WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:     || 2 |

«Молекулярно-генетические механизмы образования и функциональная значимость капсулы Yersinia pestis ...»

-- [ Страница 1 ] --

Министерство здравоохранения Российской Федерации

«Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"

Министерства здравоохранения Российской Федерации»

На правах рукописи

АНИСИМОВ Андрей Павлович

Молекулярно-генетические механизмы образования и

функциональная значимость капсулы Yersinia pestis

03.00.07 - микробиология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Саратов, Оболенск - 1999 2

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ ………………………………………………………………………. ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………………………………………… Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………………… 1.1. УСТОЙЧИВОСТЬ БАКТЕРИЙ К ЗАЩИТНЫМ МЕХАНИЗМАМ МАКРООРГАНИЗМА …………………………………………………………………... 1.1.1. ПЕРСИСТЕНЦИЯ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ В ОРГАНИЗМЕ ХОЗЯИНА ……………………………………………………………………………... 1.1.2. УСТОЙЧИВОСТЬ Y. pestis К ЗАЩИТНЫМ МЕХАНИЗМАМ ХОЗЯИНА …………………………………………………………………………………... 1.2. КАПСУЛЬНЫЙ АНТИГЕН Y. pestis ……………………………………….. 1.2.1. ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ, УСЛОВИЯ БИОСИНТЕЗА, ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА …………………………………………………..………….…………….. 1.2.2. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА ……. 1.2.3. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПРОДУКЦИИ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА ……………………………………………………………………………. 1.2.4. РОЛЬ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА В ПАТОГЕНЕЗЕ …………………. 1.2.5. ВЛИЯНИЕ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА НА БЛОКООБРАЗОВАНИЕ 1.2.6. ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА ……... 1.2.7. ИЗМЕНЧИВОСТЬ СИНТЕЗА КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА Y. pestis

КАК ЧАСТНЫЙ СЛУЧАЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ ……

1.3. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ РОДСТВО КЛАСТЕРА ГЕНОВ fra ОПЕРОНА

И ПРОДУКТОВ ЭТИХ ГЕНОВ С АНАЛОГИЧНЫМИ СТРУКТУРАМИ,

ОБЕСПЕЧИВАЮЩИМИ БИОГЕНЕЗ ПИЛЕВЫХ И НЕПИЛЕВЫХ АДГЕЗИНОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ …………………………………………………….. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ………………………….. Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ……………………………………………………. 2.1. ШТАММЫ МИКРООРГАНИЗМОВ ………………………………………... 2.2. ПЛАЗМИДЫ …………………………………………………………………... 2.3. БАКТЕРИОФАГИ ……………………………………………………………. 2.4. СРЕДЫ И УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ …………………………….. 2.5. ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ ……………………………………………. 2.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКЦИИ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА …………. 2.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСНОВНЫХ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ИССЛЕДОВАННЫХ ШТАММОВ ………………………………………. 2.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ НАСЛЕДОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПЛАЗМИД …………………………………………………………… 2.9. ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ МАНИПУЛЯЦИИ ……………………………….

2.10. КОНСТРУИРОВАНИЕ ИНТЕГРАТИВНЫХ ПЛАЗМИД, ДЕФЕКТНЫХ

ПО ОТДЕЛЬНЫМ ГЕНАМ fra ОПЕРОНА ………………………………………

2.11. НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ ПЛАЗМИДЫ pFra ЗА СЧЕТ ГОМОЛОГИЧНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ С ИНТЕГРАТИВНЫМИ ВЕКТОРАМИ И

СЕЛЕКЦИЯ Fra ИЛИ caf1M МУТАНТОВ Y. pestis …………………………… 2.12. КОНСТРУИРОВАНИЕ ШТАММОВ Y. pestis, ЛИШЕННЫХ ПЛАЗМИДЫ pFra ……………………………………………………………………………..

2.13. ЗАРАЖЕНИЕ ЖИВОТНЫХ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИРУЛЕНТНОСТИ

2.14. "АНИМАЛИЗАЦИЯ" РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ Y. pestis ДЛЯ

СЕЛЕКЦИИ КЛОНОВ, СОХРАНИВШИХ ВИРУЛЕНТНОСТЬ НА УРОВНЕ

2.15. ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННОСТИ НА БИОЛОГИЧЕСКИХ МОДЕЛЯХ

2.16. ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ……………………………….. 2.17. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В СВОБОДНОМ ПОТОКЕ ……………………………. 2.18. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА МИКРОБНЫХ КЛЕТОК ………………………………………………………………... 2.19. ВЫЯВЛЕНИЕ КАПСУЛЫ ………………………………………………….. 2.20. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА ……………. 2.21. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛКОВ … 2.22. ПРОВЕДЕНИЕ ИММУНОБЛОТИНГА ………..………………………….. Глава 3. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ fra ОПЕРОНА …………..

3.1. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИД, ДЕФЕКТНЫХ ПО ОТДЕЛЬНЫМ

3.2. ИССЛЕДОВАНИЕ СПОСОБНОСТИ ИНСЕРЦИОННЫХ И ДЕЛЕЦИОННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ПЛАЗМИДЫ pFS1 ОПРЕДЕЛЯТЬ СИНТЕЗ

КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА И ОБРАЗОВАНИЕ КАПСУЛЫ ………………. Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ УТРАТЫ СПОСОБНОСТИ К СИНТЕЗУ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА НА ВИРУЛЕНТНОСТЬ Y. pestis …………………… 4.1. КОНСТРУИРОВАНИЕ ШТАММОВ Y. pestis, ДЕФЕКТНЫХ ПО ГЕНАМ caf1, caf1M И caf1A ОПЕРОНА fra ……………………………...………………... 4.2. КОНСТРУИРОВАНИЕ ШТАММОВ Y. pestis, ЛИШЕННЫХ ПЛАЗМИДЫ pFra ……………………………………………………………………………..

4.3. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ИЗОГЕННЫХ ШТАММОВ

Y. pestis, ЛИШЕННЫХ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ ……... 4.3.1. ВИРУЛЕНТНОСТЬ ИЗОГЕННЫХ ШТАММОВ Y. pestis, ЛИШЕННЫХ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ, ДЛЯ ИНТАКТНЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ………………………………………………………. 4.3.2. ИЗУЧЕНИЕ СПОСОБНОСТИ ИЗОГЕННЫХ ШТАММОВ Y. pestis,

ЛИШЕННЫХ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ, ПРЕОДОЛЕВАТЬ ИММУНИТЕТ У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ……………………

Глава 5. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ШТАММОВ Y. pestis, ОБРАЗУЮЩИХ АТИПИЧНЫЕ КАПСУЛЫ …………………………………………….…………………….. 5.1. КОНСТРУИРОВАНИЕ pFra+ ШТАММОВ Y. pestis, ДЕФЕКТНЫХ ПО 5.2. ЭЛЕКТРОПОВЕРХНОСТНЫЕ СВОЙСТВА КЛЕТОК ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ, ОТЛИЧАЮЩИХСЯ ПО СПОСОБНОСТИ ОБРАЗОВЫВАТЬ КАПСУЛУ Y. pestis …………………………………………………………………………

5.3. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КЛЕТОК ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ, ОТЛИЧАЮЩИХСЯ ПО СПОСОБНОСТИ ОБРАЗОВЫВАТЬ КАПСУЛУ

5.4. ИЗУЧЕНИЕ ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ ШТАММОВ



Y. pestis, ОПИСАННЫХ КАК Fra И Fra, НО ОБРАЗУЮЩИХ АТИПИЧНЫЕ ВАРИАНТЫ КАПСУЛЫ …………………………………………………………

5.5. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА БЕЛКОВ КАПСУЛЫ ИЗ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ С АТИПИЧНЫМИ КАПСУЛАМИ И ИССЛЕДОВАНИЕ

ЭТИХ ШТАММОВ С ПОМОЩЬЮ ИММУНОЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ ……………………………………...…………………………………….

5.6. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВИРУЛЕНТНОСТИ ШТАММОВ

Y. pestis, ОБЛАДАЮЩИХ АТИПИЧНЫМИ КАПСУЛАМИ, С ИХ ИЗОГЕННЫМИ "КЛАССИЧЕСКИМИ" И БЕСКАПСУЛЬНЫМИ ВАРИАНТАМИ …..

5.7. ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ У ИНТАКТНЫХ И ИММУННЫХ БЕЛЫХ МЫШЕЙ, ЗАРАЖЕННЫХ ВАРИАНТАМИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ, ОТЛИЧАЮЩИМИСЯ ПО СПОСОБНОСТИ СИНТЕЗИРОВАТЬ КАПСУЛЬНЫЙ АНТИГЕН ……………………………………………….

Глава 6. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА С

УЧЕТОМ ДАННЫХ О СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ fra ОПЕРОНА Y. pestis ………………………………………………………

6.1. КОНСТРУИРОВАНИЕ НА ОСНОВЕ ПЛАЗМИДЫ ЧУМНОГО МИКРОБА pPst РЕКОМБИНАНТНЫХ ПЛАЗМИД, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ СТАБИЛЬНОЕ НАСЛЕДОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ КАПСУЛЬНОГО

АНТИГЕНА Y. pestis В РЕЦИПИЕНТНЫХ КЛЕТКАХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ..

6.2. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СКОНСТРУИРОВАННЫХ ШТАММОВ

ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ ПО УРОВНЮ ПРОДУКЦИИ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА ……………………………………………………………………………….. 6.2.1. ПРОДУЦЕНТЫ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА НА МОДЕЛИ Escherichia coli ……………………………………………………………………….. 6.2.2. ПРОДУЦЕНТЫ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА НА МОДЕЛИ Salmonella spp. ……………………………………………………………………………. 6.2.3. ПРОДУЦЕНТЫ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА НА ОСНОВЕ Y. pestis.. 6.2.4. ПРОДУЦЕНТЫ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА НА ОСНОВЕ Yersinia enterocolitica ………………………………………………………………………...

6.2.5. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ПРЕПАРАТОВ РЕКОМБИНАНТНОГО

КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА И КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА ИЗ ШТАММА Y. pestis EV ЛИНИИ НИИЭГ ………………………………………………… 6.3. ОБСУЖДЕНИЕ ………………………………………………………………..

Глава 7. ИЗУЧЕНИЕ ПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ

ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ - СУПЕРПРОДУЦЕНТОВ КАПСУЛЬНОГО

АНТИГЕНА Y. pestis ……………………..………………………………………..

7.1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ВАКЦИННЫЙ ШТАММ НА ОСНОВЕ

7.2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ВАКЦИННЫЙ ШТАММ НА МОДЕЛИ

Y. enterocolitica …………………………………………………………………….. 7.3. ОБСУЖДЕНИЕ ……………………………………………………………….. Глава 8. КЛАССИФИКАЦИЯ ФАКТОРОВ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ ПЕРСИСТЕНЦИЮ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ В ПРИРОДЕ ………………………………...….. ЗАКЛЮЧЕНИЕ …………………………………………………………………………….. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ………………………………………

