Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Челябинский государственный университет»

На правах рукописи

Беляева Светлана Валерьевна

ГЕНЫ ИММУННОГО ОТВЕТА И ИХ КОМБИНАЦИИ В КАЧЕСТВЕ

ПРЕДИКТОВЫХ МАРКЕРОВ ПОТЕНЦИАЛЬНОГО РИСКА

РАЗВИТИЯ АКТИВНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ И ЕГО

КЛИНИЧЕСКИХ ФЕНОТИПОВ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РУССКОЙ

ПОПУЛЯЦИИ ЧЕЛЯБИНСКОЙ ОБЛАСТИ

14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Бурмистрова Александра Леонидовна доктор медицинских наук, профессор Челябинск- Оглавление Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Полиморфизм иммунокомпетентных генов хозяина как фактор риска развития различных клинических форм туберкулеза легких

1.2. Участие полиморфизмов генов системы HLA и их продуктов в развитии клинически активных форм туберкулеза легких

1.3. Роль факторов врожденного иммунного ответа в развитии туберкулеза 1.3.1.TLR (Toll-like receptor)

1.4. Участие полиморфизмов генов цитокинов и их продуктов в развитии клинических форм туберкулеза легких

1.4.1. IL1

1.4.2. IL10

1.4.3. TNF

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Обследуемые лица

2.2. Статистическая обработка результатов

Глава 3. Результаты собственных исследований

3.1.Ассоциация полиморфизмов генов HLA с развитием активного туберкулеза легких и его фенотипов

3.2. Ассоциация полиморфизмов генов цитокинов IL1RА, IL1, IL10, TNFА и рецепторов врожденного иммунитета TLR4, TLR2 с развитием активного туберкулеза легких и его фенотипов

Глава 4. Обсуждение полученных результатов

Заключение

Выводы

Список сокращений и условных обозначений

Список используемой литературы

Приложение

Введение Актуальность темы исследования и степень ее разработанности Туберкулез (ТБ) является одной из постоянных глобальных проблем здоровья населения планеты. Несмотря на широкомасштабную вакцинацию, использование современных лекарственных препаратов и осуществление национальных и межнациональных программ контроля за туберкулезом [42] ежегодно в мире регистрируется 10 млн. новых случаев первичного туберкулеза и около 1,7 млн. смертей в год [147]. Более того, по данным статистических исследований, 1/3 населения Земли инфицирована M.tuberculosis, но только 10% от всех инфицированных демонстрируют прогрессию к активным формам туберкулеза [132, 144, 147].

Представленные статистические данные порождают предположения о причинах и механизмах разнообразия в реализации ответа хозяина на возбудитель туберкулеза: 1) протективный иммунный ответ против M.

tuberculosis с элиминацией возбудителя; 2) персистенция возбудителя на фоне клинического здоровья в течение нескольких лет (и даже в течение жизни); 3) конверсия асимптоматической инфекции в высоко контагиозную, клинически активную и потенциально смертельную форму заболевания (реактивацию) [106].

Характерной чертой персистентных инфекций, обусловленных высокоадаптированными к человеку возбудителями (в частности МБТ), является состояние динамического баланса между партнерами возбудителем и «хозяином», изменения в котором могут потенциально обладать риском манифестации активного туберкулеза и трансмиссии возбудителя [40].

В свете сказанного, важным направлением исследований является поиск информативных биомаркеров персистентной инфекции и маркеров прогрессии заболевания к клинической форме, т.е. маркеров доклинического прогнозирования заболевания, использование которых позволит своевременно осуществлять профилактические эпидемиологические мероприятия.

В настоящее время широкие возможности для изучения гомеостаза человека в норме и при патологии представляют современные технологии, особенно в области геномики. Изучение генома человека складывается из основных направлений, каждое из которых имеет положительные стороны и, в тоже время, для каждого существует множество требований и ограничений.

Оценка транскриптомной активности широко используется при изучении патогенеза заболеваний, в том числе инфекционной этиологии, и для идентификации биомаркеров конкретных состояний организма человека или динамических процессов. Однако, активность транскриптома во многом зависит от окружающих факторов, от изменений, не имеющих отношения к изучаемой патологии, и может описываться профилями транскрипции генов, общими для многих заболеваний [53].

Изучение структуры генома – идентификация общих полиморфизмов или редких мутаций, ассоциированных с заболеваниями. Параметры, измеряемые этими исследованиями, в частности частоты распределения полиморфных генов, генотипов, гаплотипов генов иммунного ответа, детерминируются наследованием и не изменяются в течение жизни, поэтому могут выступать в качестве маркеров потенциального риска развития заболевания и конкретных клинических фенотипов с учетом этногеографических характеристик. Ассоциации между общими вариантами генов, входящими и не входящими в ГКГС, и чувствительностью к ряду инфекционных заболеваний установлены [144]. Дальнейшие исследования по изучению полиморфизма генов региона HLA и других, участвующих в развитии воспалительных ответов, позволят выделить прогностические маркеры конверсии асимптоматической инфекции в клинически активную форму туберкулеза; на их основе сформировать группы потенциального риска и определить подходы к персонализированной профилактике и терапии с использованием новых биотехнологий; выделить мишени для трансформации воспалительно-иммунных ответов хозяина на МБТ: от гиперпродуктивных к толерогенным, что даст возможность снизить деструкцию пораженного органа.

Цель исследования Оценить особенности распределения вариантов и комбинаций генов, продукты которых участвуют в реализации иммунного ответа хозяина на встречу с возбудителем туберкулеза в русской популяции Челябинской области, у больных и здоровых лиц, с целью выделения маркеров потенциального риска развития активного туберкулеза легких и его клинических фенотипов.

Задачи исследования Провести анализ связи аллелей и гаплотипов генов системы HLA с развитием клинически активного туберкулеза легких.

ассоциированные с клиническими фенотипами туберкулеза легких.

Оценить ассоциацию генов TLR2 и TLR4 и цитокинов IL1, IL1RA, IL10, TNFA, а также их генотипов и гаплотипов с клинически активным туберкулезом легких и его клиническими формами.

Установить распределение гаплотипов генов HLADRB1-TNFA(-308) у больных с активным туберкулезом и в контрольной группе.

