ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«РОСТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

МИРОШНИЧЕНКО ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

СОСТОЯНИЕ МУКОЗАЛЬНОГО БАРЬЕРА РЕПРОДУКТИВНОГО

ТРАКТА И УРОВЕНЬ АДИПОКИНОВ У ЖЕНЩИН ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕРЕМЕННОСТИ

Специальность: 03.01.04 – биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор А.В. Шестопалов г. Ростов-на-Дону –

ОГЛАВЛЕНИЕ

Оглавление………………………………………………………………... Список сокращений………………………………………………………

Общая характеристика работы

………………………………………… Глава I. Обзор литературы…………………………………………….. Глава II. Материалы и методы………………………………………... 2.1.Клиническая характеристика обследованных беременных ………. 2.2. Методы исследования……………………………………………….. Глава III. Результаты собственных исследований. Исследование факторов мукозальной защиты репродуктивного тракта при физиологической беременности ………………………………………………………. 3.1. Содержание трефоилового пептида-3 и муцинов (5АС и 6) в цервико-вагинальном секрете и эндометрии у первородящих и повторонородящих женщин………………………………………………………………………….. 3.2. Содержание трефоилового пептида-3 и муцинов (5АС и 6) в цервико-вагинальном секрете и эндометрии у женщин в зависимости от состояния микрофлоры……………………………………………………………………... Глава IV. Результаты собственных исследований. Уровень провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в плазме крови и эндометрии при физиологической беременности…………………………. 4.1. Уровень провоспалительных цитокинов у первородящих и повторонородящих женщин……………………………………………………........... 4.2. Уровень провоспалительных цитокинов у женщин в зависимости от состояния микрофлоры ……………………………

4.3. Уровень противовоспалительных цитокинов у первородящих и повторонородящих женщин………

4.4. Уровень противовоспалительных цитокинов у женщин в зависимости от состояния микрофлоры…………………………………………………. Глава V. Результаты собственных исследований. Уровень адипокинов и продуктов метаболизма коллагена I типа при физиологической беременности…………………………………………………………………… 5.1. Уровень глюкозы, инсулина в плазме крови и HOMA-IR у первородящих и повторонородящих женщин ………………………………………. 5.2. Уровень глюкозы, инсулина в плазме крови и HOMA-IR у женщин в зависимости от состояния микрофлоры…………………………………….. 5.3. Уровень адипонектина и резистина в плазме крови у первородящих и повторонородящих женщин …………………………………………………. 5.4. Уровень адипонектина и резистина в плазме крови уженщин в зависимости от состояния микрофлоры…………………………………………. 5.5. Уровень CrossLaps (телопептид коллагена I типа) и CiCP (пропептид проколлагена I типа) в плазме крови у первородящих и повторонородящих женщин ………………………………

5.6. Уровень CrossLaps (телопептид коллагена I типа) и CiCP (пропептид проколлагена I типа) в плазме крови у женщин в зависимости от состояния микрофлоры………………………………………………………………… Заключение………………………………………………………………. Выводы………………………………………………………………….... Список литературных источников…………………………………..

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

АТФ – аденозинтрифосфат АФК – активные формы кислорода ЖКТ – желудочно-кишечный тракт ИЛ – интерлейкин ИЛ-1 РА – интерлейкина-1 рецепторный антогонист ИМТ – индекс массы тела ИФА – иммуноферментный анализ ЛПС – липополисахарид РТ – репродуктивный тракт ТФР (TGF) – трансформирующий фактор роста ФНО (TNF) – фактор некроза опухоли шЭПР – шероховатый эндоплазматический ретикулум AdipoR -адипонектиновый рецептор CiCP – пропептид проколлагенаI типа CrossLaps – телопептид коллагена I типа GLUT – глюкозный транспортер HOMA-IR — (homeostasis model of assessment – insulin resistance) гомеостатическая модель исследования инсулинорезистентности MUC – муцин NF-kB – нуклеарный фактор kB TFF (trefoil factor) - трефоиловый фактор TMB – тетраметилбензидиновый (стабилизирующий) субстрат TNFR – рецептор ФНО

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На современном этапе приоритетным направлением демографической политики является повышение рождаемости, снижение заболеваемости и материнской смертности [13]. Достижение данных целей возможно путем более детального изучения и осмысления этиопатогенетических факторов акушерско-гинекологической патологии. Нормальное осуществление репродуктивной функции у женщин возможно благодаря наличию ряда иммунологических, гормональных, метаболических механизмов. Данные механизмы контролируют скоординированное функционирование клеток и тканей, обеспечивающих физиологическое течение беременности. Но наряду со значительными успехами в изучении молекулярных и клеточных процессов физиологической беременности, многие механизмы остаются до сих пор не изученными.

Для нормального течения беременности особое значение имеют системные и локальные иммунные факторы. Важными компонентами защиты репродуктивного тракта являются механизмы врожденной или неспецифической резистентности [14]. Особое место среди таких врожденных компонентов иммунной системы занимают малоизученные муцины и трефоиловые пептиды, которые участвуют не только в защите от распространения патогенов, но и в восстановлении целостности ткани. Вероятно, что оперативное родоразрешение первой беременности приводит не только к нарушению целостности ткани эндометрия и миометрия, но и к изменению микробного пейзажа репродуктивного тракта, что влияет на изменение продукции муцинов и трефоиловых пептидов. Взаимодействие эпителиальных и иммунных клеток, а также различных белков и других биологически активных веществ обеспечивает тканевую интегральность, что является непременным условием для развития нормальной беременности.

Актуальность изучения регуляторных процессов гестации и родовой деятельности имеет не только теоретическое значение, но и практическую значимость, которая заключается в понимании причин нарушения физиологических процессов при патологиях беременности [11]. Особого внимания заслуживает цитокиновая регуляция. Основная часть иммунных функций опосредуется растворимыми факторами, то есть цитокинами. Многочисленные цитокины создают специфические условия, в которых происходит взаимодействие между матерью и плодом [8].

Наряду с вышесказанным, происходят также значительные изменения в метаболических процессах, что обуславливает актуальность изучения данного вопроса. Установлено, что эндокринная активность жировой ткани при беременности возрастает, что выражается в изменении концентраций адипокинов в материнской крови [15]. Беременность является уникальным состоянием, при котором происходит физиологическое увеличение резистентности к инсулину. Таким образом, даже нормальная беременность является «диабетогенным состоянием». При беременности развивается состояние относительного гиперинсулинизма с периферической инсулиновой резистентностью за счет увеличения концентрации контринсулярных гормонов, а также действия адипокинов жировой ткани.

Обращает внимание, что дифференцировка адипоцитов, фибробластов и остеобластов следует от единой клетки-предшественницы – мезенхимальной стволовой клетки [84]. Не исключено, что во время беременности изменяется функциональная активность клеток, продуцирующих коллаген. К тому же, резорбция и репаративный синтез материнской костной ткани с целью обеспечения плода кальцием, размягчение связочного аппарата таза и стромы родовых путей при беременности сопровождаются изменениями в метаболизме соединительной ткани [16]. Метаболизм коллагена – и синтез, и деградация, наиболее активен в период роста, при этом образуется большое количество промежуточных метаболитов, используемых в качестве оценки активности обменных процессов в соединительной ткани. Считается, что дефект метаболизма коллагена может приводить к осложнениям беременности.

Стоит учитывать, что ранее перенесенная беременность сопровождается изменением микрофлоры репродуктивного тракта, а также метаболизма. В свою очередь, это может привести к изменению системы мукозального барьера и метаболизма мезенхимальных тканей при повторной беременности.

Достаточно широко изучен вопрос о влиянии микроорганизмов ЖКТ на метаболизм жировой ткани, клеточный и гуморальный иммунитет, эндокринную систему [95]. Напротив, в литературе отсутствуют данные о влиянии микрофлоры репродуктивного тракта на метаболизм мезенхимальных тканей. В связи с этим, в данном исследовании проводится оценка влияния синантропной флоры репродуктивного тракта на продукцию мукозальных факторов защиты, цитокины и адипокины.

Учитывая, что метаболиз мезенхимальных тканей претерпевает существенные изменения, следует предположить, что при повторной беременности они могут проявляться с другой степенью выраженности. Очевидно, что нормы клинико-лабораторных показателей для повторнородящих женщин должны формироваться в самостоятельную группу, учитывая изменения, происходящие при повторной беременности.

Таким образом, целью исследования явилась оценка факторов мукозальной защиты репродуктивного тракта, определение уровня адипокинов и цитокинов, а также продуктов метаболизма коллагена I типа и определение инсулинорезистентности у женщин с первой и повторной физиологической беременностью, родоразрешенных путем кесарева сечения.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи исследования:

Исследовать уровни муцинов (MUC 5AC, MUC 6) и трефоилового фактора-3 (TFF-3) в цервико-вагинальном секрете и эндометрии у женщин с первой и повторной физиологической беременностью, родоразрешенных путем кесарева сечения.

Определить уровни провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в плазме крови и ткани эндометрия у женщин с первой и повторной физиологической беременностью, родоразрешенных путем кесарева сечения.