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И

ТЕРМИНОВ

Авидность - "функциональная аффинность" - суммарная энергия взаимодействия антигенсвязывающих центров антитела с антигенными детерминантами поливалентного антигена АППО - антиген "панкреатического перевара оболочки" (pancreatic envelope digest antigen) [445] Атипичные кап- - в контексте настоящего исследования термин “атипичные” капсулы иссулы пользуется для обозначения совокупности морфологических структур идентичных по данным световой или электронной микроскопии "классической" капсуле Y. pestis, образованной из агрегатов Caf1, но отличающихся от нее по данным иммунологических тестов Аффинность - "внутренняя аффинность" - сумма межмолекулярных сил притяжения и отталкивания, возникающих при взаимодействии антигенсвязывающего центра антитела и гомологичной антигенной детерминанты Ашер - "usher" - белок, обеспечивающий транслокацию из периплазмы через внешнюю мембрану комплекса периплазматический шаперонструктурная субъединица пилевого адгезина и закрепление пилей адгезии ВНИИ ПМ - Всесоюзный НИИ прикладной микробиологии (Государственный НИИ (ГосНИИПМ, прикладной микробиологии, Государственный научный центр прикладГНЦ ПМ) ной микробиологии) ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа ГИСК - Государственный институт стандартизации и контроля медицинских ГосКПБ - Государственная коллекция патогенных бактерий ИИ - индекс иммунитета (индекс резистентности) ИФА - иммуноферментный анализ Капсульный ан- - компоненты капсулы, вызывающие образование антител тиген КОЕ (cfu) - колониеобразующая единица (colony forming unit) мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота ПААГ - полиакриламидный гель Персистенция - в контексте настоящего исследования под этим термином подразумевается способность бактерий сохранять свою жизнеспособность в организмах хозяина, переносчика и окружающей среде пн (bp) - пара нуклеотидов (base pair) ПЦР - полимеразная цепная реакция РДИД - реакция двойной иммунодиффузии (диффузионной преципитации) в РНАт - реакция нейтрализации антител РНГА - реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации тпн (kb) - тысяча пар нуклеотидов (kilobase) Фолдинг - "folding" – сворачивание белков во вторичную и третичную структуры Шаперон - "chaperon" – "белок-помошник", обеспечивающий фолдинг другого белка в нативную конформацию, препятствующий протеолизу последнего и ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия ЭКП - электрокинетический ( - дзета) потенциал Эпитоп - антигенная детерминанта ЭФСП - электрофорез в свободном потоке - ген, определяющий устойчивость к ампициллину amp ApR (S) - устойчивость (или чувствительность) к ампициллину Caf1 (YcaF) - белковая субъединица капсульного антигена caf1 (ycaF) - структурный ген, кодирующий субъединицу капсульного антигена (capsular antigen fraction I; Yersinia pestis capsular antigen fraction I) - ген, кодирующий белок "usher" (привратник) капсульного антигена (capcaf1A caf1M (ycaA) - ген, кодирующий периплазматический шаперон капсульного антигена (capsular antigen fraction I mediator; Yersinia pestis capsular antigen protein - ген-регулятор fra оперона (capsular antigen fraction I regulator) caf1R - ген, кодирующий хлорамфениколацетилтрансферазу cat CmR (S) - устойчивость (или чувствительность) к хлорамфениколу Dcl (LD100) - абсолютно летальная доза (dosis certa letalis) Dlm - минимальная летальная доза (dosis letalis minima) FI (F1, ФI, Ф1) - капсульный антиген - "фракция I" (fraction I) по E.E. Baker [381, 382] FI-1, FI-2 и т.д. - введенное нами обозначение различных серовариантов атипичных капсул fra (f1, caf) - оперон, обеспечивающий образование капсулы Y. pestis, сформированной из субъединиц Caf Fra - отсутствие способности к синтезу капсульного антигена "фракция I" и Fra - продукцию капсульного антигена выявляют только в препаратах разрушенных клеток, что связывают с нарушением его секреции, т.к. в процессе обработки ультразвуком или ацетоном и последующего высушивания внутриклеточные антигены выходят из разрушенных бактерий и становятся доступными для антител [271, 400] Fra+ - способность к синтезу капсульного антигена "фракция I" и образованию - аккумулирование гемина (hemin storage) или пигментсорбция Hms (Psb) ImD50 - доза вакцинного штамма, предохраняющая от гибели 50 % экспериментальных животных imm (pim) - ген, определяющий иммунность к пестицину KmR (S) - устойчивость (или чувствительность) к канамицину Lcr - (low calcium response) потребность в ионах кальция для роста in vitro Термин "Psb" нельзя признать удачным для обозначения пигментсорбции, т.к. в английском словосочетании "pigment sorption" букве кириллицы "б" соответствует буква латиницы "p" а не "b".

Согласно Международной системе СИ молекулярная масса измеряется в атомных единицах массы (а. е. м.);

1 а. е. м. 1,6605710-27 кг. В биохимии молекулярную массу макромолекул принято выражать в дальтонах;

1 дальтон = 1 а. е. м.

этой же температуре V антиген и белки внешних мембран lcrV LD50 - доза летальная для 50 % животных (dosis letalis 50) - область, ответственная за способность плазмиды к переносу конъюгаmob тивными плазмидами (mobilization) ORF4' - "ашер" белок pH6 антигена - область, ответственная за начало репликации (origin) ori pCad (pLcr) - 45-47 MDa плазмида, определяющая температурную зависимость роста иерсиний от ионов кальция, синтез V антигена и белков внешней мембраны pFra (pYT) - 60-65 MDa плазмида, кодирующая синтез капсульного антигена фракция I и "мышиного" токсина pFra/pFBK7 - гибридная плазмида, полученная в результате рекомбинации интактной плазмиды pFra с интегративным вектором pFBK - сочетанное проявление фенотипов Hms и PstS Pgm pH6 (4, I) - pH6 антиген, образующий пили адгезии - структурный ген активатора плазминогена pla Pla - активатор плазминогена, определяющий фибринолитическую и плазмокоагулазную активности возбудителя чумы pPst - 6 MDa плазмида, кодирующая синтез пестицина, активатора плазминогена и определяющая иммунность к пестицину - структурный ген антигена pH6 (pH Six antigen) psaA - ген, кодирующий периплазматический шаперон антигена pH psaB psaE - структурный ген, кодирующий синтез пестицина pst PstR (S) - резистентность (чувствительность) к пестицину TcR (S) - устойчивость (или чувствительность) к тетрациклину - ген, определяющий устойчивость к тетрациклину tet Tox (FII, Ymt) - признак синтеза "мышиного" токсина ("fraction II", Yersinia murine toxin) Yops - белки внешних мембран иерсиний (Yersinia outer membrane proteins)

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Сведения о механизмах реализации патогенности микроорганизмов и, в первую очередь, факторах, определяющих способность приживаться в тканях организма хозяина, а также размножаться в них, вызывая патологические изменения, лежат в основе разработки эффективных методов профилактики и лечения инфекционных заболеваний. Совокупность генотипических особенностей микроорганизмов, детерминирующих патогенность, фенотипически проявляется вирулентностью. В настоящее время полидетерминированность вирулентности патогенных микроорганизмов и, в частности, возбудителя чумы - Y. pestis является общепризнанной. При этом каждая из биомолекул (факторов патогенности) может обладать несколькими активностями, направленными на преодоление различных звеньев системы защиты макроорганизма. Реализация патогенных свойств Y. pestis в организме восприимчивого хозяина требует присутствия у возбудителя чумы целого набора факторов патогенности различной функциональной направленности и систем регуляции, обеспечивающих их координированную экспрессию. Абсолютизирование роли любого отдельно взятого из указанных факторов - некорректно [236, 395, 398, 399]. Однако детальный анализ каждого из этих факторов лежит в основе системного подхода при изучении патогенности и вирулентности Y. pestis.

Один из "классических" факторов патогенности Y. pestis - капсульный антиген FI обладает целым рядом свойств, традиционно связываемых со способностью бактерий к персистенции [58, 434, 435]. Капсула, образованная из FI [406, 407], защищает клетки Y. pestis от захвата интактными нейтрофилами хозяина [399, 403]. Это согласуется с общепризнанной ролью бактериальных капсул, препятствующих поглощению бактерий фагоцитарными клетками макроорганизма [582]. С одной стороны, капсулы экранируют пептидогликан или ЛПС бактериальной клетки, препятствуя инициации альтернативного пути активации комплемента [512], с другой стороны, повышение устойчивости к фагоцитозу обычно коррелирует с увеличением отрицательного заряда микробной клетки, способствующего электростатическому отталкиванию от одноименно заряженных фагоцитов [582]. Но FI истощает систему комплемента за счет избирательной активации C`2 и C` компонентов системы комплемента и таким образом препятствует комплементопосредованной опсонизации бактерий [599], а синтез капсулы, сопровождался снижением отрицательного заряда клеточной поверхности [132, 184]. Более того, отсутствие FI у некоторых штаммов Y. pestis обусловливало снижение эффективности захвата бактерий макрофагами морских свинок, но не белых мышей [96]. В то же время известно, что размножение клеток Y. pestis внутри макрофагов является обязательным этапом патогенеза чумы [403], а вирулентность чумного микроба коррелирует не столько с устойчивостью к захвату фагоцитами, сколько со способностью выживать и размножаться в фаголизосомах фагоцитарных клеток за счет подавления антибактериальных функций фагоцитов [66, 183, 194, 195, 354, 404]. Показано, что FI способна образовывать в двухслойных фосфолипидных мембранах поры, проницаемые для воды [544]. Высказано предположение, что это приводит к нарушению осмотической регуляции и последующей гибели клетки-мишени теплокровного животного. Показано, что высокомолекулярный капсульный антиген обладал гемагглютинирующей активностью за счет способности специфически связываться с Dгалактозамином-HCl и глюкуроновой кислотой [300], что может объяснить гипотетическое участие капсульного антигена в образовании клейких скоплений микробов и образовании блока в преджелудке блохи [480].

Интересно, что в подавляющем большинстве исследований бескапсульные варианты, в отличие от полноценных штаммов, обладали избирательной вирулентностью, что проявлялось в резком снижении их вирулентности в отношении морских свинок, но не белых мышей [201, 266, 290-292, 329, 398-400, 574, 589, 590]. В Или-Каратальском междуречье выделены Fra штаммы, авирулентные для белых мышей и морских свинок, слабо вирулентные для краснохвостых и гребенщиковых, но высоко вирулентные для больших песчанок [191]. В то же время описаны Fra штаммы 358/12 [6] и И-2422 [198], обладающие универсальной вирулентностью для лабораторных животных. Таким образом, вопрос о корреляции Fra+ признака с вирулентностью Y. pestis требует дальнейшего изучения.

О.А. Проценко с соавт. [271] показали, что гены, ответственные за синтез FI, локализованы на плазмиде pFra. Fra оперон, кодирующий капсульный антиген, был впервые клонирован из EcoRI банка "больших" плазмид Y. pestis А.В. Карлышевым, В.М.

Красильниковой и П.А. Черепановым в 1984 году (цитируется по П.А. Черепанову с соавт.

[346]). Секвенирование и определение структурно-функциональной организации fra локуса, клонированного в составе этой плазмиды, независимо друг от друга проводилось группами А.В. Карлышева [442, 443, 476-478] и П.А. Черепанова [350] и не дало однозначных результатов. До настоящего времени нет единого мнения о функциях отдельных генов fra оперона в секреции структурной субъединицы на поверхность клетки и образовании капсулы чумного микроба [91, 186, 350, 442, 443, 476-478, 567]. Относительно недавно показано, что в рекомбинантных клетках Escherichia coli, дефектных по гену caf1M оперона fra, происходит образование капсульного антигена, выявляемого с помощью коммерческих иммунодиагностикумов в реакции иммунодиффузии в геле по O. uchterlony и РНАт, но не в РНГА [350]. Большинство исследователей считает, что в Caf1M энтеробактериях происходит лишь нарушение секреции капсульного антигена и не происходит образования капсулы [198, 442, 476, 527, 534].

Классическая иммунодиагностика чумы построена на выявлении капсульного антигена FI или анти-FI-антител [120, 243, 288, 289, 380, 397, 527]. Капсульный антиген Y. pestis является важнейшим составным компонентом подавляющего большинства Южное Прибалхашье.

современных коммерческих и экспериментальных чумных вакцин. Показана его ведущая роль в создании напряженного иммунитета у белых мышей, морских свинок, приматов и человека [61, 89, 110, 341, 368, 382, 492, 507, 508, 567, 597 и др.]. В настоящее время для получения FI Y. pestis - основного компонента чумных диагностических и вакцинных препаратов, используют вакцинный штамм чумного микроба EV линии НИИЭГ. Этот штамм обладает повышенной субстратной специфичностью и при этом невысокой скоростью роста при оптимальной температуре для синтеза капсульного антигена - 37 оС. Методами генной инженерии на основе подбора оптимальных реципиентных штаммов получены продуценты капсульного антигена на модели E. coli XL1-blue [567], K802 [165, 268] и HB101 [99, 101, 102, 163], Salmonella minnesota R595 [101, 102]. Вышеперечисленные гибридные штаммы, хотя и продуцировали капсульный антиген в достаточных количествах, однако нестабильно наследовали плазмидные репликоны, несущие в своем составе fra оперон чумного микроба, что, в свою очередь, неблагоприятно влияло на протективность этих рекомбинантных штаммов и выявлялось при испытании их на биологических моделях. Все вышеперечисленное создает значительные ограничения для применения указанных штаммов в технологических процессах. Ряд исследователей столкнулся и с затруднением экспрессии fra оперона, клонированного в клетках E. coli [91, 111, 152, 358]. Высказано предположение, что капсульный антиген может оказывать токсический эффект на клетки штаммапродуцента, приводящий к накоплению в популяции микроорганизмов с дефектами fra оперона, вызванными встройками в его структуру IS-элементов [111].

Исследование молекулярно-генетических механизмов образования капсулы возбудителя чумы с привлечением комплекса методов бактериологии, генной инженерии, биохимии, биофизики, иммунологии и электронной микроскопии позволит получить новые сведения о сборке бактериальных органелл, роли fra оперона в целом и отдельных его генов в патогенезе и иммуногенезе чумы. Это создаст основу для разработки методологии получения стабильных (технологичных) штаммов-продуцентов с максимальным уровнем синтеза и секреции "классического" капсульного антигена, необходимую для конструирования экспериментальных вакцинных штаммов нового поколения и суперпродуцентов капсульного антигена, способных осуществлять температуронезависимый синтез и секрецию конечного продукта на "небогатых" питательных средах, что позволит значительно упростить и, соответственно, удешевить производство капсульного антигена.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - получение новых сведений о молекулярно-генетических механизмах образования капсулы Y. pestis, ее функциональной значимости в патогенезе и иммуногенезе чумы, а также механизмах изменчивости антигенной специфичности капсулы возбудителя чумы; конструирование стабильных штаммов-суперпродуцентов капсульного антигена.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Разработать новые и усовершенствовать имеющиеся методы генетического анализа факторов патогенности и иммуногенности на модели fra оперона Y. pestis (методология направленного "выключения" определенных генов fra оперона, селекция рекомбинантных клонов и стабилизация генетической информации в клетках Y. pestis).