Установить паттерны генов, включающие совокупность генов и их комбинаций системы HLA, цитокинов и TLR, соответствующие разным клиническим фенотипам.

Методология и методы исследования Данное исследование проведено в рамках научной проблемы «Популяционная иммуногенетика», раздел «Гены иммунного ответа и болезни». При выполнении экспериментальной части мы использовали традиционный подход к изучению иммуногенетики инфекционных заболеваний:

Оценили частоты распределения аллелей, генотипов и гаплотипов генов, продукты которых участвуют 1.1. в развитии воспаления:

ассоциированных молекул), и вызывают ответ на них клеток воспаления, – цитокины - организаторы межклеточных взаимодействий, регуляторы иммунного ответа;

в презентации микробных антигенов - молекулы HLA I и II классов 1.2.

АПК (антиген представляющих клеток).

Гены перечисленных компонентов иммунной системы обладают высокой полиморфностью, особенно система HLA, и для них характерны как межиндивидуальные, так и популяционно-географические различия в частотах аллелей, генотипов и гаплотипов [21]. Учитывая данный факт, мы провели исследование на уровне:

- внутрипопуляционной биологической гетерогенности. Для выделения иммуногенетических маркеров потенциального риска развития активного туберкулеза и его клинических форм проводили сравнительный анализ распределения генов и их комбинаций между здоровыми лицами и больными активными формами ТБ с использованием подхода случай-контроль.

- популяции – изучали популяцию русских, проживающих в Челябинске и Челябинской области и имеющих наибольшее представительство среди других народов на этой территории (84%) [156].

Методы исследования В работе применен комплекс современных молекулярно-генетических методов исследования: ПДРФ-анализ (анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов) и аллель-специфическая ПЦР (полимеразноцепная реакция).

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора Для оценки статистической значимости рассчитывали показатели непараметрической статистики: критерий Пирсона, критерий Пирсона с поправкой Йейтса для значений более, либо равных 5 и менее 10, точный критерий Фишера для значений менее 5 с применением пакета прикладных программ «Statistica 8.0». Для попарного сравнения трех групп больных использовали поправку Бонферрони (pc). Поправку на количество аллелей не применяли. Различающие возможности методов оценивали по критерию отношения шансов (OR) и их доверительным интервалам (CI) с помощью программы Ms Excel пакета Ms Office 2010. Для расчета величины неравновесного сцепления и частот гаплотипов методом максимального правдоподобия использовали программу Arlequin 3.5. Для графического представления распределения генотипов генов воспалительного ответа и пола больных относительно клинических фенотипов туберкулеза легких был использован метод канонического анализа соответствий (CCA – Canonical Correspondence Analysis) с помощью программного пакета PAST 2.17с.

Основные материалы диссертации представлены и обсуждены на конференции зональной лаборатории иммунологического типирования тканей «Фундаментальное и прикладное значение оценки генов иммунного ответа» (г. Челябинск, 2008), Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (г. Москва, 2008), Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2009), IX конференции Иммунологов Урала (г. Челябинск, 2011), X конференции Иммунологов Урала (г. Тюмень, 2012), научно-практической конференции, посвященной 15-летию биологического факультета ФГБОУ ВПО «ЧелГУ» (г.

Челябинск, 2013).

Основные цели, задачи, положения, выносимые на защиту, и выводы сформулированы автором совместно с руководителем Бурмистровой А.Л.

Разработка дизайна исследования, научно-информационный поиск, анализ и обобщение данных специальной литературы, определение необходимых методологических подходов исследования, выполнение большей части лабораторных исследований, математическая обработка полученных результатов выполнены лично автором. Набор материала для исследования проводился на базе ГБУЗ «Челябинский областной клинический противотуберкулезный диспансер» под руководством заведующей 3-его стационарного фтизиатрического отделения Ананьевой И.П. Обследование контрольной группы осуществлялось совместно с коллективом отделения молекулярно-биологической диагностики ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови» (М.С. Чернова, Е.Б. Хромова, Е.И. Лупарь, М.Н.

Вавилов, Д.С. Сташкевич, Е.О. Кошель) под руководством заведующей Сусловой Т.А. HLA-типирование локусов A, B осуществлялось согласно протоколу исследования и консультациям научного директора Welsh Bone Marrow Donor Registry C. Darke. Материал для совместной статьи предоставлен заведующей ревматологическим дневным стационаром ГБУЗ «Городская клиническая больница №1» Девальд И.В.

Положения, выносимые на защиту В качестве этногеографических маркеров потенциального риска развития активных форм туберкулеза у русских Челябинской области могут использоваться комбинации генов (в терминах изменения аллельных частот) системы HLA: A*02, A*24, DRB1*16, и гаплотипов A*24-DRB1*16, DRB1*16-DQA1*01:02-DQB1*05:02.

Гены DRB1*16 и DRB1*03, находящиеся в неравновесном сцеплении с аллелем TNFА(-308)*А, и расширенный анцестральный европеоидный гаплотип AH 8.1., в состав которого входит высокопродуктивный аллель TNFА(-308)*А, могут рассматриваться у русских Челябинской области в качестве маркеров потенциального риска развития активного туберкулеза легких и его тяжелых клинических форм (фиброзно-кавернозный, инфильтративный в фазе распада, экссудативный плеврит).

Варианты клинических фенотипов туберкулеза ассоциированы у русских Челябинской области с определенной совокупностью комбинаций генов, генотипов и гаплотипов системы HLA, цитокинов, и, в меньшей степени, TLR, что позволяет установить паттерны генов иммунновоспалительного ответа хозяина, реализованного в конкретных клинических фенотипах с различным потенциалом поражения легких: фибрознокавернозном, инфильтративном и очаговом, которые можно использовать в качестве прогностических маркеров предрасположенности индивидуума к развитию тяжелой прогрессирующей или легкой формы заболевания.

Научная новизна Впервые проведен анализ частот распределения генов системы HLA и их сочетаний у больных активным туберкулезом легких русских Челябинской области и установлено, что комбинации генов системы HLA А*02, A*24, DRB1*16, и гаплотипов A*24-DRB1*16, DRB1*16-DQA1*01:02DQB1*05:02, можно использовать в качестве этногеографических маркеров потенциального риска развития активной формы заболевания.

