«ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ У ЛИЦ, ПОДВЕРГШИХСЯ ХРОНИЧЕСКОМУ РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ ...»

периферической крови наряду с моноцитами являются радиорезистентными клетками [21, 89, 205].

Как отмечалось выше, ГСК и клетки-предшественники являются основной мишенью при действии ИР. Радиационно-индуцированное истощение пула ГСК и клеток-предшественников приводит к повышению пролиферативной активности сохранивших жизнеспособность клеток ККМ, повышенной скорости репарации сублетальных повреждений, ускоренному прохождению клеточного цикла костномозговыми предшественниками и, в конечном счете, к стимуляции гемопоэза. Гемопоэтическое окружение, которое в норме поддерживает гомеостаз пула ГСК, играет важную роль в восстановлении иммуно-гемопоэза после облучения [174]. В процессе репопуляции наибольшая функциональная нагрузка приходится на интактные ГСК и клетки-предшественники. Длительное воздействие ИР может вызвать недостаточность компенсаторных механизмов и привести к снижению эффективности гемопоэза и жизнеспособности функционально зрелых клеток крови [157].

Важно отметить, что после облучения с низкой мощностью дозы наблюдается более полное восстановление гемопоэза, чем при более высоких мощностях [144, 174]. Тем не менее, в некоторых исследованиях показано, что после облучения с низкой мощностью дозы число селезеночных колониеобразующих единиц (КОЕс) не возвращалось к исходным уровням в течение всей последующей жизни животных, что указывает на наличие отдалённых остаточных повреждений ККМ [57]. Действительно, при хроническом облучении ККМ может постепенно заменяться фиброзной тканью, которая способствует снижению его функции [140, 204]. Важно отметить, что сами иммунные, а также сосудистые пострадиационные нарушения играют важную роль в развитии фиброза [221]. Так, в последние годы стало известно, что активированные цитокиновые каскады после облучения могут сохраняться длительное время и приводить к развитию отдаленных воспалительных реакций и фиброза [24, 157]. Имеются также иммунокомпетентных клеток в отдаленном постлучевом периоде [84].

Таким образом, пострадиационное восстановление иммунитета и его состояние в отдаленные сроки определяются выживаемостью ГСК ККМ, способных мигрировать в наиболее пораженные участки гемопоэтической ткани, усилением скорости пролиферации и созревания коммитированных клеток-предшественников, а также полноценностью и жизнеспособностью зрелых иммунокомпетентных клеток.

1.2. Роль нейтрофильных гранулоцитов в поддержании генетического фагоцитирующими клетками врожденного иммунитета и обеспечивают первую линию защиты организма от инфекций, представляют самую предшественников и зрелых нейтрофилов длится 10-15 дней, время нахождения в крови колеблется в пределах 6-12 часов, в тканях – до 5 суток Нейтрофилы наделены рядом свойств (высокая мобильность, [20].

способность к адгезии, наличие большого спектра бактерицидных и цитотоксических продуктов), позволяющих им быстро мигрировать в ткани, эффективно распознавать, поглощать, убивать и переваривать микробные клетки [27, 72]. На ведущую роль нейтрофилов в противоинфекционном иммунитете указал И.И. Мечников, отводя особую роль в элиминации патогенов фагоцитарному процессу. В последующие годы был проведен ряд фундаментальных работ, позволивших подробно исследовать особенности ультраструктуры, метаболизма нейтрофилов, а также описать свойства и функции этих клеток [10, 29, 54, 127, 147, 162].

В настоящее время установлено, что помимо бактерицидных и цитотоксических продуктов нейтрофилы продуцируют целый спектр биологически активных веществ: хемокины, провоспалительные цитокины:

лейкотриены, различные ферменты, низко- и среднемолекулярные пептиды, гормоны, пептиды-антибиотики и другие [71, 72, 98, 99, 115], что позволяет им активно влиять на функции макрофагов, лимфоцитов, эозинофилов, эндотелиоцитов, фибробластов, систему комплемента, калликреинкининовую систему, систему фибринолиза, а также оказывать влияние на функционирование отдельных органов и систем [25]. Особая роль в реализации противомикробной активности нейтрофилов принадлежит пептидам-антибиотикам: -дефенсинам и кателицидинам. Данные субстанции, секретируясь во внеклеточную среду, помимо антимикробной активности могут способствовать развитию гуморального и клеточного иммунного ответа [98]. Кроме того, благодаря своим уникальным свойствам, а также наличию на поверхности клеточной мембраны большого количества рецепторов к различным биологически активным веществам, нейтрофилы быстро реагируют на малейшие изменения постоянства внутренней среды организма, изменяя свою метаболическую активность, модифицируя ультраструктуру. Это является необходимым условием для немедленного ответа клетки на генетически чужеродный объект, поступивший в организм [20].

гранулоцитов являются биоцидная (реализуется в процессах фагоцитоза и секреции), цитотоксическая (основной механизм - антителозависимая клеточная цитотоксичность) и регуляторная. Для осуществления этих функций нейтрофил должен обладать рядом свойств, которые условно делят на три группы: аффекторные (восприятие сигналов), интегративные (трансформация сигналов и развитие пострецепторных событий в клетке) и эффекторные (хемотаксис, адгезивная способность, поглощение и метаболический взрыв) [19].

противоопухолевой защиты организма. С одной стороны известно, что нейтрофилы играют ведущую роль в обеспечении противоопухолевого иммунитета за счет способности распознавать опухолевые клетки, контактно взаимодействовать с ними, и запускать в них процессы апоптоза, либо лизировать их по механизму антителозависимой клеточной цитотоксичности [58, 130, 131, 152, 153]. С другой стороны, нейтрофильные гранулоциты под влиянием опухолевого микроокружения могут секретировать факторы роста, стимулировать продукцию эндотелиоцитами факторов ангиогенеза, тем самым способствуя инвазивному росту опухоли и ее васкуляризации [58, 128,195], а селектин-опосредованная адгезия атипичных клеток к мембране нейтрофильных гранулоцитов может способствовать их гематогенной диссеминации [209].

Для восприятия сигналов и осуществления своих функций нейтрофилы нейтрофилов описано в ряде монографий [25, 27, 71, 98, 175, 184].

Для нейтрофильных гранулоцитов характерным является наличие позволяющие клетке перемещаться в тканях и деградировать поглощенные флавоцитохромы и другие вещества. Состав нейтрофильных гранул также подробно описан в ряде работ [72, 138, 225].

Исходя из вышесказанного становится понятным, что нарушения со стороны хотя бы одной из функций нейтрофилов могут привести возникновению целого ряда патологических состояний [61, 172]. Значимость нейтрофильного звена врожденного иммунитета в жизнедеятельности организма становится отчетливо видна при развитии нейтропений, сопровождающихся целым комплексом инфекционно-воспалительных заболеваний, приводящих нередко к летальному исходу [172].

В настоящее время известно, что для осуществления своих функций нейтрофильные гранулоциты находятся в тесной кооперации с другими клетками иммунной системы, а также с эндотелиоцитами [25, 115]. В недавних исследованиях с использованием метода проточной цитометрии было показано, что примерно 25% нейтрофилов периферической крови ассоциировано с тромбоцитами, образуя, так называемые, тромбоцитарнонейтрофильные комплексы, увеличение которых в крови отмечено в экспериментальной модели системного воспаления [191].

функциональной неоднородности популяции нейтрофильных гранулоцитов периферической крови [15]. Так, по активности НАДФН-оксидазной системы и различиям в адгезивной способности популяция нейтрофилов была разделена на два класса: нейтрофилы-киллеры и нейтрофилы-кейджеры.

Нейтрофилы–киллеры обладают высокой НАДФН-оксидазной активностью и способностью активно продуцировать АФК, поэтому их относят к потенциальным фагоцитам, в то время как нейтрофилы-кейджеры обладают меньшей способностью продуцировать АФК и, вероятно, выполняют транспортную функцию, доставляя фагоцитированные частицы в определенные органы. К нейтрофилам-киллерам относятся клетки маргинального пула, а также часть клеток циркулирующего пула (примерно 82,5% от всей популяции нейтрофилов периферической крови). Известно, что нейтрофилы подвергаются апоптозу вследствие лишения их контакта с субстратом. Поскольку способностью прикрепляться к субстрату обладают, в основном, нейтрофилы-киллеры, то это означает, что путем апоптоза погибают, как правило, представители данной субпопуляции нейтрофилов [15].

В 2004 году группой исследователей во главе с A. Zychlinsky был описан процесс образования активированными нейтрофилами фибриллярных внеклеточных структур, названных впоследствии нейтрофильными внеклеточными ловушками (НВЛ) [127]. При исследовании структуры и состава НВЛ было установлено, что они образованы ядерной ДНК в комплексе с гистоновыми белками и ферментами нейтрофильных гранул.

