«ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНЫ В БИОХИМИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМАХ СТАРЕНИЯ ОРГАНИЗМА ...»

УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

Зимницкий Александр Николаевич

ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНЫ В БИОХИМИЧЕСКИХ

МЕХАНИЗМАХ СТАРЕНИЯ ОРГАНИЗМА

03.00.04 - биохимия

Диссертация

на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор С.А. Башкатов Уфа – 2004 2

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Список принятых сокращений ………………………………………….. ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………. Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………… 1.1. Структура и функции гликозаминогликанов…………………….. 1.2. Взаимосвязь обмена гликозаминогликанов с процессами детоксикации ксенобиотиков…………………………………………….. 1.3. Возрастные изменения биохимических процессов в печени……. 1.4. Возрастные изменения фракционного состава белков сыворотки крови………………………………………………….. 1.5. Изменения белкового спектра при беременности………………… 1.6. Теории старения и возрастные изменения биохимических показателей кожи………………………………………. 1.6.1. Генетическая теория старения……………………………………. 1.6.2. Свободнорадикальная теория старения…………………………. 1.6.3. Элевационная теория старения…………………………………… 1.7. К вопросу о локализации биосинтеза полисахаридов и его связи с генетическим аппаратом клетки ……………………………………… 1.8. Заключение по обзору литературы…………………………………. Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………….. Глава 3. ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА СОДЕРЖАНИЯ И МЕТАБОЛИЗМА ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ……………………. Глава 4. ВЛИЯНИЕ ГЛЮКОЗЫ НА СОДЕРЖАНИЕ

ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ В ЯДЕРНОЙ ФРАКЦИИ ПЕЧЕНИ

КРЫС……………………………………………………………………….. Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ БИОСИНТЕЗА

ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ И ЕГО ДИНАМИКИ С

ПРИМЕНЕНИЕМ 14С-ГЛЮКОЗЫ, МЕЧЕННОЙ ПО С1……………. Глава 6. КВАНТОВО-ХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОБРАЗОВАНИЯ

ВОДОРОДНЫХ СВЯЗЕЙ МЕЖДУ ОСНОВАНИЯМИ ДНК И

РАЗЛИЧНЫМИ ХИМИЧЕСКИМИ ГРУППАМИ

ПОЛИСАХАРИДОВ………………………………………………………. Глава 7. ДОТ-ГИБРИДИЗАЦИЯ ПОЛИСАХАРИДОВ С ПУРИНПИРИМИДИНОВЫМИ ЗОНДАМИ……………………………………. Глава 8. ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ

ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ, БЕЛКА И НУКЛЕИНОВЫХ

КИСЛОТ В КОЖЕ У ЖЕНЩИН……………………………………….. Глава 9. ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА БЕЛКОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЖЕНЩИН…………. Глава 10. СОПОСТАВЛЕНИЕ ВОЗРАСТНОЙ ДИНАМИКИ

ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ У

ЖЕНЩИН С АНАЛОГИЧНЫМИ ПОКАЗАТЕЛЯМИ ПРИ

БЕРЕМЕННОСТИ………………………………………………………… Глава 11. ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА БИОХИМИЧЕСКИХ

ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПЕЧЕНИ И ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА

ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ У

ЖЕНЩИН…………………………………………………………………. Глава 12. ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА БИОХИМИЧЕСКИХ

ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПЕЧЕНИ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И

БИОПОЛИМЕРОВ В КОЖЕ У ЖЕНЩИН…………………………… Глава 13. ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТА ПЛАЦЕНТАРНЫХ

ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ НА ПРОЦЕССЫ РЕПАРАТИВНОЙ

РЕГЕНЕРАЦИИ…………………………………………………………… 13.1. Качественная оценка влияния плацентарных ГАГ на репаративную регенерацию кожи……………………………………………….. 13.2. Количественная оценка влияние плацентарных ГАГ на репаративную регенерацию кожи…………………………………………….. 13.3. Влияние плацентарных ГАГ на транскрипционную активность фибробластов, лимфоцитов и моноцитов в экспериментах in vitro…………………………………………………………………………... Глава 14. СВЕДЕНИЯ ОБ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ

ПРЕПАРАТА «ПЛАЗАН» В МЕДИЦИНЕ И

14.1. Применение препарата «Плазан» в хирургии…………………… 14.2. Применение препарата "Плазан" в гинекологии……………….. 14.3. Сведения об эффективности применение плацентарных гликозаминогликанов в составе лечебно-профилактических средств в дерматокосметологии……………………………………………………...

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

• АДФ - аденозиндифосфат • АТФ - аденизинтрифосфат • Ацетил-КоА - ацетилкоэнзим А • ГАГ – гликозаминогликаны • ГК – гиалуроновая кислота • ГС – гепарансульфаты • ХС - хондроитинсульфаты • СГАГ – сульфатированные гликозаминогликаны • НСГАГ – несульфатированные гликозаминогликаны • D-ГК - D-глюкуроновая кислота • Г6Ф-ДГГ- глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа • 6ФГ-ДГГ - 6-фосфоглюконатдегидрогеназа • НАД - никотинамидадениндинуклеотид • НАДН+Н+ - восстановленный никотинамидадениндинуклеотид • НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат • НАДФН+Н+ - восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат • НК - нуклеиновые кислоты • ПОЛ - перекисное окисление липидов • РНК - рибонуклеиновая кислота • cpm - количество импульсов в минуту • СГАГ – сульфатированные гликозаминогликаны • *S – радиоактивномеченный сульфат (35SO42-) • УДФ - уридиндифосфат • УДФ-ГК - уридиндифофатглюкуроновая кислота • УК - уроновые кислоты • УТФ - уридинтрифосфат • ФАД - флавинадениндинуклеотид • ФМН - флавинмононуклеотид

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Биохимические механизмы адаптации организма к патологическим состояниям, неблагоприятным воздействиям со стороны окружающей среды, возрастным и физиологическим изменениям, например, таким как состояние беременности, в течение последних десятилетий постоянно привлекают внимание исследователей с целью создания средств, повышающих адаптационные возможности организма. В этом отношении недостаточно изучена роль гетерополисахаридов - гликозаминогликанов (ГАГ) (прежнее наименование “кислые мукополисахариды”), содержащих в своем составе гексозамины, гексозы и гексуроновые кислоты (Кочетков Н.К., 1967), подразделяющихся в основном на гиалуроновую кислоту (ГК), хондроитинсульфаты (ХС) и гепарансульфаты (ГС).

ГАГ содержатся в межклеточном матриксе, клеточных мембранах (Hunter G.K., Heersche J.N.M., Aubin J.E.,1983; Vogel K.G., Dolde J.,1979; Vogel K.G., Peterson D.W.,1981), а также в ядрах клеток в виде ассоциированных с хроматином протеогликанов (Onarheim H., Missavage A.E., Gunther R.A. et al.,1991; Stein G.S., Roberts R.M., Davis J.L. et al.,1975). В настоящее время известно (Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981; Фукс Б.Б., Фукс Б.И.,1968), что ГАГ в составе протеогликанов соединительной ткани обеспечивают ее механические свойства, участвуют в воспалительных реакциях (Лабори Г.,1970) и репаративных процессах (Слуцкий Л.И., 1969), необходимы для нормального кроветворения (Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Агафонов В.И. и др.,1995; Северин М.В., Юшков Б.Г., Ястребов А.П.,1993; Ястребов А.П., Юшков Б.Г., Большаков В.Н.,1988) и полноценного иммунного ответа (Соловьев Г.М., Петрова И.В., Ковалев С.В.,1987), выполняют за счет влияния на проницаемость веществ в клетки трофическую и антитоксическую функции (Лабори Г., 1970). Следует подчеркнуть, что традиционные представления о механизмах антитоксических эффектов ГАГ основываются на их полианионных возможностях связывать гидрофильные токсические вещества основного характера в межклеточном матриксе, блокируя тем самым их поступление в клетки (Лабори Г., 1970; Переверзев А.Е.,1986).

Этот механизм не представляется исчерпывающим в связи с общностью метаболических путей обмена ГАГ, пентозофосфатного цикла, детоксицирующих реакций глюкуронидной конъюгации (Парк Д.В.,1973) и монооксигеназной системы (Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А.,1986).

Не вызывает сомнений, что именно механизмы устойчивости к ксенобиотикам определяют возможность самого выживания организмов в окружающей среде, которая становится все более насыщенной невероятным количеством разнообразных химических соединений. То есть, проблема адаптации организма к неблагоприятным ситуациям во многом может быть сведена к общебиологической способности клетки защищать себя от токсического воздействия экзогенных и эндогенных токсикантов, используя в качестве щита гетерополисахаридные компоненты межклеточного матрикса (Зимницкий А.Н., Башкатов С.А., 2004).

Однако участие в процессах детоксикации, как уже отмечалось, только часть функций ГАГ в рамках глобального явления адаптации. Источники литературы свидетельствуют, что в организме человека с возрастом отмечаются морфологические и физиологические изменения, являющиеся следствием биохимических сдвигов. Данные литературы констатируют наличие возрастных изменений концентраций низко- и высокомолекулярных эндогенных соединений в органах и тканях организма человека и животных. Однако наблюдения авторов фрагментарны и часто противоречат друг другу. Так, например, не существует однозначного мнения о биохимических механизмах старения и их регуляции, о направленности обусловленных возрастом концентрационных сдвигов содержания альбуминов и глобулинов в крови, фракций ГАГ и ДНК в коже.

Не вызывает сомнений, что качество обмена биополимеров в организме во многом зависит от токсической нагрузки на него экзо- и эндогенных соединений, метаболизирующихся в реакциях микросомального окисления и различных типов конъюгации и, тем самым, отвлекающих на себя метаболические потоки субстратов и макроэргических соединений, а также загружающих белоксинтетический и каталитический аппараты клетки. Очевидно, что такие физиологические состояния как старение и беременность в силу различных причин сопровождаются интоксикацией. В указанной связи возникает закономерное предположение о наличии определенного сходства в направленности биохимических сдвигов при этих состояниях. В пользу этой гипотезы свидетельствуют, например, сведения различных авторов об уменьшении концентрации альбумина в сыворотке крови, как при старении (Маршалл В.Дж., 2002; Пименов Ю.С., 1993; Кипшидзе Н.Н., Ткешелашвили Л.К., Салуквадзе Н.С., 1963;

Коркушко О.В., 1963; Нагорный Л.В., Никитин В.И., Буланкин И.И., 1963), так и при беременности (Кухта В.К., 1986).

В конце восьмидесятых годов прошлого века в руководимой нами лаборатории биотехнологии Отдела биохимии и цитохимии Уфимского научного центра РАН был разработан лекарственный препарат «Плазан», представляющий собой высокомолекулярную фракцию биополимеров из плаценты человека, основным компонентом которой являлись гетерополисахариды из класса ГАГ. В экспериментах на животных была продемонстрирована способность плазана стимулировать синтез РНК, подавлять рост патогенных микроорганизмов, значительно ускорять процессы репаративной регенерации. После успешного проведенных доклинических исследований безопасности препарата и получения разрешения на клиническую апробацию в начале девяностых годов была показана высокая терапевтическая эффективность плазана при лечении хирургических и гинекологических заболеваний.

В последующие годы плазан успешно использовался в качестве биологически активной добавки в изделиях лечебно-профилактической косметики, существенно улучшая у пациентов состояние кожных покровов и корригируя внешние проявления старения кожи. Именно в этот период середины девяностых годов стала очевидной взаимосвязь между качеством обмена ГАГ и функциональным состоянием кожи у человека, послужившая толчком к выполнению настоящих экспериментальных исследований, направленных на выяснение биохимических механизмов старения организма, сопряженных с обменом ГАГ.