Впервые показано, что гаплотипы генов системы HLA, в составе которых присутствует высокопродуктивный аллель TNFА(-308)*А:

HLADRB1*16-TNFА(-308)*А, HLADRB1*03-TNFА(-308)*А анцестральный европеоидный AH 8.1., могут рассматриваться у русских Челябинской области в качестве маркеров потенциального риска развития активного туберкулеза и его тяжелых клинических форм: фибрознокавернозной, инфильтративной в фазе распада и экссудативного плеврита.

Впервые установлены особенности распределения у больных туберкулезом русских Челябинской области генов и их комбинаций: системы HLA, цитокинов и TLR, что позволило описать паттерны генов иммунновоспалительного ответа хозяина, реализованного в конкретных клинических формах: фиброзно-кавернозной, инфильтративной и очаговой, и предложить их в качестве маркеров прогноза предрасположенности к тяжелому прогрессирующему или легкому течению заболевания, которые могут быть использованы при разработке новых направлений в создании основ персонализированной профилактики и лечения.

Теоретическая и практическая значимость работы исследованиях по направлениям биологии и медицины: «Молекулярная медицина», «HLA и болезни», «Инфекционные болезни». На основе полученных данных можно оценить индивидуальный риск развития активного туберкулеза легких и осуществить прогнозирование тяжести течения заболевания, что позволит разработать новые подходы к персонализированной профилактике и лечению.

Внедрение результатов исследования в практику Результаты работы внедрены в учебный процесс: используются при преподавании отдельных тем курса иммунологии на биологическом факультете ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет».

Полученные данные о распределении аллелей и гаплотипов HLA в международную базу данных Allele Frequency Net Database (AFND).

Публикации Автор имеет 28 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 15 работ общим объемом 2,5 печатных листов, в том числе публикации в научных журналах, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов для опубликования основных научных результатов диссертаций, а также 1 работу в зарубежном научном издании, входящем в международные базы цитирования, 5 работ опубликованы в материалах всероссийских и международных конференций и 6 статей в других научных журналах и изданиях.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 104 страницах, проиллюстрирована таблицами, 3 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием клинического материала и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 156 источников, в том числе 28 отечественных и 127 зарубежных.

1.1. Полиморфизм иммунокомпетентных генов хозяина как фактор риска развития различных клинических форм туберкулеза легких Рассматривая проблему перехода от состояния персистенции к развитию разных клинических форм туберкулезной инфекции, вероятно, нельзя четко разграничить значение биологических свойств МБТ и иммунной системы макроорганизма. Благоприятный исход туберкулезной инфекции, с одной стороны определяется патогенностью штамма возбудителя, с другой – адекватным противоинфекционным ответом со стороны системы иммунитета. Недавно было продемонстрировано, что различные генотипы M.tuberculosis индуцируют разные паттерны инфекционного ответа хозяина [73], и могут быть ассоциированы с формированием многообразных клинических фенотипов заболевания. В тоже время развитие активного ТБ, вызванного определенными штаммами МБТ, связано с генетическими факторами хозяина, в частности генами системы HLA [129]. Одна из причин многообразия клинических форм туберкулеза легких: начиная от небольших гранулем, казеозных гипоксических поражений с незначительным содержанием бактерий, до сжиженных полостей с массивной нагрузкой реплицирующих организмов и внелегочных милиарных комплексов [76] – генетический полиморфизм генов хозяина, участвующих в иммунном ответе на МБТ [50, 52], оказывающих решающее влияние на форму взаимодействия МБТ и организма хозяина. Ряд исследований показал, что вклад генетической составляющей хозяина в развитие клинически активного туберкулеза у человека составляет от 36 % до 80% [105].

С середины 80-х годов было проведено множество исследований, направленных на идентификацию генов чувствительности к прогрессии развития клинических форм ТБ или на поиск доказательств уже опубликованных ассоциаций [46]. На современном этапе выявлен ряд генетических маркеров повышенной чувствительности к туберкулезной инфекции. Это полиморфизмы генов цитокинов IL12, IL1, IFN, TNFA, IL10, генов молекул костимуляции CD40/CD40L, NRAMP1, VDR, MBL, а также HLA и TLR [37, 38, 121]. Но полученные результаты исследований различаются между популяциями [91]. Индивидуальные сочетания аллелей генов, способствующих формированию активных форм туберкулеза, являются уникальными для каждой популяции, что может быть одной из причин невоспроизводимости в разных выборках результатов анализа сцепления болезни с маркером [1]. На генетический полиморфизм популяций значительное влияние оказали эпидемии, имевшие место на протяжении всей истории человечества, выступающие в качестве факторов селективного давления, что не могло не сказаться на формировании популяционных генотипов [41, 73], в результате которых возникли межпопуляционные и расовые различия в отношении чувствительности к развитию активных форм ТБ. Известно, что негроиды, северные народы и эскимосы более восприимчивы к туберкулезу, чем европеоиды, возможно в связи с тем, что туберкулез был эндемичен для Европы гораздо более длительный период и естественный отбор способствовал формированию у европейцев особого генетического профиля, снижающего риск развития активных форм ТБ [104].

Этническая принадлежность – мощная детерминанта развития клинических фенотипов ТБ [114], что делает необходимым выбор популяции для исследования.

Существование групп риска развития активных форм туберкулеза требует создания новых стратегий проведения вакцинации и алгоритмов для прогноза развития различных клинических фенотипов с учетом генотипа хозяина и МБТ, а также негенетических факторов [105]. Исследование генетических детерминант чувствительности развития активных форм ТБ позволяет определять индивидуальный прогноз инфекционного заболевания, изучать его патогенез и потенциальные мишени для терапевтического вмешательства [58].

1.2. Участие полиморфизмов генов системы HLA и их продуктов в развитии клинически активных форм туберкулеза легких Широкомасштабные геном-ассоциированные исследования, продемонстрировали наличие высокой, даже доминирующей роли (в некоторых случаях) вариантов генов и гаплотипов системы HLA в прогрессии ряда таких инфекционных заболеваний, как ВИЧ-инфекция, лепра, гепатит В и незначительной в отношении гепатита С, малярии, туберкулеза [144].