индуцируют ИЛ-8, форбол-миристат-ацетат, липополисахариды грамотрицательных бактерий [28, 81, 82, 147]. Результаты экспериментальных исследований показали, что НВЛ в избытке имеются в очагах воспаления.

Предположительно, НВЛ выполняют следующие функции: фиксация грамположительных и грам-отрицательных бактерий, их киллинг, деградация факторов патогенности, поддержание высокой локальной концентрации антимикробных агентов, создание физического барьера, препятствующего дальнейшему распространению микроорганизмов из очага инфекции, кроме того, секвестрация гранулярных протеинов в НВЛ препятствует их диффузии и предотвращает повреждение тканей за пределами очага воспаления [127].

Вместе с тем, НВЛ могут также оказывать вредное влияние на организм хозяина, поскольку формирование экстрацеллюлярных гистоновых комплексов способно играть роль в развитии аутоиммунных заболеваний, например, системной красной волчанки [127]. К настоящему времени изучено влияние целого комплекса факторов физической, химической и биологической природы на способность нейтрофилов образовывать внеклеточные ловушки [16, 27, 30, 81, 82, 108]. Однако данных о влиянии ИР на способность нейтрофилов формировать НВЛ в доступной литературе найдено не было.

рассматривать как уникальную иммунокомпетентную клетку, обладающую многообразными специфическими функциями и обеспечивающую разнообразные иммунные ответы.

1.3. Система нейтрофильных гранулоцитов у лиц, подвергшихся физиологической значимости и высокой радиочувствительности, определяют после радиационного воздействия выживание облученных лиц и прогноз в отношении отдаленных медицинских последствий. Особое внимание привлекает система нейтрофильных гранулоцитов, изменения в которой развиваются достаточно рано и сохраняются длительное время после облучения, определяя нарушение разнообразных функций системного и местного иммунитета [21]. Во многих экспериментальных исследованиях показано, что выживаемость различных видов животных и человека определяется именно постлучевым угнетением гранулоцитопоэза [83, 171, 196, 224].

гранулоцитов у человека проводились среди лиц, переживших атомные бомбардировки в Японии, а также у населения прибрежных сел реки Теча и радиоактивно-загрязненных территорий вокруг Чернобыльской АЭС. В периферической крови и их фагоцитарная активность.

Так, уже в первые дни у лиц, переживших атомные бомбардировки, отмечалась лейкопения (первоначально за счет лимфоцитопении, а в лейкопении сопровождалось палочкоядерным сдвигом влево. Минимальный уровень лейкоцитов в крови отмечался примерно через 1 месяц после облучения, после чего начинались процессы регенерации кроветворения.

Среди облученных лиц регистрировались летальные случаи вследствие выраженности лейкопении носила дозозависимый характер [205]. В это время также регистрировались морфологические аномалии нейтрофилов (в частности, токсическая зернистость, вакуолизация цитоплазмы клеток) в сочетании с их гипофункцией (снижение фагоцитарной и пероксидазной активности) [170].

И хотя восстановление гемопоэза в 75% случаев начиналось с регенерации лимфоцитарного ростка [143], восстановление числа клеток миелоидного ряда (нейтрофилов и моноцитов) шло более быстрыми темпами в сравнении с лимфоцитами [161, 186, 218]. Через 1-2 года после радиационного воздействия абсолютное количество лейкоцитов в крови у лиц, переживших атомные бомбардировки, продолжало увеличиваться, однако частота лейкопений в когорте облученных лиц была по-прежнему значительно выше, чем среди необлученных (14,9% против 3,5%). Причем среднее число нейтрофилов и лимфоцитов в крови у облученных не отличалось от таковых у необлученных лиц аналогичного возраста [205].

Исследования, проведенные через 2 года и 2 месяца после облучения, выявили, что частота лейкопений в группе лиц, переживших атомные бомбардировки, практически не отличалась от таковой в группе необлученных (3,7% против 3,5%). К 1957 году у облученных лиц отмечалось полное восстановление гемопоэза, включая гранулоцитопоэз [205]. В более поздних исследованиях не было выявлено каких-либо изменений фагоцитарной, хемотаксической и бактерицидной функций нейтрофилов у облученных лиц [122, 125, 155, 199, 200]. Хотя в отдаленные сроки по результатам эпидемиологических исследований среди лиц, переживших атомные бомбардировки, регистрируется повышенная заболеваемость ЗНО [192, 194, 205], роль изменений иммунитета в реализации канцерогенного эффекта до сих пор не доказана [205].

В отличие от жителей Хиросимы и Нагасаки, которые подверглись однократному острому облучению в высоких дозах, доза облучения населения прибрежных сел реки Теча формировалась в течение многих лет.

В 1950-х гг. на реке Теча сложилась уникальная радиационная ситуация, где жители прибрежных сел подверглись многолетнему сочетанному внешнему - и внутреннему облучению, преимущественно, за счет Sr. Облучение местных жителей было обусловлено аварийными и регламентными сбросами радиоактивных отходов комбинатом «Маяк» в речную систему Теча – Исеть – Тобол – Обь [73]. Исследования, проведенные уже в первые годы после сбросов радиоактивных отходов в реку Теча, свидетельствовали о том, что изменения показателей иммунитета у жителей прибрежных сел развивались в достаточно ранние сроки. У них чаще, чем у необлученных людей, регистрировались нейтропения, угнетение фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови, увеличение численности аутофлоры кожи и слизистых оболочек с повышением доли патогенных штаммов, снижение бактерицидной функции кожи по отношению к кишечной палочке и содержания лизоцима в слюне [4, 5]. Изменения в системе врожденного иммунитета в период сбросов радиоактивных отходов в реку Теча носили дозозависимый характер. Важно отметить, что эти изменения имели место даже у практически здоровых лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию [34]. Необходимо подчеркнуть, что выявлялись возрастные особенности реакций системы врожденного иммунитета у жителей прибрежных сел на воздействие ионизирующей радиации. Так, угнетение фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов при сходных дозах облучения ККМ чаще наблюдалось у лиц зрелого и пожилого возраста, чем у молодых людей (54% случаев против 17%) [107].

Через 10-15 лет после начала облучения, когда мощность дозы облучения ККМ значительно снизилась, у жителей прибрежных сел сохранялись изменения со стороны врожденного иммунитета. У лиц, подвергавшихся облучению в наибольших дозах (средняя эквивалентная доза облучения ККМ составила 122 сЗв), сохранялось нарушение симбиотических взаимоотношений с аутофлорой, хотя их глубина существенно уменьшилась по сравнению с первыми годами после начала облучения. Также было показано увеличение фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов у облученных людей, коррелировавшее с величиной поглощенной дозы ККМ [107]. Известно, что фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови является одной из наиболее радиорезистентных функций нейтрофильных гранулоцитов [21]. Можно предположить, что повышение фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов имело компенсаторное значение, поскольку другие их свойства являются более радиочувствительными в условиях хронического облучения. Важно отметить, что в этот период отсутствовали методы, позволяющие оценить другие функции нейтрофилов (адгезия, хемотаксис, лизосомальная активность и др.), что существенно затрудняло ретроспективную интерпретацию полученных результатов.

Иммунологические исследования, проведенные через 20-28 лет после начала облучения (средняя эквивалентная доза на ККМ за 20 лет составила 60,8 сЗв) позволили констатировать нормализацию фагоцитарной активности нейтрофилов у большинства облученных лиц. Однако использование эпидемиологических исследований на данном временном отрезке не было выявлено увеличения частоты инфекционных заболеваний среди облученных лиц [34, 42].

Восстановление фагоцитарной активности нейтрофилов зависело не только от глубины угнетения гемопоэза, но и возраста облученных лиц.

Более быстрое восстановление фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови имело место у молодых облученных лиц [35].

Через 35-44 года после начала облучения у облученных людей регистрировались признаки иммунологического дисбаланса, которые характеризовались исчезновением закономерных связей между различными параметрами иммунитета и появлением аномальных связей, не отмечавшихся у необлученных лиц [1]. Важно отметить, что в группе лиц 1950-1954 гг.

рождения, антенатальный и ранний постнатальный период развития которых пришлись на время максимального радиационного воздействия, средние значения показателей иммунитета соответствовали таковым у лиц более старших возрастных групп [107]. Эти данные свидетельствуют как о большей радиочувствительности плода и детского организма, так и о возможности преждевременного старения иммунной системы, вызванного действием ионизирующей радиации [210].