2. Создать коллекции изогенных штаммов энтеробактерий, отличающихся способностью к образованию капсулы, и на их основе получить эффективную систему для комплексной сравнительной оценки свойств полученных штаммов энтеробактерий.

3. Провести молекулярно-генетический анализ fra оперона и определить значение этого локуса для реализации патогенности Y. pestis, а также роль его отдельных генов в образовании и изменчивости антигенной специфичности капсулы.

4. Разработать, с учетом полученных данных о молекулярно-генетических механизмах суперпродуцентов "классического" капсульного антигена и на ее основе сконструировать экспериментальные вакцинные штаммы.

5. Провести анализ и обобщение собственных экспериментальных исследований и обеспечивающих его персистенцию в природе.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Приоритет в конструировании рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей капсульный белок - антиген FI чумного микроба, и штамма бактерий E. coli - продуцента белка - антигена FI чумного микроба защищен авторским свидетельством (А.с. № 327782).

Впервые показано, что на модели белых мышей рекомбинантный капсульный антиген, синтезируемый в клетках E. coli, обладает выраженной протективной активностью в отношении вирулентных штаммов Y. pestis "дикого" типа.

Впервые с помощью комплекса иммунохимических, биофизических методов и световой микроскопии получены экспериментальные доказательства образования капсулы, энтеробактерий, несущих оперон fra, дефектный по генам caf1R или caf1M. Выявлено, что перемещение субъединиц капсульного антигена Caf1 на поверхность микробной клетки может проходить и без участия шаперона Caf1M. Впервые показано, что "серологический" вариант капсульного антигена в Caf1M бактериях определяется особенностями клеточной поверхности штамма-продуцента и, в первую очередь, формой его ЛПС. Определены минимальные размеры фрагментов плазмиды pFra, необходимые для полноценной экспрессии локуса fra в составе гибридных плазмид в клетках E. coli, Y. pestis, Y. enterocolitica и Salmonella spp.

Впервые доказано, что направленное "выключение" генов, ответственных за синтез капсульного антигена FI, не приводит к снижению вирулентности для белых мышей и преимуществами не только в организмах белых мышей, предварительно иммунизированных штаммами "дикого" типа или "классическим" капсульным антигеном, но и в организмах морских свинок, переболевших экспериментальной чумой, вызванной штаммами "дикого" типа, но не в организмах морских свинок, однократно вакцинированных живой чумной вакциной.

Приоритетные данные получены в результате изучения вирулентных штаммов Y. pestis, образующих атипичные капсулы. На модели белых мышей показано, что указанные атипичные штаммы преодолевают иммунитет, индуцированный вакцинным штаммом EV.

Препараты капсульных белков или "убитая" вакцина, приготовленные на основе этих штаммов, практически не защищают иммунизированных животных от последующего заражения штаммом, на основе которого были приготовлены эти препараты. У интактных и иммунных белых мышей, павших от экспериментальной чумы, вызванной штаммами с атипичными капсулами, патоморфологические изменения внутренних органов принципиально не отличались от таковых у животных, погибших в результате их заражения исходным штаммом "дикого" типа.

Впервые показано влияние экспрессии интактного или дефектного по гену caf1M оперона fra возбудителя чумы на электрокинетический потенциал клеток чумного микроба и других энтеробактерий. Выявлено что в клетках caf1M бактерий изменение величины потенциала связано с формой ЛПС штамма-продуцента.

Впервые сконструированы продуценты капсульного антигена на основе Yersinia spp., обладающие по данным РНГА в 103-104 раз большей серологической активностью, чем природные штаммы Y. pestis. Установлено, что в регуляции синтеза капсульного антигена принимают участие неидентифицированные пока хромосомные гены иерсиний, отсутствующие у E. coli. Увеличение копийности fra оперона в клетках Yersinia spp., но не E. coli, приводит к температуронезависимому синтезу капсульного антигена.

Достоверно показана принципиальная возможность повышения протективности живых чумных вакцин за счет суперпродукции основного иммуногена Y. pestis - FI.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Сформулирована гипотеза, объясняющая механизмы устойчивости Fra- штаммов Y. pestis к ряду антибиотиков in vivo. Учитывая, что возбудитель чумы является факультативным внутриклеточным паразитом, а капсульный антиген способен встраиваться в двухслойные фосфолипидные мембраны, образуя в них поры, проницаемые для воды, a priori высказано предположение, что in vivo индуцированные капсульным антигеном "водяные" поры могут быть основной причиной проникновения антибиотиков в макрофаг и его фаголизосомы, обеспечивающей чувствительность к антибиотикам клеток Y. pestis "дикого" типа.

На основании анализа доступных литературных сведений и данных собственных экспериментов предложена классификация факторов Y. pestis, обеспечивающих его персистенцию в природе.

Определены перспективные направления изучения факторов, определяющих вирулентность, блокообразующую активность и эпидемиологическую значимость различных экотипов возбудителя чумы на основе разработанных методических подходов и созданных коллекций изогенных штаммов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ДИССЕРТАЦИИ.

Впервые разработана простая и надежная методология направленного конструирования неревертирующих Fra, caf1M или pFra мутантов Y. pestis, сочетающая локализованный мутагенез in vitro, гомологичную рекомбинацию in vivo, селекцию рекомбинантных клеток в организме иммунного животного и позволяющая получать достоверные данные о роли признака капсулообразования в проявлении патогенных и иммуногенных свойств возбудителя чумы. Разработанный способ локализованного мутагенеза Y. pestis, позволяющий направленно "выключать" гены факторов патогенности, защищен двумя авторскими свидетельствами (А.с. № 293939 и А.с. № 1754779).

Оптимизированы способы стабилизации наследования и экспрессии генетической информации в клетках Y. pestis и подобраны векторы, обеспечивающие стабильную суперпродукцию капсульного антигена в клетках энтеробактерий. Разработана методика прямой электрофоретической селекции трансформантов, содержащих последовательности ДНК, кодирующие поверхностные структуры бактерий. На основе аттенуированных штаммов иерсиний сконструированы суперпродуценты, обеспечивающие эффективную секрецию капсульного антигена в культуральную среду при температурах (25±3) оС, соответствующих минимальным питательным потребностям Y. pestis. Штаммы Y. pestis КМ277 (EV11MpFSK3) и Y. enterocolitica КМ33pFSK3 способны продуцировать капсульный антиген на голодных средах в количествах, равных или превышающих уровень продукции вакцинного штамма EV, выращиваемого на богатых питательных средах.

Сконструированный штамм Y. pestis KM276 (KM217pFSK3) с синтезом основного протективного антигена возбудителя чумы - фракции I, повышенным относительно уровня продукции других - "балластных" антигенов, может служить основой для разработки новой вакцины живой чумной.

В ГосКПБ "Микроб" депонирована коллекция, состоящая из 2 охраноспособных и авторских штаммов - эффективных продуцентов белковых продуктов fra оперона и производных природных изолятов Y. pestis, представляемых как авторские в связи с их способностью образовывать атипичные варианты капсулы.

рекомендуются для оценки эффективности коммерческих и экспериментальных чумных вакцин в отношении атипичных вариантов возбудителя чумы.

Результаты проведенных исследований послужили основой или были учтены при составлении ниже перечисленных документов:

- Методика лабораторная "Стерилизация F и I антигенов, выделяемых из вакцинных штаммов чумного микроба". Оболенск, 1990 (учрежденческий уровень внедрения).

- Методика лабораторная "Криотрансформация вакцинных штаммов чумного микроба плазмидными ДНК". Оболенск, 1990 (учрежденческий уровень внедрения).

- Пособие для научных сотрудников "Применение электрофореза в свободном потоке для отбора рекомбинантных бактериальных клеток, содержащих последовательности ДНК плазмиды pFra Y. pestis, экспрессирующие генетические детерминанты поверхностных биополимеров". Саратов, 1998 (учрежденческий уровень внедрения).

- Инструкция по изготовлению и контролю тест-заражающих культур вирулентных штаммов возбудителя чумы сухих. (Инструкция). - Москва, Саратов, Киров, (федеральный уровень внедрения).

- Методические указания "Основные критерии оценки вакцинных штаммов чумного микроба". Москва, Саратов, Киров, 1999 (федеральный уровень внедрения).

Разработанные методические приемы, сконструированные плазмиды и штаммы в настоящее время применяются в микробиологических, генетических, молекулярнобиологических, иммунологических и других исследованиях ряда лабораторий ГНЦ прикладной микробиологии (Оболенск, Московская обл.), АООТ "Институт инженерной иммунологии" РАО "Биопрепарат" (Любучаны, Московская обл.), РосНИПЧИ "Микроб", ГИСК им. Л.А. Тарасевича и НИИ микробиологии МО РФ (Киров). Список документов по внедрению научных достижений в практику приведен в конце автореферата.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Разработан комплекс методических приемов, позволивший создать уникальную коллекцию генетически маркированных штаммов, которые являются основой для проведения микробиологического, биофизического, биохимического и генетического изучения роли признака капсулообразования в патогенезе и иммуногенезе чумы, эпидемиологической значимости штаммов Y. pestis, отличающихся по способности образовывать капсулу.

2. Избирательное "выключение" синтеза капсульного антигена не приводит к снижению вирулентности мутантных штаммов Y. pestis в отношении белых мышей и морских свинок. Fra бактерии Y. pestis имеют селективные преимущества в организме морских свинок, выживших после заражения штаммами "дикого" типа.

3. Капсула Y. pestis представляет собой сложную надмолекулярную структуру, состоящую из целого ряда белков и ЛПС. Основным компонентом "классической" капсулы штаммов возбудителя чумы "дикого" типа, выращиваемых при температуре 37 оС и pH 7,2 in vitro, является капсульный антиген FI. При закислении среды культивирования при температуре 37 оС in vitro образуется капсула, состоящая в основном из антигена pH6. В caf1M штаммах при температуре 37 оС in vitro образуется атипичная капсула, в состав которой входит целый спектр белков, большая часть которых не идентифицирована.

Биофизические, серологические и протективные свойства различных вариантов капсулы определяются составляющими их компонентами.

4. Генно-инженерная конструкция pFSK3, несущая в своем составе fra оперон чумного микроба, стабильно наследуется в штаммах E. coli, Y. pestis и Y. enterocolitica без селективного давления, обеспечивая экспрессию кластера генов fra. Штаммы Y. pestis и Y. enterocolitica, несущие рекомбинантную плазмиду pFSK3 и выращенные на полноценных питательных средах проявляют в гемагглютинационных реакциях на три-четыре порядка большую серологическую активность, чем вакцинный штамм EV. Штаммы Y. pestis КМ (EV11MpFSK3) и Y. enterocolitica КМ33pFSK3, обладающие гибридной плазмидой pFSK3, продуцируют на голодных питательных средах капсульный антиген в количествах равных или превышающих уровень продукции вакцинного штамма EV на полноценных питательных средах.

5. Экспериментальный генно-инженерный чумной штамм KM276 (КМ217pFSK3), обеспечивает за счет суперпродукции капсульного антигена, обладающего повышенной серологической активностью, протективность в 27 раз большую, чем маточная культура коммерческой вакцины живой чумной (штамм EV линии НИИЭГ).

6. Классификация факторов Y. pestis, обеспечивающих его персистенцию в природе.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

конференциях ГосНИИ ПМ (Оболенск, 1986, 1987, 1989, 1990); итоговых научных конференциях РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов, 1994, 1995); межведомственной научной конференции "Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний" (Киров, 1991); XIV научно-практической конференции ГосНИИ ПМ "Новые технологии и биосистемы. Достижения и перспективы" (Оболенск, 1991); IV Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Нижний Новгород, 1991); Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" (Волгоград, 1992); Российской научной конференции "Иммунология и межгосударственной научной конференции, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы "Профилактика и меры борьбы с чумой" (Алматы, 1994); I съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994); межгосударственной научнопрактической конференции, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы "Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний" (Ставрополь, 1994); международной конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс" (Саратов, 1996); International Symposium on Optical Science, Engineering, and Instrumentation.

SPIE's Annual Meeting (Denver, Colorado, USA, 1996); VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997); научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997); совместном Американо-Российском семинаре в USAMRIID (Fort Detrick, USA, 1997); 7th International Congress on Yersinia (Nijmegen, the Netherlands, 1998); XVII Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 1998); 4th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology (Пущино, 1998); юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 1998); научной конференции учреждений по борьбе и изучению природно-очаговых инфекций Министерства Здоровья и Социальной Защиты (Улан-Батор, Монголия, 1999).