Определить показатели инсулинорезистентности, уровни адипонектина и резистина в плазме крови у женщин с первой и повторной физиологической беременностью, родоразрешенных путем кесарева сечения.

Определить уровень пропептида проколлагена I типа (CiCP), телопептида коллагена I типа (CrossLaps) в плазме крови у женщин с первой и повторной физиологической беременностью, родоразрешенных путем кесарева сечения.

Провести оценку роли изучаемых биорегуляторных факторов физиологической беременности, установить корреляционные связи между ними с целью выявления новых биохимических показателей, характеризующих первую и повторную физиологическую беременность Научная новизна. Впервые определено содержание муцинов 5 АС и 6, а также трефоилового пептида -3 в цервико-вагинальном секрете и эндометрии. Выявлено влияние микрофлоры репродуктивного тракта беременной на концентрацию факторов мукозального барьера. Впервые показано, что при повторной беременности в ткани эндометрия происходит увеличение содержания MUC 5AC и TFF-3 на фоне снижения MUC 6, а в цервиковагинальном секрете снижение концентрации MUC 5AC, MUC 6, TFF-3.

Впервые установлено, что у первородящих женщин, микрофлора которых характеризуется отсутствием роста лактобацилл, снижается концентрация MUC 6 в ткани эндометрия. У повторнородящих женщин, в микрофлоре которых отсутствует рост лактобацилл, происходит снижение содержания MUC 5АС в ткани эндометрия.

Впервые исследовано влияние микрофлоры репродуктивного тракта на метаболизм мезенхимальных тканей. Установлены корреляционные связи между концентрацией лактобацилл репродуктивного тракта и уровнем муцина 6, интерлейкинов, CiCP.

Определены концентрации провоспалительных (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО) и противовоспалительных (ТФР, ИЛ-1РА) цитокинов в плазме крови и ткани эндометрия при первой и повторной беременности. Впервые установлено, что у повторнородящих женщин, которые в анамнезе имели оперативное родоразрешение, в ткани эндометрия происходило снижение концентрации ИЛ-1 и ФНО на фоне увеличения ИЛ-6. Тогда как в плазме крови у этих женщин увеличивалась концентрация ИЛ-8 и снижалась ИЛ-6. Вместе с этим выявлена взаимосвязь между микрофлорой и уровнем провоспалительных цитокинов. Установлено, что отсутствие роста лактобацилл в репродуктивном тракте беременных приводит к снижению содержания ФНО в ткани эндометрия у первородящих женщин и ИЛ-8 в плазме крови у повторнородящих. У повторнородящих женщин наблюдается сильная положительная корреляция концентрации лактобацилл репродуктивного тракта с плазменным уровнем ИЛ-8 и ТФР.

Исследован уровень адипокинов (адипонектина, резистина) у беременных, родоразрешенных путем кесарева сечения. Впервые показан рост степени выраженности инсулинорезистентности при повторной беременности.

Выявлено, что отсутствие роста лактобацилл в репродуктивном тракте у повторнородящих женщин, приводит к повышению концентрации резистина.

Впервые изучен уровень продуктов метаболизма коллагена I типа в плазме крови у перво- и повторнородящих женщин, родоразрешенных оперативным путем. Установлено, что уровень CrossLaps одинаково повышается при первой и повторной беременности, а уровень CiCP достоверно повышается у повторнородящих женщин. У первородящих женщин отмечена сильная отрицательная корреляция между концентрацией лактобацилл репродуктивного тракта и плазменным уровнем CiCP.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в ходе исследования данные расширяют представления о роли факторов муказальной защиты, цитокинов, адипокинов, а также продуктов метаболизма коллагена I типа в развитии и поддержании физиологической беременности. При этом позволяют сопоставить изменения, которые происходят как при первой, так и повторной беременности.

Расширены представления о роли TFF и муцинов в защите репродуктивного тракта. Установлена взаимосвязь между микроорганизмами и концентрацией таких компонентов мукозального барьера, как муцины и трефоиловый пептид.

Исследован вклад жировой ткани в механизмы формирования инсулинорезистентности при физиологической беременности.

Материалы исследования внедрены в работу клинико-диагностической лаборатории МБУЗ «ГБСМП г.Ростова-на-Дону», клинико-диагностической лаборатории ЗАО «Наука», г. Ростов-на-Дону, а также в курс лекций на кафедре общей и клинической биохимии №2 РостГМУ.

Основные положения, выносимые на защиту:

Предыдущая беременность в анамнезе и микробиологический пейзаж репродуктивного тракта беременной влияют на продукцию муцинов и трефоилового фактора-3 в репродуктивном тракте, а также цитокинов как в ткани эндометрия, так и в плазме крови.

При первой и повторной физиологической беременности формируется различной степени выраженности инсулинорезистентность, обусловленная продукцией адипокинов, на концентрацию которых оказывает влияние микрофлора репродуктивного тракта.

Апробация работы. Результаты работы представлены на Международной научно-технической конференции «Европейский инновационный конвент» (г. Вена, Австрия 20-21 декабря 2013г.) («EastWest» Association for Advanced Studies and Higher Education GmbH, Wien, sterreich); на Международной заочной научно-практической конференции «Актуальные вопросы образования и науки» (г. Тамбов, Россия, 30 декабря 2013 г); на XII Международной научно-практической конференции «Тенденции и инновации современной науки» (г. Краснодар, 26 февраля 2014 г.).

Публикация результатов исследования. По теме диссертационного исследования опубликовано 9 работ, в том числе из них 4 в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых журналов, рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени, 1 статья в зарубежном издании.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах и содержит – общую характеристику работы, главы – обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, заключение, выводы, список литературы, включающий 16 отечественных и 128 зарубежных источников.

Работа содержит 1 схему, 22 таблицы, иллюстрирована 36 рисунками.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.Роль мукозального барьера в функционировании женского репродуктивного тракта Слизистая репродуктивного тракта представляет собой сложную, динамическую биосистему, включающую в себя компоненты врожденной и приобретенной иммунной системы, которые обеспечивают эффективный барьер от различных агрессивных факторов. Эндометрий и цервикальный канал представлены неороговевающим, цилиндрическим эпителием, который продуцирует слизистый секрет. Свою барьерную функцию данный секрет выполняет не только за счет блокирования распространения микроорганизмов из нижних отделов репродуктивного тракта в верхние, а так же за счет содержания в нем различных противомикробных веществ [89,115]. Вместе с тем, мукозальный слой является средой обитания различных представителей комменсальной микрофлоры [54,77, 94].

Наиболее важными компонентами мукозального секрета являются муцины и трефоиловые пептиды.

Основным компонентом мукозального секрета является особый класс гликопротеинов – муцинов, обладающих высокой молекулярной массой, содержащих в своей структуре до 50-80% углеводов, которые образуют олигосахаридные цепочки соединенные О-гликозидной связью с белком [58]. Муцины являются основной составляющей макромолекулярной слизи и несут ответственность за вязкие свойства слизистого геля. В дополнение к формированию относительно непроницаемого геля, который выступает в качестве смазки, физического барьера и ловушки для микробов, слизь содержит богатый набор антимикробных молекул [77,94]. Эпителиальные клетки продуцируют в мукозальный слой большое количество противомикробных веществ, таких как антитела, дефензины, протегрины, коллектины, каталецидин, лизоцим, гистатины и оксид азота [31,94,108]. Вместе эти соединения образуют физический барьер и обладают прямой антимикробной активностью, а также участвуют в опсонизации, с дальнейшей элиминацией возбудителя. Помимо этого прямое взаимодействие с муцинами может способствовать удержанию антимикробных молекул в слизистом геле, так например, в слюне MUC связывается с гистатином-1 истатерином и MUC 5B связывается сгистатином 1,3,5 и статерином. Кроме того, муцины сами по себе проявляют антимикробные свойства, которые ограничивают рост микроорганизмов [94].

Мукозальный слой представлен такими компонентами как вода 95%, белки и нуклеиновые кислоты около 0,5-2% и муцины 3 %. Муцины характеризуются большим содержанием пролина, серина, треонина, а также специфичным набором углеводов, которые представлены пятью типами моносахаридов: галактозой, N-ацетилгалактозамином, N-ацетилглюкозамином, сиаловыми кислотами, образующие олигосахаридные цепи [33]. Углеводная связь с аминокислотными остатками происходит за счет О-гликозидной связи. Доля белка в муцинах составляет 30 %. Было установлено, что углеводные цепочки связываются исключительно с серином или треонином, что обуславливает высокое содержание этих аминокислот в муцинах. Относительно пролина имеются предположения, что он необходим для формирования особойконформации остова, а так же влияет на гликозилирование серина или треонина, которые располагаются рядом с ним. Вместе полипептидная основа и отходящие от нее углеводные цепочки формируют структуру, напоминающую ершик для мытья посуды («bottle-brush») [77].