Комплекс генов HLA расположен на коротком плече 6-й аутосомной хромосомы и содержит более 220 генов [122]. Со времени открытия системы гистосовместимости распределение генов HLA у больных ТБ исследовалось в различных популяциях. Несмотря на масштабность проведенных исследований, высокую полиморфность системы HLA, у представителей многих национальностей выявлено повышение частоты HLA-DR2 серологической специфичности у больных туберкулезом, в которую входят гены HLADRB1*15 и 16 [21, 91].

Но изучение проблемы ассоциации генов HLA с чувствительностью к активным формам туберкулеза не ограничивается только поиском генетических маркеров. Одним из основных и, по-видимому, чрезвычайно перспективных ее аспектов является установление механизмов, лежащих в этих основе ассоциаций [20]. Существует ряд предположений о связи конкретных HLA - специфичностей с развитием предрасположенности к клиническим формам ТБ. Во-первых, полиморфизм системы HLA влияет на экспрессию HLA на клетках, что отражается на качестве презентации микобактериальных антигенов [48]. Во-вторых, определенные полиморфные варианты HLA вызывают супрессию иммунного ответа на микобактерии, стимулируя формирование Th2-типа иммунного ответа [75], что приводит к гиперфункции гуморального звена иммунитета, преобладание активности механизмов которого при туберкулезе, можно рассматривать как один из прогностически неблагоприятных факторов иммунопатогенеза основного заболевания [13].

Известны исследования, указывающие на ассоциацию полиморфизмов HLA микобактериального пептида зависит от строения 57 цепи Р9-связывающего кармана. В своих исследованиях Delgado et al. установили ассоциацию легочного туберкулеза с HLA DQB1*05:03 в Камбоджи и выяснили, что этот ген кодирует аспарагиновую кислоту в HLA-DQ 57 вместо аланина.

Презентация ESAT46-60 (основного антигена МБТ) HLA-DQ с 57-Asp по сравнению с HLA-DQ с 57-Ala способствует значительно меньшей секреции IFN CD4+ T-клетками и существенному различию в эффекторном ответе Т-клетки [56]. Эти результаты объясняют функциональные различия в прогрессированию легочного туберкулеза.

Следующим механизмом ассоциации полиморфизма HLA с развитием клинически активного туберкулеза легких является взаимосвязь туберкулезом легких с DRB1*12 геном повышена продукция IL10 и снижена продукция IFNy [59], - с DRB1*03 - повышена продукция IFNy, - с DRB1* - повышена продукция IL12p40, - с DRB1*04 - повышена продукция IL [135].

Особый интерес представляет накопление данных об эффективном использовании терапии с учетом индивидуальных полиморфных сайтов генов HLA у больного. Для носителей маркерных специфичностей (DRB1*16, DRB1*12), на основании анализа снижения уровня IFN и целесообразным включение в комплексную терапию при ТБ селективных многообещающи в плане использования генотипирования по системе HLA с целью индивидуального подбора адекватной терапии для больных клинически активным туберкулезом.

1.3. Роль факторов врожденного иммунного ответа в развитии Большинство эпидемиологических данных поддерживают роль врожденного иммунного ответа в развитии туберкулеза [145], т.к. адекватное сетевое взаимодействие его факторов в большинстве случаев приводит к элиминации патогена. Однако гиперактивация или угнетение механизмов врожденного иммунитета может вызвать развитие патологического процесса [7]. Если действие адаптивного иммунного ответа основано на распознавании индивидуальных антигенов (и в этом ведущая роль принадлежит HLA), то формирование врожденного иммунного ответа основано на распознавании образов патогенности - консервативных в эволюционном отношении молекул, присущих одновременно большим систематическим группам микроорганизмов [26]. Взаимодействия между Toll-подобными рецепторами и другими рецепторами, распознающими образы патогенности на МБТ, такими как маннозный рецептор, DC-SIGN и NOD, может привести к нескольким возможным биологическим результатам, включая секрецию цитокинов, модуляцию адаптивного иммунного ответа, быструю клеточную дифференцировку, апоптоз и прямую антимикробную активность [86, 98].

Toll-подобные рецепторы (TLRs) являются ключевыми участниками врожденного иммунитета против микобактерий, являясь основными посредниками между микобактериями и макрофагами [31, 117]. В настоящее время различные авторы насчитывают 11 TLR у человека [71]. TLR1, TLR2 и TLR6 выполняют свои функции в составе гетеродимеров TLR2/TLR1 и TLR2/TLR6 [28]. Основными участниками иммунного ответа на микобактерии являются TLR2 и TLR4 [153].

TLR2 играет важную роль в иммунном ответе на микобактерии путем инициации ответа через увеличение продукции TNF и IFN макрофагами, в составе гетеродимера TLR2/TLR6 стимулирует продукцию IL1 и играет важную роль в стимуляции продукции IL12 макрофагами [148]. Длительная сигнализация TLR2 на липопротеиды МТБ ингибирует МНС II [72, 138], таким образом, инфицированные макрофаги не презентуют микобактериальные антигены CD4+ Т-клеткам, что ведет к недостаточной активации эффекторных Т-клеток, приводящей к уклонению возбудителей от иммунного надзора и созданию ниш, где МТБ выживают и сохраняются [86;

108, 138]. Лигандами для него являются компоненты микобактериальной стенки, такие как LAM, LM, 38-kDa, и 19-kDa микобактериальные липопротеины и фосфатидилинозитол маннозид (PIM), с которыми TLR взаимодейстует в виде гетеродимеров (с TLR1 или TLR6) [128, 134].

Лигандами для TLR4 являются липополисахарид и белки фильтрата культуры микобактерий, TLR4 также активируется белком теплового шока 60/65,который выделяется многими видами микобактерий [43].

Регуляция экспрессии, интенсивности и продолжительности TLR активации является решающей в определении исхода микобактериальной инфекции. Изменение в структуре рецепторов в результате SNPs часто ведет к ассоциации с различными инфекционными заболеваниями [94], в том числе и с туберкулезом [139, 155].