Диссертация обсуждена и одобрена на межлабораторной научной конференции РосНИПЧИ "Микроб" 10 декабря 1999 г. протокол № 96.

ПУБЛИКАЦИИ.

Основное содержание работы

отражено в 75 научных публикациях, в том числе в авторских свидетельствах. Список публикаций приведен в автореферате.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

Работа состоит из введения; 1 главы обзора литературы; 7 глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований, экспериментальную часть, анализ факторов возбудителя чумы, обеспечивающих его персистенцию в природе, по литературным данным и собственным наблюдениям;

заключения; выводов; списка литературы, включающего 617 цитируемых работ. Общий объем диссертации составляет 325 страниц. Текст иллюстрирован 23 таблицами и рисунками.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. УСТОЙЧИВОСТЬ БАКТЕРИЙ К ЗАЩИТНЫМ МЕХАНИЗМАМ МАКРООРГАНИЗМА

1.1.1. ПЕРСИСТЕНЦИЯ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ В ОРГАНИЗМЕ ХОЗЯИНА

Способность патогенных микроорганизмов проникать в свою экологическую нишу (организм хозяина) и переживать в ней - одна из наиболее интересных и интенсивно разрабатываемых проблем современной микробиологии. В последнее время все чаще появляются публикации по изучению персистентных характеристик микроорганизмов, направленных на преодоление защиты хозяина (антилизоцимная, антикомплементарная, антиглобулиновая, антигистонная и другие активности). На обширной эмпирической основе известных способов переживания патогенных бактерий в макроорганизме в последнее десятилетие был предпринят ряд попыток разработки классификации механизмов персистенции бактерий [58, 252, 434, 435].

Персистирование патогенных микробов в макроорганизме принято рассматривать как стратегию выживания вида. Но любая стратегия порождает разнообразие тактики, и смена экологической ниши бактериальной клеткой с ее переходом от сапрофитизма к паразитизму, при котором организм хозяина используется в качестве источника питания и среды обитания, причем микро- и макроорганизмы находятся в антагонистических взаимоотношениях, будет сопровождаться появлением новых биологических характеристик у бактерий, облегчающих адаптацию патогена к новым условиям существования. При этом следует иметь в виду, прежде всего, те структурно-функциональные перестройки у бактерий, которые они приобрели в процессе эволюции и постоянной адаптации к меняющейся экологической среде [58].

Принято считать, что клеточная стенка бактерий, в частности пептидогликан, должен быть экранирован, либо "сброшен", чтобы не индуцировать иммунный ответ хозяина. Это связано с тем, что пептидогликан бактерий - уникальное образование клетки, формирующее ее жесткий каркас, является отличной иммунологической мишенью в организме, так как присутствует в прокариотических клетках и отсутствует у эукариот. Следует отметить, что у грамотрицательных бактерий пептидогликан "прикрыт" наружной мембраной, в верхнем слое которой находится такой сложный амфипатический биополимер, как ЛПС, который, как и пептидогликан, обладает выраженной способностью индуцировать альтернативный путь активации комплемента [107, 136, 137].

Поэтому, чтобы удержаться в организме хозяина, бактериальной клетке необходимо осуществить защиту пептидогликана и (или) ЛПС либо за счет дополнительных экранирующих структур, либо путем продукции различных секретируемых факторов, направленных против механизмов защиты организма, либо посредством "антигенной мимикрии" - схожести антигенных детерминант паразита и хозяина. Наконец, возможна просто утрата бактерией этих компонентов клеточной стенки в условиях образования ею "бесклеточных" (дефектных) L-форм. Исходя из этих посылок О.В. Бухарин [58] предложил следующую классификацию механизмов персистенции патогенных бактерий: 1) факторы, "экранирующие" клеточную стенку бактерий;

2) "антигенная мимикрия" - наличие общих гетерогенных антигенов в системе "паразит-хозяин";

3) секретируемые факторы бактериальной природы, инактивирующие защитные механизмы хозяина;

4) образование форм с отсутствием (дефектом) клеточной стенки бактерий: Lформы, микоплазмы.

Попытки классификации свойств, определяющих отличия патогенных бактерий от сапрофитов предпринимались и ранее. Так, по мнению В.Г. Петровской [262], "наиболее четким" разграничением "трех основных атрибутов патогенности (вирулентности)" являются "инфективность, инвазивность, или инвазионность, и токсигенность, или токсичность". И.Н. Моргунов еще в 1964 г. [240] отмечал, что "до недавнего сравнительно времени вирулентность микробов объясняли наличием у них инвазивности, агрессивности и инфекционности. Они отражали свойство проникать в организм, подавлять неспецифические механизмы защиты и развиваться (размножаться) в нем. Но, в сущности, эти понятия ничего не разъясняли".

Очевидно, что этот перечень необходимо дополнить 5) факторами, обеспечивающими переживание и даже размножение патогенных бактерий внутри эукариотических клеток, т.к. внутриклеточная локализация препятствует контакту микробов с клеточными элементами и гуморальными факторами иммунной системы хозяина [511].

Нам кажется целесообразным также включить в эту классификацию еще несколько пунктов из обзорных статей B.B. Finlay & S. Falkow [434, 435]:

6) фимбрии или пили адгезии, обеспечивающие присоединение патогенов к клеткам хозяина;

7) факторы, обеспечивающие инвазивные свойства патогенных бактерий;

8) антигенная изменчивость бактерий, препятствующая эффективной работе иммунной системы.

Правомочно дополнить рассматриваемую классификацию еще двумя пунктами:

9) факторы, обеспечивающие антагонистическую активность бактерий в конкуренции за экологическую нишу [192];

10) факторы, обеспечивающие питательные потребности микроорганизма [222, 263].

1.1.2. УСТОЙЧИВОСТЬ Y. pestis К ЗАЩИТНЫМ МЕХАНИЗМАМ ХОЗЯИНА Возбудителем чумы - острой инфекционной болезни, характеризующейся явлениями тяжелой общей интоксикации, воспалительными процессами в лимфатических узлах, легких и других органах, - является Yersinia pestis - грамотрицательная бактерия, впервые описанная A. Yersin [605, 606].

В соответствии с описанной в предыдущем разделе классификацией кратко рассмотрим факторы, обеспечивающие Y. pestis возможность переживания в организме теплокровного хозяина.

1) Клетки Y. pestis "дикого" типа при температуре 37 оС способны формировать капсулу [550, 561, 562], образованную капсульным антигеном FI [406, 407].

Плазмокоагулирующая способность может являться фактором, который в какой-то мере экранирует клеточную стенку бактерии за счет образования вокруг микробной клетки фибринового сгустка [118, 119];

pH6 антиген (I антиген, антиген 4, PsaA или пили адгезии) связывает 500-kDa аполипопротеин B100 из неиммунной сыворотки крови человека и животных [410] и реагирует с субъединицами Fc иммуноглобулинов человека подклассов G1, G2 и G3 [362, 607], что может приводить к образованию капсулоподобного слоя, покрывающего поверхность бактерии.

Передача кодирующего его образование оперона psa в клетки кишечной палочки придавала последним способность к образованию капсулы, состоящей из антигена pH6 [347]. По данным иммуноэлектронной микроскопии клетки возбудителя чумы, выращенные при температуре 37 оС и кислых значениях pH среды, были покрыты капсулоподобной полимерной структурой подобной капсуле, образованной капсульным антигеном FI [411].

Наличие на поверхности клеток возбудителя чумы белка, образующего S слой (от surface - поверхность), коррелирует с устойчивостью бактерий к переваривающей активности фагоцитарных клеток [376].

2) Выявлено антигенное сходство у клеток Y. pestis с эритроцитами [53, 95, 145], тканями сердца человека [95], тканями селезенки и печени морской свинки [145]. Показано, что 45-kDa и, по-видимому, 14-kDa белки, кодируемые плазмидой pCad Y. pestis, являются перекрестно-реагирующими антигенами, общими для возбудителя чумы и клеток печени и селезенки человека [77]. В тканях грызунов с различной естественной резистентностью к чуме в ряде иммунных реакций выявлен различный спектр антигенов мимикрии с Y. pestis [45].

3) Клетки Y. pestis секретируют во внешнюю среду целый ряд факторов, противодействующих защитным механизмам хозяина:

а) капсульный или оболочечный антиген "фракция I" (подробно рассмотрен в разделе 1.1.3);

б) "мышиный" токсин ("фракция II") оказывает летальное действие на мышей и крыс, но не на других хозяев [397]; угнетает окислительно-восстановительные процессы в митохондриях сердца и печени чувствительных животных [399], функционируя, как адренэргический антагонист [394]; подавляет окислительный взрыв перитонеальных лейкоцитов белых мышей и приводит к снижению эффективности фосфорилирования высокомолекулярных белков в этих эукариотических клетках [33]; обладает фосфолипазной [238, 273] фосфотазной, аутокиназной, фосфодиэстеразной, дезаминазной и NAD-гликогидразной активностями [238]; его суперантигенные свойства проявляются при низких (106 г) концентрациях - в условиях резкого снижения синтеза при температуре 37 оС [238];

в) V антиген ингибирует хемотаксис нейтрофилов [592], супрессирует синтез таких цитокинов как -интерферон и фактор некроза опухолей [513] за счет стимуляции продукции интерлейкина-10 - репрессора указанных выше цитокинов [516];

г) белки внешней мембраны (Yops) кодируются плазмидой pCad, наличие которой в клетке необходимо для проявления вирулентности возбудителя чумы [175, 533]. YopM, реагируя с тромбином, препятствует агрегации тромбоцитов [540]. YpkA обладает Ser/Thrфосфокиназной активностью [441]. YopH и YopE ингибируют фагоцитоз [546-548]. Полагают, что YopH дефосфорилирует клеточные структуры хозяина за счет тирозинфосфотазной активности [450], а YopE обладает цитотоксичностью за счет способности деполимеризовать сеть актиновых микрофиламентов фагоцитарной клетки [547]. В настоящее время комплекс признаков, кодируемых плазмидой pCad, рассматривают как вирулон Yop - единую систему, позволяющую внеклеточно расположенным бактериям обезвреживать клетки, участвующие в иммунном ответе хозяина, разрушать их связи и вызывать их апоптоз путем инъекции бактериальных эффекторных протеинов. Эта система состоит из белков Yops и аппарата их секреции III типа, названного Ysc. Аппарат Ysc состоит из 25 белков, включая секретин. По своим функциям большая часть белков Yops может быть разделена на две группы. Некоторые из них являются внутриклеточными эффекторами (YopE, YopH, YpkA/YopO, YopP/YopJ, YopM, YopT), тогда как другие (YopB, YopD, LcrV) формируют аппарат транслокации, который разворачивается на поверхности бактерии для доставки эффекторов внутрь эукариотических клеток через плазматическую мембрану. Секреция белков Yops запускается при контакте с эукариотическими клетками и контролируется белками вирулона, включая YopN, TyeA, LcrG, которые закрывают бактериальный секреторный канал предположительно в виде затвора. Для точного функционирования системы необходимы также шапероны, названные белками Syc, которые находятся в бактериальном цитозоле. Транскрипция генов контролируется температурой и активностью аппарата секреции [413, 414];

д) активатор плазминогена (фибринолизин-плазмокоагулаза, Pla) отвечает за фибринолитическую активность Y. pestis, способен гидролизовать C3 компонент комплемента [568] и такие цитокины как фактор некроза опухолей, -интерферон, интерлейкин 8 и протеин хемотаксиса моноцитов [557]; высказано предположение о его Ig-протеазной активности [554];

е) pH6 антиген обладает цитотоксичностью в отношении моноцитов [390], альвеолярных макрофагов [311, 312], вызывает выраженное нарушение переваривающей функции макрофагов [80], приводит к снижению количества антителообразующих клеток, ингибирует реакцию митогензависимой бласттрансформации клеток селезенки и реакцию смешанной культуры лимфоцитов, подавляет рост клеток в системе интерлейкин-2 зависимой пролиферации T-бластов [85];

4) Показана возможность выделения Y. pestis в L-форме в природных очагах чумы от грызунов [157], морфологические проявления, свойственные нестабильным L-формам бактерий, выявлены у возбудителя чумы, переживающего в блохах [182].

5) Клетки Y. pestis способны переживать и размножаться в моноцитах чувствительных животных [403]. За инактивацию компонентов кислородзависимой системы бактерицидности могут отвечать различные ферменты. Так, у возбудителя чумы выявлен антиген 5, отвечающий за каталазную активность [395, 397, 399], превышающую таковую у целого ряда других бактерий [401]; показано, что высокая каталазная активность может коррелировать с вирулентностью [543], но есть и данные, противоречащие этому наблюдению [115, 401]. Супероксиддисмутазная активность Y. pestis при температуре 37 оС была в 2-10 раз выше, чем при 28 оС [123, 357]. Также выявлена и охарактеризована пероксидаза чумного микроба [222].

