[ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК
Федеральное государственное бюджетное учреждение
«РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР
ИМЕНИ Н.Н.БЛОХИНА» РАМН
На правах рукописи
АРШИНОВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА
ТЕХНОЛОГИЯ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ
ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
ФОТОДИТАЗИНА
14.04.01 – Технология получения лекарств Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
Научный руководитель:
доктор фармацевтических наук, профессор Н.А. Оборотова Москва –
СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений………………………………………………………………. ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………… 1.1. Фотодинамическая терапия и препараты для ее проведения………………………………………………………………………. 1.1.1. Принципы фотодинамической терапии………………………………… 1.1.2. Фотосенсибилизаторы…………………………………………………… 1.1.3. Фотодитазин………………………………………………………………. 1.2. Лиофилизация………………………………………………………………. 1.2.1. Основы процесса лиофилизации………………………………………… 1.2.2. Вспомогательные вещества, применяемые в процессе лиофилизации…………………………………………………………………… Особенности лиофилизации липосомальных лекарственных 1.2. препаратов…………...………...………………………………………………… Заключение…………………………………………………….…………………ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ…………...… 2.1. Материалы………………………………………………………………..…. 2.2. Оборудование………………………………………………………………. 2.3. Статистическая обработка полученных результатов…………………….. 2.4. Методы исследований……………………………………………………… 2.4.1. Стерилизующая фильтрация раствора фотодитазина………………….. 2.4.2. Получение лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина………………………………………………...………………….. Определение растворимости лиофилизированной лекарственной 2.4.3.формы фотодитазина………………………………………………………….… 2.4.4. Определение оптической плотности раствора фотодитазина……...…. 2.4.5. Определение средней массы содержимого флакона…………………… 2.4.6. Определение прозрачности раствора………………………
2.4.7. Определение рН…………………….…………………………………….. 2.4.8. Определение потери в массе при высушивании……………………….. 2.4.9. Спектрофотометрическое определение содержания фотодитазина в лиофилизированной лекарственной форме…………………………………… 2.4.10. Метод тонкослойной хроматографии для качественного анализа лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина……….……..…… 2.5.Получение липосомальной дисперсии фотодитазина…..…..……..……... 2.6. Получение липосомального лиофилизата………………………………… 2.7. Определение размеров липосом с фотодитазином …………………...…. 2.8. Количественное определение фотодитазина в лиофилизированной липосомальной лекарственной форме…………………………………………. 2.9. Определение эффективности включения фотодитазина в липосомы…... Заключение……………………………………………………………………….
ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ЛИОФИЛИЗАЦИИ
РАСТВОРА И ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ДИСПЕРСИИ
ФОТОДИТАЗИНА…………………………………………………………….. 3.1. Разработка технологии лиофилизации раствора фотодитазина………… 3.1.1. Изучение влияния материала используемого для стерилизующей фильтрации на качество раствора фотодитазина……………………………... 3.1.2. Выбор условий замораживания раствора фотодитазина………………. 3.1.2.1.Определение температуры замораживания раствора фотодитазина.... 3.1.2.2. Выбор режима замораживания раствора фотодитазина……………... 3.1.3. Разработка режима сублимационной сушки фотодитазина…………… 3.1.4. Влияние толщины слоя раствора на качество лиофилизата фотодитазина……………………………………………………………………. 3.2. Оптимизация режима лиофилизации липосомальной дисперсии фотодитазина……………………………………………………………………. Заключение………………………………………………………………………ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ХИМИКОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ
ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ФОТОДИТАЗИНА. СТАНДАРТИЗАЦИЯ
ЛЛФ И ЛЛЛФ ФОТОДИТАЗИНА………………………………………….. 4.1. Разработка методики спектрофотометрического определения содержания фотодитазина в лиофилизированной лекарственной форме…………………. 4.1.1. Изучение характера поглощения электромагнитного излучения раствором фотодитазина и лиофилизированным фотодитазином в видимой области спектра…………….……………………………………………………. 4.1.2. Количественное определение действующего вещества в лиофилизированной лекарственной форме фотодитазина…………………… 4.1.3. Валидация методики количественного определения действующего фотодитазина……………………………………………………………………. 4.2. Метод тонкослойной хроматографии для качественного анализа лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина…………………... 4.3. Выбор параметров для стандартизации лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина…………………………………….