приблизительно 89 SNPs, 26 из них в 5'-транслируемом регионе, 17 в 3'транслируемом регионе, 29 локализовано в интронной части гена, и 17 на третьем экзоне TLR2 [137]. Из них шесть смысловых SNPs TLR2 связаны с заменой аминокислоты в цитозольной части рецептора, включая 5 SNPs в пределах TIR домена (аминокислоты 643-784). Эти полиморфизмы ведут к понижению активации NF-КВ, а значит к повышению восприимчивости к инфекции [137]. Первый смысловой TLR2 SNP состоит в С-Т замене в нуклеотиде 2029 от кодона TLR2 с заменой аргинина (Arg; R) триптофаном (Trp; W) в позиции 677. Данный полиморфизм связан с отрицательной мутацией Pro681His гена TLR2, которая блокирует связывание сигнальной молекулы MyD88 с TLR2 [101]. Полиморфизм TLR2 Arg677Trp присутствует у представителей азиатской и африканской популяции и с низкой частотой встречается среди кавказоидов [83].

Известна ассоциация данного полиморфизма с клиническими формами туберкулеза в популяции Туниса [38]. Существуют данные об ассоциации Arg677Trp полиморфизма с другим заболеванием, вызванным микобактериями - лепроидной лепрой в корейской популяции [88].

Пациенты, несущие мутантный TLR2Arg677Trp аллель, имеют пониженный уровень IL12 в сыворотке, что может быть одним из механизмов ассоциации между этим вариантом TLR2 и клинически активным туберкулезом [137].

Второй функциональный вариант TLR2 состоит из замены G/A в нуклеотиде 2257 от стартового кодона TLR2 с заменой аргинина (Arg) глутамином (Gln; Q) в позиции 753. Этот полиморфизм TLR2 был идентифицирован у 3 % здоровых кавказоидов [100]. Наиболее высокая частота встречаемости характерна для немцев (9,4%) [130]. В результате конформационных изменений в TIR-домене и нарушения передачи сигнала с TLR2 происходит снижение выработки провоспалительных цитокинов и активное распространение инфекции среди носителей маркерного аллеля по сравнению с носителями аллеля дикого типа [103]. Полиморфизм TLR сигнальными молекулами Mal и MyD88 [152], что ведет к уменьшению клеточной активации в ответ на бактериальные пептиды, а значит, снижает иммунный ответ хозяина [100]. Известна ассоциация активного туберкулеза легких с полиморфизмом TLR2Arg753Gln в турецкой популяции [55, 109].

Гены TLR 4 локализованы на 9 хромосоме 9q33.1. Для TLR 4 описаны 28 несинонимичных и 7 синонимичных SNP. Наиболее изучены из них два несинонимичных полиморфизма TLR4, переход A/G в SNP rs4986790, который вызывает замену Asp/Gly в аминокислоте 299 и переход C/T в SNP rs4986791, с заменой Thr/Ile в точке 399 белка [139]. Полученные положения приводят к изменениям в лиганд-связывающем и корецептор-связывающем сайтах рецептора, т.е. во внеклеточном домене, что нарушает передачу сигнала при контакте с липополисахаридом [85]. Оба положения найдены в косегрегации в кавказоидных популяциях. Самая высокая частота встречаемости аллеля TLR4 Asp299Gly в африканских популяциях 10% из них только у 2 % присутствует TLR4 Thr399Ile [84.].

фенотипом, тогда как TLR4 Asp299Gly / TLR4 Thr399Ile гаплотип не имеет функциональных отличий от дикого типа TLR4. Эволюционно нейтральный гаплотип TLR4 Asp299Gly / TLR4 Thr399Ile в различных популяциях распространен в пределах от 0% в азиатских популяциях, 1-2% в африканских популяциях (протективный против малярии), и 5% у голландцев, до 9% у басков [69, 84].

У носителей мутантного аллеля TLR4 Asp299Gly замечена ассоциация со снижением эффективности иммунного ответа в воздухоносных путях за счет снижения экспрессии TLR4 на воздухоносном эпителии и альвеолярных макрофагах [131], что ведет к снижению продукции IL1a и TNF и повышает риск инфекции [33, 130]. Последние исследования показали, что TLR4 может также активировать регуляцию провоспалительного сигнала белка теплового шока 65 [43], секретируемого многими видами MБТ [139].

Известно об ассоциации данных полиморфизмов с клинически активным туберкулезом у мексиканцев [123], у ВИЧ-инфицированных кавказоидов Средиземноморья [116], в Танзании у ВИЧ позитивных индивидуумов [70].

1.4. Участие полиморфизмов генов цитокинов и их продуктов в развитии клинических форм туберкулеза легких Цитокины играют ключевую роль в защите против МБТ [115].

Макрофаги инициируют фагоцитоз МБТ и регулируют иммунные реакции опосредовано через провоспалительные цитокины, такие как TNF.

Эффекторные Т-лимфоциты и ЕК секретируют IFN, который активирует альвеолярные макрофаги и повышает продукцию ими реактивных соединений азота и кислорода [90]. IL12 секретируется главным образом макрофагами и дендритными клетками, играет ключевую роль в иммунной реакции на МБТ, объединяя врожденный и адаптивный иммунитет. Кроме того, IL12 индуцирует Т-клетки и ЕК для продукции провоспалительных цитокинов, таких как IFN и TNF, а также регулирует выработку IL17 [80].

Синергическое действие IFN, IL12, TNF и IL17 активирует макрофаги и усиливает внутриклеточный киллинг патогенов, действуя в качестве основных эффекторных механизмов клеточного иммунного ответа [127], однако, уровни продукции определенных цитокинов, таких как TNF, способны модифицировать антибактериальный эффект и создавать неадекватный разрушительный для тканей хозяина ответ [145].

иммунологических реакций при туберкулезе значительное место отводится IL1, воспаления в легких [11]. Недостаточная продукция цитокина ведет к снижению эффективности иммунного ответа на микобактерии [12].

Гиперпродукция IL1 вызывает избыточное воспаление и, как результат, повреждение тканей [92]. Существуют различия в продукции IL1 в группах с разными клиническими фенотипами заболевания [25].