Муцины продуцируются бокаловидными клетками эпителиальных тканей или же клетками слизистых желез. Полипептидные цепи муцинов синтезируются на полирибосомах, которые связаны с шЭПР. Транслоцируясь через мембрану ретикулума, пептид попадает в полость, где происходит Nгликозилирование муцинов [94]. Затем в транспортных везикулах переносятся в аппарат Гольджи, где происходит О-гликозилирование [33]. По окончанию гликозилирования происходит упаковка муцинов в секреторные гранулы. Путем экзоцитоза происходит секреция муцинов [94]. Было установлено,что важную роль в секреции муцинов играют ионы кальция, так как при экзоцитозе освобождается большое количество кальция. Возможно, ионы кальция позволяют экранировать отрицательный заряд муцинов, что позволяет более компактно упаковываться в гранулах. Было зафиксировано увеличение объема муцинов в 600 раз после дегрануляции. Этот феномен возникает за счет гидрофильности углеводных цепей муцинов, а так же сил отталкивания соседних молекул [2].

На сегодняшний день, были определены три класса муцинов, они включают секретируемые или гелеобразующие муцины (MUCs 2, 5AC, 5В, 6), мембранные муцины (MUCs 1, 3, 4, 12 и 13) и небольшие растворимые муцины (MUCs 7,11,13,14) [54,78,94]. Секретируемые муцины это большой класс, который является основным компонентом, образующим вязкую слизь.

К ним относятся 4 муцина, которые кодируются в пределах одного региона хромосомы 11p15.5. Они обозначаются 2 MUCs, 5AC, 5В, и 6 [54].

Экспрессия на клеточной поверхности гелеобразующих муцинов может регулироваться воспалительными цитокинами, такими как ИЛ-1, 4,6,9,13, интерферонами, ФНО, оксидом азота. Реагирование на данные цитокины обеспечивает связь между муцинами и врожденным иммунитетом, а также формированием воспалительного ответа [77]. Продукты жизнедеятельности патогенных микроорганизмов так же могут стимулировать продукцию муцинов [78].

Слизь играет важную роль в репродуктивной функции и защите женского репродуктивного тракта. В верхнем отделе репродуктивного тракта, мембран-ассоциированные муцины, находящиеся на мембране эпителиальных клеток маточных труб и эндометрия принимают участие в имплантации и защите эпителия. Основным источником слизистого секрета в женском репродуктивном тракте является эпителий канала шейки матки. Выделяемыйсекрет выступает в качестве барьера, препятствуя проникновению микроорганизмов в матку. Цервикальная слизь играет важную роль в поддержании гомеостаза женского репродуктивного тракта [23,139]. В целом, цервикальный секрет представляет собой сложную смесь воды (90-98%), низкомолекулярных компонентов, в том числе органических (аминокислоты, холестерин, липиды, глюкоза, аскорбиновая кислота, полисахариды) и неорганических, а также высокомолекулярных компонентов, например, ферментов, бактерицидных белков (секреторный IgA, лактоферрин, дефензины) и муцинов [54,139]. Муцины, входящие в состав этого секрета, характеризуются огромными размерами, высокой плотностью (примерно 1,4 г / мл) и высоким содержанием углеводов [54]. Высокая степень гликозилирования муцинов обеспечивает смазку, предотвращает обезвоживание и обеспечивает защиту от протеолиза. Муцины связывают микробные адгезины, обеспечивая тем самым защиту подлежащих тканей от микробной инвазии [26].

Эпителиальная экспрессия и секреция муцинов регулируется несколькими генами, что приводит к гетерогенности слизи. Все клонированные муцины, за исключением MUCs 3 и 7, экспрессируются эпителием канала шейки матки, появление MUC2 может быть спорадическим. Преобладающим гелеобразующим муцином является MUC 5B, а также два других муцина MUC 5AC и MUC 6, но с более низким уровнем экспрессии [54]. По мнению ряда авторов, увеличение продукции муцина в канале шейки матки связано с его способностью связывать и удерживать воду на поверхности клеток. Так же есть предположение, что увеличение экспрессии муцина в цервикальном канале, необходимо для защиты шейки матки и самой матки. Это происходит путем захвата патогенных компонентов муцинами, что исключает их попадание в матку.

Муцины являются одним из самых трудных классов молекул для изучения, их огромные размеры и высокое содержание углеводов препятствует использованию обычных биохимических методов. Функции конкретных муцинов в цервикальном канале еще предстоит определить [54,93].

1.2 Физиологическая роль трефоиловых пептидов У человека известны 3 типа трефоиловых пептидов (TFF 1-3). Первый трефоиловый пептид был обнаружен при поиске эстроген индуцированных мРНК линий клеток карциномы молочной железы MCF 7 в 1982 г. и был обозначен как pS2/TFF-1. В том же году, при подготовке свиного инсулина был очищен и экстрагирован TFF2 (ранее спазмолитический полипептид, SP) из поджелудочной железы свиньи. Вскоре было замечено, что эти пептиды имеют общую структуру, похожую на трилистник, в связи, с чем и получили свое название. Третий пептид из этого семейства был обнаружен позже, при изучении клеток эпителия кишечника крыс, ITF/TFF3 (ранее кишечный трефоиловый фактор, ITF) [142,55,127]. Все три пептида закодированы на хромосоме.

Эти белки являются небольшими, компактными пептидами, содержащими одну или две трефоиловые области. Эти области состоят из 42-43 аминокислотных остатков и образуют три дисульфидные связи с шестью остатками цистеина, создавая тем самым характерную структуру в виде трех листов. За счет такой структуры TFF устойчивы к тепловому и ферментативному расщеплению. TFF2 содержит две трефоиловые области, в то время как TFF и TFF3 содержать только одну трефоиловую область [37, 127, 131,142]. Муцин-продуцирующие клетки или бокаловидные клетки эпителия являются преобладающим местом синтеза TFF [127].

Существует сильная связь между экспрессией TFFs и муцинами. TFF связан с экспрессией MUC6, TFF2 с MUC 5AC, а TFF3 с MUC 2 [61]. Было высказано предположение, что взаимодействие между TFF2 и муцином тормозит, как in vitro так и in vivo, проникновение протонов через слизистую.

Действительно, добавление TFF к очищенному муцину приводит к быстрому увеличению оптической плотности и вязкости, а вместе с тем, к синергическому действию в миграции клеток. Поэтому TFF может участвовать в стабилизации слизистого геля, который покрывает желудочно-кишечный, респираторный, урогенитальный эпителий. Данные показывают, что in vitro и in vivo, TFF принимают участие в поддержании гомеостаза и восстановлении поверхности слизистых оболочек, то есть в процессах регенерации [61,75].

Слизистые оболочки, в том числе и репродуктивного тракта, постоянно подвергаются широкому спектру потенциально вредных факторов, которые могут нарушать целостность ткани. Быстрое восстановление ткани необходимо для предотвращения развития воспаления. TTF участвуют в реэпителизации путем усиления миграции клеток с соседних участков, таким образом восстанавливая слизистый барьер [132]. Процесс восстановления начинается в первые минуты повреждения. При этом начальные фазы этого многоступенчатого процесса не требуют пролиферации клеток или биосинтеза белка.

Но вместе с тем это энергозависимый процесс. Гликолиз имеет важное значение для ранней миграционной фазы, в том числе, и для формирования плотных контактов (морфологическая реституция), при этом полное восстановление функции слизистой также основывается на АТФ, полученном при митохондриальном дыхании (функциональная реституция) [44].

В опытах на клеточных линиях колоректальной карциномы было установлено, что TFF-3 участвует в транспорте хлоридов, движущихся с базолатерального в апикальном направлении, а также связывается с мембранными белками клеток, что сопровождается фосфорилированием тирозина. Фосфорилирование сопровождалось возбуждением межклеточной адгезии [61].

Трефоиловые пептиды наряду с муцинами играют центральную роль в мукозальной защите и регенерации слизистых. Изучение TFF in vitro показало, что они стимулируют эпителиальную регенерацию, но клеточномолекулярный механизм еще до конца не ясен. Дальнейшие исследования в этой области помогут более четко определить роль TFF в механизмах реституции и репарации слизистых тканей.

Слизистая оболочка репродуктивного тракта уникальна тем, что с одной стороны, должна, как и все слизистые оболочки, поддерживать равновесие между иммунной системой и патогенами, а с другой стороны, создавать благоприятные условия для репродуктивного процесса. То есть, не активировать иммунную систему в ответ на аллогенную природу сперматозоидов и их миграцию в маточные трубы, а так же на имплантацию оплодотворенной яйцеклетки [89]. Это хрупкое равновесие осуществляется путем сложного взаимодействия гуморального и клеточного иммунитета [138]. Сложные взаимодействия между двумя иммунными системами, а также их взаимодействие с бактериальной микрофлорой, расположенной на эпителиальных клетках, в конечном счете, ответственны за здоровье репродуктивного тракта.

2. Про – и противовоспалительные цитокины в функционировании репродуктивного тракта Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов межклеточного взаимодействия, участвующих главным образом в формировании и регуляции защитных реакций организма при внедрении патогенов и нарушении целости тканей, а также в регуляции ряда нормальных физиологических функций [5]. К числу важнейших представителей общего семейства цитокинов, являющихся медиаторами межклеточных коммуникаций, относятся интерлейкины. Участие в межклеточных и межсистемных взаимодействиях, дифференцировке, функциональной активности клеток и других процессах определяют актуальность изучения динамики этих регуляторных пептидов в течение беременности.

