ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«СИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

на правах рукописи

КУЛИКОВ ЕВГЕНИЙ СЕРГЕЕВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПАТТЕРНЫ ТЯЖЕЛОЙ

БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ

Научный консультант: Огородова Людмила Михайловна, доктор медицинских наук, профессор, членкорр. РАМН, заслуженный деятель науки РФ ТОМСК- Оглавление Введение…………………………………………………………………. Глава 1. Молекулярная и генетическая характеристика воспаления при тяжелой бронхиальной астме (обзор литературы)……………... 1.1 Бронхиальная астма: распространенность, определение………… 1.2 Механизмы формирования аллергического воспаления………… 1.3 Аспекты клинического течения БА………………………………… 1.4 Классификация БА и контроль болезни…………………………… 1.5 Распространенность неконтролируемой астмы в популяции…… 1.6 Тяжелая и терапевтически резистентная БА……………………… 1.7. Молекулярные паттерны тяжелой БА……………………………. 1.8. Генетические паттерны тяжелой БА………………………………. Глава 2. Клинические группы и методы исследования………………. 2.1 Протокол исследования…………………………………………….. 2.2 Методы исследования………………………………………………. Глава 3. Клиническая характеристика изучаемой популяции и оценка эффективности терапии…………………………………………………. 3.1 Исходная клиническая характеристика изучаемой популяции…. 3.2 Динамика клинико-функциональных показателей и уровня контроля в течение периода наблюдения……………………………… 3.3 Исходная клиническая характеристика терапевтически чувствительных и терапевтически резистентных пациентов…………. 3.4. Динамика клинико-функциональных показателей и уровня контроля в течение периода наблюдения……………………………… Глава 4. Оценка дифференциальной экспрессии генов………………. 4.1 Дифференциальная экспрессия генов на Визите 1………………… 4.2 Дифференциальная экспрессия генов на Визите 3……………….. 4.3 Дифференциальная экспрессия генов на Визите 4……………….. Глава 5. Анализ генных онтологий и KEGG путей…………………… 5.1 Сравнение тяжелой терапевтически чувствительной и легкой БА.. 5.2 Сравнение тяжелой терапевтически чувствительной и резистентной астмы……………………………………………………… 5.3 Сравнение тяжелой терапевтически резистентной и легкой БА…. Глава 6. Характеристика динамики генной экспрессии при тяжелой бронхиальной астме в течение лечебного периода…………………… 6.1 Функциональная характеристика генных кластеров…………….. 6.2 Характеристика изменений экспрессии кластеров в течение периода наблюдения……………………………………………………. 6.3. Оценка динамики генной экспрессии в течение лечебного периода…………………………………………………………………… Глава 7. Обсуждение результатов……………………………………… Заключение……………………………………………………………….. Список сокращений и условных обозначений………………………… Список литературы………………………………………………………. Приложения……………………………………………………………… Приложение А. Сравнительный анализ уровня генной экспрессии.

Полный перечень генов с дифференциальной экспрессией с уровнем статистической значимости p 50% времени 2. Необходимость использования высоких доз ИКС (1260 мкг/сутки беклометазона или эквивалентные дозы других ИКС) Малые критерии:

1. Ежедневная потребность в длительно действующих бета2-агонистах (ДДБА), теофиллине, антилейкотриеновых препаратах 2. Ежедневные симптомы астмы, требующие применения короткодействующих бета2-агонистов (КДБА) 3. Сохраняющаяся бронхиальная обструкция (ОФВ1< 80%, дневная вариабельность ПСВ > 20%) 4. 1 вызова скорой помощи за последний год 5. 3 курсов СКС за последний год 6. Быстрое обострение астмы при уменьшении на 25% дозы ИКС или СКС 7. Жизнеугрожающие события, связанные с астмой в прошлом Согласно данной классификации, для постановки диагноза терапевтически резистентной БА (ТРБА) достаточно одного большого критерия в сочетании с двумя малыми.

