцевые трубки сортов Спартан, Лобо и Мелба, содержащих флавонолов 10-13% вес., очень длинные и во многих случаях уходили из поля зрения.

Рис. 15 - Прорастание пыльцы контрастных по самоопыляемости сортов яблони после 4 часов на искусственной питательной среде: 1Бессемянка мичуринская (флавонолов 2 %); 2 - Синап орловский (флавонолов 2%); 3 – Орлик (флавонолов 3 %); 4 – Лобо (флавонолов %); 5- Спартан (флавонолов 13 %); 6 – Мелба (флавонолов 11 %) Учитывая, что в условиях in vivo пыльцевые трубки обязаны прорастать в пестиках цветков яблони, содержащих халкон флоризин в нашей лаборатории был поставлен опыт по изучению экзогенного влияния флоризина в различных концентрациях на прорастание пыльцевых трубок in vitro (Козлов, 2012 [б]). C этой целью проращивали пыльцу исследуемых сортов яблони на питательной среде с различной концентрацией флоризина.

Было отмечено, что при концентрации флоризина (0,01%) пыльцевые трубки склонных к самоплодности сортов (Антоновка, Лобо и Спартан), прорастания не превышали длины равной 3-4 диаметров пыльцевого зерна, пыльцевые трубки оканчивалась вздутием либо разрывом. Малая концентрация флоризина в питательной среде (10-3 – 10-4%) практически не влияла на жизнеспособность пыльцы этих сортов. Пыльцевые зерна не мичуринская, Орлик) с низким содержанием флавонолов при добавлении экзогенного флоризина не прорастали вовсе.

Эти сведения позволяют сделать вывод о том, что и в живых пестиках количественное содержание эндогенного флоризина будет существенно сказываться на прорастании пыльцы и росте пыльцевых трубок.

При этом необходимо учитывать, что флоризин в пестиках распределен не равномерно, а градиентно. Это значит, что его содержание увеличивается по длине столбика от рыльца к завязи. И содержание флоризина в тканях столбиков может значительно превосходить опытные концентрации в условиях in vitro. Однако высокие концентрации флоризина in vivo не всегда ингибируют рост пыльцевых трубок, особенно, от пыльцы с высоким содержанием флавонолов, следовательно, в нативных пестиках существуют биохимические условия, ослабляющие ингибирующее действие флоризина.

3.2 Сопоставление исследованных сортов яблони по содержанию флоризина в пестиках цветков и по самоопыляемости Флоризин (моноглюкозид дигидрохалкона флоритина) – природное фенольное вещество внутрирастительного действия, при высоких концентрациях является ингибитором ростовых процессов. Впервые был выделен немецким врачом Д.Л. Конинком (Koninck, 1935) из коры корней яблони. Флоризин является основным фенольным веществом яблони (рис.

16).

Рис. 16 – Структурная формула флоризина (моноглюкозида флоретина) (Палфитов, Козлов, Молодцов, 2010) «В научной литературе часто встречается термин флоридзин, однако более правильным является название флоризин (phlorhizin), (Словарь органических…, 1949).

Ряд исследователей, (Henke, 1963; Сарапуу, 1970), считают, что флоризин характерен только растениям рода Malus, тогда, как например, у рода Pyrus, т.е. в грушах, основной флавоноид это арбутин (Williams, 1963;

Williams, 1965)» (Палфитов, 2003).

В.Ф. Палфитов (2003) в своей работе показал, что сорта яблони могут существенно отличаться по содержанию флоризина в столбиках пестиков цветков. В самих пестиках концентрация флоризина увеличивается от рыльца к основанию, т.е. флоризин в пестичных столбиках распределен градиентно. В основаниях столбиков пестики цветков яблони могут содержать его до 30% от сухой массы. Учитывая, что флоризин в больших концентрациях является сильнейшим ингибитором ростовых процессов нам необходимо все исследованные сорта охарактеризовать по содержанию его в пестичных столбиках.

Количественное определение флоризина мы проводили в столбиках пестиков от тех же цветков, от которых отбирали пыльники для получения пыльцы. Пестики, перед переработкой, иногда хранили в закрытых пробирках в холодильнике при температуре +4 °С до 5-7 дней. При более длительном хранении сырыми в пробирках пестики разлагаются, чернеют и плесневеют. Для анализа использовались, только хорошо сохранившиеся – зеленые столбики, наиболее характерные по длине для данного сорта. Эти столбики разрезали поперек на несколько частей. Длинна столбиков сортов Антоновка, Зеленый май, Лобо, Мартовское, Мелба, Орлик, Спартан, Синап орловский, Уэлси составляла от 9 до 15 мм. Измерение длины столбиков осуществлялось ученической линейкой. По длине столбики этих сортов разрезали на пять частей: вначале отрезали по одному миллиметру с концов, оставшуюся часть делили на равные доли. Столбики сорта Бессемянка мичуринская, длина которых в среднем составляла 4-5 мм, делились на две части.

Столбики на части разделяли канцелярским ножом на тефлоновой подложке. Для проведения трех повторностей спектрофотометрического анализа по каждому исследуемому сорту, разделению на части подвергалось 80-90 столбиков. Этого количества стодбиков было достаточно.

Для того, чтобы можно было сопоставлять сорта по содержанию флоризина в пестиках части пестиков должны иметь одинаковую влажность.

Но проще всего добиться влажности высушиванием всех образцов до постоянного веса. Затем такие образцы подвергают анализу и расчет содержания флоризина проводят на единицу сухой массы столбиков.

Поэтому разделенные части пестиков заворачивали в алюминиевую фольгу и нумеровали, начиная с верхней части столбика. Аналогично заворачивали по 50-60 целых, не разрезанных, столбиков и завязей каждого сорта.