Во время беременности происходит физиологическое изменение регуляции врожденного иммунного ответа для предотвращения отторжения плода. Центральное место в этой регуляции занимают цитокины. Многие авторы указывают на то, что во время беременности происходит уменьшение синтеза цитокинов Th1 и индукция цитокинов Th2. Согласно этому, беременность является противовоспалительным состоянием, и сдвиг в типе продуцируемых цитокинов может привести к аборту или осложнениям беременности. Некоторые авторы рассматривают беременность как состояние, состоящее из трех иммунологических фаз. Имплантация, плацентация, первый и начало второго триместра беременности напоминают "открытую рану", которая сопровождается сильной воспалительной реакцией. Во время первой стадии бластоциста нарушает эпителиальную выстилку матки для того, чтобы произошла имплантация; происходит повреждение ткани эндометрия, замена эндотелия сосудов при плацентации. Все эти процессы требуют определенного микроокружения. Провоспалительные цитокины обеспечивают адекватное восстановление эпителия матки и удаление клеточных остатков. Таким образом, первый триместр беременности является провоспалительной фазой. Вторая фаза иммунологической беременности, во многих отношениях, оптимальное время для матери. Это период быстрого роста плода и развития. Мать, плацента и плод это симбиоз, а отличительной особенностью является иммунологическая индукция противовоспалительных цитокинов.

Последняя иммунологическая стадия это период перед родами. Роды характеризуется притоком иммунных клеток в миометрий, которые активизируют воспалительный процесс [67,125]. Это способствует сокращению матки, изгнанию ребенка и отторжению плаценты. Таким образом, происходит равномерное распределение про- и противовоспалительных цитокинов в зависимости от периода беременности [91].

2.1 Физиологическая роль провоспалительных цитокинов ИЛ-1 является одним из эмбриональных факторов, активность которых обнаруживается на самых ранних стадиях гестации. Система ИЛ-1 участвует в подготовке эндометрия к имплантации бластоцисты, в регуляции взаимоотношений между матерью и плодомв процессе имплантациии продолжает функционировать на более поздних стадиях гестации, включая родовой акт [6, 80].

Важным моментом в имплантации является связывание ИЛ-1 с рецепторами в материнском эндометрии. При этом известно, что уровень секреции ИЛ-1, с которого начинается каскад продукции иммунорегуляторных цитокинов, при физиологическом течении беременности изменяется в критические периоды развития плода. При повышенной секреции ИЛ-1 могут возгникать осложнения беременности.

ИЛ-1 является мощным провоспалительным цитокином, продуцируемым моноцитами, макрофагами и эпителиальными клетками, который активирует каскад синтеза ФНО, ИФН, ИЛ-2 и ИЛ-12 [3,12,40]. Исследование зрелых плацент показало, что они продуцировали преимущественно ИЛ-1, причем уровень секреции в образцах, полученных при спонтанных родах, был выше, чем в полученных до развития родовой деятельности [11].

ИЛ-1также участвует в регуляции инвазивной способности клеток трофобласта путем экспрессии в них рецепторов к ламинину и коллагену [8].

ИЛ-6 представляет собой цитокин, участвующий не только в воспалительном и инфекционном ответах, но и в регуляции метаболических, регенераторных и нервных процессов. Является важнейшим медиатором острой фазы воспаления [5].

Ил-6 проявляет двойственность действия. Он может выступать как про-, так и противовоспалительный цитокин. Регенеративная или противовоспалительная активность интерлейкина- 6 опосредуется путем классической сигнализации, в то время как провоспалительные реакции путем транссигнализации [24,74].

В трофобласте реализуется аутокринный путь ИЛ-6. Синтезируемый клетками трофобласта, ИЛ-6 стимулирует выработку ХГЧ. Синтез ИЛ-6 происходит в клетках амниона и хориона. Установленно, что накопление провоспалительных цитокинов в амниотической жидкости приводит к преждевременным родам [14]. Но при этом выявлено, что ИЛ-6 также как и ИЛ- участвует в наступлении срочных родов.

ИЛ-8 относится к классу хемокинов. Основными продуцентами являются активированные при встрече с патогенами моноциты/макрофаги и эндотелиальные клетки, однако, и другие клетки могут его продуцировать:

лимфоциты, различные эпителиальные клетки, фибробласты и др. [5].

Экспрессия ИЛ-8 инициируется многими патогенами. Биологическое действие хемокинов связано с регуляцией миграции различных типов клеток.

Чаще всего ИЛ-8 синтезируется в очаге воспаления. Вызывает увеличение концентрации внутриклеточного кальция, полимерезацию актина, изменение формы нейтрофилов для эффективного процесса миграции, а также дегрануляцию с выбросом лактоферрина, миелопероксидазы, желатиназы В и эластазы.

Эндометрий представляет собой сложную многокомпонентную систему, включающую покровный и железистый эпителий, строму, основное вещество и кровеносные сосуды, а также такие клеточные элементы как лейкоциты. Тип и количество лейкоцитов в эндометрии меняться в течение менструального цикла, следовательно, имеется гормональный (эндокринный) и местный (паракринный) контроль миграции лейкоцитов. Кроме того, известно, что эндометрий является местом синтеза нескольких цитокинов, которые могут влиять на миграцию, репликацию и / или функции этих лейкоцитов [14].

Одним из факторов, который играет определенную роль в привлечении лейкоцитов в эндометрий, является интерлейкин-8. Данный цитокин участвует в хемотаксисе и активации нейтрофилов, экспрессии поверхностных молекул адгезии на нейтрофилах, ангиогенезе (хемотаксис эндотелиальных клеток), митогенезе, хемотаксисе эпидермальных клеток гладких мышц сосудов. Было установлено, что ИЛ-8 продуцируется стромальными и эпителиальными клетками эндометрия и его экспрессия регулируется ИЛ-1 и ФНО [110]. Также было показано, что уровень ИЛ-8 увеличен в перитонеальной жидкости женщин, страдающих эндометриозом по сравнению со здоровыми женщинами [71].

Есть исследования, в которых указывается на высокие уровни секреции ИЛ-8 децидуальными клетками на ранних сроках беременности [111]. В то время как у небеременных женщин, регистрируются низкие уровни ИЛ-8 [25].

Фактор некроза опухоли (TNF, кахексиин или кахектин) плейотропный воспалительный цитокин, хорошо известный член суперсемейства ФНО, состоящего как минимум из 18 лигандов и 29 различных рецепторов, участвующих в многочисленных клеточных процессах. Сигналы ФНО идут через два отдельных рецептора TNFR1 и TNFR2, тем самым контролируя экспрессию цитокинов, протеаз, факторов роста и генов клеточного цикла, которые, в свою очередь, регулируют воспаление, апоптоз, миграцию клеток, пролиферацию и дифференцировку. Экспрессия ФНО была обнаружена в амнионе и плаценте, а также в других репродуктивных тканях. Физиологические уровни цитокинов могут быть важны для балансировки слияния клеток, а также в ограничении инвазии трофобласта в децидуальную ткань. Аберрантные уровни ФНО, связаны с различными репродуктивными заболеваниями, такими как рецидивирующие спонтанные аборты, преэклампсия, преждевременные роды и эндометрит. Следовательно, концентрация, распределение рецепторов и длительность стимуляции определяет, оказывает ли ФНО благоприятное или неблагоприятное воздействие на репродуктивную функцию женщин и беременность.

Целью многих исследований являлось изучение характера экспрессии ФНО, а также его рецепторов, TNFR1 и TNFR2 в различных гестационных тканях. Экспрессия ФНО и его рецепторов была отмечена в эндометрии, децидуальной ткани, плаценте. ФНО был обнаружен в околоплодных водах и плацентарном супернатанте при физиологической беременности [59].

При иммуногистохимическом анализе была отмечена экспрессия мРНК ФНО в эндометрии и в клетках миометрия матки [90]. Различные типы клеток эндометрия, т.е. фибробласты, железистые клетки эпителия и сосудистые клетки также экспрессируют цитокин [100].

ФНО обладает широким спектром биологической активности и большинство клеток обладают чувствительностью к нему. Для ФНО свойственна функциональная двойственность, то есть участие в регенерации тканей и деструкции. В нормальных физиологических условиях ФНО участвует в иммунном надзоре и защите, в клеточном гомеостазе, а также в процессах пролиферации, миграции и дифференциации [118]. Благодаря своей мощной провоспалительной и иммуностимулирующей деятельности, ФНО связан с рядом патологических процессов. В целом, концентрация ФНО определяет,оказывает ли цитокин положительное или отрицательное воздействие. В высоких дозах ФНО при взаимодействии с ЛПС и другими бактериальными токсинами играет ключевую роль в развитии септического шока. Низкие концентрации в течение длительного периода данного цитокина часто связаны с кахексией, которая отмечается у больных с онкопатологией. Описанная роль ФНО указывает на то, что существует сложная схема взаимодействия между концентрацией ФНО, тканью и типом клеток, рецептором ФНО и продолжительностью стимуляции, ведущая к определенной физиологической или патологической реакции.

Баланс про – и противовоспалительных цитокинов является критическим для имплантации, плацентарного развития и исхода беременности.