Семейство IL1 включает два агониста - IL1a и IL1 и их специфический антагонист IL1RА [12]. Гены, кодирующие IL1a, IL1 и IL1RА, картированы на длинном плече хромосомы 2 в области q14. IL1a и IL1 кодируются разными генами, но имеют гомологию в аминокислотной биологической активностью [11]. IL1Rа, кодируемый геном IL1RА, является эндогенным ингибитором IL1 [34.].

В промоторном регионе гена IL1 показаны точечные замены в позициях -35 и -511. В кодирующей части гена описан полиморфизм в пятом экзоне в позиции +3953 [16]. У лиц, гомо- или гетерозиготных по высокопродуцирующему аллелю IL1(+3953)*T, продуцируется, соответственно, в 4 и 2 раза большее количество этого цитокина, чем у лиц, гомозиготных по немутантному варианту этого гена (+3953*С) [10].

В гене IL1RA известен минисателлитный полиморфизм вариабельность по числу 86-членных тандемных повторов (VNTR) во 2-м интроне, для которого известно существование пяти аллелей [49].

Согласно данным популяционных исследований, вариант IL1RA*2R чаще встречается в ассоциации с нормальным вариантом гена IL1(+3953) (IL1(+3953)*C) и редко присутствует совместно с высокопродуцирующим вариантом - IL1(+3953)*T. Феномен такого наследования объясняется тем, что эти варианты генов, расположенных близко друг к другу, наследуются, как правило, совместно [10]. Чаще всего встречается аллель IL1RА*2R (21% населения), носительство которого связано с повышенной секрецией IL1RA во время воспаления [150] и IL1RА*4R (74% населения), на остальные приходится только 5% случаев [39]. Широкая распространенность аллеля 2R гена IL1RA среди популяций позволяет гетерозиготам 4R/2R быть наиболее устойчивыми к туберкулезу легких. Гомозиготы 2R/2R намного чаще подвергаются различным инфекционным и воспалительным заболеваниям [81].

Анализ полиморфизма кластера генов IL1 (IL1B, IL1RN) показал противоречивые результаты. У африканцев развитие клинически активного туберкулеза ассоциировано с аллелем IL1RА*2R [37], у башкир с генотипом IL1RА*4R/4R [11], у русских с IL1RА*2R и IL1(+3953)*С/T [23]. В других исследованиях не было найдено различий в частотах генотипов IL1RN и IL между выборками больных легочным туберкулезом и группой сравнения [102, 150].

IL1RА*2R/IL1 (+3953)*Т гаплотипа с низкой экспрессией IL1RА и повышенным уровнем IL1, что проявляется в провоспалительном фенотипе и сильной реакцией Манту [23].

Несмотря на то, что механизм подобной ассоциации остается малоизученным, генотипирование IL1 может иметь диагностическое и прогностическое значение при целом ряде заболеваний.

IL10 является противовоспалительным цитокином, который предотвращает альтерацию тканей при избыточном воспалении в ответ на МБТ [119], подавляя производство IFN, секрецию TNFA и оксида азота [140]. Гиперпродукция IL10 детерминирует гуморальный иммунный ответ, малоэффективный в отношении МБТ [59], блокирует созревание фагосом в макрофагах[111] и препятствует формированию гранулемы, тем самым способствует диссеминации туберкулезной инфекции[18].

полиморфностью гена IL10. Ген IL10 локализован на первой хромосоме в участке 1q31-32 [47], содержащем 5 экзонов [142]. В результате секвенирования были выявлены полиморфные участки промотора этого гена, в том числе IL10G и IL10R из 5 -фланкирующего региона, различающиеся количеством СА-повторов [63, 64, 65]. Установлены варианты точечных замен в 5 -фланкирующем регионе гена IL10: А-3533Т, А-2769G, A-2739G, A-2013G, A-1349G, C-1255T, A-815G, A-657G [54].

Среди восьми новых аллельных вариантов гена аллели -2769G и -1255Т очень редки. В 1997 году описаны шесть полиморфизмов гена IL10 в позициях -819, - 592, -652, -127, -41 относительно транскрипционного сайта [142]. Показаны аллельные варианты в позиции Т-854С и С-627А, а также полное сцепление аллелей -854Т и -627А.

Самые важные биаллельные замены (SNP) в позициях от сайта транскрипции -1082, -819, -592 и 2 микросателлитных полиморфизма [142].

Большинство исследований сообщают, что на уровень цитокина в сыворотке влияют полиморфизмы в позиции IL10(-1082)*G/A [120], C/A [95, 126] и -819*C/T [82]. Обнаружена корреляция точечных мутаций, лежащих в промоторном регионе гена IL10 в позициях -1082 и с уменьшением продукции цитокина, т.к. они лежат внутри ETSподобного сайта узнавания [16], а в позиции -819 - с увеличением продукции цитокина IL10 [82]. Данные полиморфизмы находятся в сильном неравновесном сцеплении и образуют гаплотипы GCC, ACC и ATA.

Гаплотип GCC связан с избыточным производством IL10, а ATA – с низким IL10 в культуре периферической крови мононуклеарных клеток [82].

Частота аллеля IL10(-1082)*G намного выше у кавказоидов (>0,36) [99, 133], чем в азиатских популяциях (корейской) (0,07) [56]. Наличие гетерозиготного гаплотипа ведет к увеличению продукции IL10, что снижает защиту против микобактерий за счет супрессии Th1 [29].

туберкулезу являются IL10(-1082)*G/A в разных популяциях [37; 56; 99; 102, 133], -1082*G - в Турции [35], -1082*A/A - в Египте и Колумбии, -592*A - в Корее [110] и в России [18]. В популяции Гонконга с развитием активных форм туберкулеза легких ассоциирован гаплотип -1082*G/-819*C/-592*C [140].

В других работах сообщается о связи полиморфизмов гена IL10 с благоприятных исходом: для больных с IL10(-1082)*A и IL10(-1082)*А/А характерно обызвествление туберкулы [113].

Во многих исследованиях не были обнаружены достоверные различия в полиморфизмах IL10 между больными и контролем [95].

Таким образом, данные об ассоциации полиморфизмов IL10 с развитием клинически активного туберкулеза противоречивы.