На наш взгляд, выполненная работа является примером того, как выяснение биохимических механизмов, лежащих в основе фармакологической активности препаратов, позволяет получить новую информацию о сути общебиологических процессов. В нашем случае исследование фармакологической активности ГАГ проливает свет на ранее не известные стороны метаболизма биополимеров и патохимических механизмов старения организма в целом. В указанной связи сведения о терапевтической эффективности плазана в экспериментальных исследованиях на лабораторных животных и в клинике вынесены в заключительную часть работы, так как используются в качестве дополнительного подтверждения основной гипотезы исследования.

В связи со сказанным, основной гипотезой нашей работы являлось предположении о том, что патохимические механизмы старения сопряжены с изменением обмена таких биополимеров как гликозаминогликаны, белки и нуклеиновые кислоты. В качестве объекта исследования мы, помимо лабораторных животных, намеренно выбрали женскую популяцию по двум причинам:

во-первых, на наш взгляд, характеристика «практически здоровые лица» в старческом возрасте больше соответствует женщинам и, во-вторых, если говорить о прикладном аспекте наших исследований, то есть о прикладной геронтологии и дерматокосметологии, то женская популяция в силу исторически сложившейся структуры социальных отношений, системы культурных ценностей и норм поведения больше заинтересована в создании средств, корригирующих патологические изменения при старении.

Целью настоящей работы является теоретическое и экспериментальное обоснование значимой роли гликозаминогликанов и других биополимеров в биохимических процессах возрастных изменений, уточнение патохимических механизмов старения и разработка подходов к их направленной коррекции.

Для достижения поставленной цели представлялось необходимым решить следующие задачи:

1. Изучить фракционный состав гликозаминогликанов в органах и тканях неинбредных белых крыс.

2. Оценить интенсивность метаболизма в органах и тканях различных фракций ГАГ по интенсивности включения радиоактивного сульфата (35S042-) и групп.

3. Квантово-химическими и молекулярно-генетическими (дот-гибридизация) методами оценить возможность взаимодействия карбоксильной и гидроксиметильной групп моно- и полисахаридов с генетическим аппаратом клетки.

4. Изучить фракционный состав ГАГ и белков в сыворотке крови у женщин различных возрастных групп.

5. Изучить фракционный состав ГАГ, уровни общего белка и ДНК в коже у женщин различных возрастных групп.

6. Исследовать возрастную динамику состояния печени по показателям «печеночных проб» у женщин.

7. Сопоставить возрастные изменения фракционного состава белков сыворотки крови у женщин с аналогичными показателями в динамике беременности.

8. Оценить возможность стимуляции ГАГ транскрипционных процессов (синтеза РНК) и репаративной регенерации в целом.

9. Методами корреляционного, регрессионного, дисперсионного, факторного и кластерного анализов изучить взаимосвязи и взаимовлияния изучаемых показателей, описать их математически с помощью уравнений линейной регрессии, а также выявить латентные переменные и их конструкты.

10. Оценить принципиальную возможность патогенетически обоснованной коррекции негативных возрастных биохимических сдвигов.

11. Разработать концепцию дестабилизации системы гликозаминогликанов как одного из общих механизмов старения.

12. Обосновать возможность прогнозирования интенсивности процессов старения по показателям гликозаминогликанового и белкового обменов.

13. Показать возможность практического использования результатов экспериментальных исследований биохимических механизмов фармакологической активности ГАГ в хирургии, гинекологии и дерматокосметологии.

Научная новизна. Проведенные исследования позволили существенно расширить представления о биохимических механизмах, лежащих в основе старения, сопоставить их с побочными эффектами беременности и выявить взаимосвязь с генетическим аппаратом клетки. При этом установлены зависимости между возрастом и показателями содержания в органах и тканях гликозаминогликанов, белков, а также их фракций и нуклеиновых кислот. Показано сходство сдвигов исследованных биохимических параметров при старении и беременности. Разработаны методические подходы к формированию оптимальных концентраций гиалуроновой кислоты в органах и тканях для профилактического применения с целью повышения резистентности организма к возрастным изменениям биохимических процессов. Предложена концепция дестабилизации системы гликозаминогликанов как одного из общих механизмов старения, заключающегося в том, что с возрастом нарушается генетически детерминированный обмен биополимеров межклеточного матрикса, приводящий к обеднению гликозаминогликанами органов, покровной ткани и повышением вследствие этого их концентрации в сыворотке крови. В экспериментах по изучению биохимических механизмов фармакологических эффектов гликозаминогликанов (и в частности, препарата «Плазан») установлено, что в их реализации существенную роль играет стимуляция транскрипционной активности клеточных ядер, обеспечивающая интенсификацию репаративной регенерации тканей и антимикробной активности иммунокомпетентных клеток.

Практическая значимость выполненного исследования заключается в том, что показана принципиальная возможность прогнозирования интенсивности процессов старения по показателям гликозаминогликанового и белкового обменов путем определения фракционного состава гликозаминогликанов, белков в сыворотке крови с последующей подстановкой результатов в соответствующие уравнения линейной регрессии. Сопоставление данных биохимических исследований механизмов метаболизма гликозаминогликанов и результатов клинических испытаний содержащего плацентарные ГАГ препарата «Плазан»

при хирургических и гинекологических заболеваниях позволяет рекомендовать проведение дальнейших исследований с целью расширения показаний к применению плацентарных ГАГ и, в перспективе, широкого внедрения препаратов на их основе в практическое здравоохранение и дерматокосметологию.

На защиту выносятся следующие научные положения:

1. В патогенезе старения существенное значение имеет снижение генетически детерминированного синтеза организмом несульфатированных и сульфатированных гликозаминогликанов.

2. Существуют возрастные различия во фракционном составе гликозаминогликанов и белков в органах и тканях у подопытных животных, а также в сыворотке крови и коже у женщин.

3. Существуют возрастные различия показателей состояния печени у женщин.

4. Существуют возрастные изменения фракционного состава белков сыворотки крови у женщин, сопоставимые с аналогичными показателями в динамике беременности.

5. В норме в организме существуют взаимосвязи и взаимовлияния показателей возраста, беременности и обмена биополимеров.

6. Существует принципиальная возможность коррекции негативных возрастных биохимических сдвигов путем стабилизации обмена биополимеров межклеточного матрикса.

7. В биохмическом механизме фармакологической активности гликозаминогликанов существенную роль играет стимуляция транскрипционной активности ядер клеток, обеспечивающей интенсификацию репаративной регенерации тканей и антимикробной активности иммунокомпетентных клеток.

8. Дестабилизацию системы гликозаминогликанов правомерно рассматривать в качестве одного из общих механизмов старения организма.

9. Существует возможность прогнозирования интенсивности процессов старения по показателям гликозаминогликанового и белкового обменов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на II Всероссийском симпозиуме с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии» (Самара, 2004), на IV Международном конгрессе по эстетической медицине (Москва, 2004), на III Международном форуме по пластической хирургии и дерматокосметологии (Москва, 2004), на III Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik international» (Москва, 2004), на Международной конференции «Профессиональная косметика и современные технологии в эстетической косметологии» (Санкт-Петербург, 2004), на Международном форуме по пластической хирургии и дерматокосметологии (Москва, 2003), на II Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik international» (Москва, 2003), на IV конгрессе по пластической, реконструктивной и эстетической хирургии (Ярославль, 2003), на IV Коференции «Косметология будущего – косметология antu-age» (Санкт-Петербург, 2003), на X Юбилейной научно-практической конференции «Клиническая эффективность нелекарственных оздоровительных продуктов: парафармацевтики, нутрицевтики, космецевтики» (Москва, 2003), на VII Всероссийской конференции по проблеме термических травм (Челябинск, 1999), на IV Съезде травматологов и ортопедов России (Нижний Новгород, 1997), на Научной конференции «Люминесцентный анализ в медицине и его аппаратурное обеспечение» (Рига, 1988), на Международной конференции «Медицина и катастрофы» (Уфа, 1990), на Научнопрактической конференции «Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов (Уфа, 1989).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 45 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 333 страницах, содержит 124 таблицы, 78 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов, предметов и методов исследования, 14 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 226 источников, из которых 126 отечественных и 100 иностранных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Применение методов аналитической биохимии, меченых атомов, молекулярной биологии и квантово-химических расчетов позволило аргументировать выдвижение гипотезы матричного синтеза гликозаминогликанов.

2. В патогенезе старения, по данным корреляционного и дисперсионного анализов, существенное значение имеют взаимозависимые снижения синтеза и концентрации в тканях не только несульфатированных, но и сульфатированных гликозаминогликанов.

3. Переменная «возраст», показатели содержания гликозаминогликанов и их фракций, а также анаболизма сульфатированных гликозаминогликанов, по данным факторного анализа, описываются одним математическим конструктом, доказывающим регуляцию именно возрастом биохимических процессов в организме.

4. Возраст, по данным кластерного анализа, в большей мере связан с биохимическими показателями печени и мозга и в меньшей степени с биохимическими показателями кожи, что свидетельствует о первичности патохимических сдвигов в печени, головном мозге и вторичности – в коже.

5. С возрастом изменяется фракционный состав гликозаминогликанов органов и тканей организма (головного мозга, печени, кожи и сыворотки крови).

При этом наименьшие патохимические сдвиги отмечаются в головном мозге, что свидетельствует о его большей устойчивости к возрастной патологии.

6. Выявлена отчетливая зависимость между возрастной динамикой биохимических показателей обмена гликозаминогликанов, белков и показателями состояния печени. По данным регрессионного анализа, интегральная оценка состояния организма может быть получена расчетом следующих индексов:

1) [ГАГ кожи]/возраст; 2) [ГАГ сыв]*[НК кожи]; 3) [Белок кожи]*Тимоловая проба.

7. Возрастные изменения фракционного состава белков сыворотки крови у женщин сопоставимы с аналогичными показателями в динамике беременности. Значения коэффициента 1/ у беременных соответствуют показателям старших возрастных групп, что позволяет предположить, по крайней мере, временную интенсификацию процессов старения в период беременности.

8. В норме в организме существуют взаимосвязи и взаимовлияния показателей возраста, беременности и обмена биополимеров. Показатель «срок беременности» в структуре корреляционных связей фактически ведет себя аналогично показателю «возраст» у небеременных женщин.

9. Существует принципиальная возможность коррекции негативных возрастных биохимических сдвигов путем стабилизации обмена биополимеров межклеточного матрикса.

10. Дестабилизацию системы гликозаминогликанов правомерно рассматривать в качестве одного из общих механизмов старения организма.

11. Существует возможность прогнозирования интенсивности процессов старения по показателям гликозаминогликанового и белкового обменов.

12. Можно считать доказанной гипотезу о сопряженности механизмов старения с состоянием гликозаминогликанового и белкового обмена.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для диагностики соответствия паспортного возраста биологическому целесообразно определять показатели фракционного состава гликозаминогликанов и белков в сыворотке крови с последующей оценкой путем применения регрессионного анализа.

2. При разработке лекарственных препаратов из группы геронтопротекторов целесообразно проводить их скрининг по показателям воздействия на спектральный состав гликозаминогликанов и белков сыворотки крови с расчетом соответствующих возрастных коэффициентов.

3. С учетом полученных сведений о биохимических механизмах метаболизма гликозаминогликанов и результатов клинических исследований фармакологической активности препарата «Плазан», в целях повышения адаптационных возможностей организма представляется целесообразным изучить на соответствующих экспериментальных моделях фармакологическую активность УДФглюкуроновой кислоты.