Продукция ФНО благоприятно сказывается в преимплантационный и имплантационный периоды. Также было установлено, что ФНО взаимодействует с MUC 1 во время имплантации эмбриона [134]. Во время беременности происходит уменьшение синтеза цитокинов Th1 и индукция цитокинов Th2, что вероятнее всего, направленно на уменьшение аберрантного воспаления и отторжения аллотрансплантата плода. В ряде исследований было отмечено увеличение секреции цитокинов Th1, таких как ФНО, в ответ на амниотические инфекции, как известно, вызывающие негативные последствия прибеременности и послеродовом периоде [112]. Хотя воспалительный ответ, спровоцированный ФНО, негативно влияет на беременность, его можно также интерпретировать в контексте иммунобиологического надзора [140].

Инициирование ответа Th1 является консервативным механизмом, позволяющим сохранить вид.

Началу родовой деятельности предшествует инфильтрация плаценты различными типами лейкоцитов, которые начинают активно синтезировать провоспалительные цитокины. При этом местное увеличение продукции цитокинов приводит к дополнительному привлечению и активации лейкоцитов, что в свою очередь, инициирует сократительную деятельность матки. При этом ИЛ-1 и ИЛ-6 влияют на синтез рецепторов окситоцина в матке. Провоспалительные цитокины также активируют синтез различных белков и ферментов, участвующих в изменениях ткани шейки матки. Вместе с тем имеет значение не только локальное увеличение провоспалительных цитокинов, но и их уровень в периферической крови матери [5].

На данный момент представлено большое количество данных, свидетельствующих о важной роли цитокинов в репродукции: развитии эндометрия, имплантации эмбриона, росте трофобласта. Цитокины, продуцируемые клетками эндометрия, миометрия и трофобласта, и их рецепторы способствуют успешному течению беременности. Эти данные указывают на разнообразное и активное участие цитокинов в репродуктивных процессах на всех этапах беременности [8].

Если говорить о провоспалительных цитокинах (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО), то чаще всего они упоминаются в контексте преждевременного и срочного родоразрешения, что может указывать на схожий механизм данных процессов.

Вообще, ИЛ-1 является одним из самых активных цитокинов, который участвует в процессах гестации, начиная с момента имплантации и заканчивая стимуляцией родовой деятельности. Система ИЛ-1 и его рецепторов участвует в подготовке эндометрия к имплантации бластоцисты и в регуляции эмбрионально-материнских взаимоотношений в процессе имплантации.

Вместе с тем, в некоторых работах было отмечено, что продукция ИЛ-1 с которого начинается каскад продукции иммунорегуляторных цитокинов, при физиологическом течении беременности изменяется в критические периоды развития плода.

Продуцируемые клетками амниона и хориона ИЛ-6 и 8, так же участвуют в процессах гестации и развития родовой деятельности. Так Ил-6 участвует в стимуляции экспрессии рецепторов ламинина и коллагена, способствуя имплантации бластоцисты, а также ИЛ-6 оказывает стимулирующее действие на выработку ХГЧ [11,8].

Необходимо учитывать, что эффект цитокина определяется не только наличием соответствующего рецептора на клетке-мишени, но и зависит от внутриклеточной регуляции со стороны различных факторов.

2.2 Физиологическая роль противовоспалительных цитокинов Трансформирующий фактор роста продуцируют такие клетки как Т-лимфоциты и макрофаги, тромбоциты, а так же плацентарные клетки [130].

Мишенями ТФР- служат разнообразные клетки, поскольку экспрессия его высокоаффинного рецептора широко распространена.

Белки семейства ТФР- принимают активное участие в развитии плода, формировании плаценты и хориона [10,57].

Трансформирующий фактор роста является одним из самых важных регуляторов эмбрионального развития, физиологических и клеточных процессов. ТФР участвует в регулировании эмбрионального развития и клеточного гомеостаза, в том числе в процессах пролиферации, дифференцировки, апоптоза. Предполагается, что ТФР – один из наиболее важных факторов, оказывающих регулирующее влияние на рост и дифференцировку трофобласта, а так же иммуносупрессивное действие, что позволяет существовать плоду как аллотрансплантату в организме матери [14,69].

Таким образом, синтез ТФР в децидуальной ткани способствует поддержанию материнского иммунного ответа, а также способствует оптимальному функционированию плаценты и развитию плода [68,129].

ИЛ-1РА блокирует действие эндогенного ИЛ-1, то есть проявляет противовоспалительное действие. Имеет практически такую же молекулярную массу, как и ИЛ-1, а также 26 % гомологию в аминокислотной последовательности с ИЛ-1. Ген ИЛ-1РА находится на длинном плече хромосомы 2 в непосредственной близости от генов ИЛ-1 и ИЛ-1. Наряду со способностью связываться с рецептором утратил способность его активировать, при этом конкурируя с агонистами за связывание с рецептором [70].

При развитии воспаления происходит усиление экспрессии гена. Индукторами являются те же факторы, что и у ИЛ-1. Трансляция мРНК приводит к образованию молекулы с типичным сигнальным пептидом. Транскрипция гена приводит к образованию 2 форм мРНК: одна кодирует секреторную форму, а другая – внутриклеточную. В отличие от других цитокинов ИЛ-1РА присутствует в плазме крови в достаточно высоких концентрациях. Предположительно, основной функцией этого цитокина является роль своеобразного буфера, блокирующего действие эндогенного ИЛ-1 и защищающего организм от резкого увеличения уровня ИЛ-1 в плазме крови при развитии воспаления [97].

Основными регуляторами метаболизма являются такие эндокринные факторы, как адипокины (лептин, адипонектин, резистин) и инсулин [60].

Адипокины играют непосредственную роль в становлении и поддержании функционирования репродуктивной системы [20].

Изменение концентрации адипокинов у беременных женщин отражает функциональную активность жировой ткани [15].Стоит обратить внимание, что дифференцировка адипоцитов, фибробластов и остеобластов следует от единой клетки-предшественницы – мезенхимальной стволовой клетки [84].

Не исключено, что при беременности также изменяется функциональная активность клеток, продуцирующих коллаген. К тому же, резорбция и репаративный синтез материнской костной ткани с целью обеспечения плода кальцием, размягчение связочного аппарата таза и стромы родовых путей, созревание шейки матки при беременности сопровождаются существенными изменениями в метаболизме соединительной ткани [16].

3.1 Физиологическая роль адипонектина в функционировании репродуктивного тракта Ранее жировая ткань считалась местом пассивного хранения энергии.

Тем не менее, в настоящее время хорошо известно, что жировая ткань является важным эндокринным органом. Жировая ткань синтезирует несколько белков, таких как лептин, резистин и другие. Адипонектин является членом этой растущей группы белков, иногда описываемых как адипоцитокины.

Адипонектин рассматривается как фактор, повышающий сенситивность тканей к инсулину, обладающий противовоспалительными и антиатерогенными свойствами [86,87].

Адипонектин это белок, состоящий из 244 аминокислотных остатков (молекулярная масса 30000 Да) продуцируется исключительно адипоцитами белой жировой ткани. Адипонектин является белковым продуктом гена APM1, который расположен на хромосоме 3q27 [106].

Адипонектин схож с семейством комплемента 1q и имеет карбоксильный конец, который является глобулярным доменом и аминоконец - коллагеновым доменом. Адипонектин секретируется жировой тканью как в виде тримера с низким молекулярным весом, так и комбинации двух тримеров среднего молекулярного веса, а так же в виде шести тримеров высокой молекулярной массы и циркулирует либо в виде тримера либо олигомера [30,102].Он реализует свою деятельность на периферии, главным образом, посредством двух рецепторов (AdipoR1 и AdipoR2).

Действие адипонектина приводит к снижению продукции глюкозы в печени за счет усиления действия инсулина [43, 114,121]. Исследования показали, что адипонектин снижает уровни глюкозы, свободных жирных кислот и триглицеридов в естественных условиях и увеличивает окисление жирных кислот в печени через снижение экспрессии CD 36 [41, 45,105]. Еще одним доказательством ключевой роли адипонектина в гомеостазе глюкозы является печеночная резистентность к инсулину у грызунов и человека, не имеющих адипонектина.

Этот белок циркулирует в плазме крови в относительно высоких концентрациях. У тучных людей концентрация адипонектина в плазме крови ниже, чем у людей с нормальным весом [50]. В соответствии с этими данными, транскрипция гена адипонектина уменьшается в адипоцитах у тучных людей. И наоборот, снижение веса сопровождается увеличением концентрации адипонектина плазмы.

Адипонектин является важным регулятором чувствительности к инсулину и гомеостаза глюкозы. У людей наблюдается обратная связь между инсулинорезистентностью и плазменным уровнем адипонектина [30]. Сильная обратная зависимость между уровнем адипонектина и резистентностью к инсулину дополнительно подтверждается генетическими исследованиями.

Кроме того, генетические вариации в гене адипонектина связаны с повышенным риском развития сахарного диабета 2 типа. Наконец, введение рекомбинантного адипонектина мышам дикого типа, а также различные модели с резистентностью к инсулину у мышей, привело к значительному снижению уровня глюкозы в плазме крови [21]. Такое снижение глюкозы не зависит от уровня инсулина в плазме, а также наблюдалось у мышей с дефицитом секреции инсулина, указывая, что эффект, вероятно, опосредуется путем усиления действия инсулина.