TNF является ключевым Th1-цитокином, участвующим в регуляции механизмов иммунного ответа на M. tuberculosis, локальное высвобождение которого приводит к усилению хемотаксиса клеток, активации фагоцитоза, повышенной продукции провоспалительных факторов, реэкспрессии молекул HLA I/II, сдвигу цитокинового баланса в сторону Th1, формированию гранулемы [96, 107]. Роль TNF при туберкулезной инфекции неоднозначна и во многом определяется его количественным содержанием в тканях [6, 18].

Дефицит продукции медиатора опосредует тяжелое течение инфекционного процесса, что сопровождается глубокой дисрегуляцией иммунного ответа с нарушением процесса гранулемообразования, т.к. низкая продукция TNF недостаточна для активизации макрофагов неспособностью контролировать рост M. tuberculosis, вследствие чего вероятно развитие тяжелых, остропрогрессирующих форм заболевания [18]. Альтернативно, повышенная продукция TNF приводит к лизису макрофагов [123] и способствует активному росту микобактерий в моноцитах через усиление экспрессии микобактериальной мРНК [107], в результате чего M. tuberculosis высвобождаются в экстраклеточное пространство, с последующей диссеминацией возбудителя по всему организму. Таким образом, во время туберкулезной инфекции важно поддержание баланса продукции TNF, который необходим для нормального иммунного ответа на микобактерии, т.к.

гиперпродукция его усиливает прогрессирование туберкулеза через каскад деструктивных изменений в легких, вызывая локальные повреждения тканей, фиброз и образование полостей распада [107].

Продукция TNF во многом определяется полиморфизмом гена TNFA.

Ген TNFА расположен на 6 хромосоме в локусе, внутри кластера генов III класса HLA между HLAB и HLADRB1 генами в позиции 6р23-q12 и находится в неравновесном сцеплении с генами HLAII класса [15]. Наиболее изученным является гаплотип гена TNFA(-308) с локусом HLA DRB1[15], входящий в состав расширенного анцестрального европейского гаплотипа АН 8.1. (HLA-A*01, B*08, TNFA(-308), BfS, C4AQ0, C4B1, DRB1*03, DQA1*05:01, DQB1*02:01), обусловленной гиперпродукцией цитокина и, с одной стороны, способствует устойчивости носителей гаплотипа к инфекционным заболеваниям, а с другой - обусловливает развитие более 30 аутоиммунных патологий [97].

Различают гены TNFA и TNFB (LT), которые лежат на расстоянии примерно 1.2 кб друг от друга [36]. Ген TNFA является одним из самых полиморфных генов цитокинов. Его промоторно-энхансерная область содержит от 9 до 13 полиморфных сайтов типа SNPs, наиболее известными среди которых являются транзиция G/A в точках -376, -308, - 238, -163;

транзиция T/C и C/T в сайтах -1031, -857, и трансверсия C/A -863. Кроме того, транскрибируемая часть гена содержит полиморфизмы типа SNP (+70, +467, +488, +851, +943 +1304) и микросателлиты [78, 143]. Однако, наиболее значимые для человека – это замены гуанина на аденин в положениях -308 и -238. Позиции -308 и -238 приходятся на промотор, что сказывается на возможности транскрипционных факторов связываться с этой частью гена и, таким образом, влиять на скорость транскрипции [19]. Данные нуклеотидные замены – явление достаточно распространенное, к примеру, среди белых европейцев около 27-33% в своем генотипе содержат полиморфный аллель TNFA(-308)*А и около 7-10% - аллель TNFA(-238)*А. Аллель TNFA(А является более сильным активатором транскрипции с 6–7-кратным повышением индуцируемого уровня транскрипции гена TNFA [151]. Наряду с этим, другой полиморфный вариант гена - TNFA(-238)*А ассоциирован с пониженной продукцией TNF [19, 87].

Исследования, посвященные связи аллелей и генотипов гена TNFA с развитием активных форм туберкулеза дают противоречивые результаты.

Полиморфный аллель TNFA(-308)*А является фактором риска развития активного туберкулеза у башкир [3], азиатов [149]. В исследованиях Correa P.

et al., развитии данного заболевания в Колумбии [51] и Сицилии [133].

Исследование под руководством Selvaraj Р. (2001) показало, что TNFA(-308) и TNFA(-238) сами по себе не только не играют никакой роли при развитии клинических форм туберкулеза, но даже оказывают протективное действие на первых этапах заболевания в составе гаплотипа с геном HLA В*17 [136], на стадии же иммунного ответа наличие подобного генотипа у пациентов способствует ухудшению состояния и возникновению рецидивов.

Таким образом, благодаря широкомасштабным геномным исследованиям были идентифицированы многие общие варианты генов, ассоциированные с чувствительностью к развитию активных форм туберкулеза, входящих и не входящих в ГКГС, в различных популяциях.

Представленная работа является продолжением исследований генетического компонента ТБ и направлена на поиск маркеров потенциального риска развития клинических фенотипов туберкулеза легких на основе изучения полиморфизма генов системы HLA, цитокинов и рецепторов врожденного иммунного ответа TLR у больных русской популяции Челябинской области.

«Популяционная иммуногенетика. Исследование полиморфизма генов иммунного ответа: генов гистосовместимости, генов стресса и генов цитокинов этнических групп Южного Урала» (№ государственной регистрации 01201257623).

В качестве исследуемой нами была выбрана популяция русских, которая является преобладающей в национальном составе Челябинской области [156].

Исследуемую группу составили 86 больных туберкулезом легких русской национальности, находящихся на стационарном лечении в Государственном бюджетном учреждении здравоохранения «Челябинский областной клинический противотуберкулезный диспансер». Постановка диагноза проводилась на основе клинико-рентгенологических показателей врачами-фтизиатрами ГБУЗ «ЧОКПТД». В исследование включены больные из русской популяции, проживающие на территории Челябинской области.

Характеристика обследованных лиц представлена в таблице 1.

Таблица 1-Характеристика обследованных лиц Обследованные количество Среди больных, согласно российской клинической классификации (Российская клиническая классификация, Приказ МЗ РФ от 21.03.2003 N 109), выделены группы, представленные в таблице 2.

Таблица 2 - Клиническая характеристика больных туберкулезом легких Бактериовыделение зафиксировано у 73% больных.