4. Целесообразна подготовка соответствующей документации, способствующей широкому внедрению препарата «Плазан» в практическое здравоохранение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Структура и функции гликозаминогликанов Гликозаминогликаны представляют собой линейные гетерополисахариды, состоящие из повторяющихся дисахаридных фрагментов, в которые входят гексозы, гексозамины и гексуроновые кислоты (Кочетков Н.К., 1967). ГАГ, содержащие гексуроновые кислоты, подразделяют на несущие сульфогруппы хондроитинсульфаты, дерматансульфаты, гепарансульфаты, гепарин и несульфатированную гиалуроновую кислоту (Стейси М., Баркер С.,1965; Tool B.D., Biswas Ch., Gross J., 1979; Башкатов С.А., 1996) (рис.1.1.1 – 1.1.5).

Структурная единица гиалуроновой кислоты (рис.1.1.1) представляет собой остаток D-глюкуроновой кислоты, связанный 13 о-гликозидной связью с остатком N-ацетилглюкозамина. Внутри полимера структурные единицы связаны 14 о-гликозидными связями.

COOH CH2OH COOH CH2OH

H OH H NHCOCH3 H OH H NHCOCH

Рис. 1.1.1. Строение гиалуроновой кислоты.

Хондроитин-4-сульфат (хондроитинсульфат А) состоит из остатков Dглюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-галактозамин-4-сульфата, связанных 13 о-гликозидной связью. В свою очередь, дисахариды связаны 14 огликозидными связями.

Хондроитин-6-сульфат (хондроитинсульфат С) (рис.1.1.2) отличается от хондроитинсульфата А сульфатированностью N-ацетил-D- галактозамина в положении.

H OH H NHCOCH3 H OH H NHCOCH

Рис. 1.1.2. Строение хондроитинсульфата С.

На рисунке 1.1.3. изображено строение дерматансульфата (хондроитинсульфата В), в дисахаридах которого остаток L-идуроновой кислоты связан 13 о-гликозидной связью с N-ацетилгалактозамин-4-сульфатом. Следует отметить, что в составе этого гетерополисахарида иногда, помимо Lидуроновой кислоты, встречается D-глюкуроновая кислота. Дисахариды дерматансульфата связаны 14 о-гликозидными связями.

H OH H NHCOCH3 H OH H NHCOCH

Рис. 1.1.3. Строение дерматансульфата.

Гепарансульфаты (рис. 1.1.4) и гепарин (рис. 1.1.5) являются структурно близкими соединениями, дисахаридные звенья которых состоят из остатков глюкуроновой или идуроновой кислот, связанных с глюкозамином 14 огликозидными связями. Повторяющиеся димеры связаны 14 о-гликозидными связями. При этом уроновые кислоты могут быть сульфатированы во 2 и 3 положениях, а глюкозамин может быть N- ацетилированным, N- и Осульфатированным.

OH OH H H H

Рис. 1.1.4. Строение гепарансульфатасульфата.

OH OH H H H

Рис. 1.1.5. Строение гепарина.

В тканях организма сульфатированные гликозаминогликаны входят в состав протеогликанов, в которых ковалентно связаны с белковой молекулой кором (Lyon M., Nieduszynski I.A.,1983).

В свою очередь, протеогликаны могут быть объединены несульфатированной молекулой гиалуроновой кислоты, имеющей молекулярную массу от до 10 млн Да, в огромные нековалентно связанные комплексы. Так, электронномикроскопические исследования показали, что в хрящевой ткани одна молекула гиалуроновой кислоты может удерживать до 140 протеогликанов с образованием агрегата с молекулярным весом около 70 млн Да (Rosenberg L., Hellmann W., Kleinschmidt A.K., 1975).

В настоящее время считается, что функциональная роль протеогликанов обусловлена входящими в их состав гликозаминогликанами и заключается в обеспечении по ионообменному механизму и благодаря особому пространственному строению их агрегатов, проявляющемуся в феномене переплетения и эффекте исключенного объема, трофической функции (особенно в бессосудистой брадитрофной ткани) (Елаев Н.Р., Бахтиярова К.З., 1992; Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981).

Велико значение протеогликанов в обеспечении механических свойств тканей (Слуцкий Л.И., 1969), показана регулирующая роль в процессах фибриллогенеза при репаративной регенерации. Однако до настоящего времени мало изучена роль этих гетерополисахаридов в биохимических механизмах адаптации организма к воздействию ксенобиотиков.

1.2. Взаимосвязь обмена гликозаминогликанов с процессами детоксикации ксенобиотиков Известно (Тиунов Л.А., 1987), что после первой фазы детоксикации липофильных ксенобиотиков с участием микросомальных монооксигеназ и образованием соответствующих метаболитов, содержащих нуклеофильные группировки, начинается чрезвычайно важная вторая фаза, представленная реакциями конъюгации, наиболее важной из которых выступает глюкуронидная, требующая для своей реализации D-ГК. В этой реакции с образованием глюкуронидов детоксицируются фенолы, первичные, вторичные и третичные спирты, гидроксиламины, кетоны, ароматические и алифатические карбоновые кислоты, карбаматы, полиамины, сульфаниламиды, арилмеркаптаны, дитиокарбоновые кислоты и другие соединения. Синтез глюкуронидов (Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А.,1986; Тиунов Л.А., 1987) является ферментативным биосинтетическим процессом, протекающим с затратами энергии, и начинается с образования глюкозо-1-фосфата из гликогена печени, который, взаимодействуя с уридин-5-трифосфатом, превращается в уридиндифосфатглюкозу и далее с восстановлением НАД - в уридиндифосфатглюкуроновую кислоту, которая вступает в реакцию конъюгации с ксенобиотиками и эндогенными соединениями с образованием нетоксичных продуктов. Последняя реакция катализируется ферментом уридиндифосфатглюкуронозилтрансферазой, лимитирующей скорость процесса глюкуронидной конъюгации в целом.

МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПУТИ УДФ-ГЛЮКУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ

HO P O P OH

ксилулозный Глюкозо-6-фосфат Пентозофосфатный

OH O ФФУ

Рис. 1.2.1. Метаболические пути УДФ-глюкуроновой кислоты.

Для синтеза организмом ГАГ также как и для реакций глюкуронидной конъюгации необходима активная форма глюкуроновой кислоты (УДФ-ГК), которая для образования полимерной формы этого гетерополисахарида взаимодействует с N-ацетилгексозамином по механизму аналогичному образованию глюкуронидных конъюгатов (Лабори Г., 1970; Слуцкий Л.И., 1969). В связи с этим синтезирующие ГАГ клетки все время находятся перед выбором на что использовать УДФ-ГК: на синтез ГАГ или на реакции конъюгации (рис. 1.2.1).

В том случае, если УДФ-ГК не вступила в реакции детоксикации с образованием конъюгатов и в процессы синтеза ГАГ, она в виде D-ГК продолжает свой метаболический путь в глюкуронат-ксилулезном цикле (рис. 1.2.2 и 1.2.3) и, окисляя НАДФН+Н+, восстанавливается в L- гулоновую кислоту, которая в свою очередь, восстанавливая НАД, окисляется в 3-кето-L-гулоновую кислоту.

Вслед за этим 3-кето-L-гулоновая кислота декарбоксилируется в L-ксилулезу, которая в процессе двух реакций с окислением НАДФН+Н+ и восстановлением НАД преобразуется в D-ксилулезу, фосфорилируемую АТФ и вступающую в виде D-ксилулезо-5-фосфата на пентозофосфатный путь (гексозомонофосфатный шунт) превращения углеводов (Лабори Г., 1970). Таким образом, в случае образования глюкуронидных конъюгатов и ГАГ путь уроновой кислоты является незавершенным, однако при метаболизме гексуроновых кислот, образующихся при катаболизме ГАГ, он должен быть пройден до конца (до ксилулезы), так как только в этой ситуации возможен нормальный обмен гликозаминогликанов.

ГЛЮКУРОНАТ-КСИЛУЛОЗНЫЙ ЦИКЛ

Глюкозо-1-Ф

ПЕНТОЗОФОСФАТНЫЙ

УДФ-глюкоза УДФ-глюкуронат D-глюкуроновая к-та Кетогулонолактон Рис. 1.2.2. Глюкуронат-ксилулезный цикл.

ОБРАЗОВАНИЕ И РАСЩЕПЛЕНИЕ D-ГЛЮКУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ

ПЕНТОЗОФОСФАТНЫЙ

OH O ФФУ

2НАД+ 2НАДН+2Н+

OH O ФФУ

H OH OH OH

OH H OH H

OH H O OH

НАДФ+

OH OH H OH

Рис. 1.2.3. Образование и расщепление D-глюкуроновой кислоты.

Также представляется важным, что описанный метаболизм УДФ- глюкуроновой кислоты характерен для приматов (в том числе человека) и морских свинок, в организме которых не синтезируется аскорбиновая кислота. У прочих животных обмен УДФ-ГК проходит через образование и распад аскорбиновой кислоты (рис. 1.2.4).

МЕТАБОЛИЗМ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

OH H OH OH

OH H OH OH

L-гулоно- -лактон

OH H OH O OH H O O

2-кето-L-гулоно- -лактон

OH H OHOH

Рис. 1.2.4. Метаболизм аскорбиновой кислоты.

К сказанному об обмене уроновой кислоты следует добавить, что глюкуронидазы способны расщеплять не только полимерные ГАГ, но и могут осуществлять гидролиз глюкуронидов эндогенных веществ, что, по-видимому, играет роль в оптимизации уровня гормональных веществ (Парк Д.В.,1973).

Рассмотрев в общих чертах некоторые аспекты метаболизма ГАГ, проанализируем с биохимической точки зрения его изменения в клетках печени и головного мозга при нагрузке организма экзогенными ГАГ в норме и при патологической ситуации на примере токсического поражения. Прежде остановимся на особенностях энергетического обмена в головном мозге и печени.

Головной мозг, составляя около 2% от массы тела, потребляет 20-25% поступающего в организм кислорода (табл. 1.2.1). При этом в коре больших полушарий 70% кислорода утилизируют нейроны, а 30% - глиальные клетки (Ещеенко Н.Д., 1996).

Среднее потребление кислорода тканями взрослых крыс (мМ О2 за 1 ч на 1 г сухой массы) (Ещеенко Н.Д., 1996) 2. Сердце Помимо значительного поглощения кислорода для мозга характерно высокое потребление глюкозы крови, составляющее 70% от ее количества, образующегося в печени. Собственные запасы глюкозы в мозге крайне невелики и достаточны для обеспечения его функционирования лишь в течение 3-6 минут.

Также незначительно в мозге и содержание гликогена, время полного расщепления которого до глюкозы с последующим ее окислением оценивается всего в 5-7 минут. Высокая зависимость головного мозга от поступления глюкозы обусловлена еще и особенностями функционирования гематоэнцефалического барьера, обеспечивающего высокую проницаемость для глюкозы и низкую для других субстратов окисления (табл.1.2.2). Поэтому в силу перечисленных обстоятельств глюкоза выступает в качестве главного субстрата окисления в мозге.

гематоэнцефалического барьера (Ещеенко Н.Д., 1996) 3. Нейтральные В таблице 1.2.3 представлены сведения, касающиеся интенсивности основных метаболических путей глюкозо-6-фосфата в мозге и печени половозрелых крыс.

Интенсивность отдельных путей метаболизма глюкозо-6-фосфата в головном мозге и печени крыс (Ещеенко Н.Д., 1996) 1. Окисление до СО2 и Н2О в ходе аэробного гликолиза и цикла Кребса 80-90 Около 3. Расщепление в глюкозо-6фосфатазной реакции до свободной Следы До глюкозы В энергетическом обмене мозга преобладает использование этого субстрата в реакциях аэробного распада. Для печени характерна определенная сбалансированность и универсальность всех метаболических путей. Если в головном мозге 90% глюкозо-6-фосфата расходуется в реакциях аэробного гликолиза и цикла трикарбоновых кислот, то в печени значительное его количество может метаболизироваться на пентозофосфатном пути, сопровождающимся запасанием НАДФН+Н+, а также расщепляется до свободной глюкозы или запасаться в виде гликогена.