Литературные данные свидетельствуют об участии адипонектина в функциях эндометрия. Оба рецептора AdipoR1 и AdipoR2 экспрессируются в эндометрии свиней. В 2006 было установлено, что эти рецепторы присутствует в эндометрии и железистом эпителии человека и в стромальных фибробластах [49]. Гомеостатические и противовоспалительные эффекты адипонектина в эндометрии могут влиять на имплантацию. Интересно, что уровни адипонектина были ниже у женщин с эндометриозом по сравнению со здоровыми женщинами. Только в одном исследовании оценивали адипонектин при лейомиоме, и было установлено, что женщины с лейомиомой имели значительно более низкие уровни адипонектина [17].

Беременность является уникальным состоянием, при котором происходит физиологическое увеличение резистентности к инсулину. Таким образом, даже нормальная беременность является "диабетогенным состоянием".

Несмотря на большое количество доказательств, относительно важности адипонектина в регуляции чувствительности к инсулину, мало известно о роли этого гормона во время беременности.

Уровень адипонектина на ранних сроках беременности практически такой же, как и у небеременных женщин [99]. В отличие от небеременных женщин, уровни адипонектина в течение всей беременности не коррелируют с материнским индексом массы тела (ИМТ). Тем не менее, существует обратная зависимость между уровнями этого гормона и прегестационным ИМТ [64,82,101]. Нарушение отрицательной корреляции между адипонектином и материнским весом может быть следствием нескольких факторов. Наиболее вероятной причиной для этого нарушения являются гормональные изменения во время беременности. Повышенные уровни эстрогена, пролактина, кортизола, и тестостерона характеризуют нормальную беременность. Эстроген связан со снижением уровня адипонектина у мышей. Хотя эстроген отрицательно коррелирует с адипонектином у женщин. Пролактин подавляет синтез адипонектина у мышей, однако, у трансгенных мышей, с повышенным уровнем адипонектина, отмечалось повышение уровня пролактина. Так же неоднозначно влияние тестостерона на адипонектин. Хотя значительное подавляющее действие на адипонектин было отмечено у мышей и мужчин, никакого эффекта не было продемонстрировано у женщин. Не было никакой корреляции у женщин между кортизолом и адипонектином. Другое объяснение отсутствия корреляции между адипонектином и материнским весом во время беременности является тот факт, что большинство случаев увеличения веса во время беременности не могут быть отнесены к накоплению жира.

Плацента продуцирует практически все известные цитокины. Цитокины синтезируются тремя различными типами клеток плаценты: клеткамиХофбауэра, клетками трофобласта и сосудистыми эндотелиальными клетками [19]. Плацента и человека, и грызунов, а также трофобласт являются источником адипонектина [48]. Установлено, что адипонектин отрицательно коррелирует с HOMA, и снижается после родов, что свидетельствует о значительном плацентарном вкладе в продукцию адипонектина [113].

Таким образом, учитывая, что репродуктивная ткань экспрессирует рецепторы к адипонектину, можно говорить, что он является важным гормональным связующим компонентом между жировой тканью и репродуктивной системой.

3.2 Физиологическая роль резистина в функционировании Беременность характеризуется эндокринной и метаболической адаптацией, которая включает увеличение веса (жировой массы тела) и резистентность к инсулину. Эти изменения не отражают патологическое состояние, а являются физиологическим процессом, необходимым для удовлетворения энергетических потребностей плода и подготовки материнского организма к родоразрешению и лактации. Важную роль в этих процессах играет жировая ткань и плацента. Существует большая группа цитокинов, известных под общим названием - адипокины, с эндокринными и паракринными эффектами.

В последние годы было установлено, что клетки трофобласта продуцируют те же адипокины, что и жировая ткань, предполагается, что эти молекулы могут влиять на взаимоотношения мать – плод с момента имплантации до третьего триместра. Наиболее изученными адипокинами являются лептин, адипонектин и резистин [72].

Резистин представляет собой цитокин, который был обнаружен впервые в 2001 году Steppan и соавт. [124]. Это гомодимер с дисульфидными связями, который у животных продуцируется в жировой ткани. В организме человека он был обнаружен в не жировых клетках, в частности, в мононуклеарах, эндотелиальных или гладкомышечных клетках сосудов и в плацентарной ткани. Резистин был рассмотрен как связующее вещество между ожирением и инсулинорезистентностью у мышей. В организме человека сывороточные уровни резистина (нормальный диапазон 7-22 нг / мл) положительно коррелирует с массой тела. Однако существует противоречие в литературе относительно ассоциации между резистином, резистентностью к инсулину и ожирением у человека. Хотя, некоторые авторы сообщают о более высоких концентрациях в плазме резистина у тучных людей по сравнению с худыми людьми, у больных сахарным диабетом по сравнению со здоровыми людьми [46] в других исследованиях не подтверждают эту связь [29,109]. Вполне вероятно, что эти разногласия связаны с методологическими ограничениями. Вполне возможно, что коммерческие доступные наборы ИФА имеют потенциал к перекрестной реакции с циркулирующими резистин – подобными молекулами, следовательно, обеспечивая различные концентрации в сыворотке.

Резистин был обнаружен в ворсинках плаценты и в цитотрофобласте.

Более поздние исследования указывают на положительное влияние резистина в процессах ангиогенеза. Резистин также активирует экспрессию нескольких белков, участвующих в ангиогенезе. Как у человека, так и у мышей резистин вызывает миграцию эндотелиальных клеток и формирование клеточных сетей.

Сывороточные уровни резистина схожи среди небеременных женщин и женщин в первом и втором триместре нормальной беременности. Напротив, концентрация значительно увеличивается в течение третьего триместра [22].

Yura и соавт., показали, что продукция резистина значительно выше в плаценте, чем в ворсинах хориона, подтверждая, что плацентарная продукция резистина представляет собой главную причину увеличения сывороточной концентрации во время беременности. Роль резистина в материнском организме должна быть связана с развитием пониженной чувствительности к инсулину на более поздних стадиях беременности [38,128].

Ряд авторов отметили высокие концентрации резистина в образцах пуповинной крови [81,98], что указывает на роль этого адипокина в регуляции энергетического гомеостаза плода. Silvia D’Ippolito с соавт., указали, что резистин способен модулировать экспрессию и активность транспортера глюкозы 1 (GLUT- 1) в клетках трофобласта. GLUT- 1 является основной изоформой, которая участвует в движении трансплацентарной глюкозы. Эффекты резистина по GLUT -1 зависят от концентрации, так в физиологической дозе (10 нг / мл) резистин усиливает поглощение глюкозы, в то время как более высокие концентрации (50-100 нг / мл), которые достигаются в третьем триместре беременности, значительно ухудшают этот процесс. Можно предположить, что с помощью этого механизма, резистин способствует инсулинорезистентности и косвенно содействует быстрому росту плода.

Костная ткань по гистоморфологическим признакам относится к скелетным соединительным тканям, состоящих из органических компонентов, в первую очередь из коллагеновых волокон. Коллагены являются главными белками соединительной ткани – коллаген I типа, находится в составе минерализованной кости, кожи и сухожилий, а коллаген III типа, наиболее распространен в мягких тканях.Основные пути синтеза и деградации коллагена являются общими для всех тканей, но есть определенные особенности, которые являются более выраженными в твердых, либо в мягких тканях, что позволяет различать метаболиты коллагена I типа между двумя источниками.

Метаболизм коллагена – и синтез, и деградация, наиболее активен в период роста, при этом образуется большое количество промежуточных метаболитов, используемых в качестве оценки активности обменных процессов в соединительной ткани. Для I типа коллагена маркеры синтеза включают карбокси-терминальный и амино-терминальный пропептиды проколлагена I типа (CICP, PICP и PINP), а маркер деградации – карбокси-терминальный телопептид коллагена I типа (Crosslaps, ICTP) [16].

Основной биологической функцией коллагена является обеспечение прочности ткани при растяжении.

Коллаген является основным структурным белком шейки матки. Исследования, проведенные с тканью шейки матки мыши, указывают на снижение активности лизилоксидазы на ранних сроках беременности. Этот фермент катализирует образование сильных коллагеновых поперечных связей.

Во время беременности ремоделирование соединительной ткани шейки матки происходит с уменьшением концентрации коллагена и протеогликанов, одновременно с увеличением коллагенолитической активности ферментов.

Важность прогрессивных изменений в метаболизме коллагена во время размягчения шейки матки подтверждается тем фактом, что встречаемость преждевременных родов увеличивается у женщин с наследственными дефектами синтеза коллагена и эластина [144].

Считается, что дефект метаболизма коллагена может приводить к осложнениям беременности [116]. Известно, что локальное увеличение активности макрофагов и нейтрофилов в шейке матки, приводит к ее преждевременному созреванию, путем запуска воспалительных реакций с реорганизацией межклеточного вещества соединительной ткани [123]. Предполагается, что работа шейки матки находится в зависимости от метаболизма коллагена в связи с высоким содержанием волокнистых соединительнотканных структур [120,141].