Исследование состояния врожденного звена иммунитета через 43- лет после начала радиационного воздействия (средняя накопленная эквивалентная доза на ККМ составила 68,4±4 сЗв, диапазон индивидуальных доз от 7 до 580 сЗв) не позволило выявить у облученных лиц различий с необлученными лицами, по основным показателям, характеризующим врожденный иммунитет, в том числе фагоцитарной активности нейтрофилов [55].

Дальнейшее исследование иммунного статуса проводилось через 53- лет после начала радиационного воздействия, когда облученные люди достигли пожилого и старческого возраста. В периферической крови у них было отмечено увеличение относительного количества нейтрофилов и снижение доли фагоцитирующих клеток, которые не имели зависимости от поглощенной дозы облучения ККМ и максимальной мощности дозы, зарегистрированной в 1951 году [64]. Результаты исследования способствовать реализации субкомпенсированных изменений со стороны системы нейтрофильных гранулоцитов.

В период максимальных сбросов радиоактивных отходов (1949- гг.) у части жителей наиболее близко расположенных к комбинату «Маяк»

сел были зарегистрированы случаи хронического лучевого синдрома (ХЛС).

Cредняя доза облучения ККМ на время постановки диагноза ХЛС у жителей прибрежных сел реки Теча составляла 0,60±0,02 Гр, а максимальное значение достигало 2,5 Гр. Наиболее часто отмечался ХЛС легкой степени, основными проявлениями которого были изменения со стороны кроветворной, иммунной, нервной, сердечно-сосудистой и эндокринной систем. Важно отметить, что нейтропения со сдвигом влево в лейкоцитарной формуле и изменения врожденного иммунитета у пациентов с ХЛС развивались в дебюте заболевания и сохранялись достаточно длительное время. При прогрессировании заболевания изменения со стороны врожденного иммунитета приобретали более выраженный характер и регистрировались значительно чаще, чем у облученных лиц, не имевших ХЛС [55].

Анализ ККМ позволил отметить задержку созревания гранулоцитов на стадии миелоцита и ускоренное созревание эритрокариоцитов на фоне повышения их пролиферативной активности. Сопоставление данных костномозгового кроветворения и периферической крови свидетельствовало об адаптивном характере изменений эритропоэза, направленных на сохранение нормального уровня эритроцитов в периферической крови. Тогда как задержка созревания гранулоцитов свидетельствовала о дезадаптивных функциональных изменениях в критическом органе – ККМ, которые обусловливали сначала транзиторную, а затем и устойчивую нейтропению и лейкопению у лиц с ХЛС [3].

Наряду с функциональными изменениями в гранулоцитарном ростке кроветворения отмечалось повышение уровня аберрантных нейтрофильных гранулоцитов, как на стадии митоза, так и в интерфазе. У пациентов в период формирования ХЛС отмечался повышенный уровень «сцепленных митозов»

в костномозговых нейтрофильных гранулоцитах по сравнению с необлученными лицами. Среднее количество костномозговых гранулоцитов, имеющих потенциально летальные аберрации (кариолиз, двуядерность и гигантизм), было у облученных лиц также существенно выше, чем в группе сравнения. При этом в отличие от эритропоэза компенсаторная пролиферация костномозговых гранулоцитов являлась недостаточной для компенсации радиационно-индуцированных повреждений и задержки созревания гранулоцитов в ККМ. Развитие нейтропении у больных ХЛС на ранней стадии при отсутствии значительного снижения зрелых нейтрофилов в ККМ могло свидетельствовать также о функциональной неполноценности и уменьшении продолжительности жизни зрелых сегментоядерных нейтрофилов [2].

Как уже отмечалось, частота сцепленных митозов в костномозговых гранулоцитах у пациентов с ХЛС была значительно выше, чем у необлученных лиц. Согласно немногочисленным литературным данным клампинг хромосом является одной из форм анафазных хромосомных аберраций и может быть обусловлен патологией митотического аппарата клетки [139]. Значение данной аномалии для будущей судьбы клетки не известно, но считается, что она не является летальной. Таким образом, нейтропения в период формирования ХЛС была обусловлена не только задержкой дифференцировки костномозговых нейтрофильных гранулоцитов на стадии миелоцита, но и значительным увеличением частоты летальных повреждений и патологических митозов без существенного повышения пролиферативной активности гранулоцитов [3].

Исследование состояния адаптивного иммунитета у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС, а также у жителей радиоактивно загрязненных территорий проводилось в течение ряда лет после аварии [8, 37, 67, 68, 110, 112]. Важно отметить, что состоянию нейтрофильных гранулоцитов в этих исследованиях уделялось значительно меньше внимания, чем адаптивному иммунитету. Через 10-12 лет после выхода из зоны повышенной радиационной опасности у участников ликвидации последствий аварии на ЧАЭС (дозы, как правило, не превышали 25 Гр) различий в общем количестве лейкоцитов и нейтрофилов в периферической крови по сравнению с необлученными людьми не отмечалось. У облученных лиц не отмечалось статистически значимых различий в содержании липидов, активности миелопероксидазы и щелочной фосфатазы нейтрофилов периферической крови, однако содержание внутриклеточных катионных белков в нейтрофилах лиц исследуемой группы было ниже, чем в группе необлученных людей. Тесты с дополнительной лучевой нагрузкой in vitro, позволили установить, что функциональный резерв системы нейтрофильных гранулоцитов достаточен, а изменения функционального статуса нейтрофилов, по-видимому, носят компенсаторный характер [90].

Исследование иммунного статуса у жителей г. Озерска, облученных в результате неконтролируемых газо-аэрозольных выбросов комбинатом «Маяк», через 50 лет после техногенного облучения в раннем детском установить, что показатели функциональной активности нейтрофилов периферической крови у них по сравнению с необлученными людьми не были изменены [41].

Значительный интерес представляют исследования иммунитета у жителей арктических регионов Российской Федерации, которые подвергались преимущественно внутреннему облучению за счет глобальных радиоактивных выпадений в результате испытаний ядерного оружия.

Поступление радионуклидов в организм людей происходило по цепочке лишайник – северный олень – человек, что обеспечивало дополнительную дозу облучения местных жителей примерно 2 мЗв в год [93, 109, 111]. У оленеводов Чукотки, Якутии, Таймыра, Ямало-Ненецкого автономного округа и Кольского полуострова было отмечено угнетение фагоцитарной связанными с оленеводством, и приезжими, а также жителями умеренных широт [111].

Необходимо отметить, что данные исследования имеют достаточно много ограничений: во-первых, исследования проводились в разные годы, когда радиационная обстановка существенно различалась; во-вторых, исследовались разные группы людей, для которых отсутствовали индивидуальные дозиметрические данные, что не позволяло провести анализ зависимости «доза-эффект». Воздействие экстремальных условий Севера (низкая температура, условия проживания и питания) также существенно затрудняет интерпретацию полученных данных и не позволяет оценить реальный вклад внутреннего облучения в формирование выявленных изменений в системе врожденного иммунитета.

нейтрофильных гранулоцитов у населения, проживающего на территориях с повышенным естественным радиационным фоном (ЕРФ). Особенностью облучения населения данных территорий является то, что оно имеет характер хронического с постоянной мощностью дозы. С позиции концепции радиоадаптации данные исследования представляют большой научный интерес, поскольку жители этих территорий подвергаются воздействию повышенных уровней ЕРФ в течение многих поколений [145].

У жителей Ирана, проживающих в окрестностях города Рамсар, где (преимущественно за счет Ra и Rn), показатели внутриклеточного кислородзависимого метаболизма, фагоцитоза и локомоторной активности нейтрофилов периферической крови статистически значимо выше, чем у лиц, Полученные данные согласуются с положением, что воздействие малых доз ионизирующей радиации оказывает стимулирующее действие на иммунную систему [137, 173]. Абсолютное количество лейкоцитов и нейтрофилов в дополнительного облучения лимфоцитов периферической крови in vitro в дозе 1,5 Гр частота индуцированных облучением хромосомных аберраций в них была статистически значимо ниже, чем в группе необлученных лиц. При этом фоновая частота хромосомных аберраций в обеих группой была одинаковой. Проведенные исследования показывают, что функциональные резервы иммунной системы у лиц, проживающих в условиях повышенного ЕРФ, выше, чем у необлученных людей. Отсутствие эпидемиологических исследований в данной когорте облученных лиц не позволяет сопоставить изменения в системе врожденного иммунитета с частотой злокачественных новообразований (ЗНО) у них [145].

Эпидемиологические исследования, проведенные среди населения других регионов с повышенным ЕРФ (отдельные регионы Китая и Индии), свидетельствуют об отсутствии избыточного относительного риска ЗНО.