6) Пили адгезии Y. pestis [79, 80] образованы pH6 антигеном [497] и отвечают за агглютинацию эритроцитов [390]. Эти пили способны связывать фибронектин, муцин и ганглиозид [78].

Передача pla локуса, кодирующего продукцию активатора плазминогена, в клетки кишечной палочки придавала последним адгезивную способность в отношении ряда эукариотических клеток [483] за счет способности активатора плазминогена связываться с экстрацеллюлярным матриксом и ламинином [490].

Высокомолекулярный капсульный антиген обладал гемагглютинирующей активностью за счет способности специфически связываться с D-галактозамином-HCl и глюкуроновой кислотой [300].

7) В качестве фактора инвазии Y. pestis принято рассматривать протеазу - активатор плазминогена [568, 591]. 8) Принято считать, что возбудитель чумы, в отличие от других представителей рода Yersinia, лишен сероваров и, соответственно, антигенной изменчивости [120, 397, 418], однаПри патологоанатомических исследованиях в органах погибших от чумы животных и людей отмечается "полное или почти полное отсутствие фибрина". Это позволило сделать предположение о том, что активатор плазминогена "не только участвует в локальном фибринолизе в очагах воспаления, но играет также роль "фактора распространения" 119.

ко недавно было показано, что в "полевочьих" штаммах Y. pestis V антиген представлен вариантом характерным для Y. enterocolitica O:3 серовара [603]. Оба серовара V антигена обладали выраженной протективной активностью в отношении штаммов с гомологичным вариантом V антигена, но не обеспечивали защиты животных при заражении штаммами Y. pestis другого серовара [449, 545].

9) Y. pestis продуцирует бактериоцин - пестицин, гидролизующий пептидогликан чувствительных бактерий [430]. Спектр его активности ограничивается несколькими атипичными штаммами E. coli, сероварами IA и IB Yersinia pseudotuberculosis, сероваром O: Y. enterocolitica и непестициногенными, но Pgm+ вариантами Y. pestis [395]. По-видимому, пестицин обеспечивает селективные преимущества клеткам Y. pestis в конкуренции с другими патогенными представителями рода Yersinia, обладающими сходными механизмами поглощения неорганического железа и гемина [526], т.к. мутантные клетки, утратившие чувствительность к пестицину за счет 5-bp делеции в гене пестицинового рецептора (psn) авирулентны и обладают сниженными способностями в отношении поглощения железа [499].

10) Гемолитическая активность обеспечивает бактериям Y. pestis дополнительный источник железа в виде гемоглобина из разрушенных эритроцитов. Она проявляется при температуре 37 оС и выше, но не при 28 оС и определяется геном pla плазмиды pPst [56].

До последнего времени в большинстве публикаций [119, 174, 198, 263, 303, 395, 427, 453, 526, 527, 537, 585] к "обязательным" факторам патогенности возбудителя чумы, как впрочем, и других представителей рода Yersinia, помимо кодируемой плазмидой кальцийзависимости системы секреции III-го типа, относят и продукты хромосомного кластера железо-регулируемых генов, обозначенного - HPI (high-pathogenicity island). Полная потеря этого "острова" ведет к значительному снижению вирулентности HPI-мутантов в отношении мышей [467]. Установлено, что часть "острова высокой патогенности" отвечает за продукцию сидерофора, обеспечивающего поглощение клетками иерсиний железа [453],6 являющегося необходимым фактором роста эукариотических и прокариотических клеток [303]. Однако, как справедливо отмечали Л.Н. Классовский и В.С. Петров [167], "любая утрата бактериями способности синтезировать" или получать "необходимое для развития клеток соединение, отсутствующее или имеющееся в недостаточном количестве в организме хозяина, должно или, во всяком случае, может приводить к утрате вирулентности". По мнению В.М. Степанова [305], факторы питания на вирулентность Y. pestis "могут действовать двояко: с одной стороны, они обеспечивают условия для синтеза или проявления детерминант вирулентности, а с другой - ограничивая размножение обладающих всеми детерминантами клеток, или, способствуя их размножению, определяют возможность проявления вирулентности возбудителя".

Таким образом, если система поглощения железа признана фактором патогенности возбудителя чумы, то необходимо "восстановить в правах" и такой классический "детерминант вирулентности" как независимость от дополнительной потребности в пуринах7 [399] и второй механизм поглощения железа, начинающийся с сорбции гемина [526, 527,, 573].8 На наш взгляд, системы, обеспечивающие питательные потребности микроорганизмов необходимо четко дифференцировать от собственно факторов патогенности.9 Следует отметить, что уже T.W. Burrows [399] выделял факторы питания в отдельную группу факторов вирулентности. К факторам, обеспечивающим питательные потребности Y. pestis в организме теплокровного хозяина, помимо системы поглощения железа следует отнести способность чумноПоказано, что избирательное отсутствие экспрессии только генов, отвечающих за признак пигментсорбции и локализованных в составе этого "острова", не приводит к снижению вирулентности Hms мутантов возбудителя чумы [3, 200, 203, 214, 226].

Следует отметить, что в последней монографии И.В. Домарадского 119 способность синтезировать пурины, как и способность к синтезу пестицина, все еще рассматривается в качестве фактора вирулентности.

Интересно, что во время ответов на вопросы после своего выступления на 7th International Congress on Yersinia (Nijmegen, the Netherlands, 1998) А. Ракин [536] признал, что продукция сидерофора не может расцениваться фактором патогенности в строгом смысле этого термина, о чем и свидетельствуют кавычки в названии его выступления.

К истинным факторам патогенности следует относить лишь те уникальные свойства патогенных микробов, которые обеспечивают их персистенцию в паразитарных системах и отсутствуют у неболезнетворных и условно-патогенных микроорганизмов.

го микроба при температуре 37 оС прекращать эндогенный синтез ряда аминокислот (валина, изолейцина, цистеина) [32, 116] и значительно увеличивать поглощение аминокислот из среды культивирования [242]. Это должно значительно сокращать его энергетические затраты, т.к. на модели кишечной палочки показано, что синтез одной молекулы гистидина требует молекулу АТФ, а транспорт в клетку уже готовой аминокислоты - только 1-2 молекулы АТФ [364]. К этой же категории факторов относят и способность к синтезу ароматических аминокислот, т.к. они в клетках млекопитающих не синтезируются [263]. Интересно, что авирулентные для морских свинок aroA мутанты возбудителя чумы сохраняли вирулентность для мышей на уровне исходного штамма, хотя сроки жизни погибших животных увеличивались примерно на двое суток [524].

Необходимо отметить, что хотя представленный выше перечень уже установленных и предполагаемых факторов, обеспечивающих переживание Y. pestis в организме хозяина, является далеко не полным (не рассматривались вопросы, связанные с устойчивостью к действию сыворотки [527], продукцией нейраминидазы и аденилатциклазы [236], уреазной [257] и антилизоцимной [297] активностями, синтезом 32-kDa протеина внешней мембраны, имеющегося у всех вирулентных для морских свинок и человека экотипов10 Y. pestis, но отсутствующий у штаммов выделенных от полевок (Microtus brandti) и их блох [612, 613], регуляцией экспрессии указанных выше факторов [466, 523, 527, 573]), на его примере отчетливо видна полидетерминированность вирулентности возбудителя чумы. Более того, каждая из биомолекул может обладать несколькими активностями, направленными на преодоление различных звеньев системы защиты макроорганизма, обеспечение персистенции Y. pestis в организме блохи и окружающей среде [238, 370, 431].

Введенный И.Л. Мартиневским термин "экотип" отражает отличие ряда свойств выделенных в разных природных очагах штаммов возбудителя чумы, обусловленные географической разобщенностью очагов чумы с выраженными экологическими различиями в условиях существования микроорганизма. Следует отметить, что этот термин не соответствует требованиям Международного кодекса номенклатуры бактерий [116, 119].

1.2. КАПСУЛЬНЫЙ АНТИГЕН Y. pestis 1.2.1. ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ, УСЛОВИЯ БИОСИНТЕЗА, ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА

Наличие капсулы у возбудителя чумы было установлено еще A. Yersin [605, 606]. Более детально феномен капсулообразования у Y. pestis описан S. Rowland [550] и H. Schtze [561, 562], которые наблюдали, что при росте на искусственных питательных средах при температуре 37 оС и в организме теплокровных животных чумной микроб синтезирует желатиноподобное вещество, окружающее в виде капсулы бактериальные клетки и постепенно диффундирующее в окружающую среду. А.И. Желтенков [142] отмечал, что капсула состоит из "гомогенного вещества слизистой консистенции, плохо окрашивающегося анилиновыми красками. В некоторых случаях толщина оболочечной субстанции (капсулы) может в несколько раз превосходить толщину самой бактериальной клетки. Довольно часто оболочечная субстанция окружает не каждого микроба в отдельности, а целые группы их, что указывает на секреторное происхождение ее". Для выделения оболочечного антигена H. Schtze [561, 562] выращивал культуру возбудителя чумы на агаре в течение 48 ч при температуре 37 оС, затем суспендировал бактериальные клетки в физиологическом растворе и нагревал суспензию при температуре 60 оС 90 мин. После центрифугирования супернатант состоял в большей своей массе из оболочечного антигена и в меньшей части из соматического антигена. Н.Н. Жуков-Вережников и Т.И. Липатова [146] получали капсульную субстанцию при помощи отмывания ее от бактерий, выращенных в течение 36 ч при температуре 37 оС на средах с pH 6,4-6,6, "физиологическим раствором, слегка подщелоченным KOH. После 1-2часовой обработки в Schttel-apparat`е, как показывает мазок, капсулы уже совершенно исчезают, сами же тела бактерий остаются вполне неповрежденными и число их не сокращается (подсчет по Райту)".

Практически все последующие работы по изучению физико-химических и иммунохимических свойств капсульного антигена были выполнены на основе препаратов фракции I, выделенных из водно-солевого экстракта ацетонвысушенных клеток по способу, разработанному E.E. Baker et al. [381, 382].

При температуре 37 оС образуется в 800-1000 раз больше капсульного антигена, чем при 28 оС [382]. Штаммы с высоким уровнем синтеза продуцируют "от 128 мкг и более FI на 1 мг сухих клеток" [161]. Синтезируемый при температуре 28 оС антиген FI находится в виде комплекса с другими компонентами и не может диффундировать в среду, а при температуре 37 оС только около 13 % капсульного антигена прочно связано с бактериальной клеткой [426]. По другим данным в среду культивирования переходит 30-50 % синтезируемого антигена [368]. Принято считать, что в клетках, выращенных при температуре 28 оС, капсула не образуется, а фракция I может быть выявлена после дезинтеграции клеток [436]. Однако использование высокочувствительных методов позволило обнаружить у клеток чумного микроба, выращенных при температуре 28 оС, капсульный антиген, расположенный на поверхности клетки [48]. "Результаты ТИФА с типичными штаммами Y. pestis показали, что МКА способны определять Ф1 на поверхности и внутри клетки, а также в культуральной жидкости бактерий, выращенных как при 28 С, так и при 37 С. Однако в последнем случае на наружной мембране выявлялось в 26 раз больше антигена, чем при культивировании бактерий при 28 С. В то же время соотношение концентраций caf–пептида внутри и снаружи клетки мало зависело от температуры роста микробов, превышая в 1.4 и 2.4 раза соответственно количество антигена, локализованного на поверхности микроорганизмов, выращенных при 28 С или 37 С. Кроме того, количество секретируемой Ф1 в среду культивирования по сравнению с клеточной стенкой бактерий, выращенных при 37 С, оказалось больше в 2.5 раза" [333].

Продукция фракции I возможна в широком диапазоне pH с максимальным выходом капсульного антигена в интервале pH от 6,3 до 7,3 [529].

На уровень синтеза фракции I чумного микроба влияет не только температура, но и состав питательной среды. Для высокого уровня синтеза FI питательная среда должна содержать аргинин, триптофан, -аминомасляную кислоту, тирозин, глицин, орнитин, гистидин, пантотенат кальция, глюконат кальция и витамин B1. Отсутствие в среде одного из данных веществ приводит к резкому снижению (от 40 до 83,6 %) выработки фракции I [331].

Классическая методика выделения фракции I по E.E. Baker et al. [381, 382] заключается в следующем. Штамм Y. pestis "дикого" типа выращивают при температуре 37 оС на плотной питательной среде в течение трех суток. Клетки смывают физиологическим раствором и двукратно обезвоживают охлажденным ацетоном. Капсульный антиген экстрагируют из ацетонвысушенных клеток 2,5 % раствором NaCl в течение суток при комнатной температуре.