Пронумерованные сверточки для одного и того же сорта, складывали в один бумажный пакетик, который подписывался названием сорта. Бумажные пакетики помещались в вакуумный эксикатор, на дне которого находился осушитель – кристаллический KOH. Затем в эксикаторе создавали вакуум.

Для этого эксикатор закрывали крышкой с вакуумным краном, соединенным с ртутным манометром и вакуумным насосом. С помощью насоса в эксикаторе создавали остаточное давление менее 1 мм. рт. ст. Затем кран эксикатора перекрывали и образцы оставляли на осушку не менее чем на три дня. За это время части пестиков высушивались при комнатной температуре до постоянного веса, и были готовы к анализу. Для взятия навесок пестиков для анализа сухие части столбиков растирали в малой ступке до порошкообразного состояния и хранили в пакетиках из кальки. Эти пакетики обязательно нумеруют соответственно частям столбиков, т.е. номерам пакетиков из фольги. Растертые образцы пестиков яблони хранили в эксикаторе с осушителем без вакуума весь период проведения анализов.

3.2.2 Сопоставление сортов яблони по содержанию флоризина в Количественный анализ содержания флоризина в тканях яблони обычно проводят на основе его свойства максимально поглощать ульрафиолетовое излучение (УФ) при длине волны 280 нм, т.е. также, как и при определении флавонолов в пыльце здесь тоже используется фотометрический анализ (Рао, 1964; Блажей, Шутый, 1977).

Определение флоризина в пестиках мы проводили в 2009-2012 годах по специально разработанной методике, описанной в работах (Палфитов, Потапов, Тарасов, 1998; Палфитов, 2003). В табл. 10 в качестве примера представлены результаты анализа на флоризин частей столбиков, исследованных сортов яблони в 2009 году.

Таблица 10 – Содержание флоризина в частях столбиков исследованных сортов яблони (Козлов, 2012 [б]) Сорта яблони наглядно видно, что распределение содержания флоризина по длине столбиков, увеличивается от рыльца (Ср) к основанию (Со), то есть он распределен градиентно. Построение графиков распределения флоризина по длине столбиков позволяет определить содержание флоризина в их основаниях Со (по пересечению с координатой концентраций) и в рыльце Ср (по проекции верхнего конца графика на координату концентраций) столбиков. Эти же показатели позволяют рассчитать величину градиента распределения флоризина по длине столбиков.

Рис. 17 - Распределение флоризина по длине столбиков пестиков Рис. 18 - Распределение флоризина по длине столбиков пестиков сорта Рис. 19 - Распределение флоризина по длине столбиков пестиков сорта Рис. 20 -Распределение флоризина по длине столбиков пестиков сорта Рис. 21 - Распределение флоризина по длине столбиков пестиков сорта Рис. 22 -Распределение флоризина по длине столбиков пестиков сорта Рис. 23 - Распределение флоризина по длине столбиков пестиков Величину градиента, т.е. изменение содержания флоризина на каждый миллиметр длины столбика можно рассчитать по формуле:

- градиент содержания флоризина по длине столбика, %/мм;

Ср- содержание флоризина в рыльце пестика, %;

Со- содержание флоризина в основании столбика, %;

Рис. 24 - Схема распределения флоризина по длине столбиков Таким образом для расчета градиента, по данным таблицы, важно построить на миллиметровой бумаге графики распределения флоризина по длине пестичных столбиков с учетом расстояний до срединных точек отрезков от оснований столбиков (Рис.17-23). Такой график (см. схему) позволит определить содержание флоризина в концевых точках пестиков, т.е.

в рыльцах (Ср) и основаниях (Со). Как видно из схемы проекции верхних (концевых) точек графиков на ось абсцисс (С,%), соответствуют содержанию флоризина в рыльцах пестиков (Ср), рис. Точки пересечения графиков с осью абсцисс соответствует содержанию флоризина в основаниях столбиков (Со).

По величинам Ср и Со и значению длины столбиков мы провели расчет градиента () флоризина, для исследуемых сортов яблони.

Пример расчета для Бессемянки мичуринской:

Таким образом, исследованные сорта яблони можно разделить на две группы:

1. Сорта яблони с малым содержанием флоризина в столбиках пестиков - Лобо, Мелба, Спартан. У них градиент флоризина составляет 4,9мм, а содержание его в основании столбиков Со в пределах 11-14 % от сухой массы.

2. Сорта яблони с высоким содержанием флоризина в столбиках пестиков - Орлик, Синап орловский, Бессемянка мичуринская, Антоновка обыкновенная. У них градиент флоризина составляет 10,6-17,2 % / мм, а содержание его в основании столбиков Со в пределах 26-32 % от сухой массы.

3.2.3 Влияние количественного содержания флоризина в пестиках Графически определенные Ср и Со, и рассчитанные на их основе градиенты распределения флоризина в столбиках, а также данные о процентах завязываемости плодов при свободном опылении и самоопылении представлены в таблице 11.

Таблица 11 - Градиент флоризина в столбиках пестиков яблони и процент завязывания плодов исследованными сортами (2010-2012 гг.) орловский Бессемянка мичурин.

обыкновенная Данные таблицы 11 позволяют заключить, что сорта яблони, с градиентом содержания флоризина в пестиках выше 9%/мм, и при содержаниях флоризина в основаниях столбиков (Со) больше 25 %, могут резко снизить процент завязываемости плодов, до уровня 6-9%, при свободном опылении, и до 0-1 % при самоопылении. Причиной этого может быть ингибирующее действие, флоризина на рост пыльцевых трубок в пестиках.

Сорта же с градиентом флоризина менее 8 %/мм и с величиной (Со) менее 15 %, показали плодовитость в пределах 56-63 % от числа свободно опыляемых цветков при свободном опылении и 5-10% при самоопылении.