Данные результаты, принимая во внимание повышенную частоту нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови у населения этих регионов [126, 178, 207, 208], могут косвенно свидетельствовать о достаточной активности врожденного иммунитета, вовлеченного в противоопухолевую защиту организма.

Таким образом, имеющиеся в литературе данные, посвященные влиянию хронического низкоинтенсивного радиационного воздействия на систему нейтрофильных гранулоцитов у людей разного возраста, пола, исходного состояния здоровья являются достаточно немногочисленными и непоследовательными. Сравнительный анализ их затруднен вследствие различий в характере облучения (распределение дозы во времени и по организму), вида излучения, диапазона доз и методологии исследования.

Главным недостатком большинства исследований населения является отсутствие индивидуальных доз облучения, что затрудняет анализ зависимости выявленных изменений от дозы. В этой связи особый интерес представляют исследования персонала ядерных предприятий, мониторинг индивидуальных доз облучения которых проводится регулярно.

Динамическое наблюдение в течение многих лет проводилось за состоянием гемопоэза и иммунитета у персонала основных производств комбината «Маяк», облучение которых произошло вследствие неадекватных мер защиты и несовершенства технологий в период пуска предприятия [59].

Максимальная мощность дозы облучения приходилась на 1949-1954 гг., а в последующем она снижалась [66]. Работники реакторного производства подверглись преимущественно внешнему -облучению, в то время как работники радиохимического завода и плутониевого производства – комбинированному (внешнему - и внутреннему облучению, за счет инкорпорированного Pu). Средняя доза внешнего -излучения для лиц, нанятых на работу в 1948-1958 гг., составила 0,91±0,95 Гр [214]. У части работников предприятия в наиболее неблагоприятные по уровням радиационного воздействия годы (1948-1954) был диагностирован ХЛС [59, 66]. В период максимального радиационного воздействия (формирования ХЛC) частота лейкопений достигала 100%, при продолжающемся облучении изменения не только сохранялись, но и углублялись (диапазон индивидуальных значений числа лейкоцитов в крови составлял от 2,2109/л до 3,5109/л). Лейкопения была преимущественно обусловлена снижением числа нейтрофильных гранулоцитов. После прекращения контакта с источниками ионизирующего излучения количество лейкоцитов в течение 3лет восстанавливалось. В отдаленные сроки частота случаев с умеренной лейкопенией не превышала таковой у одновозрастного необлученного контроля [66].

Следует заметить, что в ранние сроки после начала хронического облучения функциональный статус нейтрофилов крови у работников комбината «Маяк», а также у жителей г. Озерска не оценивался.

Исследования, проведенные у лиц, перенесших ХЛС, в отдаленные сроки после начала облучения, выявили, что количество лейкоцитов, абсолютное и относительное число нейтрофилов в периферической крови у работников, подвергшихся профессиональному внешнему -облучению, не отличалось от группы сравнения. Через 30-35 лет после установления диагноза ХЛС у работников комбината «Маяк» отмечалась тенденция к повышению абсолютного и относительного количества фагоцитирующих нейтрофилов, тогда как фагоцитарный индекс не отличался от такового у необлученных лиц [14]. Исследования, проведенные через 35-40 лет, позволили отметить статистически значимое повышение абсолютного и относительного числа фагоцитирующих нейтрофилов при снижении фагоцитарного индекса [12, 13]. Наблюдаемые явления могут свидетельствовать о том, что у хронически облученных лиц в отдаленные сроки снижается способность нейтрофилов фагоцитировать чужеродные агенты, что компенсируется увеличением числа фагоцитирующих клеток. Было также выявлено, что изменение абсолютного числа фагоцитирующих нейтрофилов зависело от дозы облучения. По мере увеличения кумулятивной дозы отмечалось повышение данного показателя, причем наибольшие его значения регистрировались у лиц, получивших максимальные дозы (свыше 4 Гр) [13, 14].

Исследования иммунного статуса у работников комбината «Маяк»

через 45-55 лет после начала облучения не выявили различий в средних количествах лейкоцитов и нейтрофилов по сравнению с необлученными периферической крови у лиц с кумулятивными дозами облучения, превышающими 2 Гр, было на 15-35% ниже, чем у необлученных лиц.

Отмеченные изменения коррелировали с величиной дозовой нагрузки [31, 41]. В этой группе облученных лиц также было отмечено снижение фагоцитарного индекса нейтрофилов [41], которое не зависело от величины дозы [31]. Статистически значимое снижение (на 15%) показателя бактерицидной активности нейтрофилов было отмечено в группе лиц с кумулятивной дозой свыше 4 Гр [41]. У них также отмечалась тенденция к снижению показателей внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов по сравнению с необлученными лицами [31]. Прямой зависимости нарушений в иммунном статусе от содержания в организме Pu при сочетанном воздействии выявлено не было [41].

Необходимо заметить, что хотя значительным преимуществом исследований персонала является наличие индивидуальных доз облучения, данные о состоянии иммунитета персонала предприятия трудно экстраполировать на население вследствие наличия строгого отбора лиц при приеме на работу (молодые здоровые мужчины), который определяет эффект «здорового работника».

нейтрофильных гранулоцитов у больших групп облученных лиц являются достаточно ограниченными (преимущественно оценивалась фагоцитарная активность) и противоречивыми. Важно указать, что значительный интерес для оценки влияния эффекта мощности дозы представляет сравнительный анализ состояния нейтрофильных гранулоцитов у жителей прибрежных сел реки Теча и лиц, переживших атомные бомбардировки Хиросимы и Нагасаки. В обеих когортах облучению в сопоставимых дозах подверглось население, включающее лиц разного возраста, пола и исходного состояния здоровья. Отличия определялись характером формирования дозы: высокая мощность дозы у переживших атомные бомбардировки и низкая мощность у жителей прибрежных сел реки Теча.

Динамическое исследование иммунитета у лиц, подвергшихся многолетнему облучению вследствие сбросов ЖРО в реку Теча, показало, что изменения в гранулоцитарном ростке кроветворения в период максимального облучения ККМ регистрировались значительно чаще, чем в лимфоцитарном, а нейтропения сохранялась более продолжительное время, чем лимфоцитопения, что наряду с угнетением фагоцитарной активности нейтрофилов обеспечивало длительные нарушения в системе нейтрофильных гранулоцитов у облученных лиц. Исходя из вышесказанного, исследование состояния системы нейтрофильных гранулоцитов в стареющей популяции облученных жителей прибрежных сел реки Теча в период реализации отдаленных последствий облучения представляло особый интерес.

1.4. Радиочувствительность отдельных функций нейтрофильных Как отмечалось выше, после облучения в костномозговых дозах отмечается резкое и значительное снижение численности популяции и функциональной активности радиочувствительных лимфоцитов, а основная нагрузка по поддержанию генетического гомеостаза внутренней среды организма ложится на более древние в эволюционном отношении клетки – нейтрофилы [19]. Известно, что зрелые нейтрофильные гранулоциты периферической крови наряду с моноцитами являются одними из наиболее радиорезистентных клеток крови по критерию клеточной гибели [33, 205].

После облучения в костномозговых дозах происходит повреждение ГСК и клеток-предшественников, которые обладают значительно большей радиочувствительностью, чем функционально зрелые гранулоциты. D0 для коммитированных костномозговых предшественников нейтрофилов (КОЕГМ) человека при -облучении составляет по данным разных авторов 1,1-1, Гр [33, 189]. Нейтропения развивается не сразу после облучения, а через продолжительностью жизни зрелых нейтрофильных гранулоцитов.

функциональная активность зрелых нейтрофильных гранулоцитов крови изменяется при меньших дозах, чем происходит их гибель. Наиболее полно влияние - и рентгеновского излучений при разных дозах и режимах (острое, пролонгированное и фракционированное) облучения на показатели функционально-метаболического статуса нейтрофилов крови изучено в работах А. Н. Гребенюк и соавт. [19, 21, 89]. Исследовались нейтрофилы крови облученных лабораторных животных и периферической крови человека in vitro. Белые беспородные мыши-самцы подвергались облучению в диапазоне доз от 0,25 до 8,75 Гр. Результаты экспериментов позволили установить, что главным фактором, определяющим направленность и выраженность реакций нейтрофилов на облучение, является доза облучения и в меньшей степени – мощность дозы и ее временная динамика [21]. Данное положение принципиально отличает реакцию иммунной системы на действие ИР от ответов других органов и тканей на облучение. В других исследованиях также были получены доказательства большей зависимости радиационно-индуцированных изменений иммунитета от кумулятивной дозы, а не от ее мощности [190].