До сих пор мы рассматривали метаболические процессы головного мозга и печени в целом для этих органов без учета особенностей вклада конкретных клеточных элементов: для мозга - нейронов и клеток нейроглии, для печени гепатоцитов и фибробластов с лаброцитами, поэтому остановимся на особенностях метаболических систем этих клеток.

Для нейронов мозга характерно превалирование аэробного гликолиза с активным функционированием цикла Кребса при неразвитости гексозомонофосфатного шунта. В клетках нейроглии, астроцитах и олигодендроцитах, образующих с нейроном анатомически и функционально единую структуру, равновесие энергетических процессов смещено в сторону пентозофосфатного цикла (Лабори Г., 1974). Для фибробластов и лаброцитов печени также характерно преобладание реакций пентозофосфатного цикла. В гепатоцитах хорошо развиты обе метаболические системы (путь Эмбдена-Мейергофа-Кребса и гексозомонофосфатный шунт). Нейроны и гепатоциты в отличие от остальных упомянутых клеток синтезируют ГАГ в минимальных количествах, необходимых для использования в пределах клетки. Все рассматриваемые клеточные структуры содержат развитую микросомальную монооксигеназную систему, содержащую цитохром Р-450.

С учетом приведенных сведений, правомерно ожидать следующих биохимических событий в организме после введения экзогенных гликозаминогликанов.

Парентеральное введение ГАГ неизбежно приведет к повышению их содержания в крови, которое, с одной стороны, должно затруднить выход в нее из органов эндогенных ГАГ, а с другой стороны увеличить интенсивность их катаболизма и как следствие вызвать накопление уроновых кислот, которые будут вынуждены вступить в гепатоцитах, фибробластах, лаброцитах и клетках макроглии (но не в нейронах, не располагающих достаточно эффективно функционирующим гексозомонофосфатным шунтом) на путь своего метаболизма со стадии трансформации в L-гулоновую кислоту и до попадания на пентозофосфатный путь. При этом метаболизм каждой молекулы уроновой кислоты в этих клетках приведет к восстановлению 2 молекул НАД и окислению 2 молекул НАДФН+Н+, то есть к трансгидрогенезации от НАДФН+Н+ к НАД, что приведет к активации запасающего НАДФН+Н+ пентозофосфатного цикла и к торможению требующих НАД пути Эмбдена-Мейергофа и лимоннокислого цикла.

Это в свою очередь приведет к активации метаболизма УДФ-глюкозы в сторону всего пути уроновой кислоты. Однако, очевидно, что при образовании УДФглюкуроната, он будет расходоваться преимущественно на образование глюкуронидных конъюгатов, а не на синтез ГАГ, в связи с перегрузкой ими тканей. К тому же синтез ГАГ будет затруднен вследствие недостаточной активности цикла трикарбоновых кислот, поставляющего аминогруппы глутамина для синтеза глюкоз- или галактозаминовых звеньев цепи ГАГ. Следует добавить, что в связи с выполнением нейроглией барьерной функции в отношении нейронов, последние скорее всего должны быть избавлены от необходимости участвовать в утилизации избытка ГАГ.

С учетом вышеизложенного, сложившаяся ситуация должна выглядеть как некоторое смещение под воздействием экзогенно введенных ГАГ метаболической активности клеток, располагающих активно функционирующим пентозофосфатным путем, в сторону повышения интенсивности заинтересованных в НАДФН+Н+ синтетических и детоксикационных процессов. Модулирующее влияние экзогенных ГАГ на энергетический обмен должно быть легко управляемым в силу их высокой доступности в тканях и значительной скорости метаболизма. Кроме того, несмотря на некоторое снижение интенсивности реакций пути Эмбдена-Мейергофа и цикла Кребса, синтез АТФ может продолжаться за счет акцепции НАДН+Н+ ФАД- или ФМН-зависимыми дегидрогеназами дыхательной цепи.

Представляется весьма вероятным, что в такой ситуации повысится активность использования НАДФН+Н+ микросомальными монооксигеназами и системой глутатионредуктазы, восстанавливающей глутатион в системе реакций антирадикальной и антиперекисной защиты. По мнению Л.А.Тиунова (1986), “ферментные антиоксидантные защитные системы “гасят” свободные радикалы с помощью потока протонов, источниками которых служит фонд НАДФН+Н+, пополняющийся за счет реакций пентозофосфатного цикла”.

Правомерно ожидать, что все сказанное в отношении событий, разворачивающихся в клетках после введения экзогенных ГАГ, не будет прямо касаться нейронов и сказываться на их функционально-метаболическом состоянии в связи с изолированностью этих клеток ЦНС гематоэнцефалическим барьером, создаваемым астроцитами и эндотелием сосудов. То есть, воздействие экзогенных ГАГ на нейроны должно быть опосредованным астро- и олигодендроцитами за счет обмена субстратами и другими физиологически активными веществами.

Таким образом, можно с достаточной степенью вероятности ожидать, что введение в организм экзогенных ГАГ переориентирует направленность энергетических процессов в клетках в сторону пентозофосфатного цикла и пути уроновой кислоты с преобладанием конъюгационных реакций на фоне индукции цитохром Р-450 содержащей монооксигеназной системы и систем реакций антирадикальной и антиперекисной защиты.

Вероятно, не будет принципиальных отличий в поведении гепатоцитов, фибробластов, тучных клеток, астро- и олигодендроцитов, так как они обладают хорошо развитыми анаэробными системами энергообеспечения. Фармакологически важным эффектом введения экзогенных ГАГ может быть повышение эффективности работы гематоэнцефалического барьера за счет увеличения антитоксической и синтетической активности астроцитов.

В случае токсического поражения химические вещества, проникая в организм, изменяют его биохимическую среду, нарушают течение метаболических процессов. При этом гибель организма наступает в случае превышения скорости поступления яда над интенсивностью процессов его детоксикации.

В развитии патологического процесса выделяют специфические и неспецифические механизмы. Общие неспецифические механизмы токсичности достаточно универсальны. К ним относится (Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А.,1986) токсический стресс, экзотоксический шок и гипоксия, усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ), дистрофические изменения и др.

В отношении экзотоксического шока принята следующая классификация (Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А.,1986):

1) “Кардиогенный шок” (резкое снижение сердечного выброса в случаях непосредственного повреждающего действия ядов на сердечную мышцу и ее нервный аппарат);

2) “Гиповолемический шок”, наступающий в результате массивной потери плазмы, воды и электролитов;

3) “Сосудистый шок” (повышение сосудистой емкости вследствие резкого снижения сосудистого тонуса и относительной гиповолемии).

Виды гипоксий дифференцируют в зависимости от механизма повреждения системы транспорта кислорода (Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А.,1986):

1) Гипоксическая (дыхательная) гипоксия - нарушение оксигенации крови в легких вследствие снижения альвеолярной вентиляции (гиповентиляция), нарушений равномерности вентиляции, затруднений диффузии газов через альвеолярно-капиллярный барьер, шунтирования венозной крови при перфузии невентилируемых альвеол (нарушение вентиляционно-перфузионных отношений).

2) Гемическая (кровяная) гипоксия - снижение кислородной емкости крови вследствие уменьшения количества эритроцитов (например, из-за гемолиза), снижения способности гемоглобина связывать кислород в легких или отдавать его в тканях.

3) Циркуляторная (сердечно-сосудистая) гипоксия - несоответствие кровотока потребностям тканей в кислороде из-за недостаточности деятельности сердца, снижения тонуса сосудов или нарушений микроциркуляции.

4) Гистотоксическая (тканевая) гипоксия - неспособность тканей эффективно использовать кислород из-за отсутствия субстратов окисления или торможения ключевых ферментов.

Устранение неспецифических патологических эффектов осуществляется микросомальными монооксигеназами, системами конъюгации и защиты от интенсификации свободнорадикальных процессов.

Рассмотрим вероятные события, которые могут происходить в клетке при интоксикации гидрофобными и гидрофильными ксенобиотиками на фоне введения экзогенных ГАГ.

В первом случае организм встречает гидрофобный (липофильный) ксенобиотик системой микросомальных монооксигеназ, контролируя интенсифицирующиеся при этом свободнорадикальные процессы с помощью соответствующих ферментных систем и соединений-антиоксидантов, и далее обеспечивает вступление полученных гидрофильных продуктов в реакции конъюгации.

Во втором случае гидрофильный ксенобиотик, благодаря наличию нуклеофильных группировок, минуя монооксигеназную систему, сразу же вступает в реакции конъюгации. При этом активация процессов ПОЛ происходит как следствие генерализованной неспецифической реакции на токсический стресс и гипоксию (Мхитарян В.Г., Агаджанов М.И., Геворкян Д.М.,1982).

Представляется вполне обоснованным, что применение ГАГ будет целесообразным и достаточно эффективным как в первом, так и во втором случае.

Как уже отмечалось выше, ГАГ за счет интенсификации реакций пути уроновой кислоты и гексозомонофосфатного шунта будут способствовать повышению интенсивности образования глюкуронидных конъюгатов, а также лучшему обеспечению восстановленными коферментами (НАДФН+Н+) микросомальных монооксигеназ, ферментативных реакции антирадикальной и антиперекисной защиты. То есть предполагаемый механизм антитоксического действия ГАГ должен базироваться на повышении эффективности всех звеньев антитоксической защитной системы организма, включая и присущую только самим ГАГ способность связывать токсические вещества в основном веществе соединительной ткани.

Эти общие сформулированные для клетки в целом положения могут быть полностью перенесены на рассматриваемые нами конкретные их типы. Так, теоретически должны увеличиться антитоксические возможности клеток печени (гепатоцитов, фибробластов и лаброцитов) за счет более эффективного метаболизма ксенобиотиков и повышения активности антиоксидантных систем. В головном мозге помимо этих эффектов можно ожидать повышения надежности гематоэнцефалического барьера за счет усиления метаболической активности глиальных клеток.

1.3. Возрастные изменения биохимических процессов в печени В организме обмен веществ прямо или косвенно контролируется печенью (Рашидов Н.Р., 2002). Очевидно, что возрастные изменения метаболических функций печени не могут не влиять на интегральный процесс старения организма.

Существенную роль в процессах старения играет апоптоз. В нормальных физиологических условиях с возрастом увеличивается восприимчивость гепатоцитов к апоптозу. Повышенная чувствительность клеток к апоптозу защищает генотипическую стабильность при старении, с другой стороны, вероятно, приводит к гибели функционально активных клеток, что уменьшает функциональные возможности органа (Жижина Г.П., 2002; Higami Y, Shimokawa I, Tomita M, Okimoto T, Koji T, Kobayashi N, Ikeda T., 1997; Muskhelishvili L, Hart RW, Turturro A, James SJ., 1995).

Многие исследователи считают, что первичные механизмы старения следует искать на уровне генетического аппарата клетки. Установлена, однако, относительная возрастная стабильность состава азотистых оснований ДНК. И все же в экспериментах на животных обнаружено, что при старении повышается доля неактивного хроматина, уменьшается уровень включения оротовой кислоты в РНК (Холобок И.Ю., Гольдштейн Н.Б., Мозжухина Т.Г., 1979). В регенерирующей печени уровень РНК у старых крыс снижается, у взрослых, наоборот, растет, а ДНК у взрослых животных повышается, оставаясь неизменным у старых крыс (Литошенко А.Я., 1979).

С возрастом изменяется реакция транскрипционного аппарата клетки на гормональные влияния. Так, максимум включения радиоактивной метки в РНК в ответ на введение инсулина у старых животных наступает позже по сравнению с молодыми (Холобок И.Ю., Гольдштейн Н.Б., Мозжухина Т.Г., 1979).