…….. лиофилизированного фотодитазина…………………………………..……. 4.5. Оценка качества раствора и лиофилизата фотодитазина в процессе хранения………………………………………………………………………... 4.6. Стандартизация лиофилизированной липосомальной лекарственной формы фотодитазина……………………...…………………………………… Заключение……………………………………………………………………... Общее заключение…………………………………………………………….. Общие выводы…………………………………………………………………. Список литературы…………………………………………………………….. Приложения…………………………………………………………………….СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БКРК – базальноклеточный рак кожи ГФ – Государственная Фармакопея ДПФХ – дипальмитоилфосфатидилхолин ЛВ – лекарственное вещество ЛС – лекарственное средство ЛФ – лекарственная форма ЛЛП – лиофилизированный лекарственный препарат ЛЛЛФ – лиофилизированная липосомальная лекарственная форма ЛЛФ – лиофилизированная лекарственная форма ПВП – поливинилпирролидон ПЭГ – полиэтиленгликоли РСО – рабочий стандартный образец СОВС – стандартный образец вещества-свидетеля ТСХ – тонкослойная хроматография УФ – ультрафиолет ФД – флуоресцентная диагностика ФДТ – фотодинамическая терапия ФЛ - фосфолипид ФС – фотосенсибилизатор ФСП – фармакопейная статья предприятия ЯФХ – яичный фосфотидилхолин Тм. – температура формирования матрицы Тф.п. – температура фазового перехода DSPE-PEG-2000 1,2-дистеароил-глицеро-3-фосфоэтаноламинN-[метокси(полиэтилен- гликоль)-2000] аммониевая сольВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования В современной онкологической практике широкое распространение получил метод фотодинамической терапии (ФДТ), принцип лечебного воздействия которого основан на избирательном накоплении в ткани опухоли светочувствительных веществ – фотосенсибилизаторов (ФС), которые при лазерном облучении в результате фотохимической реакции продуцируют синглетный кислород и кислородсодержащие свободные радикалы, вызывающие гибель опухолевых клеток. В связи с этим актуальным является поиск и разработка стабильных лекарственных форм ФС, проявляющих высокую фотодинамическую активность.синтезированный в научно-производственной фирме ООО «ВЕТА-ГРАНД»
(Россия) и представляющий собой N-диметилглюкаминовую соль хлорина е6.
В настоящее время для клинического применения разрешена инъекционная лекарственная форма данного хлоринового ФС - «ФОТОДИТАЗИН®, (Регистрационное удостоверение № ЛС-001246 от 18.05.2012 г). Кроме того с целью увеличения избирательности противоопохулевого действия фотодитазина в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН разработана новая липосомальная лекарственная форма [32]. Высокая реакционная способность, гидролитическая нестабильность, чувствительность к действию света раствора фотодитазина определяют необходимость использования сублимационной сушки в процессе создания устойчивых лекарственных форм, как в случае с концентратом, так и в случае липосомальной дисперсии фотодитазина.
регламентирующих требования к качеству лиофилизированных препаратов.
Однако сублимационно-высушенные лекарственные средства имеют ряд характерных особенностей. Поэтому исследования по разработке и стандартизации лиофильно-высушенных «сухих инъекций» отечественного препарата фотодитазин являются актуальными.
Цель работы Целью настоящего исследования являлась разработка технологии и стандартизация лиофилизированных лекарственных форм фотодитазина, обеспечивающих стабильность препарата.
Задачи исследования:
1. Разработать технологию получения стабильной при хранении лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина.
липосомальной дисперсии фотодитазина.
лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина.
4. Выбрать показатели качества для стандартизации разработанных лиофилизированных препаратов фотодитазина и изучить их стабильность в процессе хранения.
Методы исследования Основными методами, применяемыми при проведении исследований, являлись:
фильтрация, получение липидной пленки, экструзия, сублимационная сушка);
(спектрофотометрия, тонкослойная хроматография, потенциометрия, лазерная спектроскопия рассеяния).
Научная новизна исследования лиофилизированная лекарственная форма фотодитазина – «Фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инфузий 25 мг», сохраняющая заявленные физико-химические свойства на протяжении всего срока хранения. Разработаны методики качественного и количественного анализа лиофилизированной лекарственной формы фотодитазина.
лиофилизированной липосомальной лекарственной формы фотодитазина – «Фотодитазин липосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 5 мг», обеспечивающая получение лекарственного препарата стабильного в течение не менее 1 года.