В исследованиях, проведенных Гребенюк А.Н. и соавт., не было получено убедительных доказательств стимулирующего действия острого облучения в малых дозах на функциональное состояние системы нейтрофильных гранулоцитов [21]. Кроме того, показано, что воздействие сублетальных доз вызывает длительное напряжение компенсаторноприспособительных возможностей нейтрофилов, а летальных доз – срыв адаптационных возможностей нейтрофилов и критическое снижение показателей, характеризующих функциональное состояние этих клеток [21], что также согласуется с общепринятым положением об иммуносупрессивном эффекте больших доз ИР [52, 102, 215].

гранулоцитов после острого рентгеновского облучения образцов крови практически здоровых людей in vitro в дозах 0,25; 0,5; 1 и 4 Гр показало, что наиболее радиочувствительными показателями функциональнометаболического статуса нейтрофилов являются активность ферментов щелочной фосфатазы (снижение отмечено при дозе 0,25 Гр и выше) и миелопероксидазы (активность снижалась при дозе 0,5 Гр и выше) [21].

Содержание катионных белков в нейтрофилах снижалось при дозе 1 Гр и более. Интересно, что показатель спонтанного НСТ-теста не зависел от дозы, в то время как показатель индуцированного НСТ-теста при дозе 0,5 Гр снижался (тенденция к снижению отмечалась уже при дозе 0,25 Гр), а при воздействии доз 1 Гр и 4 Гр, напротив, повышался. Аналогичная дозовая зависимость показателей внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов была отмечена и в других исследованиях [150].

Адгезивная способность и хемотаксическая подвижность нейтрофилов крови снижались при дозе облучения 4 Гр. Параметры, характеризующие фагоцитарную активность нейтрофилов (доля фагоцитирующих нейтрофилов радиорезистентность – даже при облучении в дозе 4 Гр они не изменялись.

Установлено, что низкая радиочувствительность зрелых гранулоцитов крови связана с высокой радиорезистентностью их фагоцитарной активности [21].

Несколько иные результаты были получены в других исследованиях [94, При облучении нейтрофилов периферической крови человека в 149].

диапазоне доз от 0,5 до 1 Гр не было отмечено изменений показателей фагоцитоза нейтрофилов, тогда как при облучении в дозе 2 Гр и выше отмечалось их снижение.

В экспериментальных исследованиях на кроликах, облученных в дозах 7-9 Гр, в течение 2-х недель после облучения наблюдалось повышение фагоцитарной активности нейтрофилов [6]. Предполагается, данный эффект связан с функциональными особенностями системы гемопоэза у кроликов и может не воспроизводиться у других млекопитающих [33].

Исследования радиочувствительности отдельных этапов фагоцитоза показали, что наиболее радиочувствительными являются стадия направленного движения гранулоцита к объекту фагоцитоза и стадия внутриклеточного переваривания, в то время как стадия поглощения радиорезистентна [52, 215].

Усиление адгезивной способности нейтрофилов периферической крови у экспериментальных животных после облучения их в широком диапазоне доз (ЛД0-ЛД100) было отмечено рядом авторов [39, 60]. Адгезивная способность нейтрофилов периферической крови была также исследована у больных лимфогранулематозом после широкопольной -лучевой терапии при разовой дозе облучения 2,2±0,3 Гр [33]. Уже через 1 час после облучения адгезивная способность нейтрофилов начинала возрастать, достигая максимальных значений, которые превышали спонтанный уровень в 1,8 раза, через 24 часа. Предполагается, что повышение адгезивной способности нейтрофилов у облученных людей связано не только с появлением в крови продуктов тканевой деструкции, но и цитокинов, активирующих данные клетки и способствующих их миграции в очаг поражения [54]. Это предположение подкрепляется тем фактом, что при облучении образцов крови in vitro подобной активации нейтрофилов не происходит.

Известно, что фракционирование дозы снижает повреждающее действие ионизирующей радиации на клетки организма [19]. Однако имеются экспериментальные данные, свидетельствующие о более выраженных нарушениях способности нейтрофилов периферической крови продуцировать АФК при фракционировании дозы по сравнению с острым однократным облучением [150]. Механизмы данного явления пока не понятны и необходимы дальнейшие исследования. Кроме того, было установлено, что пролонгированное и фракционированное облучение нейтрофилов, чем острое облучение в тех же дозах [21].

Таким образом, имеющиеся в настоящее время данные относительно реакции различных свойств нейтрофилов на радиационное воздействие разнообразные функции нейтрофилов существенно различаются по радиочувствительности. Непоследовательность литературных данных объясняется, во-первых, разными объектами исследования (человек, лабораторные животные, периферическая кровь, лейкоцитарная взвесь, ионизирующих излучений, применяемых в экспериментальной практике (рентгеновское, -излучение, протонное и другие) и, в-третьих, применением различных методов для оценки функционального статуса нейтрофильных гранулоцитов. Необходимо заметить, что в доступной литературе не было найдено работ по влиянию ионизирующей радиации на такие важные функциональные параметры состояния системы нейтрофильных гранулоцитов человека, как их лизосомальная активность и способность формировать внеклеточные ловушки.

1.5. Модификация радиационно-индуцированных нарушений системы (антиоксиданты, нестероидные противовоспалительные препараты, пептиды тимуса и ККМ, липополисахариды, цитокины и др.) могут модифицировать пострадиационные изменения иммунитета при их приеме до облучения (радиопротекторы) или после облучения (паллиативные и терапевтические средства) [157]. Радиопротекторы проявляют свое действие по нескольким механизмам: 1) угнетение образования и детоксикация активных форм кислорода и азота; 2) стабилизация мишени; 3) повышение активности ферментов репарации и восстановительных процессов. Механизмы действия лекарственных средств более разнообразны. Ранее для терапевтической цели использовали антиоксиданты (мелатонин), полисахариды бактериального, растительного и животного происхождения (например, продигиозан), вакцины (Proteus antigenic vaccine dried), биологически активные факторы тимуса [23, 75, 188, 206]. Как отмечалось выше, выживаемость облученного организма детерминирована угнетением гранулоцитопоэза, поэтому одной из основных задач патогенетической терапии острого и хронического лучевого синдромов является восстановление нормального количества функционально полноценных нейтрофилов в крови. В настоящее время наиболее перспективными для этой цели представляются препараты направленного действия: цитокины и стволовые клетки.

1.5.1. Применение цитокинов для лечения радиационноиндуцированных нейтропений Исследования, посвященные терапии радиационно-индуцированной миелосупрессии при помощи цитокинов, немногочисленны. Показано, что свойствами стимулировать гемопоэз и иммунопоэз обладают ИЛ-1, ИЛ-3, ИЛ-6, КСФ-Г, КСФ-ГМ, эритропоэтин, тромбопоэтин, фактор стволовых предприняты еще в 1970-х годах [7]. В современной литературе, в основном, гемопоэза, развившихся вследствие острого радиационного воздействия [74, 79, 83, 129, 158, 193, 224]. Однако отдаленные эффекты применения цитокинов на состояние иммунной системы не изучены [133]. Исследований, нейтропений после хронического облучения и, особенно, в отдаленные сроки, в доступной литературе не встречалось.

Группа препаратов цитокинового ряда, способных стимулировать гемопоэз и, в частности, гранулоцитопоэз, в настоящее время представлена:

препаратами КСФ-Г и КСФ-ГМ, ИЛ-1, ИНФ, тромбопоэтина. До настоящего времени не исследована эффективность цитокинов в терапии эффективности проводилась, в основном, в экспериментах на животных, а также у онкологических больных с радиационно-индуцированными нейтропениями и, в единичных случаях, у лиц, пострадавших в результате радиационных аварий [133].

Возможность использования препаратов КСФ-Г и КСФ-ГМ с целью коррекции радиационно-индуцированной миелосупрессии связана с их способностью повышать выживаемость костномозговых предшественников нейтрофилов, а также стимулировать их пролиферативную активность и способность к последующей дифференцировке. Кроме того, КСФ-Г и КСФГМ способны повышать функциональную активность зрелых нейтрофилов [171, 219]. Данные препараты существенно ускоряют восстановление числа нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови к 3-6 суткам у пациентов после интенсивной миелосупрессивной терапии, в том числе при трансплантации ККМ и ГСК [163, 182, 201].

В экспериментах на мелких и крупных лабораторных животных (мыши и собаки) с использованием разных типов облучения (гамма-, рентгеновское, нейтронное, протонное) было показано, что препараты КСФ-Г оказывают стимулирующее влияние на гранулоцитопоэз, уменьшая частоту развития радиационно-индуцированной нейтропении, снижая ее выраженность и уменьшая длительность проявления, ослабляя проявления ОЛС и, в конце концов, повышая выживаемость облученных животных [79, 83, 196, 224].