Возрастные изменения процессов транскрипции, играющие важную роль в старении клетки, могут быть обусловлены нарушениями, как самого генетического аппарата, так и надклеточных механизмов его регуляции, в частности изменениями гормональной регуляции. Среди многочисленных гормонов глюкокортикоиды являются одними из немногих, которые активно транспортируются внутрь ядра и, связываясь с определенными локусами хроматина, оказывают специфическое регуляторное действие на синтез разных классов РНК. С возрастом влияние гидрокортизона на синтез разных классов РНК изменяется неодинаково. Исследования ряда авторов (Мартин Р., Мартин Г., Мурадян Х.К., 1978) показали, что, удельная радиоактивность (УР) прерибосомальной РНК (пре-рРНК) у взрослых и старых крыс через 2 часа после введения гидрокортизона значительно возрастает, соответственно 199 и 255% по сравнению с уровнем контрольных животных. В гепатоцитах старых крыс под влиянием гидрокортизона происходит значительная стимуляция синтеза пре-рРНК. Вместе с тем УР пре-иРНК в печени старых крыс растет незначительно по сравнению со взрослыми, и через 6 часов сменяется падением ниже исходного уровня. Примерно такие же отличия обнаружены при изучении влияния гидрокортизона на активность РНК-полимераз А. и Б. Обращает на себя внимание сравнительно быстрое наступление феномена истощения во фракции пре-иРНК. У взрослых крыс стимулирующее влияние гормона сохраняется до 6 дня, а у старых рост УР практически отсутствует. Возможно, именно недостаточной стимуляцией синтеза иРНК объясняется снижение индукционного эффекта и увеличение скрытого периода индукции многих адаптивных ферментов печени старых крыс.

По данным Никитина В.Н. и соавт. (1979) системы протеосинтеза печени старых крыс способны к развитию высокой функциональной активности. Авторы не обнаружили ни снижения белкового синтеза в старости, ни уменьшения уровня мРНК. С возрастом в печени снижается содержание маркерного протеина старения (SMP30). Его высокая экспрессия в созревающих и активно функционирующих тканях печени и почек у взрослых свидетельствуют о том, что этот белок участвует в поддержании высокодифференцированных функций.

Исследователи полагают, уменьшение содержания SMP30 связано со снижением транскрипции соответствующей РНК (Fujita T, Shirasawa T, Uchida K, Maruyama N., 1996).

Мембранные механизмы регуляции метаболизма и функций клеток оказывают существенное влияние на течение процесса старения. Изменение состояния клеточных мембран определяют сдвиги возбудимости, реакции на физиологически активные вещества, транспорт. В плазменных мембранах печени снижается уровень липидов и фосфолипидов, повышается доля насыщенных жирных кислот, ослабляется связь белков с мембраной. Активность натрийкалиевой АТФ-азы не изменяется (Дейл З., Сокорова.Л., Михль Д.Ж., Фролькис В.В., 1982). При старении изменяется и такая специфическая функция плазматических мембран клеток как рецепторный эндоцитоз. Как показали Dini L, Rossi L, Marchese E, Ruzittu MT, Rotilio G. (1996) при старении уменьшается связывание и включение Cu-, Zn-супероксиддисмутазы, а также скорость включения этого фермента в печеночные клетки.

Функциональные возможности любого органа, и печени в том числе, зависят, прежде всего, от интенсивности тканевого дыхания. Все компоненты цепи дыхательных ферментов связаны главным образом с митохондриями. По данным Литошенко А.Я. (1979), содержание белка и ДНК в митохондриях интактной печени с возрастом не изменяется, а содержание РНК растет. В регенерирующей печени уровень митохондриальной РНК у взрослых крыс растет, а у старых снижается, содержание ДНК также увеличивается у взрослых животных, а у старых не изменяется по сравнению с интактной печенью. Относительная удельная радиоактивность ДНК митохондрий печени взрослых животных во все сроки после введения метки была выше, чем у старых животных. Результаты исследований Bakala H. с соавт. (2003) указывают, что в матрице митохондриий старых крыс происходит постепенное накопление окисленных и карбоксиметилированных белков, связанное со снижением активности специфических протеаз. Накопление окисленных белков, наблюдаемое при старении, можно частично объяснить и угнетением метионин-сульфоксид-редуктазы, энзима катализирующего превращение сульфоксида метионина в метионин в составе белков (Petropoulos I, Mary J, Perichon M, Friguet B., 2001).

Разумович А.Н.(1969) отмечал, что у старых животных наблюдается возрастание активности гликолиза, кетоглютаратдегидрогеназной реакции, повышение степени сопряженности в системе окислительного фосфорилирования.

Вместе с тем приводятся данные о снижении уровня макроэргических соединений и повышении – неорганического фосфата. На основании этих данных автор делает следующее заключение: снижение энергетического потенциала не может быть объяснено снижением интенсивности функционирования энергообразующих систем. По-видимому, энергия повышенно расходуется в эндергонических реакциях стареющего организма. Это данные согласуются с результатами Bakala H (2003), указывающим на то, что потребление кислорода изолированными митохондриями старых (27-ми месячных) животных и митохондриями взрослых существенно не отличается, и Пушкарева В.Ф.(1969), который отмечает возрастное повышение активности НАД-Н2- и НАДФН2-дегидрогеназ печени. Вместе с тем наибольшая сукцинатдегидрогеназная активность отмечалась у зрелых животных, по сравнению с молодыми и старыми. Для нормального протекания реакций окислительного фосфорилирования важно наличие определенного количества сульфгидрильных групп в митохондриях. По данным Ластовской Т.Г. (1969), количество этих групп падает в печени стареющих крыс.

Определенные изменения претерпевает и микроэлементный состав печени. По сведениям Гулько В.В. (1969), в юношеском возрасте наблюдается высокое содержание цинка в печени, которое с возрастом понижается, достигает наименьших значений в группе 45-59 лет, а в пожилом и старческом возрасте концентрация цинка вновь несколько повышается. Установлена корреляция между содержанием цинка и кадмия в юношеском возрасте и у взрослых, которая утрачивается в последующих возрастных группах.

Основная роль печени в углеводном обмене заключается в обеспечении постоянства концентрации глюкозы в крови, что достигается регуляцией соотношения между синтезов и распадом гликогена. Это соотношение регулируется нейрогуморальным путем при участии желез внутренней секреции. Указанное обстоятельство необходимо учитывать при оценке углеводной функции печени при старении организма. Известно, что при старении повышается концентрация глюкозы в крови (Маршалл В.Дж., 2002). Вместе с тем, по данным Гацко Г.Г., Гулько В.В. (1969) содержание гликогена и гликогенная функция печени не обнаруживает корреляции с возрастом. Глюкозо-6-фосфатаза катализирует конечные реакции, как глюконеогенеза, так и глкогенолиза. В экспериментах на крысах ее активность резко уменьшалась с 20-го месяца онтогенеза (Plewka A, Kaminski M, Plewka D, Nowaczyk G., 2000). Эти данные согласуются с результатами исследований Разумовича А.Н. с соавторами (1969), согласно которым активность АТФ-азы и глюкозо-6-фосфатазы в ткани печени белых крыс была выше у зрелых крыс, чем у молодых и старых. На основании этих фактов можно сделать вывод об ограниченности темпов мобилизации гликогена в организме пожилых людей.

Необходимым звеном в осуществлении антитоксической функции печени являются процессы микросомального и пероксисомального окисления. Так, по данным Bitar M.S., Shapiro B.H.(1987) у старых крыс активность гексобарбиталгидроксилазы и анилин-гидроксилазы, маркеров монооксигеназной функции, была уменьшена на 33 и 26% соответственно по сравнению с молодыми животными. Снижение содержания гема в микросомах, цитохрома Р450 и зависимой от него монооксигеназной активности авторы связывают с высокой активностью гем-оксигеназы и низкого уровня синтетазы дельта-аминолевулиновой кислоты. Эти результаты согласуются с мнением Bernus I, Dickinson RG, Hooper WD, Eadie M.J. (1997), указывающих, что при старении происходит угнетение окисления некоторых лекарственных препаратов, приводящее к сужению диапазона терапевтических доз. По данным Takatori A с соавторами (2000), изучавшими возрастзависимое распределение изоэнзимов Р450 в печени хомяков, большинство этих изоферментов демонстрирует максимальную экспрессию у шестимесячных особей, с постепенным снижением в онтогенезе. В противоположность всем указанным авторам Gergely J. и Kulcsar A.(1992) не обнаружили различий в уровне печеночного цитохрома Р450 у молодых и старых крыс. Кроме того, по сведениям Пушкарева В.Ф.(1969), содержание негеминного железа, которое, как известно, входит в состав Fe-белка микросомальной цепи ферментов, с возрастом отчетливо повышается.

Наряду с микросомальным в печени существует также пероксисомальное окисление. По данным Beier K с соавторами (1993), в пероксисомах старых крыс снижена активность ацил-коэнзим А-оксидазы и каталазы, повышена – уратоксидазы и тиолазы. Авторы делают вывод, что повышенная активность оксидазы мочевой кислоты, при действии которой образуется перекись водорода, и сниженная функция каталазы, катализирующей расщепление Н2О2, могут приводить к окислительному стрессу, который рассматривается как фундаментальный механизм старения.

Важными метаболическими реакциями, характеризующими печень как орган, обезвреживающий токсичные метаболиты и ксенобиотики, являются реакции конъюгации. Gergely J и Kulcsar A. (1992) в экспериментах по курсовому введению празозина крысам показали, что интенсивность реакций конъюгации не претерпевает возрастных изменений. В противоположность этим данным Leakey J.A., Cunny H.C соавторами (1998) сообщают о снижении у старых животных активности глутатион-S-трансферазы, УДФ-глюкуронилтрансферазы и сульфотрансферазы.

Важным показателем антитоксической функции печени является концентрация билирубина в сыворотке крови. Свободный билирубин – токсичный продукт деградации железосодержащих пигментов – гемоглобина, цитохромов, миоглобина. Образовавшийся в ретикулоэндотелиальной системе билирубин поступает с током крови в печень, где подвергается конъюгации с глюкуроновой кислотой, что приводит к образованию нетоксичного прямого билирубина.

Содержание билирубина в крови колеблется от 1,7 до 20,5 мкмоль/л (Хмелевский Ю.В, Усатенко О.К.(1987), причем 70% этого количества приходится на долю свободного билирубина. Причиной гипербилирубинемии может быть усиление гемолиза, нарушение функций печеночных клеток и задержка оттока желчи. Сведения относительно возрастных изменений содержания сывороточного билирубина несколько противоречивы. Так, Bitar M.S.и Shapiro B.H.

(1987) сообщают о повышении концентрации билирубина у старых крыс. Ряд авторов указывают на неизменность его содержания в крови при старении (Gergely J., Kulcsar A., 1992; Chan-Yeung M., Ferreira P., Frohlich J., Schulzer M., Tan F., 1981; Kampmann J.P., Sinding J, Moller-Jorgensen I., 1975; Пименов Ю.С., 1993). Rosenthal P., Pincus M, Fink D. (1984), изучив сывороточные концентрации билирубина у людей различных возрастных групп, пришли к выводу, что максимальные концентрации последнего наблюдаются в 19-24 года, а затем его уровень несколько снижается и остается постоянным в течение всей последующей жизни.

Печень играет центральную роль в обмене белков. Гепатоцитами синтезируются все альбумины плазмы, 75-90% альфа-глобулинов и 50 % бетаглобулинов. Все исследователи, изучавшие белковый состав сыворотки крови, единодушно признают: c возрастом содержание альбумина снижается, и вероятнее всего это связано с уменьшением его печеночного синтеза (Нагорный Л.В., Никитин В.И., Буланкин И.И., 1963; Коркушко О.В., 1963; Кипшидзе Н.Н., Ткешелашвили Л.К., Салуквадзе Н.С., 1963; Агапова Е.Н., Крутовская О.В., Михалев И.Д., Ткаченко А.М., Фаунова В.И., Денисова Т.П., 1973; Ангелова-Гатева П., Стойнев Г., Иванова Е., 1972; Rosenthal P., Pincus M., Fink D.