Мы проводили сравнение иммуногенетических показателей только в трех группах больных с различной степенью поражения органа-мишени: с инфильтративной (ИФ), очаговой (ОФ) и фиброзно-кавернозной (ФКФ) формами туберкулеза легких, в связи с малым количеством больных с другими клиническими фенотипами заболевания.

Группу с очаговой формой составили больные с наличием очагов, локализующихся на ограниченном участке (< 1 см) одного легкого и малосимптомным клиническим течением.

Группу с инфильтративной формой составили больные с инфильтратами более 1 см. в одном или в двух легких и малосимптомным течением заболевания (32,08%), а также распространенными инфильтратами в фазе распада (67,92%) с бактериовыделением и клиническими проявлениями.

Группу с фиброзно-кавернозной формой составили больные с хроническим течением, характеризующиеся наличием в легких каверны или каверн с выраженной фиброзной капсулой и фиброзными изменениями в окружающей каверну легочной ткани, наличием очагов бронхогенного отсева и постоянным бактериовыделением.

Контрольные группы:

В качестве контрольных групп использовали популяционные выборки, сформированные случайным образом на основе ДНК-банка потенциальных доноров стволовой клетки ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови»: 239 для HLA-типирования и 85 для определения SNP полиморфизмов представителей русской популяционной группы, проживающих в г. Челябинске и Челябинской области, данные представлены в таблице 1. Популяционная принадлежность определялась по данным генеалогического анамнеза до третьего поколения (согласно рекомендациям 8-го Международного Симпозиума в 1980г., Лос-Анджелес, США).

Группы больных и контроля имели одинаковый социоэкономический статус (социально-адаптированные слои населения).

Экспериментальная часть работы представлена на рисунке 1.

Рисунок 1 - Схема эксперимента Выделение ДНК проводили из венозной крови, взятой в пробирки с 0,5% раствором калиевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), с использованием реагентов PROTRANS DNABox 500. Для амплификации использовали приборы 9700 GeneAmp Applied Biosystems (США) и «Терцик» НПФ «ДНК-Технология».

Определение полиморфизма генов HLA проводилось методом молекулярного типирования – PCR SSP наборами НПФ «ДНК-технология»;

наборами реагентов Protrans (Protrans, Germany), по методикам, описанным в статьях Olerup O.[112] и Downing J [61]. Последовательности праймеров для определения полиморфизма HLA синтезированы в ООО «Синтол» (ООО «Синтол», г. Москва). Реакционная смесь для постановки ПЦР-реакции включала dNTP, буфер "Red", MgCl2 (ООО"Синтол", г. Москва).

Типирование VNTR в гене IL1RА проводили методом прямой ПЦРамплификации с помощью набора реагентов, синтезированных в институте Химической Биологии и Фундаментальной Медицины (ИХБиФМ СО РАН), г. Новосибирск. Для определения VNTR в гене IL1RА использовали ПЦР с праймерами, фланкирующими полиморфный регион в пределах второго интрона, в котором находится вариабельное число тандемных повторов с участком 86 п.н. Для VNTR IL1RA в результате амплификации мы идентифицировали фрагменты ДНК размером 438, 524, 610, и 696 н.п.

соответственно с 2, 3, 4 и 5 копиями тандемных повторов. Эти аллели были обозначены как 2R, 3R, 4R и 5R, редкий аллель 6R не был обнаружен.

Типирование SNPs IL1 (набор реагентов ИХБиФМ СО РАН), TNFА, TLR2 и TLR4 проводили с использованием метода ПДРФ (Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов), состоящего из амплификации интересующего участка и последующей обработки эндонуклеазой рестрикции (список приведен в Таблице 3). Последовательности праймеров для определения SNPs в генах TNFA, TLR2 и TLR4 синтезированы в ООО "Синтол". Реакционная смесь для постановки ПЦР-реакции включала dNTP, буфер "Red", MgCl2 производства "Синтол", г. Москва.

Полиморфизм гена IL-10 в точках -1082G/A, -819C/T, -592C/A оценивался с использованием готовых диагностических наборов для определения полиморфизмов в геноме человека фирмы "Литех", Россия.

Таблица 3 - Характеристика полиморфных сайтов исследуемых генов Ген Исследуемый Характеристика, рестриктазы, аллели, HLAII(DRB1,DQA1, Наборы реагентов «HLA-ДНК-ТЕХ»

Статистическую обработку результатов исследований проводили на персональном компьютере с применением пакета прикладных программ «непараметрические критерии» (критерий Пирсона, критерий Пирсона с поправкой Йейтса, точный двусторонний критерий Фишера), программы Ms Excel пакета Ms Office 2010 для расчета критериев отношения шансов, относительного риска и поправки Бонферрони[8], компьютерной программы Arlequin 3.5. для расчета частот гаплотипов и неравновесного сцепления (D') методом максимального правдоподобия, программного пакета PAST 2.17с для многомерной ординации SNP полиморфизмов методом канонического анализа соответствий (CCA).

Критериями для анализа служили [8]:

1. Частота аллеля/ специфичности.

АА – число гомозигот по аллельному варианту А; АВ, АС – число гетерозигот, несущих аллель А.

Частота – процент от общего числа обследованных лиц в выборке, умноженного на два.

2. Частота гена - количество определенного аллеля данного гена в выборке, выраженное в процентах к общему числу известных аллелей этого гена.

где Px - частота гена;

Аx - частота аллеля/ специфичности.

3. Частота генотипа – процент от общего числа обследованных лиц в выборке.

4. Частоты сочетаний генотипов – процент носителей определенных генотипов двух генов от общего числа обследованных лиц.

5. Показатель отношения шансов (OR) – отношение шансов события в одной группе к шансам этого же события в другой группе.

Прежде чем анализировать вклад генов HLA, IL1RА, IL1, IL10, TNFА и TLR2 и TLR4 в предрасположенность и клинические варианты туберкулеза проверяли соответствие частот их генотипов в каждой группе равновесию Харди-Вайнберга с помощью процедуры «сравнение наблюдаемых и ожидаемых частот» для расчета критерия 2 и уровня значимости (р): модуль «непараметрическая статистика», раздел «наблюдаемые частоты в сравнении с ожидаемыми». При р>0,05 нулевая гипотеза о совпадении наблюдаемой и