При этом отмечается, что у облученных мышей под влиянием терапии КСФГ способность нейтрофилов периферической крови образовывать АФК и экспрессировать маркеры активации (CD11b и CD18) не нарушаются [196].

В настоящее время, КСФ-Г рассматривается в качестве наиболее перспективного средства активной терапии, направленной на восстановление гранулоцитопоэза при ОЛС и других состояниях, сопровождающихся нейтропенией [9, 133].

В экспериментах на собаках, облученных в дозе 4 Гр, выявлена большая эффективность терапии гематологических нарушений с использованием КСФ-Г, чем КСФ-ГМ [133]. Однако применение КСФ-Г не способствовало стимуляции гемопоэтической функции ККМ при облучении животных в дозе 6 Гр [180, 203].

пролонгированного действия «Пегфилграстим», обладающий способностью более активно и в течение более длительного времени стимулировать гранулоцитарный росток кроветворения [196]. Сегодня препараты на основе КСФ разрешены в США для использования в качестве стимуляторов гранулоцитопоэза при нейтропениях, однако ни один из этих препаратов пока не одобрен для лечения радиационно-индуцированной аплазии ККМ [133].

Считается, что большой вклад в персистенцию нарушений иммунного статуса в период отдаленных последствий облучения вносит дефект со стороны Т-лимфоцитов [133]. Дефекты Т-звена, возможно, вовлечены в механизмы нарушений со стороны других звеньев иммунной системы, в том установлено, что ряд цитокинов, таких как ИЛ-2, 4, 7, 17, c-kit – лиганд, flt- (FL), тимический стромальный лимфопоэтин и фактор роста кератиноцитов функциональной активности Т-клеток [118, 154]. Из них ИЛ-7, тимический рассматриваются как потенциальные терапевтические агенты для ускорения тимопоэза и, в конечном счете, восстановления иммунной системы [133].

Предполагается, что комбинированные препараты будут значительно более эффективными для терапии нейтропений. Так, «Прогенипоэтин»

(содержит FL и КСФ-Г) в большей степени ускоряет восстановление нейтрофильного звена после острого облучения, чем FL и КСФ-Г в нейтрофильного звена как «Прогенипоэтин» оказалась комбинация FL и КСФ-Г [133].

гемопоэтических и иммунных нарушений у мышей спустя 2 и 24 часа после тотального облучения в дозе ЛД90 существенно повышало раннюю эффективного использования данных препаратов для восстановления радиационного воздействия является их применение в самые ранние сроки после облучения [133].

Однако отдаленное восстановление иммунной системы у леченых животных не было достаточным: только 50% животных, переживших ранние сроки после облучения, прожили 300 дней после облучения и терапии.

Полученные данные свидетельствуют о том, что применение данных цитокинов в ранние сроки после облучения оказывает антиапоптотический восстановление гемопоэза и иммунной системы в ранние сроки после облучения, но ограниченную регенерацию гемопоэза в отдаленные сроки [133]. По-видимому, при применении антиапоптотических цитокинов, измененные вследствие неполной или неправильной репарации ГСК и клетки-предшественники, избегают проапоптотических сигналов, сохраняют последующей дифференцировке, тем самым обусловливая возникновение иммунных нарушений в отдаленные сроки после облучения. Поэтому для цели восстановления иммунных нарушений, сохраняющихся в отдаленные сроки, предлагается после облучения длительное время применять комбинации или отдельные цитокины [151].

А. Н. Гребенюк и соавт. исследовали возможность применения ИЛ- для терапии острых лучевых поражений. В экспериментах на лабораторных животных при разных вариантах острого радиационного воздействия, а также на добровольцах была показана противолучевая активность ИЛ-1, которая характеризовалась снижением частоты развития пострадиационной продолжительности, а также способностью модифицировать функциональнометаболический статус зрелых нейтрофилов [21, 89, 148]. Кроме того, дифференцировку и созревание клеток миелоидного, мегакариоцитарного и лимфоидного ростков, а также модулировать функциональную активность зрелых клеток иммунной системы и стимулировать ответ острой фазы [48, 77, 78].

уменьшающего степень выраженности пострадиационной нейтропении, нормализующего показатели функционально-метаболического статуса нейтрофильных гранулоцитов [158].

Следует также подчеркнуть, что применение комбинаций различных цитокинов и факторов роста приводит не просто к суммированию эффектов входящих в нее компонентов, а к синэргическому эффекту [181]. По этой причине для эффективной терапии радиационно-индуцированной нейтропении в настоящее время рекомендуется использовать комбинации интерлейкины, например, ИЛ-1 или ИЛ-3, обладающие способностью стимулировать пул ГСК, затем КСФ-Г или КСФ-ГМ, стимулирующие комбинированного применения нескольких цитокинов для лечения сотрудниками ФМБЦ им. А.И. Бурназяна разработана методика применения комбинации из 3-х цитокинов для терапии радиационно-индуцированных нарушений гемопоэза. Данная схема предусматривает одновременное экстренное однократное введение ИЛ-1 и тромбопоэтина, а также отсроченное курсовое применение препаратов КСФ-Г. Возможно также использование двойной комбинации цитокинов (ИЛ-1 и какого-либо из препаратов КСФ-Г) [74]. Как отмечалось, препараты цитокинового ряда обладают достаточной эффективностью лишь при условии их применения в самые ранние сроки после облучения, а смещение сроков начала лечения приводит к значительному снижению эффективности проводимой терапии [74, 133, 168, 177].

Вероятно, терапия отдаленных радиационно-индуцированных нейтропений с использованием колониестимулирующих факторов не будет достаточно эффективной вследствие сокращения объема функционирующей гемопоэтической ткани и невозможностью ее адекватного ответа на стимуляцию КСФ. Более перспективным представляется использование стволовых клеток, способных не только восполнить дефицит пула нейтрофильных гранулоцитов и стимулировать гранулоцитопоэз, но и восстанавливать гемопоэтическую ткань ККМ [140].

1.5.2. Применение стволовых клеток для лечения радиационно-индуцированных нейтропений Впервые термин «стволовая клетка» был предложен выдающимся русским гистологом А.А. Максимовым в начале 20 века. В настоящее время стволовые клетки достаточно широко применяются в различных отраслях медицины для терапии широкого спектра заболеваний [44, 47, 62, 100, 106].

Разнообразие стволовых клеток, применяемых в медицинских целях, достаточно велико и включает в себя эмбриональные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, ГСК, эндотелиальные прогениторные клетки, мезенхимальные стволовые клетки (МСК), скелетные миобласты, резидентные стволовые клетки различных тканей [47].

Весьма перспективным направлением для терапии радиационноиндуцированных нейтропений представляется использование ГСК, обладающих большим пролиферативным потенциалом, а также способностью, посредством продукции факторов роста, активировать пролиферацию собственных кроветворных клеток. Общеизвестно, что острое радиационное облучение всего тела человека в дозах, превышающих 7-8 Гр, требует трансплантации ГСК [133]. Однако, результаты единичных наблюдений по применению ГСК для коррекции ОЛС, не столь обнадеживающие. Так, у всех 29 пациентов, подвергшихся острому радиационному воздействию и получавших лечение ГСК, через 14 дней после трансфузии обнаруживались признаки приживления СК, однако ни у одного из выживших пациентов впоследствии не было обнаружено постоянного приживления [136]. Медиана выживаемости лиц, получавших лечение ГСК, составила всего 33 дня. Три пациента прожили более 1 года после трансплантации (двое получали терапию ГСК, один получал фетальные гемопоэтические клетки). Не удалось установить, было ли обусловлено выживание данных пациентов введением ГСК или нет. В случаях из 29 основной причиной гибели пациентов стало развитие реакции отторжения трансплантата [133].

В современной литературе нами не было найдено публикаций, описывающих применение ГСК для терапии отдаленных радиационноиндуцированных нейтропений.

Одним из возможных механизмов нарушения кроветворения у облученных лиц в отдаленном периоде может быть нарушение функционирования костномозговых ниш, необходимых для созревания и дифференцировки стволовых клеток [101]. В нишах под влиянием микроокружения (клетки мезенхимы, экстрацеллюлярный матрикс и минеральная часть кости) осуществляется созревание и дифференцировка ГСК. Проблема пространственной организации и функционирования ниш для ГСК в настоящее время является одной из самых интересных и дискутабельных в молекулярной биологии [124, 159, 223]. Предполагается, что нарушение структуры и функции ниши может привести к нарушению процессов созревания, дифференцировки ГСК и выходу зрелых клеток в кровяное русло. Исходя из этого, открывается новая перспектива совместного использования ГСК и МСК для лечения нейтропений после радиационного воздействия. Помимо того, что МСК входят в состав ниш для ГСК, они также способны предотвращать развитие острой и хронической реакции «трансплантат против хозяина» [50, 101, 106].