Практическая значимость Технология получения лиофилизированных лекарственных форм фотодитазина внедрена в работу лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. Методики фармацевтического анализа данных лекарственных форм внедрены в работу лаборатории химико-фармацевтического анализа НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН.
приготовления раствора для инфузий 25 мг» и лабораторный регламент на «Фотодитазин липосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 5 мг».
фармакологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова учебное пособие «Разработка инъекционных сублимационно-высушенных (фотосенсибилизаторов) на основе производных хлоринового ряда».
Положения, выносимые на защиту 1. Технология получения препарата «Фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инфузий 25 мг».
«Фотодитазин липосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 5 мг».
3. Методики химико-фармацевтического анализа лекарственной формы «Фотодитазин, лиофилизат для приготовления раствора для инфузий 25 мг»:
качественный хроматографический анализ и количественное спектрофотометрическое определение фотодитазина в лиофилизированной лекарственной форме.
лиофилизированных лекарственных форм фотодитазина по выбранным параметрам и изучение их стабильности в процессе хранения.
Апробация работы Материалы научных исследований по теме диссертации представлены международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты»
(22-23 марта 2011 г., Москва; 31 мая – 01 июня 2012 г., Нижний Новгород).
Апробация диссертационной работы прошла 13 февраля 2014 г. на межлабораторной научной конференции НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им.
Н.Н. Блохина» РАМН.
По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, включая 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
фармацевтической науки Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научноисследовательских работ НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН по теме: «Создание технологии лекарственных форм противоопухолевых препаратов с организацией производства» (№ гос. регистрации 01.200.809454 шифр 343).
Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, глав результатов собственных исследований, общего заключения, общих выводов, списка литературы и приложения.
Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 31 рисунок и 18 таблиц. Библиографический список включает наименований, в том числе 119 на иностранном языке.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Фотодинамическая терапия и препараты для ее проведения Поиск эффективных и щадящих методов лечения злокачественных опухолей ведется по разным направлениям и одним из наиболее актуальных, несомненно, является ФДТ [24, 103, 153]. Преимуществами данного вида лечения являются:отсутствие тяжелых местных и системных осложнений;
возможность лечения больных с тяжелой сопутствующей возможность многократного повторения лечебного процесса.
расположенных опухолях кожи [130, 136], слизистых оболочек внутренних полых органов, легкого, опухолях стенозирующих дыхательные пути [111, 114, 147] и пищеварительный тракт [80], распространенных первичных и метастатических опухолях, не чувствительных к химиотерапии и лучевой терапии [13, 57, 85], а также опухолях мозга [124].
1.1.1. Принципы ФДТ ФДТ представляет собой способ терапевтического воздействия, который заключается в избирательном накоплении ФС опухолевыми клетками (после внутривенного или местного введения) с последующим облучением опухоли лазерным или нелазерным источником света с длиной волны, соответствующей спектру поглощения ФС [5, 26, 39, 79]. При данном методе лечения свет выполняет функцию адресации воздействия и является источником энергии (рис.1). Благодаря нему в присутствии кислорода, растворенного в тканях, происходит фотохимическая реакция с генерацией синглетного кислорода (1О2) или супероксида (О2-) [105, 113], которые повреждают мембраны и органеллы опухолевых клеток и вызывают их гибель за счет некроза [6] или апоптоза [2, 78].
Рис.1. Стадии фотодинамической терапии: I – введение фотосенсибилизатора (ФС); II – накопление; III – активация;
В настоящее время фотохимические реакции, названные процессами фотосенсибилизации, при которых используется кислород, разделяют на два типа в зависимости от первичного вовлечения радикальных посредников [12].
взаимодействие возбужденного светом ФС с субстратом и образование переходных радикалов, которые вступают в реакцию с кислородом (рис.2).
Поглощая кванты света, молекула переходит из основного состояния (S0) в возбужденное состояние (S1). В последующем может происходить либо обратный переход в основное состояние с излучением кванта света (флуоресценция), либо триплетная форма сенсибилизатора (Т1) начинает взаимодействовать с биологическими молекулами и, отнимая у них электроны или атомы водорода, инициирует образование свободных радикалов, вызывающих окисление [98]. Этот тип реакции, по существу, представляет собой фотоинициированную аутооксидацию.
В фотохимической реакции второго типа перенос энергии происходит из возбужденного триплетного состояния ФС (Т1) на молекулярный кислород с образованием его синглетной формы. Несмотря на то, что в биологических
«