1982). За счет уменьшения доли альбуминов, а также роста содержания некоторых глобулинов уменьшается альбумин-глобулиновый коэффициент, численное значение которого некоторые авторы предлагают использовать как один из показателей биологического возраста человека. (Кипшидзе Н.Н., Ткешелашвили Л.К., Салуквадзе Н.С., 1963; Ангелова-Гатева П., Стойнев Г., Иванова Е., 1972; Дубина Т.Л., 1969; Султанов М.Н.,1973).

Возрастное снижение синтеза касается не только альбуминов. Так, по сведениям Hall D.M., Xu L., Drake V.J., Oberley L.W., Oberley T.D., Moseley P.L., Kregel K.C. (2000), при старении снижается способность печени к синтезу специфического белка теплового стресса (HSP70), что уменьшает адаптацию организма к повышенным температурам.

Говоря о роли печени в синтезе белков, нельзя не упомянуть о синтезе этим органом белков системы свертывания крови: протромбина, фибриногена, проконвертина, пракцелерина и др. Система гемостаза при старении претерпевает неоднозначные изменения. Часть из них способствует тромбофилии, другая – направлена на компенсацию нарушенных функций (Чеботарев Д.Ф., Коркушко О.В., Коваленко А.И., 1985). У пожилых людей концентрация фибриногена повышена (Агапова Е.Н., Крутовская О.В., Михалев И.Д., Ткаченко А.М., Фаунова В.И., Денисова Т.П., 1972; Пименов Ю.С., 1993; Курашвили Р.Б., Мегрелишвили Г.Н., Думбадзе Э.Г Зарандия Л.Т., Шатиришвили Э.Г., 1973), а содержание протромбина остается в пределах общепринятой нормы (Пименов Ю.С., 1993).

По данным Зелезинской Г.А.. (1969) в процессе старения в ткани печени снижается активность трансаминаз, осуществляющих периаминирование аминокислот, активность же глутаматдегидроеназы в митохондриях печени старых крыс, наоборот заметно выше, чем у взрослых животных. Автор делает вывод, что глютаминовая кислота в печени старых животных подвергается дезаминированию при участии преимущественно глютаматдегидрогеназы.

Ферментативные системы печени способны катализировать подавляющее большинство реакций метаболизма липидов. Печень является основным местом как образования апо-протеинов, так и сборки плазменных пре-беталипопротеидов (ЛПОНП) и альфа-липопротеидов (ЛПВП). В крови из пре-беталипопротеидов образуются бета –липопротеиды (ЛПНП) – частицы, обедненные триглицеридами и обогащенные холестерином. Как отмечают Hilmer S.N., Warren A., Cogger V.C., Fraser R., McLean A.J., Sullivan D., Le Couteur D.G.

(2004) старение не связано с существенными изменениями экспрессии апопротеина Е, включающегося в состав хиломикронов. По данным Богацкой Л.Н.

(1973), с возрастом происходят достоверные изменения во всех звеньях липидного обмена, причем наиболее значительные сдвиги наблюдаются в период от 20-29 лет до 50-59 лет. Достоверно повышается содержание общих липидов, общего холестерина (Маршалл В.Дж., 2002) и его эфиров, лецитина, триглицеридов, неэтерифицированных жирных кислот, бета-липопротеидов и связанного с ними холестерина. У лиц пожилого и старческого возраста уменьшается уровень холестерина, липопротедов высокой плотности (Никитин Ю.П., Бондарева З.Г. Отева Э.А., Филимонова Т.А., 1991; Ангелова-Гатева П.,Стойнев Г., Иванова Е., 1973). Пименов Ю.С.(1993) отмечает некоторое повышение холестерина, не выходящее, впрочем, за пределы нормы для среднего возраста.

Следует отметить, что по некоторым данным, у лиц пожилого и старческого возраста липидный состав крови претерпевает обратную динамику. Так Агапова Е.Н. с соавторами (1972) наблюдали у пожилых людей снижение уровня холестерина и бета-липопротеинов, а у долгожителей – уменьшение содержания холестерина и общих липидов. Ангелова-Гатева П..,Стойнев Г., Иванова Е.

(1973), Курашвили Р.Б., Мегрелишвили Г.Н., Думбадзе Э.Г Зарандия Л.Т., Шатиришвили Э.Г.(1972) констатировали у долгожителей уменьшение количество общих липидов, холестерина, бета-липопротеидов и фракций липидов (свободного холестерина и триглицеридов) ниже нормальных величин. По данным Ангеловой-Гатевой П. (1973), у долгожителей уровень бета –липопротеидов остается в пределах нормы, принятой для среднего возраста. Султанов М.Н. (1973) отмечал у долгожителей Нахичеванской АССР низкий уровень холестерина.

При этом сравнительно высокий показатель наблюдался в возрастной группе 50-59 лет, в последующих возрастах существовала тенденция к его снижению.

Таким образаом, можно сделать вывод, что с возрастом происходит определенное повышение уровня атерогенных липопротеидов, максимум которого приходится на 50-59 лет. У лиц старческого возраста и долгожителей показатели липидного состава плазмы имеют тенденцию к нормализации, главным образом за счет уменьшения уровня холестерина. Вероятно, снижение концентрации холестерина связано с ослаблением синтетической активности гепатоцитов. Как отмечает Нагорнев В.А. с соавторами (1998), реакции острой фазы (выработка С-реактивого белка) можно рассматривать как условие образования модифицированных форм липопротеинов и развития гиперхолестеринемии.

1.4. Возрастные изменения фракционного состава белков сыворотки крови Обмен гликозаминогликанов в организме тесно сопряжен с обменом других биополимеров, в частности, белков. Подчеркнем, что гликозаминогликаны находятся в организме в комплексе с белками, а именно: в составе протеогликанов, имеющих белковый кор и ковалентно связанные с ним линейные полимеры ГАГ. Рассматривая возрастную динамику содержания ГАГ в органах и тканях, представляется целесообразным изучить ее сопряженность с изменениями белковых показателей при старении.

В 50-е – 70-е годы 20 века было проведено большое количество исследований, посвященных изучению возрастных сдвигов биохимических показателей в органах и тканях (Слуцкий Л.И., 1969), однако при этом малое внимание уделялось такой важной ткани организма как кровь: считалось, что это – достаточно стабильное образование. По нашему мнению, интегральный процесс старения не может не воздействовать на систему крови. Представляется важным, что выявление интегральных возрастных изменений биохимических показателей крови позволит углубить представления о патогенетическом механизме старения по аналогии с тем, как разработка теории стресса Г. Селье позволила уточнить патогенез многих заболеваний.

Доказано, что с возрастом в сыворотке крови повышается концентрация таких веществ как глюкоза, щелочная фосфатаза, мочевая кислота, холестерин, уменьшается содержание общего белка и альбуминов (Маршалл В.Дж., 2002).

Однако сведения относительно возрастной динамики других фракций сывороточных белков довольно противоречивы.

К белкам плазмы крови относится группа белков, удовлетворяющих следующим требованиям:

1) содержатся в плазме крови;

2) синтезируются в печени или ретикулоэндотелиальной системе (реже в специализированных тканях);

3) проявляют основную функцию в пределах сосудистой системы;

4) в кровь секретируются, а не попадают в результате повреждения тканей;

5) находятся в плазме в концентрации большей, чем в других биологических жидкостях.

Содержание различных белков в плазме колеблется в широких пределах.

Например, концентрация альбумина составляет 40 г/л. Около десяти белков составляют примерно 90% количества всех белков плазмы. На остальные 10% приходится свыше 100 различных белков, содержание некоторых может быть в пределах всего 50-200 мкг/л. Это - так называемые минорные белки. Большинство белков плазмы крови являются гликопротеинами. Исключение составляют лишь альбумин и небольшое число других белков и ферментов плазмы. При электрофорезе на ацетатцелюллозе обычно происходит разделение пяти основных фракций белков сыворотки крови. Выделяют фракции альбумина, альфа1-, альфа 2-глобулинов, бета- и гамма- глобулинов (Галь Э, Медьеши Г., Верецкеи Л., 1982).

Альбумин – в количественном отношении наибольшая и самая однородная фракция белков плазмы. В организме альбумин выполняет следующие функции: транспортную, регулятора коллоидно-осмотического давления плазмы, белкового резерва организма. Одной из основных особенностей альбумина является способность связывать большое число различных соединений. Среди этих соединений - жирные кислоты, стероиды, билирубин, гемин, органические красители, лекарственные препараты (салицилаты, сульфаниламиды, барбитураты, антибиотики), ионы кальция, меди и другие. В плазме содержится 35- г/л альбумина. Этот белок синтезируется в печени со скоростью 10-12 г в сутки и примерно столько же разрушается, причем 20% в желудочно-кишечном тракте.

Большинство белков острой фазы входят в группу альфа-глобулинов. Их концентрации нарастают в остром периоде заболевания, когда имеет место воспаление, аллергия или деструкция (Меньшиков В.В., 1982). В зоне альфа 1глобулина располагаются следующие главные белки: альфа 1-антитрипсин, альфа-липопротеид, альфа-1-кислый гликопротеин, протромбин, тиреоидсвязывающий глобулин (Кухта В.К., Олецкий Э.И., Стожаров А.Н., 1986), альфа 1-антихимотрипсин, Gc-глобулин, промежуточный альфа-ингибитор трипсина. Альфа-1-антитрипсин является ингибитором протеиназ, синтезируется гепатоцитами, физиологическая концентрация в сыворотке крови составляет 2г/л. Альфа-1-кислый гликопротеин (орозомукоид) синтезируется в печени, в плазме его содержание составляет по данным Кухты В.К., Олецкого Э.И., Стожарова А.Н. (1986) 0,6-0,9г/л, а по сведениям Меньшикова В.В. (1982) - 0,55г/л.

Альфа-1-антитрипсин и орозомукоид - белки острой фазы воспаления.

Альфа-1-липопротеид осуществляет транспорт холестерина и жирорастворимых витаминов, относится к липопротеидам высокой плотности (ЛПВП). Протромбин является фактором свертывания крови, его физиологическая концентрация составляет 0,05-0,1 г/л. Тиреоидсвязывающий глобулин осуществляет транспорт тироксина, его концентрация в плазме достигает 0,015 г/л. Концентрация альфа-1-химотрипсина составляет 0,3-0,6 г/л, Gc-глобулина – 0,2-0, г/л; промежуточного альфа-ингибитора трипсина – 0,2-0,7 г/л (Меньшикова В.В., 1982). Общее содержание альфа 1-глобулинов колеблется от 1 до 4 г/л при солевом фракционировании или 2,5-5% от общего содержания белка по данным электрофореза (Хмелевкий Ю.В., Усатенко О.К., 1987).

К альфа-2-глобулинам относятся – альфа 2-макроглобулин, гаптоглобин, церулоплазмин, альфа 2-HS-гликопротеид, альфа-липопротеид, эритропоэтин (Кухта В.К., Олецкий Э.И., Стожаров А.Н.,1986), суммарное содержание альфаглобулинов составляет 4-12 г/л, или 7-13 % от общего белка (Хмелевкий Ю.В., Усатенко О.К., 1987). Альфа-2-макроглобулин – один из самых больших по размерам гликопротеинов плазмы крови. Синтезируется в печени, в плазме содержится в физиологической концентрации 2-3,5 г/л, является ингибитором протеиназ широкого спектра действия. Гаптоглобин связывает свободный гемоглобин крови и тем самым предупреждает потерю железа, в норме его концентрация составляет 0,4-0,75 г/л (Хмелевкий Ю.В., Усатенко О.К., 1987), а по сведениям Кухты В.К., Олецкого Э.И., Стожарова А.Н.(1986) - 0,6 -1,8 г/л. Церуплазмин обеспечивает транспорт ионов меди, его концентрация составляет 0,3-0,6 г/л. Содержание альфа-2-HS-гликопротеида колеблется от 0,4 до 0,85 г/л (Меньшиков В.В, 1982).