Таким образом, до настоящего времени не разработано эффективных средств лечения радиационно-индуцированной нейтропении у человека.

Эффективность применения различных стволовых клеток для лечения лучевой миелосупрессии остается неясной и неизвестно влияние такой терапии на функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов реципиента.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование являлось рандомизированным. Случайная выборка включала 318 жителей прибрежных сел реки Теча, облучение которых произошло в результате сброса ЖРО комбинатом «Маяк» в реку Теча. Сбросы привели к крупномасштабному радиоактивному загрязнению всех компонентов речной системы: воды, донных отложений, поймы, растительности и биоты. Важно заметить, что пик сбросов ЖРО в реку Теча пришелся на первую и вторую декады октября 1951 года, когда более 60% от суммарной активности долгоживущих продуктов деления урана поступили в реку Теча [17].

Детальное описание радиоэкологической обстановки в бассейне реки Теча представлено в ряде публикаций [11, 55, 73, 107].

Критериями включения в исследуемую группу являлись: постоянное проживание в одном из сел, расположенных на побережье реки Теча, в период с 01.01.1950 по 31.12.1960 года; дата рождения до 01.01.1950 года (до начала радиоактивных сбросов в реку Теча).

Критерии исключения из исследуемой группы:

1) наличие у обследованных лиц онкологических, аутоиммунных, острых или хронических (период обострения) воспалительных заболеваний, гемобластозов, почечной или печеночной недостаточности, острого нарушения мозгового кровообращения в течение последних 3-х месяцев;

2) острый и промежуточный периоды черепно-мозговой травмы;

3) прием антибиотиков, глюкокортикоидов и цитостатиков в течение последних 6 месяцев до исследования;

4) рентгенологическое обследование в течение последних 6 месяцев;

5) отсутствие индивидуальных дозиметрических данных.

В зависимости от реакции гранулоцитарного ростка кроветворения в ранний и отдаленный периоды радиационного воздействия среди облученных лиц было выделено 3 подгруппы. Первую подгруппу составили 256 лиц, не имевших в анамнезе ХЛС и нейтропении на время исследования.

Вторую подгруппу сформировали 37 облученных лиц, у которых в период максимального радиационного воздействия (преимущественно в 1950- гг.) был диагностирован ХЛС. В третью группу было включено облученных лиц, имеющих отдаленную нейтропению (снижение абсолютного числа нейтрофильных гранулоцитов менее 2109/л).

Группу сравнения составили 134 жителя тех же административных районов, что и облученные, доза облучения которых не превышала допустимые пределы для населения России [63]. Данная группа включала лиц аналогичного возраста и пола (таблица 2.1), которые имели сходные с группой облученных лиц социально-экономические условия жизни, характер профессиональной деятельности и медицинского обслуживания. Все обследованные лица относились к двум этническим группами (славяне, преимущественно, русские, и тюрки: татары и башкиры).

Таблица 2.1 – Распределение обследованных лиц в изучаемых группах по полу, этнической принадлежности и возрасту Облученные Облученные, Облученные с Как отмечалось, жители прибрежных сел реки Теча подверглись сочетанному (внешнему и внутреннему) радиационному воздействию. Доза внешнего облучения населения прибрежных сел сформировалась за счет излучающих радионуклидов (137Cs, 95Zr, 95Nb, 106Ru и др.), присутствовавших в сбросах и загрязнивших речную воду, донные отложения, пойменные земли вдоль реки Теча, территории населенных пунктов и жилые дома [55].

Внутреннее облучение было обусловлено поступлением в организм жителей речной водой и продуктами питания местного производства. Для местных жителей река была основным, а часто и единственным источником питьевого и хозяйственного водоснабжения. В первые годы значительный вклад в формирование дозы облучения вносили овощи, картофель, рыба, мясо водоплавающей птицы, молоко. После проведения комплекса защитных мероприятий основным источником поступления Sr в организм местных жителей было молоко [55].

Особенностью радиационного воздействия на население являлось большое содержание в сбросах остеотропного Sr, который является относительно долгоживущим радионуклидом (период полураспада составляет 28,1 года) [56]. Органом-мишенью для -излучателя 90Sr является ККМ – центральный орган гемопоэза и иммунопоэза. Аккумулируясь в костной ткани, Sr оказывает длительное радиационное воздействие на клетки ККМ. Таким образом, кроветворная и иммунная системы у жителей прибрежных сел реки Теча являлись критическими не только вследствие высокой радиочувствительности костномозговых кроветворных клеток, но и, как результат, значительных доз облучения ККМ у них [107].

Важно подчеркнуть, что соотношение доз внешнего и внутреннего облучений зависело от местоположения села вдоль реки и времени после начала сбросов. Так, у жителей сел, расположенных в верховьях реки (наиболее близко к месту сбросов), в формировании доз облучения преобладало внешнее -излучение, а у жителей среднего и нижнего течения (более удаленных от места сбросов) превалирующим являлось внутреннее облучение. Необходимо также отметить, что в первые годы (1950-1952 гг.) после начала сбросов до 90% дозы облучения ККМ было обусловлено внешним -излучением, тогда как, начиная с 1953 года, преобладало внутреннее облучение, преимущественно, за счет инкорпорированного в костной ткани 90Sr.

Для анализа зависимости «доза-эффект» использовали индивидуальные оценки доз на ККМ. Оценка индивидуальных доз облучения ККМ у обследованных лиц проводилась с использованием дозиметрической системы TRDS-2009, межправительственного соглашения Дозиметрическая система позволила также оценить дозы, полученные обследованными людьми, за счет аварии 1957 года и от медицинских процедур. Расчет индивидуальных доз был выполнен сотрудниками биофизической лаборатории ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России (зав. лабораторией – М.О. Дегтева). Основные дозовые характеристики группы облученных лиц и входящих в нее подгрупп представлены в таблице 2.2.

Таблица 2.2 – Дозовые характеристики группы облученных лиц и входящих в нее подгрупп, (M±m) Принимая во внимание широкий диапазон доз облучения ККМ у обследованных облученных лиц, представлялось важным оценить распределение индивидуальных значений поглощенной дозы (рисунок 2.1).

Около 9,3 % от числа всех облученных лиц (29 случаев) имели дозы менее 0,2 Гр. У 125 облученных лиц (40,2 %) доза ККМ находилась в диапазоне от 0,2 до 1 Гр. У такого же числа облученных лиц она была в диапазоне 1-2 Гр и только у 32 пациентов (около 10,3 %) она превышала 2 Гр.

Рисунок 2.1 – Распределение всех облученных лиц по величине поглощенной дозы облучения ККМ.

Динамика формирования поглощенной дозы и мощности дозы облучения ККМ у обследованных лиц представлена на рисунке 2.2. Видно, что максимальные значения мощности дозы облучения ККМ имели место в 1951 году и достигали 1,26 Гр/год. Среднее значение мощности дозы облучения ККМ у облученных лиц в 1951 году составляло 0,27±0,01 Гр (таблица 2.2). В дальнейшем мощность дозы радиационного воздействия снижалась и с 1985 года она не превышала предела дозы для населения [63].

Поглощенная доза облучения ККМ была преимущественно сформирована к 1961 году, а максимальное ее значение достигало 4,69 Гр. Среднее значение кумулятивной дозы облучения ККМ у облученных лиц за весь период наблюдения (1950-2005 гг.) составило 1,09±0,05 Гр, а индивидуальные значения варьировали в широком диапазоне (0,08-4,69 Гр).

Рисунок 2.2 – Динамика формирования поглощенной дозы и мощности дозы облучения ККМ у облученных лиц в 1950-2005 гг.

Средние значения и распределение индивидуальных значений максимального радиационного воздействия (1951 г.) у облученных лиц без ХЛС и отдаленной нейтропении были примерно таким же, как и в группе, включающей всех облученных лиц. Наиболее высокие значения мощности и поглощенной дозы отмечались у облученных лиц с отдаленной нейтропенией, а наименьшие – у лиц, перенесших ХЛС (таблица 2.2). Доля лиц, имевших дозы облучения ККМ более 1 Гр, среди пациентов с отдаленной нейтропенией была также значительно выше, чем среди лиц, перенесших ХЛС, и составляла, соответственно, 66,7% и 29,7%.