Но, несмотря на существование достаточно четко сформулированных клинических критериев отдельных фенотипов, данные знания не позволяют определить фенотип-специфичный подход к терапии болезни.

При использовании данных клинических критериев знание врача о наличии у пациента того или иного фенотипа определяет, в некоторой степени, лишь прогноз, риски будущих обострений и необходимость коррекции плана мониторинга течения болезни. Однако предложенные клинические группировки фенотипов БА не позволяют скорректировать фармакотерапевтический подход в связи с отсутствием знаний о патофизиологических механизмах, лежащих в основе формирования фенотипов тяжелой астмы [83]. На сегодняшний день накоплено достаточно данных для утверждения того, что в основе течения тяжелой астмы лежат особенности формирования и персистенции воспаления, но доминирующих механизмов пока не определено.

Публикация монографии «Difficult asthma» в 1999 году акцентировала внимание научной общественности на проблеме тяжелой астмы, в целом, и на необходимости более точной патофизиологической характеристики фенотипов болезни, в частности.

Попытки группировки тяжелой БА по клиническим признакам не прекращались. Так, в 2006 г. Sally E. Wenzel в журнале Lancet опубликовала обзорное исследование, в котором проанализированы все статьи по астме в рецензируемых журналах за последние 20 лет, содержащие определенные ключевые слова. В данной работе определены 13 фенотипов астмы, которые классифицированы в три категории: клинико-физиологические фенотипы;

фенотипы, связанные с воздействием триггеров и воспалительные фенотипы.

Однако, анализ полученных данных показал, что каждый конкретный пациент имел паттерны нескольких фенотипов, принадлежащих сразу к нескольким категориям, что не позволяло четко разделить фенотипы и использовать данную классификацию в практике [350]. В 2010 году проведен неконтролируемый иерархический кластерный анализ данных 726 пациентов из базы данных Severe Asthma Research Program (Программа исследования тяжелой астмы). Пациенты, участвующие в данной программе, имели детализированную фенотипическую характеристику [174]. В результате данного анализа выявлено 5 групп (фенотипов). Однако, и в данном исследовании, выполненном на высоком доказательном уровне, все кластеры включали пациентов, которые соответствовали определению терапевтически резистентной астмы по критериям ATS, необходимость новых подходов к идентификации фенотипов тяжелой астмы, используя молекулярные или генетические паттерны [92].

В последнее время в литературе широко обсуждается мнение о том, что в основе тяжелой БА лежат патофизиологические механизмы, отличные от легкой и среднетяжелой форм болезни. Данные механизмы и являются основой формирования терапевтической резистентности, в связи с чем, отсутствует возможность достижения контроля заболевания на фоне применения адекватной базисной противовоспалительной терапии [298, 228]. Опубликованы результаты десятков исследований, посвященных идентификации биомаркеров, которые могли бы быть использованы как в диагностических целях, так и стать новыми таргетными мишенями терапии БА [298, 228]. Но количество таких работ, выполненных в группе ТРБА, достаточно ограничено, и, как правило, каждое отдельное исследование характеризует только один биомаркер, не оценивая изменения и дисбаланс в молекулярных воспалительных каскадах в целом при данной форме болезни.

По данным современных исследований, наиболее вероятные причинные факторы и молекулы, лежащие в основе формирования тяжелой БА и терапевтической резистентности, можно условно разделить на следующие группы: дисбаланс цитокинового профиля, феномен резистентности к глюкокортикоидам, ангиогенез и ремоделирование бронхов, детерминация иммунного ответа в направлении Th2-звена.

У терапевтически резистентных пациентов, находящихся на терапии высокими дозами СКС, в БАЛ зарегистрированы высокие уровни нейтрофилов, в то время как у пациентов, не получающих СКС преобладает, эозинофилия [337, 203]. Наряду с повышенным уровнем эозинофилов в индуцированной мокроте, регистрируется высокий уровень нейтрофилов и ИЛ-8 [337, 181]. Необходимо также отметить, что у тяжелых пациентов с частыми обострениями регистрируются достоверно более высокие уровни проэозинофильных цитокинов, в сравнении с пациентами, имеющими фиксированную бронхиальную обструкцию [113]. В период тяжелых обострений, фатальных атак преобладает нейтрофильное воспаление.