Четыре вышеперечисленных белка относятся к белкам острой фазы. Во фракции альфа-2-глобулина обнаруживаются ЛПОНП и хиломикроны (Кухта В.К., Олецкий Э.И., Стожаров А.Н., 1986). Самая богатая липидами группа белков – это бета-глобулины. В этой фракции содержится около 75% всех липидов плазмы и только от 8 до 14 % всех сывороточных белков. По данным солевого фракционирования ее концентрация колеблется в пределах 5-11 г/л (Хмелевкий Ю.В., Усатенко О.К., 1987).

Бета-глобулиновую фракцию составляют следующие белки: беталипопротеиды, трансферрин, компоненты комплемента, гемопексин. Беталипопротеиды (липопротеиды низкой плотности) осуществляют транспорт холестерина, фосфолипидов, гормонов, нормальное содержание в плазме составляет 1,9-7,4 г/л. Трансферрин относится к белкам острой фазы воспаления, является переносчиком ионов железа, физиологическая концентрация составляет 2,9 г/л.

Белки системы комплемента выполняют ряд важных функций: вовлечены в антимикробную защиту организма, играют важную роль в регуляции проницаемости и тонуса сосудов, хемотаксиса и взаимодействия между клетками.

Концентрация С4 компонента коплемента составляет 0,4-0,45 г/л. Гемопексин носитель гема, предотвращает его выведение с мочой, нормальный уровень гемопексина достигает 1 г/л.

Зона гамма-глобулинов содержит все известные классы иммуноглобулинов. Доля иммуноглобулинов по отношению к остальным белкам плазмы варьирует от 13 до 21 %.

Многие исследователи констатируют, что при старении уменьшается концентрация альбуминов и значение альбуминово-глобулинового коэффициента (Пименов Ю.С., 1993; Маршалл В.Дж., 2002; Кипшидзе Н.Н., Ткешелашвили Л.К., Салуквадзе Н.С., 1963; Коркушко О.В., 1963; Нагорный Л.В., Никитин В.И., Буланкин И.И., 1963). Причиной уменьшения альбуминов, по мнению Коркушко О.В. (1963), является снижение их синтеза в печени и не связано с повышенным расходованием белка.

Большинство авторов отмечают также как относительное так и абсолютное увеличение глобулинов. Кожура И.М. (1963) полагает, что это повышение содержания глобулинов – результат роста концентрации гамма-глобулинов.

Кипшидзе Н.Н. с соавторами (1963) приводит данные о возрастном увеличении бета и гамма-фракций. Несколько иные результаты получены Карелом, Цилдером, Билбером в 1956 году (Нагорный Л.В., 1963). Сравнивая 2 возрастные группы 22-50 и 66-88 лет, они обнаружили, что с возрастом наблюдается как относительное, так и абсолютное нарастание содержания глобулинов за счет увеличения всех фракций глобулинов, особенно бета и гамма. Аналогичные данные приводит Лопер Дж. с соавторами (1960) и Неккер И.(1956) (Кожура И.М., 1963). Иного мнения придерживаются Nocker и Bemm (1956), они считают, что происходит повышение содержания белков во фракциях альфа-2- и бета-глобулинов. Так, в 20 летнем возрасте, согласно их данным, доля альфа-2глобулинов составляет 7,28%, бета – 12,50%. В 70-ти летнем - альфа2глобулинов – 10,87, бета – 17,27% (Нагорный Л.В., 1963). По Гинголду (1957), у лиц старше 60 лет явно выражено увеличение глобулиновой фракции, прежде всего гамма-, альфа-1-, и альфа-2-глобулинов, а содержание бета-глобулинов близко к нормальному или понижено (Коркушко О.В., 1958). В противоположность всем названным авторам Парфентьев и Джонсон (Porfentjev, Jonson, 1955) (Нагорный Л.В., 1963; Ойвин И.А., 1951; Эдель Х., 1962; Кожура И.М., 1963) не обнаружили каких-либо возрастных различий белковых фракций. Противоречивость суждений может быть объяснена, по нашему мнению, неоднотипностью и,вероятно, несовершенством примененных биохимических методик фракционирования белков и методов статистической обработки результатов.

Определенные возрастные изменения претерпевает и липопротеиновый спектр сыворотки крови. Известно, что пожилой возраст является одним из главных факторов риска развития атеросклероза. Показано, что с возрастом нарастает содержание атерогенных липопротеинов – липопротеинов очень низкой плотности (пре-бета-липопротеидов) и липопротеидов низкой плотности (беталипопротеидов), и снижается концентрация липопротеидов высокой плотности (альфа-липопротеинов) (Никитин Ю.П., Бондарева З.Г. Отева Э.А., Филимонова Т.А., 1991; Никитин Ю. П. Бондарева З.Г., Отева Э.А. с соавторами, 1989;

Богацкая Л.Н., Коркушко О.В., Киряков О.А., 1978; Богацкая Л.Н., Коркушко О.В., Киряков О., 1982; Асинова М.И., Белая И.И., 2001). Так, если в возрастной группе – 18-23 года альфа-липопротеиды составляют 31-35 %, беталипопротеиды – 65-69%, в группе 32-50 лет данные показатели составляют соответственно – 26% и 74%. Причиной такого изменения липидного спектра может являться возрастное снижение активности липопротеидлипазы, осуществляющей переход ЛПОНП в ЛПНП и ЛПВП (Рихтер В., Богацкая Л.Н., 1978).

1.5. Изменения белкового спектра при беременности Беременность оказывает существенную нагрузку на женский организм, сопровождается серьезными гормональными и физиологическими сдвигами. На ранних стадиях беременности, когда предъявляемые плодом требования еще не очень велики, организм матери готовится к грядущим потребностям плода.

Этот период можно назвать анаболической фазой беременности, для него характерно увеличение массы тела, накопление белковых и жировых запасов.

Усиливается синтез жиров из глюкозы, что стимулируется характерной для этого периода высокой концентрацией инсулина. В катаболическую фазу, когда потребности плода в питательных веществах и кислороде достигают максимума, концентрация глюкозы в крови матери постепенно убывает. Поскольку концентрации глюкокортикоидов высоки, создаются условия для новообразования глюкозы. Однако глюконеогенез оказывается все же недостаточным и, таким образом, зависимость материнского организма от глюкозы должна быть сведена к минимуму, чему способствует уменьшение чувствительности клеток к инсулину. В этом и состоит причина мобилизации жиров путем гидролиза триацилглицеролов, при этом в крови повышается содержание триглицеридов и жирных кислот. Наконец, на этой стадии добавляется мобилизация эндогенных белков (Хочачка П., Сомеро Дж., 1988).

Беременность сопровождается усилением свободнорадикальных процессов в сыворотке, увеличивается активность церуплазмина и уменьшается активность глутатионпероксидазы. При повышенной активности свободнорадикальных процессов при беременности наблюдается надежная работа антиоксидантной защиты, что не приводит к резкому изменению процессов деградации белков и накоплению токсичных продуктов (Бурмистров С.О., Опарина Т.И., Прокопенко Г.Р., Арютюнян А.В., 2001).

При беременности обнаруживаются определенные изменения в белковом спектре сыворотки крови. Так, снижаются концентрации относящихся к альфаглобулинам протромбина и альфа-1-кислого гликопротеина. Содержание альфа-2-макроглобулина и церулоплазмина, являющихся компонентами фракции альфа-2-глобулинов, наоборот, повышается (Титов В.Н., Амелюшкина В.А., 1994; Joseph J.C., Baker C., Sprang M.L., Bermes E.W., 1978). Кроме того, беременность предрасполагает к снижению концентрации альбуминов и повышению уровня трансферрина (Кухта В.К., 1986). В сыворотке крови беременных женщин обнаруживаются специфические «ассоциированные с беременностью» белки, большинство из которых являются минорными компонентами сыворотки и не влияют на соотношение пяти основных белковых фракций. Такими белками являются, например, ассоциированный с беременностью протеин А (Мальцева Н.В., Горин В.С., Жабин С.Г., 1991), плацентарный альфа-1- микроглобулин (Рыбка И.Д., Болтовкая М.Н., Маршицкая М.Н., 2000). Сказанное, однако, не относится к таким белкам как альфа-2-глобулин беременных, содержание которого достигает 2 г/л и альфа-1-фетопротеин, концентрация которого на 14 неделе развития зародыша достигает 4г/л (Кухта В.К., 1986). По данным Меньшикова В.В. (1982), содержание альфа1- фетопротеина не превышает 0, мг/л, альфа 2-глобулина беременности – 4,2 мг/л.

1.6. Теории старения и возрастные изменения биохимических показателей кожи Геронтология представляет собой науку, изучающую закономерности старения и старческий возраст. Медицинская косметология ставит целью улучшения качества жизни человека путем коррекции внешних признаков старения. Чтобы ответить на вопрос, насколько реальна эта цель, необходимо остановиться на достижениях современной геронтологии.

1.6.1. Генетическая теория старения Доказано, что одним из факторов, определяющих продолжительность жизни человека, является наследственность (Акифьев А. Г., Потапенко А.И., 1979; Александрова М.Д.,1965; Войтенко В.П.,1970; Войтенко В.П., Полюхов А.М., 1986; Нагорный Л.В., Никитин В.И., Буланкин И.И., 1963). В экспериментах показано, что клеточное старение является результатом генетической программы, с помощью которой специфические гены ограничивают клеточную пролиферацию. Повреждение ядерной и митохондриальной ДНК соматических клеток, накопление мутаций определяют развитие возрастной патологии, включая рак. Ген белка р53 является чрезвычайно важным для контроля репликативного старения клеток. Он активирует гены, вовлеченные в подавлении тканевого роста (Жижина Г.П., 2002; Королькова Т.Н., 2001). В 1971г. А.М. Оловников предложил теорию маргинотомии, суть которой заключается в том, что в соматических клетках при каждой репликации недореплицируются концы хромосом – теломеры. В конце концов в результате постоянного укорочения хромосом при каждом митозе недорепликация захватывает области генома, существенные для выживания клеток, что и приводит к старению организма и затем к его гибели.

Клетки фибробластов человека в норме делятся 75-80 раз. Однако в 1985 году была открыта теломераза, при введении которой фибробласты приобретали способность делиться 280 раз без каких-либо признаков старения и патологии. Этот предел, при всей его достоверности, является, однако, всего лишь лабораторным феноменом, так как фибробласты человека не успевают за человеческую жизнь исчерпать даже свои обычные репликативные возможности.

В настоящее время не вызывает сомнений значимая роль, которую играет апоптоз в старении клеток и организма в целом. Апоптоз выступает в качестве одного из механизмов, защищающих организм от клеток, несущих генетические повреждения. Установлено, что инициация апоптоза происходит при участии продукта гена р53. При старении сигналы апоптоза становятся неэффективными и потенциально опасные клетки остаются жизнеспособными. Этим можно объяснить высокую чувствительность кожи пожилых людей к канцерогенному действию УФ-облучения (Жижина Г.П., 2002; Королькова Т.Н., 2001).