Выделение капсульного антигена из солевого раствора проводят с помощью переосаждения насыщенным раствором сульфата аммония (pH 7,5).11 Препарат, преципитирующий при насыщении 0,25-0,3, был обозначен как FIA, а при 0,3-0,33 - FIB. Указанные субфракции были серологически идентичны, но фракция IA помимо белка содержала полисахаридный компонент, в то время как фракция IB - чистый белок.

Метод выделения FI из ацетонвысушенных клеток был усовершенствован В.И. Вейнблатом с соавт. [68, 69], которые для более полного извлечения антигена из водно-солевого раствора предложили его экстракцию трихлоруксусной кислотой. Это позволило получить дополнительные фракции IC и ID, серологически идентичные фракциям IA и IB по результатам РНАт и РДИД. Однако, в отличие от фракций IA, IB и IC, фракция ID не реагировала в РНГА. Было высказано предположение, что это "связано с более глубокой гаптенизацией препарата". По своему химическому составу фракции IC и ID оказались белковонуклеополисахаридными комплексами, поскольку содержали 60-69 % белка, 28-31 % полисахарида, 1нуклеиновых кислот.

Исходя из того, что капсульный антиген непрочно связан с микробной клеткой и легко переходит в среду культивирования [144, 368, 426], в последнее время его чаще всего выделяют из культуральной жидкости. Интересно, что препарат FI, полученный путем фракционирования культуральной жидкости сульфатом аммония, превосходил по своей иммунохимической активности препараты, полученные по оригинальной методике E.E. Baker et al.

[70, 71, 538]. В 1983 г. М.М. Титенко с соавт. [326] предложили метод выделения FI из культуральной жидкости осаждением в изоэлектрической точке, что позволило значительно сократить сроки и увеличить выход конечного продукта. Л.Н. Сердобинцевым [299] был разработан метод выделения FI из культуральной жидкости с использованием колоночной хроматографии на молекулярных ситах.

Интересно, что препараты FI, выделенные из жидкой среды выращивания, были лишены полисахаридных примесей и представляли собой монокомпонентную белковую систему [70, 71, 326, 299]. В то же время есть данные, что даже препараты FI, выделенные из супернатанта культур, выращенных на жидких средах, содержат примеси ЛПС [301, 313, 368].

Комплексное исследование капсулообразования с помощью иммунологических и электронно-микроскопических методов показало, что гелеподобная капсула Y. pestis образована FI антигеном, постепенно переходящим в окружающую среду в процессе культивирования [156, 180, 181, 397, 406, 407, 415, 584]. Хотя после указанных выше экспериментов, клонирования и определения первичной нуклеотидной последовательности fra оперона [350, 351, 443], кодирующего капсулообразование у Y. pestis, и конструирования бескапсульных вариантов возбудителя чумы за счет делеции части структурного гена caf1 [162], тот факт, что структурный компонент капсулы Y. pestis состоит из белка, получил практически всеобщее признание, периодически появляются публикации, свидетельствующие о качественно иной Основным недостатком этого метода получения капсульного антигена FI является то, что для выделения антигена использовали не собственно вещество капсулы Y. pestis, а экстракт из разрушенных ацетоном бактеструктуре "субстанции", ответственной за антигенную и биологическую активность капсульного материала [159, 428, 445, 527]. На наш взгляд, основой для этого заблуждения послужила работа R. Glosnicka, E. Gruszkiewicz [445], которые в качестве источника выделения антигена "панкреатического перевара оболочки" (pancreatic envelope digest antigen) использовали ацетонвысушенные клетки штамма EV, выращенные в течение 48 ч при температуре 37 оС. Антигены экстрагировали 0,9 %-ным раствором NaCl, а надосадочную жидкость использовали в последующих экспериментах. Неочищенный "экстракт капсульной оболочки" содержал 32 % белков, 2 % углеводов и значительное количество нуклеиновых кислот.

Наличие в препарате последних свидетельствует о разрушении клеток в процессе подобной обработки и, на наш взгляд, термин "экстракт капсульной оболочки" неправомочен, т.к. помимо антигенов, находящихся на клеточной поверхности, в нем присутствуют и экстрагированные внутриклеточные компоненты.12 Последующее использование ферментативного переваривания панкреатином, хроматографии на колонках, содержащих смесь мембран эритроцитов человека с целитом, и рехроматографии на сефадексе G-200, позволило получить однородный препарат АППО, обладающий высокой специфичностью в серологических реакциях и рецепторной активностью по отношению к фагу чумного микроба. Изучение химических и физических свойств антигена продемонстрировало его липополисахаридную природу. Показано, что углеводная часть препарата состояла из галактозы и фукозы. Липидная фракция содержала фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин. По предварительным данным, ЛПС АППО отличался от ЛПС клеточной оболочки Y. pestis отсутствием глюкозы, гексозаминов и наличием этаноламина. Чтобы подчеркнуть различия ЛПС АППО и эндотоксина возбудителя чумы, он был обозначен термином "галактолипид". Было высказано мнение, что за антигенную специфичность галактолипида ответственна его полисахаридная часть риальных клеток, содержащий также компоненты клеточной стенки и протоплазмы.

Аналогичного мнения придерживается И.В. Домарадский [119], который отмечает, что "водно-солевой экстракт содержит, помимо FI и FII, полисахаридно-липидный комплекс". Его полисахаридная часть "состоит из галактозы и фукозы, а" в липидную - входят "фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин".

[445]. Другой группой исследователей из препарата капсульного антигена, полученного осаждением сульфатом аммония по E.E. Baker et al. [381, 382], методом Вестфаля-Людерица выделен ЛПС, обладающий значительной вязкостью и не вызывающий летального шока у мышей при внутрибрюшинном введении в дозах 1-2 мг [159], что дополнительно, по мнению авторов работы, подтверждало белково-липополисахаридную организацию фракции I чумного микроба. Однако попытка воспроизведения экспериментов, подтверждающих эту точку зрения [98], свидетельствует о некорректности выводов, сделанных цитированными выше авторами. Препарат FI, полученный по методу E.E. Baker et al. [381, 382], с концентрацией белка 2 мг/мл экстрагировали горячим фенольным методом. ЛПС осаждали 70 % этанола, высушивали и разводили до концентрации 1 мг/мл. Полученный препарат не реагировал с моноклональными антителами к FI. Эти данные были подтверждены обработкой препарата FI различными ферментами. Обработка протеиназой K приводила к снижению титров РНГА с 1:64000 до 1:128. Обработка препарата липазой, ДНК-азой и РНК-азой не влияла на активность реакции. Эти данные соответствуют классической работе E.E. Baker et al. [382], в которой FIA и FIB после обработки трипсином теряли свою иммунохимическую активность. Кроме того, простое строение галактолипида, представляющего собой по сути гаптен, не позволяет рассчитывать на его высокую иммуногенность, но он может индуцировать синтез антител к минимальным количествам примесей белка, сохранившимся в виде примесей в липидных мицеллах, являясь, по сути, липидным адъювантом.

Фракции IA и IB, полученные по методу E.E. Baker et al. [382], а также фракции IC и ID, выделенные по способу В.И. Вейнблата с соавт. [69] представляли собой серии молекулярных агрегатов с молекулярными массами от 300 kDa до 1,5 MDa [69, 368, 388, 451]. Выделение капсульного антигена более щадящими методами из культуральной жидкости, исСледует отметить, что есть данные и о высокой устойчивости препарата FIA к специфическому действию трипсина, химотрипсина, протеазы V8, протеиназы K. Лишь прогревание FIA в растворе при 95 оС в течение 5 мин делало его доступным действию протеаз, воздействие которых закономерно приводило к существенному снижению иммунохимической активности антигена [327].

ключающими этапы обработки ацетоном и высушивания, позволяет получать агрегат субъединиц с молекулярной массой до 2,0 MDa [299, 368].

Определение изоэлектрической точки FI показало, что ее величина для фракции IA составляла 4,5, а для IB - 4,7 [382], или 4,6 и 4,8, соответственно [388]. Следует отметить, что эти данные характеризуют препараты фрагментированного капсульного антигена, выделенного в достаточно жестких условиях. Значения pI для препаратов выделенных из культуральной жидкости с помощью гелевой фильтрации или изоэлектрической преципитации составляло 3,950,05 [299, 326], 4,00,05 [317] или 4,10,05 [71, 131, 133]. Изоэлектрическая точка для препаратов, полученных из культуральной жидкости высаливанием сульфатом аммония с последующей очисткой от эндотоксина с помощью хроматографии на иммобилизированном полимиксине B, находилась в диапазоне 4,3-4,5 [368]. Эти отличия могут свидетельствовать об изменении, и, может быть, определенной степени нарушения структуры и конформации макромолекул антигена, выделенного из ацетонвысушенных клеток, и влиянии на величину pI примесей липополисахарида. Интересно, что изоэлектрическая точка FI, рассчитанная на основе данных о первичной нуклеотидной последовательности его субъединицы составляет 4,3 [350, 443].

При исследовании FI методами вискозиметрии и спектров рассеяния было показано, что для нативного капсульного антигена характеристическая вязкость равна 476 см3/г, молекулярная масса по Тенфорду - 3,6 MDa, для препарата подвергнутого кипячению - 56,7 см3/г и 43 MDa, соответственно. Температура диссоциации FI зависит от растворителя и лежит в интервале 50-85 оС [247].

1.2.2. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА

В исследованиях с применением сканирующей электронной микроскопии T.H. Chen, S.S. Elberg [406] показали, что капсульный антиген образует на поверхности бактерий грануляционный слой, который постепенно диффундирует в окружающую среду. Н.П. Коннов [180] при негативном контрастировании клеток Y. pestis установил, что капсула отстояла на 0,125 нм от клеточной стенки и имела четкие контуры. Однако при достаточно интенсивном отмывании зона капсульного вещества истончалась, и образовывались участки, полностью лишенные капсулы. Совместное использование иммуноферритинового метода и электронной микроскопии позволило А.Г. Золотареву и соавт. [156] подтвердить эти данные. Капсула на электронных микрофотографиях представлена в виде обрывков фибриллярного материала (диаметр отдельных фибрилл около 3 нм) [164] или внеклеточного фибриллярного матрикса [180, 407]. Однако в большинстве случаев капсула Y. pestis определялась как аморфное вещество, и только при достаточном увеличении на снимках можно было видеть элементы ячеистой структуры капсулы и отдельные "фимбриеподобные тяжи" длиной порядка 0,25-15 нм, расходящиеся в разные стороны от поверхности бактерии [180, 300]. Интересно, что капсулы некоторых энтеротоксигенных или способных вызывать септицемию штаммов E. coli образованы белковым антигеном CS31A, представляющим собой фимбрии диаметром 2 нм [444], а структурная субъединица этих пилей - ClpG филогенетически родственна структурной субъединице капсульного антигена Caf1 [389].

В отношении молекулярной организации капсульного антигена, большинство авторов поддерживают точку зрения о том, что FI состоит из большого числа субъединиц. Было показано, что ген caf1 (ycaF) кодирует белок Caf1 (YcaF) с молекулярной массой 17,6 kDa, состоящей из 170 аминокислот. При удалении сигнального пептида из Caf1 образуется 15,5-kDa зрелый белок [350, 443].

На основании данных об одинаковой иммунохимической активности в РДИД как исходного так полностью диссоциированного капсульного антигена было сделано предположение о том, что антигенные детерминанты FI определяются структурой субъединицы и не зависят от конформации надмолекулярного образования [388].

Блокирование аминогрупп капсульного белка тринитробензосульфокислотой не снижало иммунохимической активности FIA, что является аргументом против определяющего участия N-концевого аланина, а также аминокислот, содержащих боковые аминогруппы, в формировании антигенных детерминант. Было высказано предположение, что наиболее вероятным способом организации основного антигенного эпитопа является структура, образованная связанными между собой в определенном порядке субъединицами FIA [327]. Однако та же группа исследователей в том же году публикует материалы свидетельствующие о том, что в коммерческих противочумных сыворотках установлено наличие антител, как к агрегированной, так и диссоциированной формам FI [328].

В результате исследования гипериммунных сывороток, полученных к интактной FI и к капсульному антигену, структура которого была нарушена температурной обработкой, в том числе в присутствии SDS, было сделано заключение, "что секвенциальные антигенные детерминанты FI не являются иммунодоминантными и не определяют известных свойств диагностических сывороток. Высокие титры противочумных диагностических сывороток определяются конформационнозависимыми эпитопами агрегированной формы фракции I" [286].

В результате компьютерного анализа аминокислотной структуры субъединицы Caf было установлено, что она состоит из двух -структурных доменов, соединенных между собой гидрофильной неструктурированной петлей, которая соответствует основному Bклеточному эпитопу данного белка (аминокислотные остатки 72-95). Высказано предположение, что эта гидрофильная петля расположена на поверхности субъединицы напротив Cконцевой последовательности, которая, возможно, отвечает за агрегацию субъединиц белка, не препятствуя экспозиции B-клеточных эпитопов на поверхности образующихся агрегатов.