Объектом исследования являлись нейтрофилы периферической крови.

Количество лейкоцитов и нейтрофилов в периферической крови у всех обследованных лиц определялось с использованием автоматического гематологического анализатора Pentra 120 DX (HORIBA ABX S.A.S., Франция). Для исследования фагоцитарной, лизосомальной активности и показателей внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов использовалась лейкоцитарная взвесь. Показатели адгезивной способности, интенсивность апоптоза нейтрофилов и их способность образовывать внеклеточные ловушки определялись у нейтрофилов чистой фракции.

2.2.1. Получение лейкоцитарной взвеси и чистой фракции Забор крови у пациентов проводился утром, натощак из кубитальной вены в шприц с гепарином в объеме 5 мл. Для выделения лейкоцитарной взвеси из периферической крови в центрифужной пробирке смешивали 3 мл цельной гепаринизированной крови с 2,5 мл 1% раствора желатина. Кровь с желатиной инкубировали в термостате в течение 1 часа при температуре 37°С. После инкубации лейковзвесь дозатором переносили в сухую центрифужную пробирку. Клетки трижды отмывали раствором Хэнкса путем центрифугирования со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 7 минут, после чего надосадочную жидкость сливали, а лейкоциты ресуспендировали в 3 мл среды 199. Концентрация клеток в среде, подсчитанная в камере Горяева, составляла 2106 клеток/мл. По 1 мл стандартизованной клеточной суспензии помещали в 3 пробирки – «сапожка»: 1-ая пробирка использовалась для постановки спонтанного НСТ-теста; 2-ая пробирка – для фагоцитоза и индуцированного НСТ-теста; 3-я пробирка – для оценки лизосомальной активности нейтрофилов. На дне пробирок предварительно размещалась половина покровного стекла. Пробирки инкубировались в термостате при 37°С в течение 1 часа. После инкубации клетки дважды отмывались средой 199. При этом хорошо адгезирующиеся клетки (нейтрофилы, моноциты) оставались на стекле, а слабо адгезирующиеся (лимфоциты) удалялись. После второго отмывания в каждую пробирку – «сапожок» добавлялся 1 мл среды 199. Далее лейковзвесь использовалась для оценки фагоцитарной, лизосомальной активности и проведения НСТ-теста.

Выделение чистой фракции нейтрофильных гранулоцитов проводили в стерильных условиях путем центрифугирования предварительно разбавленной физиологическим раствором венозной крови (соотношение крови и физиологического раствора 2:3) на двойном градиенте плотности фиколл-урографина (Serva, Germany; Schering, Germany) в течение 40 минут со скоростью 1500 оборотов в минуту. Плотность верхнего слоя градиента составляла 1,075-1,077 г/мл, нижнего – 1,093-1,095 г/мл. Выделенные клетки двукратно отмывали стерильным физиологическим раствором в течение минут при 1500 оборотах в минуту, после чего их концентрацию в суспензии доводили до 5106 клеток/мл. Полученная таким образом чистая фракция нейтрофилов использовалась для определения адгезивной способности, интенсивности апоптоза нейтрофилов и их способности образовывать внеклеточные ловушки.

2.2.2. Оценка функциональной активности и апоптоза нейтрофилов периферической крови, а также содержания КСФ-Г и КСФ-ГМ в Для определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови во вторую пробирку – «сапожок» добавляли 100 мкл рабочего раствора латекса, после чего содержимое пробирки тщательно перемешивали и клетки инкубировали в течение 30 минут при 37°С [95].

Учет проводили с помощью микроскопа Axio Imager. A2 (Carl Zeiss, Germany) в световом режиме. Объектив – 63, окуляр – 10. Подсчитывалось число нейтрофилов, захвативших частицы латекса, на 100 клеток. Этот показатель определялся как активность фагоцитоза нейтрофилов – АФН.

Также оценивалось число поглощенных частиц латекса в 100 подсчитанных нейтрофилах – интенсивность фагоцитоза нейтрофилов (ИФН).

Фагоцитарное число определялось как отношение показателей интенсивности и активности фагоцитоза этих клеток и характеризовало среднее число частиц латекса, захваченное одним фагоцитировавшим нейтрофилом.

Оценка внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов проводилась путем постановки НСТ-теста в модификации А.Н.

Маянского и М.К. Виксмана (1979) [53]. В первую пробирку - «сапожок»

(спонтанный НСТ-тест) ничего не добавляли. Во вторую пробирку (индуцированный НСТ-тест) добавляли 100 мкл рабочего раствора латекса, затем содержимое пробирки тщательно перемешивали. Обе пробирки помещали в термостат и инкубировали 30 минут при температуре 37°С.

Чистое предметное стекло, разделенное стеклографом на две половины соответственно спонтанному и индуцированному НСТ-тесту, помещалось в чашку Петри. На каждую половину наносили реактив НСТ. Рабочий раствор НСТ готовился заранее и хранился в морозильной камере при температуре -20°С. После инкубации лейкоцитов обе пробирки извлекались из термостата, во второй пробирке – «сапожке» (индуцированный НСТ – тест) физиологического раствора, при последней отмывке физиологический раствор не сливался. Покровное стекло с адгезированными к нему клетками извлекалось из пробирок и укладывалось клетками вниз в каплю реактива НСТ на соответствующую половину предметного стекла. Затем препараты в чашке Петри помещались в термостат на 20 минут при температуре 37°С.

После инкубации в термостате покровные стекла извлекались из реактива НСТ и располагались параллельно друг другу на заранее приготовленном предметном стекле клетками вверх. Клетки фиксировались 96% раствором этилового спирта, подсушивались. Фиксацию проводили несколько раз в течение 15 минут. Готовые мазки окончательно высушивались и окрашивались рабочим раствором сафранина в течение 3-5 минут. Учет реакции проводили при помощи микроскопа Axio Imager. A2 (Carl Zeiss, Germany) в световом режиме под масляной иммерсией. Объектив – 63, окуляр – 10. Подсчитывалось число НСТ-положительных нейтрофилов на 100 фагоцитов.

Лизосомальная активность нейтрофилов оценивалась по методу И.С.

Фрейдлин (1986) [96]. Для этого в третью пробирку – «сапожок», содержащую суспензию лейкоцитов, добавляли 200 мкл рабочего раствора акридинового оранжевого, после чего ее интенсивно встряхивали. Затем клетки инкубировали в термостате в течение 30 минут при температуре 37°С.

После инкубации клетки трижды отмывались 2-мя мл физиологического раствора. При последней отмывке физиологический раствор не сливался.

производились в темной комнате. Покровное стекло извлекалось из пробирки – «сапожка» и располагалось на чистом предметном стекле клетками вниз.

Лизосомальная активность оценивалась с помощью микроскопа Axio Imager.

A2 (Carl Zeiss, Germany) под масляной иммерсией в люминесцентном режиме. Объектив – 100, окуляр – 10. Результаты расчитывались на клеток. Определяли лизосомальную активность нейтрофилов (ЛАН) – процент нейтрофильных гранулоцитов, имеющих лизосомальные гранулы.

Затем проводилась полуколичественная оценка содержания лизосом в нейтрофилах (обозначения: «+++» – цитоплазма нейтрофила полностью заполнена лизосомами, «++» – наполовину заполненная лизосомами цитоплазма клетки, «+» – наличие в цитоплазме нейтрофила единичных лизосом). При отсутствии лизосом в цитоплазме клетка считалась «нулевой».

Суммарная лизосомальная активность нейтрофилов (СЛАН), характеризующая лизосомальную активность нейтрофилов одного литра крови, расчитывалась по формуле:

Полученный показатель выражался в условных единицах.

Для оценки адгезивной способности нейтрофилов периферической крови использовали камеру Горяева, предварительно обезжиренную в растворе Никифорова, промытую дистиллированной водой и высушенную.

Непосредственно перед исследованием камеру протирали 96% раствором этилового спирта и затем высушивали. Подсчет клеток осуществляли на микроскопе Axio Imager. A2 (Carl Zeiss, Germany) в световом режиме.

Объектив – 40, окуляр – 10. Подсчитывали общее число нейтрофилов в пяти больших квадратах по диагонали камеры. Затем клетки в камере Горяева переносили в термостат и инкубировали при 37°С в течение 20 минут. После инкубации производили подсчет числа «распластанных» (адгезировавшихся к стеклу) нейтрофилов. Определяли процент адгезированных нейтрофилов от общего числа нейтрофилов в камере. Далее определяли средний размер распластавшихся нейтрофилов – среднее значение от 2 диаметров клетки, расчитанное для 50 нейтрофилов [36].