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Клиническая характеристика обследованных беременных Работа выполнена на базе кафедры общей и клинической биохимии № Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, МБУЗ «ГБ №1 им.Семашко Н.А. г.Ростова-на-Дону» роддома №1, НИИ биологии Южного Федерального Университета.

Для выполнения поставленных задач в исследование включены 50 беременных женщин в сроке 38-40 недель гестации, рекомендованные на плановое кесарево сечение, находившиеся в МБУЗ «ГБ №1 им.Семашко Н.А.

г.Ростова-на-Дону» роддоме №1, а также 12 небеременных женщин, которые являлись группой контроля при исследовании уровня адипокинов и продуктов метаболизма коллагена I типа. Забор биологического материала осуществлялся в стационаре с информированного согласия беременных. Лабораторные исследования выполнены на базе НИИ биологии Южного Федерального Университета и кафедры общей и клинической биохимии №2 ГБОУ ВПО «РостГМУ» Минздрава России по согласованию с локальным этическим комитетом РостГМУ.

При обследовании беременных использовали общепринятые методы:

сбор анамнеза, жалобы, осмотр и общие лабораторные исследования. При сборе анамнеза отмечались перенесенные гинекологические заболевания, наличие соматических заболеваний, число родов и абортов, наличие оперативных вмешательств на органах репродуктивного тракта, течение послеродового и постабортного периодов.

Возраст женщин колеблется от 21 года до 40 лет. Средний возраст беременных в I группе составил 28,5 4,7, во II группе –30,5 5,9.

Структура гинекологической и экстрагенитальной патологии Все женщины были с физиологической беременностью, без сопутствующих воспалительных заболеваний. Но имели показания к кесареву сечению в связи с гинекологической и экстрагенитальной патологией.

Структура гинекологической и экстрагенитальной патологии группе преобладающим показанием к кесареву сечению являлось тазовое предлежание плода, во второй группе единственным показанием к оперативному родоразрешению являлось наличие рубца на матке.

Характеристика микрофлоры репродуктивного тракта беременных Всем беременным был взят мазок на микрофлору, а так же выполнен бактериальный посев. Результаты микробиологического исследования получены совместно с аспирантом кафедры акушерства и гинекологии №1 РостГМУ Потаповой М.В. В ходе анализа было установлено, что у беременных обеих групп отмечались дисбиотические сдвиги различной степени выраженности.

Отсутствие роста тофлоры Отмечен рост бактерий Исследование беременных женщин состояло из сбора анамнеза, осмотра, жалоб, общего анализа крови и мочи, биохимических показателей крови, микроскопии отделяемого цервикального канала и влагалища, УЗИ, допплерометрии, кардиотокографии. При сборе анамнеза отмечалось количество родов, абортов, наличие оперативных вмешательств на органах репродуктивного тракта, течение послеродового или послеоперационного периодов. Также отмечалось наличие соматических заболеваний и инфекционный статус на момент родоразрешения. Назначались консультации терапевта, окулиста, эндокринолога, иммунолога. В соответствии с полученными рекомендациями проводилась оценка соматического состояния и тактика ведения беременных женщин, а также определялся метод родоразрешения.

Беременные, имевшие клинические признаки инфекционных и воспалительных процессов в исследование не включались.

Социальный статус беременных не имел резких отличий. Большинство женщин находились в браке и имели удовлетворительные условия жизни.

Инструментальные методы исследования Помимо стандартных исследований выполнялось определение содержания трефоилового фактора-3, муцинов 5 АС и 6, ФНО, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛТРФ-1, ИЛ-1РА (рецепторный антогонист), адипонектина, резистина, CiCP, CrossLaps, инсулина и глюкозы.

Объектом исследования служили: цервико-вагинальный секрет, эндометрий и сыворотка крови.

Получение сыворотки крови.

Забор крови осуществлялся утром натощак, до проведения диагностических процедур в объеме 20 мл с последующим центрифугированием в течение 10 мин. при 1500 об/ мин. (800 g) сразу же после ее взятия. Полученную сыворотку разливали по пробиркам эппендорф и помещали в жидкий азот с последующим хранением в морозильной камере при t -80С.

Забор цервико-вагинального секрета.

Забор цервико-вагинального секрета осуществлялся в 2 этапа. Первый забор осуществлялся в день госпитализации беременной в стационар, максимально возможный объем секрета помещали в эппендорф и погружали в жидкий азот с дальнейшим хранением в морозильной камере при t -80С.

Второй забор производился в день родоразрешения непосредственно перед оперативным вмешательством. Транспортировался и хранился аналогичным образом.

Забор эндометрия.

Забор ткани эндометрия осуществлялся сразу же после извлечения плода из полости матки. Ткань отмывалась в физиологическом растворе, помещалась в эппендорф и погружалась в жидкий азот с последующим хранением в морозильной камере при t -80С.

Содержание TFF-3 определяли вцервико-вагинальном секрете, а также в эндометрии методом иммуноферментного анализа наборами «BioVendor»

(Чехия).

Принцип метода состоял в том, что стандарты, контроль качества и образцы инкубировали в лунках микропланшета, предварительно покрытых анти-человеческими поликлональными антителами TFF3. После 60 минут инкубации и промывки, добавляли меченные биотином поликлональные античеловеческие антитела TFF3 и инкубировали в течение 60 минут. После очередной промывки добавляли конъюгат стрептавидина-HRP. После 30 минут инкубации и последней промывки, оставшийся конъюгат реагировал с раствором субстрата (ТМВ). Реакцию останавливали добавлением кислого раствора. В результате получался окрашенный в желтый цвет продукт. Полученный продукт измерялся фотометрически. Стандартная кривая демонстрировала прямую зависимость концентрации маркера образца от оптической плотности.

Содержание MUC 5AC и 6 также определяли в цервико-вагинальном секрете и в эндометрии методом иммуноферментного анализа наборами «CUSABIO» (Китай).

Этот анализ основан на принципе «сэндвича». Антитело, специфичное к MUC 5AC и 6 было предварительно нанесено на микропланшет. Стандарты и образцы в лунках связаны с иммобилизованным антителом. После удаления несвязанного вещества, в лунки добавляли биотинилированные антитела, специфичные для MUC 5AC и 6. После промывки в лунки добавляли конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена, который специфически связывается с биотинилированными антителами. Затем несвязавшийся конъюгат удаляли при промывке. Поле этого вносили субстрат, который в результате ферментативных превращений образовывал продукт голубого цвета, при этом окраска прямо пропорциональна количеству присутствующего муцина. Ферментативную реакцию останавливали добавлением стоп-реагента, в результате голубая окраска превращалась в желтую. Абсорбция при 450 нм измерялась с помощью микропланшетного спектрофотометра. Для построения калибровочной кривой использовался набор стандартов.

Концентрация ИЛ-1 определялась в плазме крови и эндометрии беременных методом иммуноферментного анализа наборами «Вектор Бест» (Россия).

Метод определения основан на твердофазном «сэндвич» – варианте иммуноферментного анализа с применением моно- и поликлональных антител к ИЛ-1.

На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами. Имеющийся в образцах ИЛ-1, связывался с иммобилизованными антителами. Связавшийся ИЛвзаимодействовал при инкубации с конъюгатом №1 (антитела к ИЛ- человека с биотином). На третьей стадии связавшийся конъюгат №1 взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена).

Количество связавшегося конъюгата №2 определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода и хромогена – тетраметилбензидина. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству содержащегося в образце ИЛ-1.

После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывалась концентрация ИЛ-1 в анализируемых образцах.

Рецепторный антагонист интерлейкина- Концентрация рецепторного антагониста интерлейкина-1 определялась в плазме крови и эндометрии беременных методом иммуноферментного анализа наборами «Вектор Бест» (Россия).

В основе метода лежит принцип «сэндвича», являющийся вариантом иммуноферментного анализа с применением моно- и поликлональных антител к ИЛ-1РА человека.

На первой стадии анализа, исследуемые и контрольные образцы инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами. Имеющийся в образцах ИЛ-1РА, связывался с иммобилизованными антителами. Связавшийся ИЛ-1РА, взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №1 (антитела к ИЛРА человека с биотином). На третьей стадии, связавшийся конъюгат № взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена).

Количество связавшегося конъюгата №2 определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода и хромогена – тетраметилбензидина. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна концентрации содержащегося в образце ИЛ-1РА.

Концентрация ИЛ-6 определялась в плазме крови и эндометрии беременных методом ИФА наборами «Вектор Бест» (Россия).

Метод определения основан на твердофазном «сэндвич» – варианте иммуноферментного анализа. Специфическими реагентами набора являются моноклональные антитела к ИЛ-6, сорбированные на поверхности лунок разборного полистирольного планшета, конъюгат поликлональных антител к ИЛ-6 с биотином и калибровочные образцы, содержащие ИЛ-6. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами. Имеющийся в образцах ИЛ-6 связывался с иммобилизованными антителами. Связавшийся ИЛ-6 взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №1 (антитела к ИЛ-6 человека с биотином). На третьей стадии связавшийся конъюгат №1 взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). Количество связавшегося конъюгата №2 определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода и хромогена – тетраметилбензидина. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству содержащегося в образце ИЛ-6.