Два T-клеточных эпитопа расположены в C-концевых областях доменов (аминокислотные остатки 51-71 и 129-149) [113, 610]. Аналогичные результаты были получены при тестировании синтетических пептидов, соответствующих отдельным участкам этого белка, с помощью реакции ГЗТ и ИФА [215]. Синтезированные пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям 51-69 и 129-149, вызывали реакцию ГЗТ, тогда как пептиды 71-95 и 116-130 этими свойствами не обладали. Наиболее выраженная реакция ГЗТ развивалась под влиянием пептида 51-69.

Модификация Caf1 по аминокислотному остатку Тир-71 приводила к снижению способности такого белка вызывать реакцию ГЗТ и бластную трансформацию лимфоцитов [64, 65]. Наиболее выраженным В-клеточным эпитопом является аминокислотная последовательность 71-95, соответствующая неструктурированной петле зрелой субъединицы белка.

Тестирование пяти перекрывающихся олигопептидов, включающих полную аминокислотную последовательность зрелого белка Caf1, методом ИФА с помощью трех различных чумных гипериммунных сывороток и четырех моноклональных антител специфичных в отношении FI проводили с целью выявления линейных B-клеточных эпитопов [517]. Установлено, что как минимум два линейных B-клеточных эпитопа расположены на C-концевом участке FI. Тот факт, что один из клонов IgG не реагировал ни с одним из олигопептидов, но вступал в реакцию с полной последовательностью FI, свидетельствует о наличии у капсульного антигена как минимум одного конформационного B-клеточного эпитопа.

Компьютерное сравнение аминокислотной последовательности капсульного антигена с первичными структурами других известных белков выявило несколько гомологичных участков. Установлена гомология Caf1 с сегментами константных доменов рецептора Тлимфоцитов, с -структурным оболочечным белком вируса иммунодефицита обезьян, а также с сегментом гемолизина холерного вибриона и предшественником аденилатциклазы возбудителя коклюша. Предполагается, что найденные гомологичные фрагменты сравниваемых белков обладают близкими структурными, а возможно, и функциональными свойствами [113].

Диссоциация агрегатов FI на субъединицы происходила при прогревании образцов, содержащих 0,1 % меркаптоэтанола и 0,25 % SDS, в течение 5 мин при температуре 95 оС.

Устранение SDS из препаратов белка приводило к реассоциации субъединиц в серию агрегатов, отличающихся по молекулярной массе [388]. Позднее Л.Н. Сердобинцевым [299] было показано, что под влиянием денатурирующих факторов, таких как температура, додецилсульфат натрия и мочевина происходила диссоциация агрегированной формы капсульного антигена. Так, прогревание капсульного антигена при 100 оC в течение трех минут вызывало его диссоциацию до тетрамера с молекулярной массой 55 kDa. Лиофилизированный препарат капсульного антигена под влиянием SDS частично распадался, образуя набор олигомеров с различными молекулярными массами. Прогревание FI в буфере, содержащем 0,1 % SDS, при 100 оC в течение трех минут приводило к образованию субъединичной формы антигена.

Присутствие 0,1 % SDS в растворе капсульного антигена не влияло на иммунохимическую активность препарата. Прогревание капсульного антигена в буфере с 7 М мочевиной приводило к диссоциации до димера с молекулярной массой 25 kDa. Удаление денатурирующих агентов из раствора приводило к ассоциации субъединиц в тетрамеры. С течением времени происходила реассоциация субъединиц в олигомеры большей молекулярной массы. Характер денатурирующего воздействия температуры, вызывающей абсолютное преобладание в растворе тетрамера, указывает на то, что данная структура обладает конформационным оптимумом и обеспечивает максимальное взаимодействие комплементарных поверхностей субъединиц. Процесс формирования тетрамеров фракции I происходит в результате образования водородных связей между отдельными димерами, а формирование димеров происходит, в основном, за счет гидрофобных взаимодействий.

В исследованиях Л.Н. Сердобинцева [299] показано, что в объединении субъединиц в единую надмолекулярную структуру решающая роль принадлежит комплементарным участкам, расположенным на поверхности отдельных субъединиц. Формирование специфической структуры данных участков находится в абсолютной зависимости от конформационного состояния белковой глобулы субъединицы. Изменение ее пространственной упаковки, вызванное каким либо фактором, приводит к нарушению специфичности "липких" участков и последующей диссоциации агрегата. Процесс диссоциации исходной макроструктуры капсульного антигена имеет существенные особенности. Воздействия, приводящие к нарушению специфического профиля молекулярной поверхности субъединицы в результате изменения поверхностного заряда или теплового разворачивания глобулы, изменяют общее структурное состояние субъединицы таким образом, что в новых условиях термодинамически выгодным становится их ассоциация в систему из четырех единиц. Таким образом, вещество капсульного антигена переходит из высокоагрегированного состояния в тетрамер. Повидимому, внутренняя энергия структурного ансамбля тетрамеров находится в термодинамическом равновесии с энергией среды, что определяет его относительную устойчивость.

При охлаждении раствора тетрамер становится неустойчивой системой и распадается.

С помощью направленной химической модификации А.М. Васильевым с соавт. [65] было установлено, что аминокислотные остатки Тир-23, Тир-51 и Тир-138 в белке Caf1 принимают участие в процессе агрегации и формировании капсулы чумного микроба. Они выполняют функции основных ориентиров при стыковке субъединиц и формировании гидрофобных ядер в структуре надмолекулярного образования. Наличие гидрофильной перетяжки между двумя доменами делает структуру агрегата субъединиц Caf1 рыхлой и ячеистой.

В нативном состоянии антиген FI является сложноорганизованной надмолекулярной структурой с молекулярной массой около 2 MDa [72, 299, 317, 368, 584].

О пространственной структуре агрегатов субъединиц капсульного антигена есть следующие предположения: молекула FI в водных растворах имеет форму вытянутого эллипсоида вращения и может быть отнесена к асимметричным белкам с хаотически скрученными высокосольватированными полипептидными цепями [72]; по данным спектров рассеяния, структурная организация FI не может соответствовать модели жесткой асимметричной частицы, а четвертичная структура может быть собрана непосредственно из тетрамеров [344]. В составе капсульного антигена отсутствует цистеин. Таким образом, вторичная, третичная и четвертичная структуры капсульного белка образуются без участия дисульфидных связей [68, 69, 350, 443].

Гель капсульного антигена является "обратимой, неограниченно набухающей структурой с непрерывными фазами белка и растворителя, формирующей твердофазное образование по типу полупроницаемой мембраны". Гели FI могут существовать в коагуляционном, конденсационном и кристаллизационном виде. Отмечена способность белка FI к существованию в виде твердофазных образований различной морфологии (пленки, дендритные и фибриллярные кристаллические образования) после удаления из его кристаллизационных гелей растворителя [299].

1.2.3. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПРОДУКЦИИ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА

О.А. Проценко с соавт. [271] показали, что гены, ответственные за синтез FI и "мышиного" токсина, локализованы на внехромосомном репликоне. В результате передачи реципиентным клеткам Y. pestis плазмиды с молекулярной массой около 60 MDa трансформанты приобретали способность к продукции антигена FI и "мышиного" токсина. Плазмида, считавшаяся до этого криптической была обозначена pFra/Tox (позднее название было сокращено до pFra). Молекулярная масса репликона, кодирующего синтез FI вариабельна и может достигать у полевочьих штаммов 80 MDa [94, 152, 338, 339], а у отдельных штаммов основного подвида - 190 MDa [338, 339]. Описан также штамм Dodson с редуцированной формой плазмиды - < 40 MDa [527]. Показана возможность обратимой интеграции плазмиды pFra в различные участки хромосомы Y. pestis [174, 202, 275, 437, 534, 590].

Изучение генетических механизмов, контролирующих функционирование pFra Y. pestis в гетерологичных хозяевах показало, что эта плазмида стабильно наследуется в клетках Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, обеспечивая синтез FI [185, 187, 207, 208]. Однако выявлено отсутствие синтеза антигена FI и нестабильность pFra в клетках кишечной палочки [152]. Ряд исследователей столкнулся с затруднением экспрессии клонированного в составе векторных молекул ДНК кластера генов fra оперона в клетках E. coli [91, 111, 358], отмечая отсутствие продукции FI в клетках кишечной палочки при использовании плазмидных векторов pBR32215 или pBR327. Высказано предположение, что капсульный антиген может оказывать токсическое действие на клетки штамма-продуцента, что, в свою очередь, приводит к накоплению в популяции микроорганизмов с дефектами fra оперона, вызванными встраиванием в его структуру IS-элементов Как ни странно, до последнего времени некоторые чумологи считают, что вопрос о локализации генов, отвечающих за синтез FI окончательно решенным считать нельзя 119, 186. Представленный в настоящем разделе обзор публикаций, на наш взгляд, свидетельствуют об обратном.

[111].

А.Ю. Гончаровым с соавт. [91-93] проведено физическое картирование плазмиды pYT из штамма Y. pestis EV76/3 для 6 рестриктаз, О.А. Кириллиной [165] построена карта плазмиды pFra из штамма Y. pestis A1122, а Ю.И. Яшечкиным с соавт. [363] рестрикционная карта плазмиды из штамма Y. pestis 231. В 1998 г. опубликованы полная нуклеотидная последовательность плазмиды pFra из штамма Y. pestis KIM5 [460, 496] и полная нуклеотидная последовательность генома штамма Y. pestis CO-92 [479].

Fra оперон, кодирующий продукцию капсульного антигена, был впервые клонирован из EcoRI банка больших плазмид Y. pestis А.В. Карлышевым с соавт. в 198416 году (цитируется по П.А. Черепанову с соавт. [346]) в составе космидного вектора pHC79 в клетках E. coli. Не позднее 1987 года аналогичные работы были проведены в НИИ микробиологии МО РФ (цитируется по И.В. Дармову с соавт. [111]), а также в 1988 году в РосНИПЧИ "Микроб" О.Г. Шишкиной с соавт. [358].

По данным A. Karlyshev et al. [476] структурная субъединица капсульного антигена кодируется геном caf1 размером в 510 нуклеотидных пар (рис. 1, pFS1). Белокпредшественник антигена FI состоит из 170 аминокислотных остатков. Участок отщепления сигнальной последовательности расположен между 21-м и 22-м остатками аланина. Второй ген отвечает за синтез белка Caf1M. Данный белок является периплазматическим шапероном. Caf1M состоит из двух иммуноглобулино-подобных доменов и имеет гомологию с периплазматическим шапероном PapD E. coli. Третий ген кодирует "usher" белок Caf1A, обеспечивающий, закрепление капсульного антигена на поверхности бактериальной клетки. БелИнтересно, что G.P. Andrews et al. [368] напротив успешно использовали pBR322 в качестве среднекопийного вектора для стабилизации экспрессии fra оперона в клетках E. coli HB101. Селективное давление обеспечивали добавлением в среду культивирования ампициллина (100 мкг/мл).

На самом деле клонирование было осуществлено в конце 1982 г., а в 1984 г. вышел заключительный отчет по молекулярному клонированию основных факторов патогенности и иммуногенности возбудителя чумы.

ки Caf1M и Caf1A также обладают сигнальными последовательностями. Четвертый ген fra оперона кодирует белок Caf1R, который отвечает за регуляцию процесса капсулообразования.

П.А. Черепанов с соавт. [350] также определили первичную нуклеотидную последовательность fra оперона. На основании ее анализа выявлено пять протяженных открытых рамок считывания, способных кодировать белки YcaA (Caf1M [442]) - 28,8 kDa, YcaB kDa, YcaC - 33,55 kDa, YcaD - 11,36 kDa, YcaF (Caf1 [443]) - 17,66 kDa [350]. Соответствия и различия в данных этих двух групп исследователей представлены на рисунке 1. В структуре предполагаемых белков YcaA и YcaF на N-конце обнаружены потенциальные сигнальные пептиды. В публикации отмечено, что область, включающая цистроны ycaB и ycaC, которые находятся в одной трансляционной рамке, может кодировать 77,03-kDa белок YcaE (аналог Caf1A), но внутри этого района имеется единственный стоп-кодон, терминирующий белок YcaB. Высказано предположение, что "этот кодон появился за счет случайной мутации в клоне, отобранном для секвенирования".