В исследовании Селивановой П.А. (2008 г.) показано, что в БАЛ пациентов с «brittle» фенотипом регистрируется низкий общий цитоз за счет более низкого содержания лимфоцитов, эозинофилов и эпителиальных клеток, по сравнению со среднетяжелой астмой, а в БАЛ больных с фенотипом «астма с фиксированной обструкцией» было зарегистрировано преобладание нейтрофилов [23]. Таким образом, имеются различные паттерны воспаления при астме с фиксированной бронхиальной обструкцией и хрупкой (brittle) астмой.

способные активировать каскад воспалительных процессов, могут объяснить тяжесть клинического течения заболевания. Так, у пациентов с тяжелой астмой регистрируются более высокие уровни ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-11, TGF-, эотаксина [337, 113]. К интерлейкинам с наиболее выраженным провоспалительным эффектом можно отнести ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИЛ-13. Адекватная противовоспалительная терапия ассоциирована со снижением уровня провоспалительных цитокинов, медиаторов и эффекторных клеток, что может подтверждать корреляцию повышенного уровня цитокинов с тяжестью заболевания. Механизма, объясняющего увеличенный синтез провоспалительных медиаторов, на данный противовоспалительных цитокинов также может играть роль в формировании тяжелой астмы.

Цитокины ИЛ-13 и ИЛ-4 опосредуют свои провоспалительные эффекты посредством взаимодействия с IL-13Ralpha1 и IL-4Ralpha. Прямой эффект ИЛ- на эпителий бронхов приводит к повышению БГР и гиперпродукции слизи даже в отсутствие признаков воспаления [209]. Также экспрессируется IL-13Ralpha2, который функционально не способен к передаче сигнала, но при этом обладает высоким аффинитетом к ИЛ-13. По последним данным трансмембранная форма IL-13Ralpha2 может ослаблять действие ИЛ-13 и ИЛ-4 [56]. Таким образом, снижение экспрессии IL-13Ralpha2 может быть причиной персистенции воспаления у больных с тяжелой БА. Также ИЛ-13 является важным Тh цитокином, участвующим в эозинофильном воспалении и способствующим переключению В-клеток на продукцию IgЕ.

В последнее время также широко обсуждается роль механизмов регуляции продолжительности жизни эозинофилов в формировании персистирующего воспаления при астме. В нормальных условиях эозинофилы элиминируются путем апоптоза, т.е. генетически детерминированной гибели клеток. При БА количество апоптотически измененных эозинофилов прогрессивно уменьшается с нарастанием степени тяжести заболевания эти данные были продемонстрированы в исследованиях биоптатов бронхов больных БА [275]. Супрессия апоптоза сочетается с преобладанием некротического пути гибели клеток и высвобождением значительного количества провоспалительных цитокинов и медиаторов (вторичная воспалительная реакция) [20, 121, 135]. В работах, выполненных в СибГМУ Деевым И.А. и Никитиной Л.Ю, подтверждаются данные о снижении апоптотической гибели эозинофилов, наиболее выраженные у пациентов с тяжелой БА, а также выявлен ряд специфических механизмов нарушения апоптоза, особенно в группе больных с неконтролируемой астмой, связанный с дисбалансом анти- и проапоптотических факторов, что может лежать в основе формирования терапевтической резистентности [14, 210].

Доказанными являются и нарушения апоптотической гибели нейтрофилов при тяжелой БА [248, 338, 46].

1.7.2. Формирование резистентности к глюкокортикоидам В основе терапевтической эффективности глюкокортикоидов в лечении астмы лежит способность данной группы препаратов блокировать экспрессию провоспалительных цитокинов через подавление активности NF-B [107, 353].

Показано, что у гормонозависимых пациентов экспрессия NF-B достоверно