1.6.2. Свободнорадикальная теория старения Свободнорадикальная теория старения была практически одновременно выдвинута D. Harman и Н.М. Эммануэлем. Согласно этой теории, продуцируемые в митохондриях молекулы свободных радикалов вызывают повреждения мембран, коллагена, ДНК, хроматина, структурных белков, влияют на внутриклеточный уровень кальция (Эммануэль Н.М.,1975; Хавинсон В.Х., Баринов В.А., Арутюнян А.В., Малинин В.В., 2003). Если бы не существовало механизмов инактивации свободных радикалов, то они вызывали бы быстрое разрушение биологических структур. К основным эндогенным факторам защиты относят некоторые ферменты и витамины: каталаза, глутатионпероксидаза, бетакаротин, витамин Е, аскорбиновая кислота, мочевая кислота, мелатонин, супероксиддисмутаза и хелатные агенты (Эммануэль Н.М., 1979). Некоторые механизмы антиоксидантного действия могут быть опосредованы через гормональную регуляцию кортикотропином, кортикостероидами и трийодтиронином (Кольтовер В.К., 1998). Ограничение калорийности питания также является важным фактором, угнетающим свободнорадикальные процессы в организме человека и существенно снижающим темпы старения (Хавинсон В.Х., Баринов В.А., Арутюнян А.В., Малинин В.В., 2003; Королькова Т.Н., 2001).

1.6.3. Элевационная теория старения В. Дильман еще в начале пятидесятых годов прошлого столетия выдвинул теорию о возрастном повышении порога чувствительности гипоталамуса к гомеостатичесим сигналам. По его мнению, именно этот процесс приводит к возрастному включению и выключению функций репродуктивной системы в женском организме, к возрастным изменениям в гапоталамо-гипофизарнонадпочечниковой системе.

Нейрогормональная регуляция гомеостаза занимает важное место в сложной цепи процессов, приводящих к старению клеток, тканей, органов и организма в целом. Разнонаправленные изменения чувствительности различных структур к гормонам приводят к тому, что реакции нервных центров не соответствуют истинному состоянию гормонального статуса и возникают неадекватные состояния (Фролькис В.В., 1988, 1990).

Гипоталамус и гипофиз являются высшим звеном системы нейрогормональной регуляции, оказывая влияние на синтез белка, в том числе и в коже.

Содержание адренокортикотропного гормона (АКТГ) в гипофизе в старости существенно не изменяется (Фролькис В.В., 1975). У пожилых людей отмечается снижение тиреотропного гормона (Соболич И., 1980), а уровень соматотропного гормона (СТГ), наоборот, растет. По-видимому, в старости ткани больше нуждаются в гормональной поддержке. В этом возрасте СТГ как бы становится гормоном не роста, а стабилизации определенного уровня биосинтеза белка (Фролькис В.В., 1990).

Содержание гонадотропного гормона гипофиза и вазопрессина в старости нарастает. Между 25 и 45 годами происходит пятикратное увеличение экскреции гонадотропинов по причине постепенного повышения порога чувствительности гипоталамуса к торможению периферическими гормонами (Берштейн Л.М., 1998). При старении нарушается функциональная активность щитовидной железы, снижается синтез Т3, Т4 и наблюдаются отклонения в периферическом обмене тироксина (Вержиковская Н.В., Валуева Г.В., Сабольч И., 1978).

Изменение тиреоидной регуляции – важный механизм нарушения обмена при старении. С ним могут быть связаны многие сдвиги в процессах генерации энергии в клетке (сдвиги в окислительном фосфорилировании, снижение потребления кислорода, падение синтеза АТФ), ослабление синтеза белка и нарушение жирового обмена. В организме старого человека закономерно возникает скрытая инсулиновая недостаточность. Снижение активности свободного инсулина в старости ведет к тому, что затрудняется переход глюкозы в клетку, снижается синтез АТФ, страдает окисление жиров, накапливаются продукты промежуточного обмена. Повышение активности связанного инсулина приводит к усилению синтеза жиров из углеводов. Быть может, этим объясняется тучность многих пожилых людей. Известно, что инсулин повышает проницаемость клеточной мембраны к аминокислотам, активизирует сборку белка на рибосомах, поэтому инсулиновая недостаточность способствует сокращению потенциальных возможностей биосинтеза белка (Фролькис В.В., 1975).

Уровень катехоламинов и ферментов, их синтезирующих, в старости увеличивается (Баклаш В., Йорханова А., Кветнянски Р., 1976). Базальный уровень пролактина не претерпевает существенных изменеий с увеличением возраста (Захариева С., Кирянов А., Златарев.О., Наврькова Ю.,1980). Старение сопровождается почти тотальным снижением синтеза и секреции регуляторных пептидов (нейропептидов, цитокинов, иммунопептидов, иммунотрансмиттеров, цитомединов, факторов роста), а также ослаблением чувствительности к ним клеток-мишеней (Хавинсон В.Х., 2001). Показано, что на процесс старения кожи оказывает влияние снижение надпочечной секреции (Phillips TJ, Demircay Z, Sahu M., 2001). С возрастом снижаются концентрации глюкокортикоидов, уменьшается количество их рецепторов (Конопля Е.Ф., Лукша Г.М., 1991; Мартин Р., Мартин Г., Мурадян Х.К., 1978; Zoller D.P., 1987).

Известно, что эффекты стероидных гормонов реализуются путем регуляции экспрессии генов, то есть деятельности транскрипционного аппарата клетки (Страйер Л., 1985). С возрастом уменьшается чувствительность кожной ткани к глюкокортикоидам. Так, при введении преднизолона содержание ДНК в коже старых крыс остается на прежнем уровне, в то время как у молодых животных оно падает. Кроме того эффект сверхкомпенсации у старых особей был выражен слабее, чем у молодых (Linder J., Schonrock P., Nassgen A., Schmiegelow P., 1986). На динамику старения кожи оказывают влияние также уменьшение уровней дегидроэпиандростенона, инсулиноподобного фактора роста и мелатонина (Измайлов Д.М., Обухова Л.К., 1999; Zouboulis Ch.C., 2003; Phillips TJ, Demircay Z, Sahu M., 2001).

Механизмы геропротекторного действия мелатонина окончательно не выяснены, однако существенную роль может играть его способность угнетать свободнорадикальные процессы в организме, стимулировать клетки иммунной системы, продлевать циклическую деятельность яичников (Измайлов Д.М., Обухова Л.К., 1999; Reiter R.J., 1995).

Особое место в регуляции обменных процессов в коже принадлежит половым гормонам. Новая область эндокринологии – эстетическая эндокринология, изучающая влияние половых гормонов на обмен веществ в коже и ее придатках, привлекает все больший интерес исследователей (Gruber C.J., Wieser F., Gruber I.M., Ferlitsch K., Gruber D.M., Huber J.C., 2002). Хорошо известно, что экстрагенитальные эффекты гормонов яичников затрагивают метаболизм кожи и волос, телосложение и распределение подкожной жировой клетчатки. Считается доказанным, что эстрогены выполняют важные функции в коже человека, включая эпидермис, дерму, сосуды, волосяные фолликулы и сальные железы (Thornton M.J., 2002). К настоящему времени открыты 2 типа рецепторов к эстрогенам в коже – альфа и бета (Raine-Fenning N.J., Brincat M.P., Muscat-Baron Y., 2003). Эстрогеновые бета-рецепторы обнаруживаются в эпидермисе, сосудах, дермальных фибробластах, волосяных фолликулах, клетках сосочкового слоя дермы (Thornton M.J., Taylor A.H., Mulligan K., 2003; Thornton M.J., 2002).

Сухость и ломкость ногтей, появление морщин, выпадение волос, себорея лица и кожи головы, оволосение на щеках и верхней губе – далеко не полный перечень косметологических проблем, подстерегающих женщин, переживающих климакс (Сметник В.П., 1995; Aron-Brunetiere R., 1980). Указанные симптомы относят к среднесрочным климактерическим расстройствам, так как они возникают спустя 3-5 лет после наступления менопаузы, их появление связывают с дефицитом эстрогенов (Серебренникова К.Г., Чуманова И.В., 2003; Королевская Л.И., Серова Л.Д., Лукьянчиков В.С., Чеботарева Е.В, 2003; Потемкин В., 1999; Кустаров В.Н., Черниченко И.И., 2003; Сметник В.П., 1995; Зайдиева Я.З., 1995; Broniarczyk-Dyla G, Joss-Wichman E.J., 2001; Palacios S., 1999;

Gow S.M., Turner T.I., Glasier A., 1994; Schidt J.B., Binder M., Demschik G., Bieglmaer C., 1996; Barbo D.M., 1987). Недостаток половых гормонов рассматривается как важный фактор эндогенного старения, однако их роль в этом процессе определена недостаточно четко (Schidt J.B., Binder M., Demschik G., Bieglmaer C., 1996). В условиях гипоэстрогении изменяются механические свойства кожи – повышается ее растяжимость, уменьшается эластичность (Pierard-Franchimont C., Cornil F., Dehavay J., Deleixhe-Mauhin F., Letot B., Pierard G.E., 1999), вследствие снижения секреции кожного сала появляется сухость кожи (Pierard-Franchimont C., Pierard G.E, 2002; Zouboulis C.C., Boschnakow A., 2001). У женщин в постменопаузе наблюдается истончение кожи (Sator P.G., Schmidt J.B., Sator M.O., Huber J.C., Honigsmann H., 2001; Callens A., Vaillant L., Lecomte P., Berson M., Gall Y., Lorette G., 1996; Vaillant L., Callens A., 1996;

Maheux R., Naud F., Rioux M., Grenier R., Lemay A., Guy J., Langevin M., 1994;

Bolognia J.L., 1993), связанное, вероятно, с угнетением митотической активности клеток эпидермиса (De Lignieres B., 1991) и уменьшением содержания коллагена (Youn C.S., Kwon O.S., Won C.H., Hwang E.J., Park B.J., Eun H.C., Chung J.H., 2003; Raine-Fenning N.J., Brincat M.P., Muscat-Baron Y., 2003; Affinito P., Palomba S., Sorrentino C., Di Carlo C., Bifulco G., Arienzo M.P., Nappi C., 1999;

Castelo-Branco C., Duran M., Gonzalez-Merlo J., 1992; Дейл З., 1988; Brincat M., Moniz C.F., Studd J.W., Darby A.J., Magos A., Cooper D., 1983). Однако, как отмечают Adamiak A, Skorupski P, Rechberger T, Jakowicki JA.(2000), атрофические изменения кожи женщин в постменопаузе не зависят от экспрессии гена про-альфа цепи коллагена I типа. Недостаток эстрогенов приводит к уменьшению синтеза и эластических волокон (De Lignieres B., 1991). Гистологическое исследование образцов кожи женщин 30-37 лет с преждевременным климаксом, проведенные Bolognia J.L., Braverman I.M., Rousseau M.E., Sarrel P.M.

(1989) показали значительную дезорганизацию эластических волокон. Авторы отмечают, что указанные ультраструктурные изменения наблюдаются у лиц, по крайней мере, на 20 лет старше этих пациенток. Снижение уровня прогестерона приводит к усилению влияния андрогенов на сальные железы, волосяные фолликулы тела и головы, что проявляется андроидным оволосением (De Lignieres B., 1991; Vaillant L., Callens A., 1996). Кроме того, в постменопаузе уменьшается скорость капиллярного кровотока вследствие дилатации капилляров дермы (Raine-Fenning N.J., Brincat M.P., Muscat-Baron Y., 2003).

Гормональное старение вносит гораздо менее весомый вклад в реализацию возрастного увядания кожи по сравнению с актиничным, однако лучше поддается терапии (Vaillant L., Callens A., 1996). В частности, заместительная гормональная терапия увеличивает толщину кожи (Maheux R., Naud F., Rioux M., Grenier R., Lemay A., Guy J., Langevin M., 1994), предотвращая ее атрофию, ограничивает рост волос по мужскому типу (Vaillant L., Callens A., 1996), снижает темпы возрастного увеличения растяжимости кожи (Pierard G.E., Letawe C., Dowlati A., Pierard-Franchimont C., 1995).