Отсутствие в клетках E. coli, несущих дефектный по гену caf1M оперон fra, детектируемых количеств FI позволило предположить, что для экспрессии и секреции капсульного антигена необходим продукт гена caf1M, обладающий гомологией с периплазматическим шапероном PapD из E. coli. В данной серии экспериментов тестирование продукции FI проводили с помощью ИФА и РНГА [442]. Однако в работе П.А. Черепанова с соавт. [350] было показано, что фрагмент ДНК, ограниченный сайтами XhoI-PstI, содержит кластер генов, достаточный для образования капсулы. Делеция XhoI-BamHI фрагмента (около 600 bp) приводила к температуронезависимому синтезу в клетках E. coli капсульного антигена, обладавшего необычными иммунохимическими свойствами. Такой капсульный антиген тестировался в РДИД против анти-FI-сыворотки, но не в РНГА. Капсульный антиген, синтезирующийся в клетках E. coli, содержащих гибридные плазмиды, несущие более протяженные делеции XhoI-HindIII (около 850 bp) и XhoI-NruI (около 3 kb), обладал аналогичными иммунохимическими свойствами, но его синтез шел только при наличии чужеродного промотора. Основной регулируемый промотор был выявлен перед сайтом связывания рибосомы и открытой рамкой считывания гена ycaA (caf1M). Второй промотор локализован между сайтами BamHI и HindIII в районе кодирующей области ycaA (caf1M) [350]. В ряде других экспериментов было также показано, что фрагмент ДНК, ограниченный сайтами BamHI, EcoRI и дефектный по гену caf1M, обеспечивал в клетках E. coli синтез капсульного антигена, выявляемого с помощью ИФА [567] или РДИД [91, 92].

1.2.4. РОЛЬ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА В ПАТОГЕНЕЗЕ Реализация патогенных свойств Y. pestis в организме восприимчивого хозяина требует присутствия у возбудителя чумы целого набора факторов патогенности различной функциональной направленности и системы регуляции, обеспечивающей их координированную экспрессию. Абсолютизирование роли любого отдельно взятого из указанных факторов - некорректно [9, 236, 262, 370, 395]. Однако детальный анализ каждого из этих факторов лежит в основе системного подхода при изучении патогенности и вирулентности Y. pestis.

Роль капсульного антигена в патогенезе чумы неоднозначна. Капсула, образованная из FI, защищает клетки Y. pestis от захвата интактными нейтрофилами хозяина [334, 399, 403, 469]. Это согласуется с общепризнанной ролью бактериальных капсул, препятствующих поглощению бактерий фагоцитарными клетками макроорганизма [582]. С одной стороны, они экранируют пептидогликан или ЛПС бактериальной клетки, препятствуя инициации альтернативного пути активации комплемента [512], но FI, напротив, истощает систему комплемента за счет избирательной активации C`2 и C`4 компонентов системы комплемента сыворотки человека и таким образом препятствует комплемент-опосредованной опсонизации бактерий [599]. С другой стороны, повышение устойчивости к фагоцитозу обычно коррелирует с увеличением отрицательного заряда микробной клетки, способствующего электростатическому отталкиванию от одноименно заряженных фагоцитов [582]. Но в клетках Y. pestis синтез капсулы, напротив, сопровождается снижением отрицательного заряда клеточной поверхности [131, 132, 184]. Более того, отсутствие FI у некоторых штаммов Y. pestis обусловливало снижение эффективности захвата бактерий макрофагами морских свинок, но не белых мышей [96]. В то же время известно, что размножение клеток Y. pestis внутри макрофагов является обязательным этапом патогенеза чумы [403], а вирулентность чумного микроба коррелирует не с устойчивостью к захвату фагоцитами [469], но со способностью выживать и размножаться в фаголизосомах фагоцитарных клеток за счет подавления антибактериальных функций фагоцитов [66, 67, 183, 194, 195, 354, 404].17 Интересно, что высокоочищенные препараты FI ингибируют завершенность фагоцитоза чумных бактерий макрофагами [195, 279, 328]. Одинаковый ингибирующий эффект проявляется у препаратов FI, выделенных из клеток Y. pestis и рекомбинантного штамма E. coli HB101pFS2, при фагоцитозе как зимозана, так и вакцинного штамма EV. При длительном воздействии антигенов на макрофаги (в течение 36 ч) отмечен выраженный цитопатический эффект [317].



Pages:     || 2 |


Похожие работы:

«БОЛЬШАКОВА Ирина Валентиновна ФОРМИРОВАНИЕ ГОТОВНОСТИ КУРСАНТОВ ВУЗОВ ВНУТРЕННИХ ВОЙСК МВД РОССИИ К ВЫПОЛНЕНИЮ СЛУЖЕБНО-ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ДОЛГА В ПРОЦЕССЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ 13.00.08 – Теория и методика профессионального образования Диссертация на соискание ученой степени...»

«Азаров Дмитрий Васильевич КОНСТИТУЦИОННО-ПРАВОВОЕ РЕГУЛИРОВАНИЕ РЕГИОНАЛЬНОГО ПАРЛАМЕНТСКОГО КОНТРОЛЯ КАК МЕХАНИЗМА ОБЕСПЕЧЕНИЯ РАЗДЕЛЕНИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВЛАСТЕЙ В СУБЪЕКТАХ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Специальность 12.00.02 - конституционное право; конституционный судебный процесс; муниципальное право Диссертация на...»

«Евтеева Мария Юрьевна МОДЕЛИРОВАНИЕ СЕМАНТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ГЛАГОЛОВ ШИРОКОЙ СЕМАНТИКИ С ОБЩИМ ЗНАЧЕНИЕМ ДЕЛАТЬ В ЕСТЕСТВЕННОМ ЯЗЫКЕ 10.02.19 – теория языка Диссертация на соискание ученой степени кандидата филологических наук Научный руководитель – доктор филологических наук, профессор Сулейманова О. А....»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Наперов, Владимир Владимирович Обеспечение безопасности и защиты транспортных комплексов и транспортных средств при перевозке легковоспламеняющихся грузов Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Наперов, Владимир Владимирович.    Обеспечение безопасности и защиты транспортных комплексов и транспортных средств при перевозке легковоспламеняющихся грузов  [Электронный ресурс] : Дис. . канд. техн. наук...»

«Бутенко Светлана Викторовна ВВЕДЕНИЕ ПОТРЕБИТЕЛЯ В ЗАБЛУЖДЕНИЕ КАК АБСОЛЮТНОЕ ОСНОВАНИЕ ДЛЯ ОТКАЗА В ПРЕДОСТАВЛЕНИИ ПРАВОВОЙ ОХРАНЫ ТОВАРНОМУ ЗНАКУ 12.00.03 – гражданское право; предпринимательское право; семейное право; международное частное право ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата юридических...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Нарбикова, Наталья Геннадьевна Меры пресечения, связанные с ограничением свободы Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Нарбикова, Наталья Геннадьевна Меры пресечения, связанные с ограничением свободы : [Электронный ресурс] : Дис. . канд. юрид. наук  : 12.00.09. ­ Оренбург: РГБ, 2005 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки) Уголовный процесс криминалистика и судебная экспертиза оперативно­розыскная деятельность...»

«Юмаев Егор Александрович АНТИКРИЗИСНЫЙ КОМПОНЕНТ РЕГИОНАЛЬНОЙ ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ПОЛИТИКИ Специальность 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством (региональная экономика) Диссертация на соискание ученой степени кандидата экономических наук Научный руководитель : доктор экономических наук, профессор О.П. Кузнецова Омск – СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ РЕГИОНАЛЬНАЯ ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ПОЛИТИКА РОССИИ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ...»

«Абрамов Александр Геннадьевич БИОЛОГО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ ФОРМИРОВАНИЯ МАТОЧНЫХ КОРНЕПЛОДОВ И СЕМЯН СТОЛОВОЙ СВЕКЛЫ В УСЛОВИЯХ ПРЕДКАМЬЯ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель доктор сельскохозяйственных наук профессор Таланов Иван Павлович Научный консультант доктор...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Юрченко, Оксана Феодосьевна Диагностика и коррекция проявлений личностной изменчивости у подростков из неблагополучных семей Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Юрченко, Оксана Феодосьевна.    Диагностика и коррекция проявлений личностной изменчивости у подростков из неблагополучных семей [Электронный ресурс] : Дис. . канд. психол. наук  : 19.00.01. ­ Ставрополь: РГБ, 2006. ­ (Из фондов Российской...»

«Семененко Григорий Михайлович КРИМИНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ УМЫШЛЕННОГО УНИЧТОЖЕНИЯ ИЛИ ПОВРЕЖДЕНИЯ ЧУЖОГО ИМУЩЕСТВА ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата юридических наук 12.00.08 — уголовное право и криминология; уголовно-исполнительное право Научный руководитель :...»

«АШИЕВ АРКАДИЙ РУСЕКОВИЧ ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ ГОРОХА (PISUM SATIVUM L.) И ЕГО СЕЛЕКЦИОННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В УСЛОВИЯХ ПРЕДУРАЛЬСКОЙ СТЕПИ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук...»

«из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ СоБашников, Сергей Викторович 1. Букгалтерский и налоговый учет докодов и раскодов коммерческой организации 1.1. Российская государственная Библиотека diss.rsl.ru 2005 СоБаигникоБ, Сергей Викторович Букгалтерский и налоговый учет докодов и раскодов коммерческой организации [Электронный ресурс]: Дис.. канд. экон. наук : 08.00.12.-М.: РГБ, 2005 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки) Букгалтерский учет, статистика Полный текст:...»

«Невоструев Николай Алексеевич ОБРАЗОВАНИЕ И РАЗВИТИЕ ЭЛЕМЕНТОВ РОССИЙСКОГО ГРАЖДАНСКОГО ОБЩЕСТВА НА УРАЛЕ ВО ВТОРОЙ ПОЛОВИНЕ ХIХ – НАЧАЛЕ ХХ ВЕКА 07.00.02 – Отечественная история Диссертация на соискание ученой степени доктора исторических наук Научный консультант : доктор исторических наук, профессор М.Г.Суслов Пермь 2006 2 ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«ЗИНОВЬЕВА ИРИНА СТАНИСЛАВОВНА СБАЛАНСИРОВАННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕСУРСОВ В ЭКОНОМИКЕ РЕГИОНОВ МАЛОЛЕСНОЙ ЗОНЫ РОССИИ Специальность 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством (региональная экономика) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора экономических наук Научный консультант – доктор экономических наук, профессор О.А. Степичева Тамбов – СОДЕРЖАНИЕ Введение 1 ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ...»

«Лукичев Александр Николаевич Формирование системы местного самоуправления на Европейском Севере РФ в 1990-е годы (на материалах Архангельской и Вологодской областей) Специальность 07.00.02 – Отечественная история Диссертация на соискание ученой степени кандидата исторических наук Научный руководитель – доктор исторических наук профессор А.М. Попов Вологда – 2004 2...»

«Орлов Константин Александрович ИССЛЕДОВАНИЕ СХЕМ ПАРОГАЗОВЫХ УСТАНОВОК НА ОСНОВЕ РАЗРАБОТАННЫХ ПРИКЛАДНЫХ ПРОГРАММ ПО СВОЙСТВАМ РАБОЧИХ ТЕЛ Специальность 05.14.14 – Тепловые электрические станции, их энергетические системы и агрегаты Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва, 2004 г. -2Расчет свойств газов и их смесей 3.1. Введение В настоящее время теплотехнические расчеты...»

«АФОНИНА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА ФОРМИРОВАНИЕ ГОТОВНОСТИ СТАРШКЛАССНИКОВ К САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ПРИ ПРОФИЛЬНОМ ОБУЧЕНИИ 13.00.01 – Общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация На соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель – доктор...»

«БАРБАКАДЗЕ Екатерина Тамазиевна ГАРАНТИИ ОБЪЕКТИВНОГО И СПРАВЕДЛИВОГО СУДЕБНОГО РАЗБИРАТЕЛЬСТВА ГРАЖДАНСКИХ ДЕЛ В СУДАХ ОБЩЕЙ ЮРИСДИКЦИИ 12.00.15 – гражданский процесс; арбитражный процесс Диссертация на соискание ученой степени кандидата юридических наук Научный руководитель : доктор юридических наук, профессор Викут...»

«Василенко Светлана Владимировна СТАТУСНО-РОЛЕВАЯ ДЕТЕРМИНАЦИЯ КАЧЕСТВА ПРИНЯТИЯ РЕШЕНИЙ СПОРТСМЕНАМИ ГРУППОВЫХ ВИДОВ СПОРТА Специальность 19.00.05 – Социальная психология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата психологических наук Научный руководитель : доктор психологических наук, профессор В. Б. Никишина Курск – Содержание ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВA 1. ТЕОРЕТИКО-МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОБЛЕМЫ СТАТУСНО-РОЛЕВОЙ ДЕТЕРМИНАЦИИ И...»

«УДК 612.821.6; 612.825 НОВИКОВА Маргарита Робертовна РОЛЬ ОРБИТО-ФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫ И ГИППОКАМПА В АДАПТИВНО-КОМПЕНСАТОРНЫХ ПРОЦЕССАХ ПРИ ПОРАЖЕНИИ СТВОЛА МОЗГА КРЫС Специальность 03.00.13 Физиология Биологические наук и Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: Д.б.н., проф. В.П.Подачин Д.б.н. Е.В.Шарова Москва – СОДЕРЖАНИЕ: Стр. ОГЛАВЛЕНИЕ.. ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1....»






 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.