Концентрация ИЛ-8 определялась в плазме крови и эндометрии беременных методом ИФА наборами «Вектор Бест» (Россия).

Метод определения основан на твердофазном «сэндвич» – варианте иммуноферментного анализа. Специфическими реагентами набора являются моноклональные антитела к ИЛ-8, сорбированные на поверхности лунок разборного полистирольного планшета, конъюгат поликлональных антител к ИЛ-8 с биотином и калибровочные образцы, содержащие ИЛ-8. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами. Имеющийся в образцах ИЛ-8 связывался с иммобилизованными антителами. Связавшийся ИЛ-8 взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №1 (антитела к ИЛ-6 человека с биотином). На третьей стадии связавшийся конъюгат №1 взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). Количество связавшегося конъюгата №2 определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода и хромогена – тетраметилбензидина. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству содержащегося в образце ИЛ-8.

Содержание TGF определялось в плазме крови и эндометрии беременных женщин методом ИФА наборами «DRG» (Германия).

Все компоненты набора готовились согласно инструкции к набору.

После вскрытия упаковки, брали соответствующее число микротитровальных полос и укрепляли в держателе. Неиспользованные полосы опять хорошо закрывали и хранили в сухости.

Пипетировали 100 мкл приготовленного (подкисленного и нейтрализованного) стандарта и проб (пробы разбавлены 1: 50) для двойного определения на соответствующие полосы. Платы закрывали и инкубировали 3 часа при комнатной температуре. Затем встряхивали инкубационный раствор.

Полосы трехкратно промывали разбавленным отмывочным раствором по мкл на полосу. После последнего ополаскивания убирали капли воды похлопыванием по промокательной бумаге. Затем добавляли 100 мкл спец.антител во все полосы. Инкубировали 2 часа при комнатной температуре. Встряхивали инкубационный раствор. Снова трехкратно промывали разбавленным отмывочным раствором по 350 мкл на полосу. Добавляли 100 мкл конъюгата (биотин). Инкубировали 45 мин при комнатной температуре. Встряхивали инкубационный раствор. Полосы промывали трехкратно разбавленным отмывочным раствором по 350 мкл на полосу. Затем вносили 100 мкл ферментного комплекса. Инкубировали 45 мин при комнатной температуре. Заново встряхивали инкубационный раствор. Полосы промывали трехкратно.

Вносили 100 мкл субстратного раствора. Инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Добавляли в каждую полосу 50 мклстоп-раствора. Заново встряхивали инкубационный раствор. Полосы промывали трехкратно. В среднем через 10 мин измеряли на приборе при 450+_10 нм.

Концентрация ФНО также определялась в плазме крови и эндометрии беременных женщин методом ИФА наборами «Вектор Бест» (Россия).

На первой стадии анализа,исследуемые и контрольные образцы, инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами. Имеющийсяв образцах альфа-ФНО связывался с иммобилизованными антителами. Связавшийся альфа-ФНО взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №1 (антитела к альфа-ФНО человека с биотином). На третьей стадии связавшийся конъюгат №1 взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). Количество связавшегося конъюгата № 2 определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода и хромогена. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна концентрации содержащегося в образце альфа-ФНО.

С-концевой пропептид коллагена I типа (CICP) Концентрация С-концевого пропептида коллагена I типа (CICP) определялась в плазме крови беременных и небеременных женщин наборами фирмы «Quidel corp.» (Германия).

В лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата кортизол-пероксидаза, во время инкубации устанавливается равновесие между конъюгатом и эндогенным CICP сыворотки крови в процессе связывания с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. При удалении содержимого из лунок происходит разделение свободного и связанного антителами CICP и конъюгата кортизол-пероксидаза, причем количество связанного антителами конъюгата обратно пропорционально количеству CICP в образце сыворотки крови. Во время инкубации со стабилизирующим раствором происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связанного антителами конъюгата CICP-пероксидаза. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация CICP в определяемых образцах.

С помощью ИФА с использованием наборов фирмы «Quidel corp.»

(Германия) определяли концентрацию показателя деградации коллагена I типав плазме крови.

В наборе ИФА – Crosslaps использован «сэндвич»-вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к Crosslaps. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе мечено пероксидазой хрена. В лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата антипролактин-пероксидаза, во время инкубации одновременно происходит иммобилизация Crosslaps, содержащегося в исследуемом образце, и связывание с конъюгатом. При удалении содержимого из лунок и промывке происходит удаление избытка конъюгата анти- Crosslaps -пероксидаза, не связавшегося с иммобилизованным в ходе инкубации Crosslaps. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству Crosslaps в исследуемом образце. Во время инкубации с раствором тетраметилбензидина происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связанного конъюгата антипролактин-пероксидаза. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация Crosslaps в определяемых образцах.

Уровень адипонектина измеряли методом ИФА (ELISA) при помощи наборов производителя «BioVendor» (Чехия) в плазме крови. В основе самой методики положен принцип конкурентного анализа. Сначала происходит одновременное связывание молекул адипонектина образцов с иммобилизованными на лунках микропланшета моноклональными антителами к адипонектину, затем – связывание второго биотинилированного моноклонального анти – человеческого антитела с образованными комплексами молекул. После промывки удаляются остатки несвязанного материала. Затем происходит связывание конъюгированного с пероксидазой хрена стрептавидина с иммобилизованными биотинилированными антителами. Осуществляется промывка для удаления свободного конъюгата и определяется количество связанного коньюгата посредством наблюдения за активностью пероксидазы в присутствии субстрата тетраметилбензидина. Активность фермента измеряется на спектрофотометре при повышенной абсорбции при 450 нм – 590 нм после ацидификации продуктов реакции. Увеличение абсорбции прямо пропорционально количеству связанного человеческого адипонектина в образце пациента, последнее может быть получено интерполяцией референс-кривой, полученной в ходе данной постановки анализа на результатах референс-стандартов известных концентраций адипонектина человека.

Уровень резистина измеряли при помощи наборов для ИФА фирмы «BioVendor» (Чехия). Принцип метода сводится к проведению «сэндвичанализа», который осуществляется в несколько этапов: 1) одновременное связывание молекул резистина образцов с иммобилизованными на лунках микропланшета моноклональными антителами к резистину, а так же связывание второго биотинилированного моноклонального анти – человеческого антитела с образованными комплексами молекул, 2) промывка – удаление несвязанного материала, 3) связывание конъюгированного с пероксидазой хрена стрептавидина с иммобилизованными биотинилированными антителами, 4) промывка для удаления свободного конъюгата, 5) определение количества связанного коньюгата посредством наблюдения за активностью пероксидазы в присутствии субстрата тетраметилбензидина. Активность фермента измеряется на спектрофотометре при повышенной абсорбции при 450 нм – 590 нм после ацидификации продуктов реакции. Увеличение абсорбции прямо пропорционально количеству связанного человеческого резистина в образце пациента, последнее пожжет быть получено интерполяцией референс-кривой, полученной в ходе данной постановки анализа на результатах референс-стандартов известных концентраций резистина человека.

Определяли методом ИФА (ELISA), основанным на принципе сэндвича, для количественного определения инсулина в плазме крови человека.

Нами применялись наборы «DRG» Insulin (Германия). В данном наборе микротитровальные лунки покрыты моноклональными антителами к уникальному антигенному сайту на молекуле инсулина. Аликвота с образцом пациента, содержащим инсулин, инкубируется в покрытой лунке с ферментным конъюгатом, представляющим из себя анти-инсулиновое АТ, конъюгированное с биотином. После инкубации несвязавшийся конъюгат вымывается. Во время второй инкубации ферментный комплекс стрептавидин-пероксидаза связывается с биотинилированным АТ. Количество связавшегося пероксидазного комплекса пропорционально концентрации инсулина в образце. Добавив раствор тетраметилбензидина, измеряют интенсивность образовавшегося окрашивания, пропорциональную концентрации инсулина в образце пациента. Все стандарты, образцы и контроли исследовали в дублях с тем, чтобы обеспечить одинаковые условия исследования.

Концентрацию глюкозы исследовали (ммоль/л) в плазме крови на биохимическом анализаторе.

Метод основан на окислении глюкозоксидазой D-глюкозы до глюкуроновой кислоты с образованием перекиси водорода; последняя под действием пероксидазы реагирует с 4-аминоантипирином и фенолом с образованием соединения красного цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации глюкозы в анализируемом образце.

Индекс инсулинорезистентности рассчитывался по формуле HOMAIR: (инсулин, мкЕД/мл х глюкоза, ммоль/л / 22,5) [62]. Значение больше чем 2,27 рассматривается как наличие инсулинорезистентности [137].

2.3 Методы статистической обработки результатов Статистическая обработка выполнена с использованием пакета статистических программ Statistica 6.1. Для оценки распределения данных использовали критерий Шапиро-Уилка. Для определения достоверности различий использовали критерий U Манна – Уитни, который представляет непараметрическую альтернативу t-критерию для независимых выборок и критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми