Государственное бюджетное общеобразовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Амурская государственная медицинская академия»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

Андросова Ольга Геннадьевна

ВЛИЯНИЕ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА НА ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ

ЛИПИДОВ В УСЛОВИЯХ ХОЛОДОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ

(экспериментальное исследование) 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор В.А. Доровских Благовещенск –

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ…

Классификация флавоноидов

Биосинтез флавоноидов в растениях

2.3. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.3.1. Морфофункциональная характеристика печени интактных крыс.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АО антиоксидант АОА антиокислительная активность АОС антиоксидантная система АТФ-аза аденозинтрифосфатаза АФК активные формы кислорода БАВ биологически активные вещества БМ биологические мембраны Г-6-Ф-ДГ глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа Г-S-Т глутатион-S-трансфераза ГП гидроперекиси ГР глутатионредуктаза ДК диеновые конъюгаты ДКВ дигидрокверцетин ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота МДА малоновый диальдегид НАД+ окисленный никотинамидадениндинуклеотид НАДН восстановленный никотинамидадениндинуклеотид НАДФ+ окисленный никотинамидаденидинуклеотид фосфат НАДФН восстановленный никотинамидадениндинуклеотид фосфат НЖК ненасыщенные жирные кислоты ПНЖК полиненасыщенные жирные кислоты ПО прооксидант ПОЛ перекисное окисление липидов ППОЛ продукты перекисного окисления липидов СОД супероксиддисмутаза СР свободный радикал СРО свободнорадикальное окисление ТБК тиобарбитуровая кислота

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Адаптационные реакции организма, их механизмы и возможности оптимизации, пути и способы повышения резистентности организма к неблагоприятным воздействиям различной природы остаются в ряду важных проблем фармакологии и патофизиологии (Гаркави Л.Х., 1990;

Меерсон Ф.3., 1993; Новиков В.С., 1998; Малов Ю.С., 2001; Агаджанян Н.А., 2002; Пшенникова М.Г., 2002; Лесовская М.И., 2003; Миронова Г.В., 2007;

Minois N., 2000; Guillot G., 2002). Решение проблемы приспособления человека и животных к температурным условиям окружающей среды возможно только на основе глубокого понимания естественных механизмов резистентности к охлаждению, среди которых необходимое в условиях воздействия низких температур повышение устойчивости липидов мембран к повреждающему действию кислородных радикалов (Симонова Н.В., 2004; Павлов А.С., 2007;

Шаповаленко Н.С., 2011). Холод традиционно рассматривается как прооксидантный фактор (Borodin Е.А., 1993; Доровских В.А., 2006), причем как однократное холодовое воздействие, так и многократное охлаждение организма животных ведет к активации процессов перекисного окисления липидов с увеличением количества первичных и вторичных продуктов ПОЛ (Эмирбеков Э.З., 1998; Зенков Н.К., 2004; Новоселова А.А., 2009; Ли О.Н., 2011). Известно, что в интактной клетке оксидативные процессы находятся под строгим и чрезвычайно разнообразным контролем ферментативных и неферментативных систем, поэтому скорость оксидазных реакций невелика и природные прооксиданты (ППОЛ, АФК, система NO и др.) находятся на низком стационарном уровне (Владимиров Ю.А., 1998; Кулинский В.И., 1999; Козлов Ю.П., 2006; Masuda T, Miura Y, Inai M, Masuda A., 2013). Получены также убедительные данные, что оксидативная деградация, возникающая вследствие накопления избытка продуктов окисления, способна вызывать «оксидативный стресс», являющийся результатом общей неспецифической реакции клеток и организма на внешние воздействия. При этом в клетках и тканях происходит изменение соотношения между стационарными уровнями антиоксидантов (АО) и прооксидантов (ПО). Специфика нарушений оксидативных процессов при различных заболеваниях заключается в характере и степени изменений конкретных компонентов АО и ПО (Кудряшов Ю.Б., 2000; Оковитый С.В., 2005). Обращая внимание на процессы липопероксидации в биологических мембранах, следует отметить, что хотя этот процесс развивается в липидной фазе клетки, многие стадии этой сложной системы реакций окисления протекают и в водной среде (Владимиров Ю.А., 2000; Sato M, Murakami K, Uno M, Nakagawa Y., 2013), поэтому часть эндогенных защитных систем в клетке локализована в липидах биологических мембран, часть – в водной фазе, среди которых: ферменты внутриклеточной защиты (каталаза, пероксидаза, супероксиддисмутаза, цитохромом-с-450 и др.), ферменты, контролирующие уровень NO• (Вартанян Л.С., 2000; Меньщикова Е.Б., 2000; Рябченко Н.И., 2001), низкомолекулярные антиоксиданты (тиолы, биогенные амины, пептиды, билирубин, фенолы, микроэлементы, ионы металлов переменной валентности) (Кулинский В.И., 1990; Владимиров Ю.А., 1992; Скулачев В.П., 1996; Болдырев реализуются антиоксидантные механизмы защиты, приводящие к разрушению восстановлению их стационарного уровня, что приобретает особую значимость антиоксидантной защиты организма в условиях недостатка естественных антиоксидантов (витамины Е, С, А, селен и пр.) на фоне загрязнения воздуха, воды и продуктов, повышенного ультрафиолетового облучения способствует формированию так называемого "оксидативного стресса", проявляющегося на молекулярном, клеточном и организменном уровне (Ших Е.В., 2002; Скальная М.Т., 2003; Borodin E.A., 1993; Dorovskikh V.A., 1993; Simonova N.V., 2009).

Подобный стресс является патогенетическим моментом в развитии многих заболеваний (воспалительных, бронхо-легочных и сердечно-сосудистых и т.д.) (Меньщикова Е.Б., 1993; Sato M, Murakami K, Uno M, Ikubo H, Nakagawa Y., 2013; Collins A., 1994).

свободнорадикального окисления в условиях холодового стресса является возможностей теплокровного организма к повреждающему воздействию холода при помощи модификаторов биологического действия, в число которых входят растительного происхождения, обладающие низкой токсичностью, высокой поливалентностью лечебного действия, находят все большее применение в медицинской практике (Гольдберг Е.Д., 2000; Турищев С.Н., 2000; Рабинович А.М., 2001; Зиновьев А.И., 2003; Разина Т.Г., 2006; Громовая В.Ф., 2008;

Симонова Н.В., 2012; Хобракова В.Б., 2012). Широкое поле деятельности для поиска АО представляют соединения флавоноидной природы (Плотников М.Б., 2000; Ломбоева С.С., 2008; Areias F.M., Rego A.C., Oliveira C.R., 2001), повсеместно встречающиеся в клетках зеленых растений (Лукьянова Л.Д., Германова Э.Л., Лыско А.И., 2007) и являющиеся объектом значительного научного и терапевтического интереса, изучение которых свидетельствовало о наличии антиоксидантных свойств у многих представителей данного класса (Тюкавкина Н.А., 1996; Кушнерова Н.Ф., 2003; Макаров В.Г., 2005; Толкачева А.В., 2010; Arora A., Nair M.G., Strasburg G.M., 1998; Arora A., Byrem T.M., Nair M.G., 2000; Pietta P.-G., 2000; Williams R.J., 2004; Prochazkova D., 2011), в частности у дигидрокверцетина (Мельникова Н.Б., Иоффе И.Д., Лапин А.Ю., 2002; В.А. Бабкин, Ю.А. Малков, Л.А. Остроухова, 2003; Доровских В.А., Целуйко С.С., Тимофеев К.В, 2007). Дигидрокверцетин – флавоноид антиоксидантной группы Р-витаминов, который на сегодняшний день используется в качестве гемореологического, капилляро-, гепато- и онкопротекторного средства (Белошапко А.А., Шкарятов А.А., Кузнецов Ю.Б., 1995; Тесёлкин Ю.О., Жамбалова Б.А., Бабенкова И.В., 1996; А. Шакула, В.

Некрасов, А. Щегольков, 2008; Доровских В.А., 2012; Vacek J, Papouskova B, Vrba J, Zatloukalova M, 2013). По сравнению со всеми известными, в том числе и синтетическими, антиоксидантами дигидрокверцетин является эталонным продуктом: его антирадикальная активность проявляется при концентрациях 10-4 – 10-5 % на фоне полного отсутствия мутагенной активности для человека, эмбриотоксического и тератогенного эффектов, аллергизирующего и токсического действия (Белошапко А.А., Шкарятов А.А., Кузнецов Ю.Б., 1995;

Жанатаев А.К., Кулакова А.В., Насонова В.В., Дурнев А.Д., 2008). Доказано, что дигидрокверцетин обладает мембранопротекторным действием (Мельникова Н.Б., 2002; Куркин В.А., Рыжов В.М., Бирюкова О.В., 2008), проявляет свойства антиоксиданта в различных модельных системах окисления (Бабкин В.А., Малков Ю.А., Остроухова Л.А., 2003), в частности, тормозит фотоокисление люминала (Тесёлкин Ю.О., Жамбалова Б.А., Бабенкова И.В., 1994), окисление этилбензола, инициированное азобисизобутиронитрилом (Тесёлкин Ю.О., Бабенкова И.В., Клебанов C.В., 2000), а также свободнорадикальное окисления липосом из яичных фосфолипидов, индуцированное с помощью системы Fe2+-аскорбат (Тесёлкин Ю.О., Жамбалова Б.А., Бабенкова И.В., 1996) или фотосенсебилизированное производными гематопорфирина при облучении гелий-неоновым лазером (Klebanov C., Teselkin Yu.O., Babenkova I.V., 1996).

Вместе с тем, результаты изучения антиоксидантного действия различных доз дигидрокверцетина в условиях холодового стресса не нашли отражения в литературе, что послужило основанием для проведения настоящих исследований.

Выполненная работа является самостоятельным подразделом темы Амурской государственной медицинской академии «Механизмы изменения реактивности и резистентности организма, их влияние на развитие и течение патологических процессов в условиях экстремальных воздействий факторов внешней среды: пути повышения резистентности и стимуляции адаптивных процессов, их коррекция» (номер Гос. Регистрации 01.9.6000.3989).

Цель исследования: изучить эффективность применения различных доз дигидрокверцетина в коррекции процессов перекисного окисления липидов биомембран в теплокровном организме в условиях холодового стресса.

Поставленная цель определила необходимость решения следующих задач:

1. Изучить влияние дигидрокверцетина на интенсивность процессов антиокислительного действия в условиях in vitro;

дигидрокверцетина при холодовом воздействии in vivo;

1. Выявить наиболее оптимальную дозу дигидрокверцетина, способную предотвратить прооксидантное действие низких температур в различные сроки в условиях in vivo;

1. Провести сравнительный анализ антиокислительного эффекта дигидрокверцетина с антиокислительным эффектом альфа-токоферола в экспериментах in vivo в условиях холодового воздействия;

1. Изучить морфофункциональные параметры ткани печени при охлаждении в различные сроки на фоне введения различных доз дигидрокверцетина и токоферола.

Проведено исследование влияния дигидрокверцетина на процесс перекисного окисления липидов в мембранах микросом печени крыс.

Впервые изучены антиоксидантные свойства дигидрокверцетина при холодовом воздействии.

Впервые проведено комплексное биохимическое и морфологическое исследование печени лабораторных животных при действии холода на фоне применения дигидрокверцетина.

Изучено влияние дигидрокверцетина на теплокровный организм в условиях длительного холодового воздействия, на сроки адаптации к холоду, мембраномодулирующее действие в условиях воздействия низких температур.

Получены данные о потенцирующем влиянии дигидрокверцетина на характер адаптационных процессов, развивающиеся в организме при действии холода.

Впервые проведен сравнительный анализ антиокислительного эффекта дигидрокверцетина с антиокислительным эффектом альфа-токоферола при воздействии на организм низких температур, при этом оценено состояние антиокислительной системы организма и процессов перекисного окисления липидов in vivo.

Практическая значимость работы и внедрение результатов профилактики патогенного воздействия холода на организм.

Получен ряд новых экспериментальных данных, обуславливающих использовании дигидрокверцетина.

Результаты работы могут послужить основанием для дальнейших исследований в направлении поиска природных антиоксидантов, обладающих высокой биологической ценностью.

Полученные в исследовании данные являются основой для рекомендации к практическому использованию дигидрокверцетина в качестве средства, облегчающего адаптацию организма к действию низких температур. Введение дигидрокверцетина, эффективность которого получила биохимическое и морфологическое обоснование, может быть рекомендована для коррекции состояний, сопровождающихся активацией ПОЛ в организме.

Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на кафедре фармакологии и гистологии при подготовке специалистов в постдипломного образования ГБОУ ВПО АГМА.

Выполненная работа является одним из этапов разрешения и внедрения в практическое здравоохранение новых антиоксидантов.

конференциях и симпозиумах международного, российского и регионального уровней: VI Международной российско-китайской конференции (Россия, Благовещенск, 2009); The 2th China, Japan and Korea international conference for TCM and The 7th Sino-Russia Biomedical Forum (Китай, Харбин, 2010);

расширенном заседании кафедр фармакологии, гистологии, биохимии, патофизиологии и проблемной комиссии ГБОУ ВПО Амурская государственная медицинская академия (Благовещенск, 2013). Основные положения и материалы диссертации представлены в виде докладов, стендовых сообщений, обсуждены на IX, X, XI региональных научно-практических конференциях «Молодежь XXI века: Шаг в будущее» (г. Благовещенск, 2008, 2009 и 2010 гг.), на XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2009 г.).

Работа поддержана государственным грантом по проекту «Ступени в будущее российской науки» на материально – техническую поддержку молодых ученых Амурской области в 2010 г.

По материалам диссертации опубликовано 5 статей, в том числе 3 – в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, состоит из введения, аналитического обзора научной литературы, описания методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы. Работа содержит 15 таблиц, 18 рисунков. Список литературы включает 242 источника, в том числе 89 – зарубежных.

Основные положения, выносимые на защиту:

НАДФН-зависимого ПОЛ в микросомах печени дигидрокверцетин проявляет выраженный антиоксидантный эффект.

1. В условиях in vivo при активации процессов ПОЛ в организме животных влиянием низких температур введение дигидрокверцетина приводит к снижению содержания продуктов ПОЛ на фоне увеличения активности компонентов АОС (каталаза, Гл-6-Ф-ДГ, церулоплазмин, витамин Е) в крови и ткани печени.

1. Антиоксидантный эффект дигидрокверцетина находится в обратной зависимости от дозы вещества и срока применения.

1. Антиоксидантный эффект дигидрокверцетина в дозе 0,1 мг/кг в условиях in vivo более выражен, чем аналогичный эффект токоферола на фоне холодовой нагрузки.

дигидрокверцетина в дозе 0,1 мг/кг приводит к нормализации морфофункциональных изменений в ткани печени.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Вектор движения человечества во времени, называемый развитием, неизбежно подразумевает появление новых факторов, изменяющих среду обитания людей. При этом параллельно во времени изменяется система динамических взаимоотношений между живыми объектами, включая человека, и средой. Для установления некоторого равновесия между указанными составляющими необходимо время. И если скорость изменения среды не слишком критична, живые объекты, по-видимому, способны адаптироваться к новым условиям их обитания (Малов Ю.С., 2001; Агаджанян Н.А., 2002;

Доровских В.А. и соавт., 2006). Приспособление человека и животных к температурным условиям окружающей среды – одна из важнейших проблем современной медико-биологической науки. При этом более напряженными представляются процессы адаптации к низким температурам, которые являются элементом формирования экологического стресса, приводящего к развитию различных дизрегуляционных процессов, направленных на трансформацию сложившегося гомеостаза (Ланкин В.З., 1994; Павлов А.С., 2001; Литвинов Н.Н., 2004). Холодовой стресс, как один из видов экологического стресса, для жителей Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера по степени интенсивности относится к хроническим (длительным), следствием воздействия которого является нарушение обеспечения механизмами нервной и гормонально-гуморальной регуляции поддержания гомеостаза их функций и саногенетических взаимоотношений составных компонентов функциональных систем, что влечет за собой преждевременную морфофункциональную деградацию отдельных органов и биосистемы в целом (Меерсон Ф.З., 1993;

Доровских В.А., 1998; Павлов А.С., 2007; Миронова Г.В., 2007; Новоселова А.А., 2009).

Современные технические устройства и технологии все более эффективно устраняют воздействие на человека природных, производственных и бытовых факторов, однако переохлаждение организма и формирование его устойчивости к холоду остается практически значимой проблемой медицины. Острое холодовое воздействие принято рассматривать как стрессорную реакцию, включающую активацию симпатической и гипофизарно-адреналовой систем (Колпаков А.Р. с соавт., 1993; Кондратьев Б.Ю., Rogovski V.S, Matiushin A.I, Shimanovski N.L., 2011; Friedman B.H., 1996; Shibahara N., 1996; Weller A.S., 1997). По данным Т.В. Ласуковой с соавторами (1994), при остром холодовом воздействии уровень кортизола в крови крыс возрастал на 40%. Одновременно достоверно снижалась флюоресценция катехоламинов в надпочечниках и миокарде, что свидетельствует об активации симпато - адреналовой системы и освобождении депонированных катехоламинов. Высокие концентрации катехоламинов, действуя опосредованно через аденилатциклазную систему, вызывают увеличенное вхождение в клетки ионов Са 2+, избыток которого в сочетании с избытком свободных жирных кислот приводит к разобщению окисления с фосфорилированием в митохондриях. Следствием этого является активизация липолиза, усиление генерации активных метаболитов кислорода и процессов перекисного окисления липидов, что приводит к нарушению структуры клеточных мембран, утрате мембранами барьерной функции, нарушению ионного гомеостаза и энергетического баланса клетки, а в конечном итоге к разрушению мембран, снижению функциональной активности клеток и их гибели (Косолапов В.А. и соавт., 1998; Dixon D.P., Edwards R.J., 2010).

I.1. Биологические мембраны. Роль в жизнедеятельности клетки Важнейшее условие существования клетки, и, следовательно, жизни – нормальное функционирование биологических мембран, поскольку мембраны – неотъемлемый компонент всех клеток.

В настоящее время общепринятой моделью строения мембран является жидкостно-мозаичная, предложенная в 1972 году С. Синджером и Дж.

Николсоном. Основу строения мембраны составляет двойной молекулярный слой липидов, выполняющий две основные функции – барьерную и матричную:

мембраны отделяют содержимое клеток и внутриклеточных органелл от окружающей среды, с барьерной функцией мембран также связаны метаболическая специализация отдельных клеточных органелл и возникновение на мембранах ионных градиентов, представляющих одну из конвертируемых форм энергии (Kim Y.A., Tarahovsky Y.S., Yagolnik E.A., 2013).

Химическая природа липидов, входящих в состав мембран, различна. Это и фосфолипиды, и гликолипиды, и стероиды, и нейтральные жиры. Но основную массу (55 – 57 %) мембранных липидов составляют фосфолипиды (Миронова Г.В., Кривошапкина З.Н., Олясова Л.Д., 2007).

Важным липидным компонентом мембран является холестерин, который участвует в «упаковке» и обеспечении необходимой подвижности липидных цепей биомембран. Геометрические особенности молекулы холестерина, в частности жесткость ее кольцевых цепей, позволяют холестерину играть роль регулятора надлежащего агрегатного состояния двухслойной липидной части мембран. В зависимости от типа мембраны холестерин обладает двояким эффектом: он может как уплотнять их, так и разжижать, тем самым делая мембраны более или менее подвижными. Кроме того, молекулы холестерина, по-видимому, выполняют роль мембранного амортизатора – они способствуют локализации и затуханию случайных механических нарушений упорядоченности липидных цепей в мембранах (Виноградова О.А. 2012;

Shubina V.S., Shatalin Y.V., 2012). Дальнейшая организация липидных мембран определяется структурой и свойствами белковых молекул, расположенных на поверхности и внутри мембраны. Внешние (периферические) белки и белковые комплексы электростатически фиксируются на полярной поверхности липидного слоя и способны переходить в цитозоль под действием различных побудительных клеточных механизмов, а внутренние (интегральные) или свободно плавают в липидном бислое (причем большая часть молекулы может быть погружена в мембрану, а меньшая – в окружающую водную среду), или же пронизывают мембрану насквозь. Белки природных мембран, как правило, плохо растворимы в воде и способны объединяться в комплексы с липидами.

Встроенные в фосфолипидную матрицу биомембран молекулы белков выполняют роль ферментов, переносчиков, каналов и рецепторов. Третий компонент биомембран – углеводы, которые в совокупности с молекулами липидов образуют гликолипиды, а с молекулами белков – гликопротеиды. Их углеводные цепи построены из 9 типов простейших сахаров, в том числе глюкозы, галактозы, ксилозы. При этом если каждая молекула гликолипида имеет одну углеводную цепь, то у гликопротеидов их может быть несколько. В свою очередь те и другие в составе мембран за счет своих углеводных (сахарных) остатков образуют так называемый гликокаликс – наружное полисахаридное покрытие клеточной поверхности, которое в значительной степени определяет способность клеток принимать химические сигналы и реализовать межклеточные взаимодействия. Кроме того, гликолипиды и гликопротеиды участвуют в формировании иммунитета, взаимном распознавании клеток и выполняют ряд других функций.

Мембрана представляет собой динамическую структуру. Наиболее подвижным компонентом в ней являются липиды. Они довольно свободно двигаются в плоскости липидного слоя (латеральное перемещение), меняя своих «соседей» в среднем раз/сек. Молекулы белков также могут перемещаться латерально в плоскости мембраны. Возможно также, что белковые молекулы вращаются вокруг перпендикулярных и параллельных функционировании макромолекул и мембран в целом. Однако белки распределены в мембране не статистически, образуя участки с различными функциями. Иначе говоря, белковые молекулы не абсолютно свободно перемещаются в плоскости мембраны, поскольку могут существовать взаимодействия между отдельными белковыми молекулами и, кроме того, между белками мембран и цитоскелетом клетки: структурными белками, микрофиламентами, микротрубочками, примыкающими к мембране изнутри. В свою очередь расположение белковых молекул в мембране оказывает влияние на распределение и ориентацию липидных молекул в зависимости от сродства конкретных белков и липидов.

Подвижность мембранных молекул в значительной мере зависит от состава жирных кислот. Более упорядоченной и стабильной является структура мембран, содержащая большое число насыщенных жирных кислот в фосфолипидах, менее упорядоченной – содержащая значительные количества ненасыщенных жирных кислот. При оптимальных для жизнедеятельности жидкокристаллическое состояние (промежуточное между жидким и твердым).

Это состояние обусловлено, прежде всего, наличием в мембранах системы липид – белок – вода, формирующей различного типа упорядоченные структуры, обладающие в то же время определенной подвижностью. Такое состояние мембран оказывает существенное влиянием на их функционирование и объясняет большую чувствительность к различным внешним факторам.

Соседние клетки одной ткани должны сообщаться друг с другом для того, чтобы координировать свою жизнедеятельность и функционировать как целое в соответствии со спецификой ткани. Такое сообщение достигается с помощью специальных коротких “трубочек”, которые собраны в дискообразные структуры в местах так называемых щелевых контактов. Каждая трубочка состоит из двух цилиндрических белковых молекул – коннексонов. Молекула коннексона частично погружена в клеточную мембрану, а ее выступающая часть способна связываться в межклеточном пространстве с коннексоном соседней клетки, так что образуется непрерывный канал, соединяющий внутренне пространство двух клеток (Бизето М.Ф., Петрухов К.Х., 2001;

Доровских В.А. и соавт., 1992, 1995; Егоров К.Е., 1996).

Таким образом, природа сделала мембраны носителями жизненно важных биомолекул, выполняющих определенную биологическую роль: на мембранах осуществляются процессы рецепции сигналов окружающей среды (гормоны, медиаторы, другие БАВ, антитела, лекарства) (Волчегорский И.А., Долгушин И.И., 2000; Cheng H.B., Liu X.Q., Chen K.L., 2013); через мембраны происходит активный и пассивный транспорт веществ и ионов, в котором задействованы встроенные в липидный бислой мембран переносчики и каналы (Бородин Е.А., 1992; Суханова Г.А., 2000); в плазматической мембране клетки и мембранах клеточных органелл локализованы важнейшие ферментные системы (Edmunds L.N., 1994; Levenson R., 1994; Lingrel J.B., 1994). Поэтому повреждение структуры биомембран, нарушение их функций приводят к тяжелым нарушениям жизнедеятельности клеток, которые, в свою очередь, сопровождаются развитием патологических состояний на уровне целого организма (Halliwell B.,1993). Наиболее тяжелые последствия вызывает повреждение липидного слоя мембран (Адо А.Д., Новицкий В.В., 1994; Comporti M., 1993; Covacs P., 1996).

I.2. Основные механизмы повреждения биологических мембран.

Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов В условиях патологии нарушаются как барьерная, так и матриксная функция липидного бислоя биологических мембран (Владимиров Ю.А., 1989).

Ю.А. Владимиров (1989) выделяет 4 важнейших молекулярных механизма нарушения барьерной функции мембран, к числу которых относятся:

1. Активация ПОЛ;

2. Действие эндогенных фосфолипаз;

3. Механическое (осмотическое) растяжение мембран;

4. Адсорбция на липидном слое чужеродных белков (полиэлектролитов).

Все эти процессы возникают при различных патологических состояниях, нередко сопутствуют друг другу, приводят к увеличению проницаемости мембран, имеющему следствием развитие дефицита макроэргов и постепенное исчезновение градиентов ионов. В конечном итоге происходит фрагментация мембран и гибель клеток (синдром цитолиза).

Из перечисленных механизмов повреждения мембран наиболее подробно выяснена роль активации ПОЛ (Бородин Е.А., 1989; Бородин Е.А., 1992;

Naumov A.A., Shatalin Y.V., Sukhomlin T.K., 2009). С учетом целей и задач настоящего исследования перейдем к рассмотрению именно этого механизма.

Согласно теории перекисного окисления, сформулированной в 1897 г. А.

Бахом и Р. Энглером (Chernyak Y.I., Shchukina O.G., 2009), процесс образования перекисей липидов имеет цепной, свободнорадикальный механизм и начинается с появления в системе активных форм кислорода (АФК), в частности супероксидного анион-радикала.

Супероксидный анион-радикал (02) представляет собой первичный интермедиат ионно-радикального окисления, является промежуточным продуктом окислительно-восстановительных процессов и обладает высокой реакционной способностью. В тканях организма супероксидный анион-радикал генерируется: при неферментативном спонтанном самоокислении ряда химических соединений, особенно при наличии в их составе металлов переменной валентности; как основной или побочный продукт при ферментативных окислительно-восстановительных реакциях, протекающих в присутствии 02: при так называемом «дыхательном взрыве» в процессе фагоцитоза в результате окисления НАДФН молекулярным кислородом.

НАДФН + 202 НАДФ++ Н+ + 2(02-) Токсическое действие 02 наблюдается при усилении процессов, связанных с его генерацией или при нарушении действия антиоксидантной защиты.

Супероксидный анион-радикал может вызвать необратимое ингибирование ряда ферментов за счет окисления триптофана, сульфгидрильных групп;

выступая в качестве ингибиторов глутатионпероксидазы, каталазы, ряда мембраносвязанных ферментов, он более эффективен, чем другие реакционно-способные метаболиты 02.

В результате реакции дисмутации радикалов супероксида образуется перекись водорода:

В присутствие ионов железа супероксидный радикал и перекись водорода вступают в двухстадийную реакцию Хабера-Вейса с образованием гидроксильных радикалов, которые являются непосредственными радикалами убийцами».

Fе3 + + О2- Fе2++ О2 (I) Fе2+ + H2О2 Fе3+ + ОН- + ОН* (II) (реакция Фентона) (реакция Хабера - Вейса) Одним из основных субстратов свободнорадикальных реакций являются насыщенные жирные кислоты, широко представленные в составе липидов мембран. В ходе первой, инициирующей ПОЛ, реакции образуется перекись водорода и радикал жирной кислоты (реакция инициирования цепи):

Радикал R* может реагировать с кислородом, образуя перекисный радикал:

Перекисный радикал, в свою очередь, может вступать в реакцию со следующей молекулой жирной кислоты, что приводит к появлению молекулы гидроперекиси и нового радикала жирной кислоты (реакция продолжения цепи):

Чередование двух последних реакций лежит в основе цепного характера окисления:

ROOH ROOH

В присутствии металлов переменной валентности гидроперекиси распадаются с образованием новых радикалов:

Образовавшиеся новые радикалы инициируют появление новых цепей окисления (реакция разветвления цепей) и процесс окисления приобретает самоускоряющийся «взрывной» характер.

Если бы свободные радикалы всегда реагировали только с новыми молекулами органического вещества, то один-единственный радикал рано или поздно превратил бы в перекиси все молекулы вещества. Однако в действительности этого не происходит, и процесс окисления рано или поздно останавливается. Этому способствуют так называемые реакции обрыва цепи, в ходе которых радикалы реагируют друг с другом, с ионами металлов переменной валентности или с антиоксидантами, к числу которых относятся токоферол, женские половые гормоны, тироксин и другие фенольные соединения, с образованием кинетически инертных молекул.

R* + RO2* RO2R (молекулярный продукт) RO2* + Fe2+ + H+ ROOH (молекулярный продукт) + Fe3+ RO2* + InH ROOH + In* (малоактивный радикал) Между моментами появления и исчезновения свободного радикала происходит несколько последовательных циклов реакций с участием радикалов R* и RO2*, в результате чего на каждый появившийся в системе радикал образуется несколько молекул гидроперекисей. Это число характеризует длину цепи, которая ограничивается реакцией обрыва и сокращается в присутствии антиоксидантов, чем и объясняется их действие в качестве ингибиторов свободнорадикальных процессов.

В принципе свободно-радикальному окислению могут подвергаться самые различные органические молекулы, поскольку все формы АФК, с появления которых начинается процесс образования перекисей липидов, обладают высокой цитотоксичностью для клеток и клеточных образований, однако скорость окисления их будет различна. Выделяют четыре мишени окислительной цитотоксической атаки АФК: индукция процессов ПОЛ в биологических мембранах, повреждение мембрансвязанных белков, инактивация ферментов и повреждение ДНК клеток (Пасечник И.Н., 2001).

Аминокислоты, из которых состоят белки, подвержены окислительному физико-химических свойств белков: фрагментации, агрегации и повышению чувствительности к протеолизу. В первую очередь воздействию кислородных радикалов подвергаются остатки пролина, гистидина и аргинина.

Окислительное повреждение приводит к денатурации и агрегации белков (хрусталика глаза). Агрегация белков связана со способностью АФК образовывать межмолекулярные сшивки. В результате денатурации белков нарушается их конформация, и они становятся более уязвимыми к действию протеолитических ферментов (Зенков Н.К., 2004). Окислению АФК в первую очередь подвергаются SН-содержащие группы белков – это приводит к снижению содержания восстановленных и повышению уровня окисленных SН-групп, поэтому соотношение окисленных и восстановленных SН-групп окислительного стресса (Кулинский В.И., 1999).

АФК инактивируют ферменты: наиболее подвержена окислительному стрессу Са2+-АТФаза, повреждение которой приводит к нарушению транспорта кальция через мембрану (Хрусталёва И.Э., Сухопарова Е.П. 2011).

свободно-радикального окисления в живом организме выступают липиды, содержащие остатки полиненасыщенных жирных кислот (Chernyak Y.I., Shchukina O.G., 2009; Cheeseman K.H., 1993), причем энергия разрыва С-Н связи уменьшается с увеличением числа двойных связей в молекуле жирной кислоты. Возникающие в ходе окислительной модификации ненасыщенных жирнокислотных остатков мембранных фосфолипидов полярные группы – спиртовые, карбонильные, эпоксидные, гидроперекисные и другие исполняют роль «гидрофильных пор» в толще гидрофобного бислоя, резко увеличивающих его проницаемость (Бурлакова Е.Б., 1991; Владимиров Ю.А., 1989). В этих условиях клетка испытывает дополнительные энергетические нагрузки, связанные с необходимостью поддержания градиента ионов на поврежденных мембранах, и вынуждена тратить большие количества АТФ на активный транспорт ионов. При более глубоко зашедшем процессе образуются лизоформы липидов, обладающие сильнейшим детергентным действием.

Развивающийся дефицит макроэргов сопровождается постепенным исчезновением градиента ионов на клеточных мембранах, и повреждения фрагментация мембран и гибель клеток (синдром цитолиза) (Владимиров Ю.А., 2000). Наряду с повреждением липидного слоя, при развитии ПОЛ происходит модификация мембранных белков с образованием межмолекулярных сшивок и ферментов, рецепторов и каналообразующих белков (Dean T.R., 2007; Lee R., 1997), что вводит клетку в порочный круг нарушения ионного гомеостаза и биоэнергетики, который, если его не разорвать, неумолимо ведет клетку к разрушению.

В целом, последовательность реакций свободнорадикального окисления можно отразить схемой 1 (Оковитый С.В., Шуленин С.Н., Смирнов А.В., 2005).

Последовательность реакций свободнорадикального окисления Свободнорадикальные формы кислорода О2 ------------------ О2• ---------------- Н2О2 -------------------- ОН• ---------------- Н2О (алкильные, алкоксильные, пероксильные радикалы) (гидроперекиси липидов, диеновые конъюгаты и др.) (малоновый диальдегид, триеновые конъюгаты и др.) (шиффовы основания и газообразные соединения) Диеновые конъюгаты и гидроперекиси липидов представляют первичные продукты ПОЛ. Их образованием процесс не заканчивается, и в дальнейшем образуются вторичные продукты ПОЛ: спирты, кетоны, альдегида и диальдегиды, эпоксиды, полимеры и другие. Особый интерес представляет тиобарбитуровой кислотой представляет весьма распространенный метод оценки интенсивности ПОЛ.

МДА, являясь бифункциональным реагентом, взаимодействует со свободными аминогруппами белков с образованием шиффовых оснований.

Образующиеся при этом полимерные продукты обладают характерной флуоресценцией и получили название липофусцинподобного пигмента («пигмента старения»). Этот пигмент, а так же образующиеся при расщеплении окисленных жирно-кислотных цепей фрагменты цепей – короткие газообразные углеводороды типа пентана представляют устойчивые конечные продукты ПОЛ (Кузин В. Б., Ганенков А. А., Ловцова Л. В., Окрут И. Е., Барсук А. Л., 2010).

Токсическими свойствами обладают такие продукты ПОЛ, как пероксиды и гидропероксиды, что вполне понятно и не требует каких-либо доказательств.

Однако в силу особенностей локализации в клетке, токсическое действие будут оказывать и многие окислительно-модифицированные производные липидов, например, содержащие гидроксигруппы, которые сами по себе не являются токсичными соединениями (Cavalca V., 2001).

Следует отметить, что оксидативная деградация биологических мембран не ограничивается действием продуктов ПОЛ. Так же и другие клеточные компоненты, мишени могут быть непосредственно атакованы различными водои жирорастворимыми прооксидантами, содержание которых в интактной клетке и их некоторые характеристики отражены в таблице.

Содержание и некоторые характеристики оксидантов в клетке состоянии) Активные формы кислорода – АФК кислород Каталаза ингибируется азидом, цианидом, пероксидом водорода в высоких концентрациях и некоторыми органическими гидроперекисями, может выступать источником образования АФК. 0,5% кислорода, образующегося в результате разложений перекиси водорода, возникает в возбужденном синглетном состоянии.

Глутатионпероксидаза – фермент, служащий для инактивации перекиси водорода в клетках высших животных. Он является гидрофильным соединением, что затрудняет его проникновение в липидный слой мембран, основная часть фермента локализована в цитозоле, а остальная – в митохондриях. Глутатионпероксидаза имеет селеновые изоферменты:

внеклеточная глутатионпероксидаза, обнаруженная в плазме и молоке, глутатионпероксидаза – G1, выделенная из цитозоля клеток печени и глутатионпероксидаза представляет собой тетрамер, состоящий из четырех идентичных сферических субъединиц, каждая из которых содержит по одному атому селена, на тетрамер имеется два активных GSH-связывающих центра.

При уменьшении уровня глутатионпероксидазы снижается устойчивость организма к окислительному поражению, что может приводить к развитию свободно-радикальной патологии (Белоусов С.С., 1998). Глутатионпероксидаза катализирует реакцию восстановления глутатионом нестойких органических гидропероксидов, включая гидропероксиды полиненасыщенных жирных кислот, стабильные соединения – оксикислоты:

утилизировать перекись водорода:

2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O обезвреживании пероксинитрита:

Сродство глутатионпероксидазы к Н2О2 выше, чем у каталазы, поэтому первая более эффективно работает при низких концентрациях перекиси водорода. В то же время в защите клеток от окислительного стресса, вызванного высокими концентрациями Н2О2, ключевая роль принадлежит каталазе. В целом же, глутатионпероксидаза значительно важнее, чем каталаза, так как каталаза сосредоточена в микросомах, а глутатионпероксидаза – в цитозоле и митохондриях. В некоторых тканях каталаза почти отсутствует, и глутатионпероксидаза играет главную роль в валовом метаболизме Н2О (Зубакова С.М, 1999; Arnhold J., 1996). Активность глутатионпероксидазы и супероксиддисмутазы изменяются прямо пропорционально изменению свидетельствует об усилении работы антиоксидантной защиты (Колисниченко Л.С., 1999; Abiaka C., 2000).

К числу компонентов АОС относятся и дегидрогеназы пентозного цикла окисления глюкозы, поставляющего НАДФН. Ключевым ферментом этого цикла является глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа.

Трансферрин, присутствующий в плазме крови, в физиологических условиях насыщен железом только на 20 – 30%, поэтому содержание свободных ионов железа в плазме крови ничтожно мало. Связанное с трансферрином железо не участвует в образовании ОН-радикалов и инициации ПОЛ. Добавка трансферрина in vitro к липосомам или микросомам эффективно блокирует железосвязывающую способность внесенного количества трансферрина (Halliwell B., Chirico S., 1993).

Железосвязывающей способностью обладают и другие белки, и кислые липиды плазмы крови. Эта способность будет связана с наличием свободных СООН групп, остатков фосфорной кислоты.

Антиокислительные свойства альбуминов обусловлены их способностью связывать ионы двухвалентной меди и предупреждать Cu2+-зависимое ПОЛ и продукцию гидроксильных радикалов. Реакции свободно-радикального окисления при этом как бы перемещаются на сами альбумины. Подвергнутые окислительной модификации участки полипептидных цепей альбуминов в последующем отщепляются протеазами. В процесс перекисного окисления могут вовлекаться и сорбированные на альбуминах неэстерифицированные жирные кислоты.

Церулоплазмин – важный антиоксидант внеклеточных жидкостей организма. Механизм антиоксидантного действия этого медьсодержащего белка связан с его способностью катализировать окисление ионов Fe2+ в Fe3+ (феррооксидазная активность) без сопутствующего выделения в раствор Церулоплазмин блокирует образование ОН* радикалов и Н 2О2, ингибирует Fe2+-зависимое и Cu2+-зависимое ПОЛ (Мжельская Т.И., 2000; Halliwell B., Chirico S., 1993).

Гаптоглобин и гемопексин – белки плазмы крови, антиоксидантное действие которых обусловлено их способностью связывать, соответственно, гемоглобин и гемм, попадающие в плазму из эритроцитов. Связывание с гаптоглобином и гемопексином резко ограничивает способность гемоглобина и гемма инициировать развитие свободно-радикальных реакций.

Альфа-токоферол (витамин Е) – растворимый в липидах антиоксидант, локализованный в липопротеидных комплексах и относящийся по механизму действия к ловушкам свободных радикалов или истинным антиоксидантам, разрушающим свободные радикалы и обрывающим рост цепей. Наличие в структуре токоферола систем сопряженных двойных связей в фенольном кольце подхватываются свободными радикалами. Захват радикалом второго электрона сопровождается потерей реакционной способности и фактически гибелью радикала (Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г., 1985; Kaennakam S., Sichaem J., Siripong P., Tip-Pyang S., 2013).

различными механизмами, к важнейшим из которых следует отнести следующие:

гидроксильного, перекисного, синглетного кислорода;

• Предупреждает разрушение гемма и высвобождение ионов Fe2+;

• Уменьшает образование свободных радикалов во время работы миелопероксидазы.

Кроме вышеперечисленных механизмов, аскорбиновая кислота оказывает защитное действие против канцерогенных нитрозаминов и оксидантов, присутствующих в дыме сигарет.

Рассматривая аскорбиновую кислоту в качестве антиоксиданта, следует учитывать, что в присутствии свободных ионов переменной валентности аскорбат выявляет выраженные прооксидантные свойства, и антиоксидантный эффект аскорбиновой кислоты преобладает только тогда, когда эти ионы находятся в связанном состоянии. Наличие в плазме крови трансферрина и альбуминов, обладающих высоким сродством к ионам Fe2+ и Cu2+, способствует проявлению антиоксидантного эффекта аскорбиновой кислоты. Содержание аскорбиновой кислоты в биологических жидкостях резко снижается при состояниях, для которых характерна активация ПОЛ и увеличение содержания свободных ионов железа.

Сочетанное действие рассмотренных выше компонентов АОС позволяет предотвратить активацию ПОЛ в физиологических условиях. При действии факторов, усиливающих образование в тканях свободных радикалов, АОС переходит в напряженное состояние, что позволяет сдерживать активацию процессов ПОЛ (Arnhold J., 1991; Sun J., Liu X., Yang T., Slovin J., Chen P., свободно-радикального окисления активируются, и в тканях накапливаются их продукты – свободные радикалы, конъюгированные диены, гидроперекиси липидов, малоновый диальдегид, продукты с флуоресценцией в области 440-480 нм (Зенков Н.К., Панкин В.З., Меньшикова Е.Б., 2001).

ограничивается рассмотренными выше антиоксидантными системами, а осуществляется также большим количеством репарационных систем, специфическими протеолитическими ферментами, макрофагами и гепатоцитами, эффективно захватывающими окисленные липопротеины через специальные «скэвенджнр-рецепторы». Это еще раз свидетельствует о протекающих в живом организме (Ковальчук В.И., 2004; Kim J.H., Park Y., Yu K.W., Imm J.Y., Suh H.J., 2013).

I.4. Лекарственные средства антиоксидантного действия Для регулирования свободно-радикальных процессов в организме человека в настоящее время широко применяют природные (преимущественно растительного происхождения) и синтетические соединения, обладающие антиоксидантной активностью (Воронов Г.Г., 1991; Сейфулла Р.Д., 1998;

Симонова Н.В., 2012). По механизму действия их можно разделить на две группы (Козлов Ю.П., 2006):

1) истинные антиоксиданты (прямого действия), которые разрушают непосредственно свободные радикалы, восстанавливая их в стабильную молекулярную форму. В эту группу входят токоферолы, убихиноны, полифенольные растительные комплексы, 3- и 6-оксипиридины и их синтетические производные, фенозаны, ионол, витамины А, РР, 1,4дигидропиридины, аскорбиновая кислота (Cretu E., Karonen M., Salminen JP., Mircea C., Trifan A.,2013);

2) антиоксиданты косвенного действия, которые гасят ПОЛ посредством стимуляции ферментативных компонентов АОС или путем ингибирования систем образования активных форм кислорода (селенсодержащие соединения, аллопуринол, глутаминовая кислота, цистеин, метионин, липоевая кислота, карнозин) (Доровских В.А. и соавт., 2012).

токоферолы, которые содержатся в растениях, в организм попадают с пищей и накапливаются в липидной фазе клеток. Из 8 существующих видов токоферолов наибольшей активностью обладает альфа-токоферол (витамин Е) (Абрамова Ж.И., 1985; Доровских В.А., 2001; Толкачева А.В., 2010), причем хромановое кольцо токоферола, по-видимому, ответственно за его антирадикальный, а фитильная боковая цепь – за мембраностабилизирующий эффект (Биленко М.В., 1999; Yi O.S., 1992).

Интенсивно изучается место альфа-токоферола в биохимических превращениях в норме и патологии, возможное участие в физиологических процессах. Столь пристальное внимание исследователей и клиницистов к витамину Е вызвано обнаруженной у него способности нейтрализовать аутоокислительные реакции в организме, благодаря чему токоферол приобрел репутацию одного из основных алиментарных антиоксидантов (Тутельян В.А., 2004).

Высокая биологическая активность витамина Е и, в первую очередь, его антиоксидантные свойства обусловили применение этого препарата в медицине (Сейфула Р.Д., 1990; Афанасьев Ю.И., 1997). Известно, что витамин Е вызывает положительный эффект при лучевом поражении, злокачественном росте, ишемической болезни сердца и инфаркте миокарда, атеросклерозе, в терапии больных дерматозами, при ожогах и других патологических состояниях (Ланкин В.З., 1992; Айдарханов Б.Б., 1999; Биленко М.В., 1999; Irshad M., 2000;

Кудряшов Ю.Б., 2001; Болотова Н.В., 2003; Накусов Т.Т., 2005; Разина Т.Г., 2006). Установлено, что витамин Е снижает повышенную в результате стресса эмоционально-болевом, холодовом стрессах (Бурлакова Е.Б., 1985; Воронов Г.Г., 1991; Зубкова С.М., 1997; Евстигнеева Р.Н., 1998; Доровских В.А., 2001;

Симонова Н.В., 2004; Ли О.Н., 2011).

Витамин Е проявляет антиоксидантную активность в том случае, если он встроен в клеточные и субклеточные мембраны, причем таким образом, что часть его молекулы располагается среди фосфолипидов, богатых полиненасыщенными жирными кислотами (Бородин Е.А., 1989; Бизето М.Ф., 2001). Тесный контакт витамина Е с мембранами клетки способствует их стабилизации: токоферол контролирует архитектонику мембранных фосфолипидов, снабжение фосфолипидов полиненасыщенными жирными кислотами, соединение фосфолипидов с белками (Дубинина Е.Е., 2001;

Макаров В.Г., 2005; Спиричев В.Б., 2005).

Самое пристальное внимание уделяется препаратам, близким к витамину Е. Наряду с самим витамином Е, антиоксидантными свойствами обладают его водорастворимые аналоги: тролокс-С и альфа-токоферола полиэтиленгликольсукцинат (ТПГС). Тролокс-С действует как эффективный тушитель свободных радикалов по тому же механизму, что и витамин Е (Доровских В.А., 2012). Структурные аналоги токоферола клинического применения пока не получили.

Убихинон близок по химической структуре к токоферолам. Убинон является универсальным незаменимым компонентом в функционировании биологических мембран и метаболизма в целом, в том числе и гепатоцитов в теплокровном организме. Его высокая гепатопротекторная активность является следствием ингибирования ПОЛ при токсическом поражении печени ССl4 и хлоксилом, причем антиокислительная активность убинона в пять раз выше, чем у витамина Е (Доровских В.А., 2001,; Машковский М.Д., 2010). Более подробно изучено влияние убихинона на процессы ПОЛ при ишемии и установлено, что ингибирующий ПОЛ эффект препарата обусловлен не только его накоплением, но и изменением соотношения между его окисленной и восстановленной формой (Белоусов С.С., 1998; Оковитый С.В., 2005).

Антиоксиданты синтетического происхождения Ионол (2,6 дитретбутил-4-метилфенол, бутилгидроокситолуол, дибунол) является жирорастворимым фенолом. Его окисленная форма представляет радикал, стабилизированный двумя боковыми третбутильными группировками, а поэтому более стабильный, чем у токоферолов. Ионол успешно применяется для профилактики острых ишемических повреждений органов и постишемических расстройств (Kurlbaum M., Hgger P.J., 2011). Препарат высоко эффективен при лечении раковых заболеваний, применяется при лучевых и трофических поражениях кожи и слизистых оболочек, успешно используется в терапии больных дерматозами, способствует быстрому заживлению язвенных поражений желудка и двенадцатиперстной кишки (Абрамова Ж.И., 1985; Сейфула Р.Д., 1990; Машковский М.Д., 2010; Доровских В.А., 2012).

Фенозаны (К+ - или Li+ - соли 4-гидрокси-3,5-дитретбутилфенил Исследование влияния фенозанов (фенозана 1, фенозана 28 и гамма-пропонола) на ПОЛ у крыс при ожоговой травме показало их высокую АОА (Биленко М.В., 1999).

Оксипиридины – группа азотсодержащих гетероциклических фенолов, являющихся синтетическими аналогами витамина В6. Существенным 2-этил-6-метил-3-оксипиридин, наряду с проявление АОА, восстанавливал физико-химические свойства синаптических мембран и моноаминооксидазную активность мозга стрессированных животных, а так же нарушенные при стрессе поведенческие показатели (Бурлакова Е.Б., 1999; Доровских В.А., 2004;

Волчегорский И.А., 2010).

К группе синтетических антиоксидантов относятся селен-неорганические и селен-органические соединения, механизм антирадикального действия глутатионпероксидазы (Волкотруб Л.П., 2001; Лесовская М.И., 2003). Этот фермент является первой линией защиты клеток организма от накопления токсических гидропероксидов и свободных радикалов (Меньщикова Е.Б., 2006).

Кроме того соединения селена влияют на активацию другого селензависимого фермента – фосфолипид-гидропероксид-глутатионпероксидазы, восстанавливающего структуру окисленных в результате свободнорадикального окисления фосфолипидов (Pereira R.B., Sousa C., Costa A., 2013; Ursini F., 1992;

Scnuckelt R. et al., 1991; Kuklinski B. et al., 1990).

В настоящее время одним из перспективных классов природных соединений, повсеместно встречающийся в клетках зеленых растений и представляющий объект значительного научного и терапевтического интереса, является класс флавоноидов (Дадали В.А., 2003; Кушнерова Н.Ф., 2003;

Антошина С.В., 2005; Лукьянова Л.Д., 2007; Борсук О.С., 2011; Akbay P., 2003;

Berg P.A., 1998; Heim K.E., 2002; Pietta P.-G., 2000; Prochazkova D., 2011;

Williams R.J., 2004).

полифенольных соединений, структурно содержащих 2 ароматических кольца, соединенных через пирановый или пироновый цикл (рис. 1). Структура большинства флавоноидов соответствует структуре ядра токоферолов, но в отличие от последнего содержит не изопреноидную цепь, а фенольный фрагмент, определяющий в большинстве случаев его антиоксидантные свойства. Начало активного исследования биологической активности флавоноидов начинается с 1936 г. с работы венгерского биохимика Сент-Дьёрдьи, выделевшего в чистом виде витамин Р (рутин). Позднее было показано, что помимо капилляроукрепляющего действия флавоноиды (кверцетин, рутин, гесперитин и др.) проявляли и другие виды биологической активности (Меньшикова Е.Б., 2006; Хобракова В.Б., 2012; Beyer G., 2003; Bors W., 1999; Chen Z.Y., 1996; Harbome J.B., 2000; Ferguson P.J., 2006; Tseluyko S.S., 2009).

Рис.1 Структурная формула флавонов Флавоноиды, как большинство фенольных соединений, синтезируются в растениях по двум общим механизмам: шикиматному и ацетатно-малонатному (поликетидному) путям. Шикиматный путь (рис.2) объединяет в себе биосинтез ароматических аминокислот, включая L-фенилаланин, и начальные этапы биосинтеза фенольных соединений (Николаев С.М., 1991).

Одно из более известных свойств флавоноидов – это их превосходная антирадикальная активность, что и используется для снижении действия АФК при инфекциях, воспалении, ожогах или лучевом поражении (Сыров В.Н., 1997;

Бочкарев У.Г., 2000; Гольдберг Е.Д., 2000; Тутельян В.А., 2003; Павлова С.И., 2009; Симонова Н.В., 2012).

Реакция флавоноидов с АФК характеризуется высокими скоростями, составляющими для OH-радикала – 5х108М-1с-1, для перекисного радикала липидов – 0,18х108 М-1с-1 (кверцетин), несколько ниже для супероксид аниона – 4х104 М-1с-1 (катехин) (Громовая В.Ф., 2008; Williams R.J., 2004; Prochazkova D., 2011).

Флавоноиды легко и необратимо окисляются до п-гидрохиноновой формы, которая далее обратимо может окисляться до п-хинона. Последний легко полимеризуется в нерастворимое соединение. Окисление флавоноидов катализируется ионами тяжелых металлов и под действием света (Доровских В.А., 2012). Промежуточные формы окисления флавоноидов могут являться токсичными для клеток, а в процессе их взаимопревращения в ряде случаев образуются АФК (рис. 2).

Рис. 2. Окислительно-восстановительные превращения кверцетина (Меньшикова Е.Б., и др., 2006).

Тем не менее, флавоноиды считают одними из наиболее значимых антиоксидантов, антиоксидантная активность которых возрастает в присутствии аскорбиновой кислоты (Макаров В.Г., 2005). Другой причиной высокой антиоксидантной активности флавоноидов может быть их ингибирующая активность ряда ферментов, включая гидролазы, например фосфолипазы, оксидоредуктазы, например, избирательно ингибируют ЦОГ1 или ЦОГ2, связанные с воспалительным и репарационным ответами соответственно, ДНК-синтетазы, РНК-полимеразы, фосфатазы, фосфокиназы, оксигеназы и оксидазы аминокислот. В некоторых случаях тип ингибирования конкурентный, но чаще это аллостерическое ингибирование. Многие флавоноиды также способны ингибировать цАМФ и цГМФ фосфодиэстеразы, в результате чего увеличивается уровень цАМФ, участвующего в различных каскадах.

Многочисленные экспериментальные исследования в водных системах позволили выявить следующие наиболее важные для антирадикальной активности структурные элементы молекул флавоноидов: 1) две ОН-группы в положениях С3' и С4'; 2) двойная связь между 2 и 3 атомами углерода, желательно совместно с карбонильной группой в положении С4; 3) ОН-группы в положениях С3 и С5 совместно с карбонильной группой (Van AcKer S.A., 1996).

В молекулах флавоноидов ОН-группа в положении С4' представляет собой наиболее предпочтительную мишень для радикальной атаки, при этом наличие ОН-групп у соседнего атома углерода С3' (катехоловая структура) или С3' и С5' (галловая структура) облегчает отрыв атома водорода. Между соседними гидроксилами кольца В образуются водородные связи, поэтому соединения, имеющие такие структуры, характеризуются низким окислительным потенциалом и относительно легко образуют радикалы (Зайцев В.Г., 2003).

хеллатирующими металл свойствами с помощью фенольных ОH-групп.

Металлы с переменной валентностью часто вовлекаются в генерацию свободных радикалов посредством разложения пероксида водорода и гидропероксидов липида (LOOH) с образованием гидроксильного или алкоксильного радикала соответственно (Chedeville O., 2005). Флавоноид, хеллатируя металл, может изолировать эти ионы и, таким образом, предотвратить формирование свободных радикалов.

С другой стороны, группой ученых под руководством Наруми Сугихара (Sugihara N., 1999) было продемонстрировано наличие прооксидантного действия флавоноидов на модели окислительного повреждения гепатоцитов, про/антиоксидантные свойства мирицетина, кверцетина, фисетина, кэмпферола, морина, лютеолина, апигенина и таксифолина (дигидрокверцетина).

Необходимо отметить, что в этих работах для таксифолина было обнаружено наличие как анти-, так и прооксидантной активности в зависимости от концентраций Fe2+, однако с другими металлами таксифолин проявлял только антиоксидантные свойства. Сходные работы по изучению поведения флавоноидов в присутствие металлов переменной валентностью были выполнены группами ученых под руководством В.А. Костюка (Kostyuk V.A., 2007) и И.Б. Афанасьева (Afanas'ev I.B., 1998).

«Дигидрокверцетин» - нативный (т.е. с ненарушенной природной структурой) флавоноид антиоксидантной группы Р-витаминов. На сегодняшний день он является эталонным антиоксидантом и работает на уровне клеточных мембран. Его антиоксидантное действие существенно превышает уровень действия широко известных витаминов А, С и Е, а антирадикальная активность проявляется при концентрациях 10 4 – 10 5 % и при полном отсутствии мутагенной активности для человека, т.е. с отсутствием цитотоксического капилляроукрепляющего, капилляропротекторного, гемореологического средства (Доровских В.А., 2012).

Дигидрокверцетин, относящийся к классу полифенолов, имеет в своей структуре пять активных гидроксильных групп и является р-витаминным препаратом, т.е. катализатором многих биохимических процессов в организме (Машковский М.Д., 2010). По антиоксидантной и капилляропротекторной активности ДКВ превосходит известные и применяемые в настоящее время препараты в 3-5 раз (Tseluyko S.S., 2009).

Клинические испытания дигидрокверцетина, проводимые в Академии имени Сеченова, Институте Микрохирургии глаза и в других организациях, позволили выявить высокую биологическую активность дигидрокверцетина и подтверждают, прежде всего, следующее: антиоксидантная активность заключается в блокировании, нейтрализации и выведении из организма свободных радикалов (Теселкин Ю.О., 1996; Бабкин В.А., 2003; Антошина С.В., 2005; Толкачева А.В., 2010). Благодаря этому предупреждается возникновение и развитие различных болезней, преждевременной старости, препятствует образование злокачественных новообразований, что особенно важно для людей с наследственной предрасположенностью к опухолевым заболеваниям (Гольдберг Е.Д., 2000; Подколзин А.А., 2000; Разина Т.Г., 2006).

Антиоксидантные свойства флавоноидов (в том числе и ДКВ) напрямую зависят от их липофильных свойств, т.е. с уменьшением молекулярной массы увеличивается их антирадикальная активность (Сыров В.Н., 1997; Мельникова Н.Б., 2002). Тем не менее, не только это является основополагающим для данной группы антиоксидантов. Такие производные, как пентаацетат ДКВ и пентабензоат ДКВ обладают слабой активностью вследствие отсутствия свободных группировок, и единственно возможным путем реагирования со карбоксильной группе с образованием метастабильных радикалов ортокислот с дальнейшим отщеплением эфирной группировки (Макаров В.Г., 2005; Silva I.A., Silva T.M., Camara C.A., 2013).

антиоксидантом растительного происхождения. Область использования этого соединения в пищевой, косметической, фармацевтической промышленности непрерывно расширяется (Мельникова Н.Б., 2003; Zhang Z.R., Al Zaharna M., Wong M.M., 2013). ДКВ зарекомендовал себя как консервант плодово-ягодных соков, сухого молока, кондитерских изделий, жиров, как компонент лекарственных фитопрепаратов, обладающих гепато-, каппиляро- и онкопротекторной активностью (Белошапко А.А., 1995; Роговский В. С., Розенфельд М.А., Разумовский С. Д., 2013). На фоне действия ДКВ происходит стабилизация системы перекисного окисления липидов в коже (Доровских В.А., 2007).

При изучении безопасности ДКВ установлено, что он не обладает эмбриотоксическими и тератогенными свойствами, у него не выявлено аллергизирующего и токсического действия. В отличие от некоторых других биофлавоноидов ДКВ не обладает мутагенными свойствами (Белошапко А.А., 1995; Жанатаев А.К., 2008). Нижнюю границу широты терапевтического действия ДКВ можно приближенно считать равной суточной потребности человека в витаминах группы Р, которая составляет, по разным данным 25 – мг для взрослого человека (Тюкавкина Н.А., 1996; Spindler S.R., Mote P.L., Flegal J.M., Teter B., 2013). На основании фармакологических исследований сделан вывод, что ДКВ выполняет протекторную роль в отношении развития кардиосклероза, особенно при наличии сердечной недостаточности или инфаркта миокарда, а также защищает печень от различных видов поражения (Тесёлкин Ю.О., 1996; Shimoda K., Kubota N., Hamada M., 2013). Также дигидрокверцетин оказывает стимулирующее действие на тканевой кровоток, стабилизирует барьерную функцию микрососудов, снижает проницаемость стенок капилляров и тем самым способствует снижению застойных явлений в микроциркуляторном русле, стабилизации артериального давления (Шакула А., 2008).

При изучении антиоксидантной активности ДКВ установлено, что он сопоставим с известным антиоксидантом -токоферолом и вдвое более активен, чем Р-каротин. Предположено, что механизм антиокислительного действия ДКВ заключается в перехвате липидных радикалов (Бабкин В.А., 2003).

Изучено воздействие ДКВ на поверхность мембраны на моделях липофильных и гидрофильных фрагментов биосистем, где было показано, что ДКВ, кроме высокой антиоксидантной активности, обладает высокой проницаемостью как через гидрофильную (ионные каналы, белковые включения), так и через липофильную часть мембраны (Мельникова Н.Б., 2002; elik H., Koar M., Arin E., 2013).

При создании новых лекарственных форм препаратов на основе ДКВ необходимо учитывать его совместимость и взаимодействие с другими компонентами. Одним из факторов, определяющих эффективность действия ДКВ в биологической среде, является присутствие ионов металла, в частности, в комплексе с ионами металлов ДКВ может оказывать действие на клетки иммунной системы от прямого до прямопротивоположного в зависимости от концентрации ионов металлов (Теселкин Ю.О., 1997; Смирнов Л.Д., 1999;

Мельникова Н.Б., 2001; Хобракова В.Б., 2012).

ДКВ снижает в клетках синтез холестерина посредством ингибирования 3-гидрокси-3-метиоглутарил-КоА-редуктазы (Nassuato G., 1991). ДКВ обладает преимущественно мембраностабилизирующим действием (Куркин В.А., 2008).

Установлено, что ДКВ в дозах 20 и 40 мг/кг увеличивает сократительную способность миокарда в условиях функционального покоя, нормализует кардиогемодинамические показатели при проведении нагрузочных проб у наркотизированных крыс, а также снижает выраженность морфологических изменений, вызванных моделированием эмоционально-иммобилизационного стресса (Сухомлинов Ю.А., 2005).

Показано, что ДКВ проявлял антиоксидантные свойства в различных модельных системах окисления, в частности тормозил фотоокисление люминола (Тесёлкин Ю.О., 1994), окисление этилбензола, инициированное свободнорадикального окисления липосом из яичных фосфолипидов, индуцированное с помощью системы Fe2+-аскорбат (Тесёлкин Ю.О., 1996) или фотосенсебилизированное производными гематопорфирина при облучении гелий-неоновым лазером (Klebanov C., 1996). При этом антиоксидантный эффект ДКВ был сравним либо превышал антиоксидантный эффект таких известных природных антиоксидантов, как -токоферол, ликопин, -каротин, карнозин. Гепатопротекторный эффект был обнаружен у ДКВ на моделях гепатита, индуцированного с помощью подкожного введения тетрациклина или тетрахлорида углерода (Колхир В.К., 1995).

Известно, что флавоноиды в зависимости от концентрации могут как стимулировать, так и ингибировать рост клеток, а также вызывать клеточную гибель. Флавоноиды образуют с молекулами коллагена водородные, гидрофобные и ковалентные связи в местах локализации ароматических аминокислот, триптофана и лизина (Viljanen K., 2005). Исследования по изучению воздействия ДКВ на рост клеток и состояние коллагеновых фибрилл свидетельствуют о способности ДКВ стабилизировать коллагеновый матрикс.

При этом стабилизирующее воздействие зависит как от концентрации препарата, так и от времени воздействия (Суханова Т.В., 2006; Yun J., Bae H., Choi S.E., 2013).

В связи с исключительными антиоксидантными свойствами, ДКВ через защиту важнейшего компонента клетки – ДНК от продуктов метаболизма активизирует иммунную систему человека, мобилизуя защитные силы организма, замедляет процессы старения, предотвращает развитие различных патологий (Хобракова В.Б., 2012; Satu M., Arriero Mdel M., Monjo M., Ramis J.M., 2013). Но влияние ДКВ на интенсивность процессов перекисного окисления липидов биомембран в условиях холодового воздействия остается малоизученным, что послужило основанием к проведению настоящих исследований.

ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве экспериментальных животных использованы беспородные белые крысы-самцы массой 150 – 200 граммов. Животных содержали в стандартных условиях в виварии Амурской государственной медицинской академии, при естественном световом режиме без ограничения доступа к воде и пище. В опытах использовали животных одного помета.

Протокол экспериментальной части исследования на этапах содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта соответствовал принципам биологической этики, изложенным в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985), «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 18.03.1986 г.), приказе Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных», приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».

При завершении научных исследований выведение животных из опыта проводили с соблюдением требований гуманности согласно приложению № 4 к Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к приказу Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977) о «Порядке проведения эвтаназии (умерщвления животного)» путем декапитации.

Исследование одобрено Этическим комитетом Амурской государственной медицинской академии, соответствует нормативным требованиям проведения доклинических экспериментальных исследований (выписка из протокола № заседания Этического комитета ГБОУ ВПО Амурская ГМА от 15 декабря 2007г.).

В работе использовали дигидрокверцетин в виде порошка производства компании ЗАО «Аметис» Амурской области г. Благовещенска. Партия № соответствует ТУ 9325-001-70692152-07 и СанПин 2.3.2.1078-01 на основании протокола микробиологических исследований № 5053, физики – химических измерений № 599 и протокола радиологических исследований № 551р – 07/684.

Для экспериментальных исследований из порошка дигидрокверцетина готовили раствор нужной концентрации.

Первоначально проводился анализ данных литературы посвященной изучению дигидрокверцетина, что позволило спрогнозировать возможность использования данного вещества для облегчения адаптации теплокровного организма к воздействию низких температур.

Альфа-токоферол (витамин Е) – один из основных алиментарных антиоксидантов растительного происхождения, был выбран с целью сравнения степени защитного действия от холода дигидрокверцетина. (таб.1) Таблица 1.Дозы и условия введения исследуемого вещества Холодовая модель эксперимента позволяющая изучить действие низких температур на организм животных была создана и внедрена в 1987 году в Благовещенском мединституте. В настоящих исследованиях крыс охлаждали, используя климатокамеру "ILKA'' (Fentron, ГДР), при температуре –15°С с соблюдением адекватных условий влажности и вентиляции. Охлаждение проводилось в течение 7, 14 и 21 дня по 3 часа ежедневно. Режим охлаждения выбран на основании литературных данных (Доровских В.А., 1987). В интактной группе (не связанной с охлаждением) исследование проводили при нейтральной температуре (+ 20°; + 22°С).

Выведение из эксперимента животных каждой группы проводили по окончанию срока эксперимента путём декапитации.

Индукцию ПОЛ в опытах in vitro производили в инкубационной среде, содержащей быстроокисляемый субстрат – микросомы печени крыс. Для получения микросом использовали стандартную методику.

После забоя животных вскрывали грудную и брюшную полость и в нижнюю полую вену вводили канюлю. Для удаления крови печень in situ перфузировали 0,15 М раствором KCl, содержащим 5 мМ трис-HCl буфер, рН 7,4, до светло-желтого цвета. Печень удаляли, отжимали на марлевой салфетке, взвешивали и измельчали ножницами. Гомогенат приготавливали в гомогенизаторе Даунса с тефлоновым пестиком при отношении массы ткани к объему раствора указанного выше состава как 1:3. Гомогенизирование проводили в течение одной минуты при двадцати движениях пестика вверх и вниз. Все процедуры проводили используя растворы, охлажденные до 4 0С.

Гомогенат центрифугировали при 9500g в течение 20 минут при 3 0С на лабораторной охлаждающей центрифуге К24D (Германия). Надосадочную жидкость подвергали дальнейшему центрифугированию при 24000 g в течение 120 минут при 30С. Осадок микросом ресуспензировали в среде выделения до содержания белка 20-25 мг/мл и в дальнейшем использовали в работе.

Приготовление гомогената печени для экстракции липидов После забоя животных декапитацией вскрывали грудную и брюшную полости. Печень перфузировали 0,15 М раствором КС1, содержащим 5мМ трис-НС1, рН=7,4. Печень выделяли, взвешивали, измельчали ножницами и гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса с трис-буфером в соотношении 1: в течение 1 минуты. Приготовленный гомогенат печени использовали для определения содержания продуктов перекисного окисления липидов (Штарберг М.А., 1998).

Экстракция липидов из крови и гомогената печени Для определения содержания гидроперекисей липидов, диеновых конъюгатов и витамина Е липиды из крови и ткани печени экстрагировали по методу Блайя-Дайера. Для экстракции липидов к 1 мл цельной крови, гомогенату печени добавляли 3,75 мл раствора Фолча (хлороформ + метанол в соотношении 1:2), тщательно перемешивали стеклянной палочкой и помещали в холодильник (+4оС) на 24 часа. Через 24 часа экстракт перемешивали и цетрифугировали при 3000 об./мин. в течение 5 минут. Супернатант собирали в чистые пробирки, а к осадку добавляли раствор Блайя-Дайера (хлороформ + метанол + дистиллированная вода в соотношении 1:2:0,9) по 4,75 мл, перемешивали и оставляли еще на сутки в холодильник (+4 оС). Через 24 часа содержимое пробирок с гомогенатом и раствором Блайя-Дайера тщательно перемешивали стеклянной палочкой, собирали супернатант и добавляли его к уже имеющемуся супернатанту. К полученному экстракту добавляли 1,5 мл перегнанного хлороформа и 1 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешивали и центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 7 минут, получив после это расслоение фаз. Нижнюю (хлороформную) фазу помещали во взвешенные стеклянные флаконы и упаривали досуха на водяной бане при температуре 60 – 65оС. Затем флаконы взвешивали и по разнице в весе между пустым флаконом и после выпаривания в нем экстракта находили массу липидов. Липиды растворяли в 2 мл абсолютного этилового спирта и хранили при температуре –200С (Камышников В.С., 2000).

Приготовление гистологических препаратов Морфологические исследования выполнены на 60-ти крысах.

Для микроскопического исследования забор материала проводился иссечением ткани органа через всю толщину, площадью 1 см 2. Кусочки иссекались из краевой области и помещались в отдельный флакон, заполненный на 2/3 раствором фиксатора (10% раствор нейтрального формалина), не позднее 30 минут после забоя. Хранение материала до момента исследования производилось при температуре +4 – +8 0С. Изготовление блоков проводилось по общепринятой методике заливки материла в парафин, когда после обезвоживания в батарее восходящей концентрации этилового спирта и пропитки маслом материал помещался в парафин-восковую смесь (20:1) при температуре +560С, после чего охлаждался до застывания. Из полученных блоков на микротоме изготовлялись продольные срезы 5-6 мкм, которые после депарафинизации окрашивались по общегистологической методике гематоксилином Бемера-эозином. Микроскопирование и фотографирование осуществлялось на фотомикроскопе Microphot-FXA (фирма NIKON- Япония) при увеличениях 100, 200, 400, 1000. Для изготовления полутонких и ультратонких срезов полученный материал фиксировался в 2% глютаральдегиде на фосфатном буфере при рН 7,4. Промывался в фосфатном буфере с сахарозой, дегидратировался в ацетоне восходящей концентрации, проводилась реакция четырехокись осмия – иодид цинка. Инкубация свежей ткани в среде с OsO 4 и ZnI2 дает интенсивное контрастирование различных компонентов клетки:

аппарата Гольджи, лизосом, содержимого перинуклеарного пространства, гранулярной эндоплазматической сети, матрикса митохондрий и ядер.

Обезвоживали в ацетоне, заливали в смесь эпон-аралдит. Блоки полимеризовались в течение 72 часов при температуре +60°С. Полутонкие и ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB – NOWA. Для светооптического исследования применялись полутонкие срезы, которые окрашивались метиленовым синим. Исследование полутонких срезов применялось как самостоятельный морфологический метод. По сравнению с парафиновыми срезами толщиной в 5 – 10 мкм изображение тканевых структур на полутонком срезе толщиной в 1 мкм получается более четким, не происходит существенных пространственных изменений, что позволяет проводить электронно-микроскопического исследования применялись ультратонкие срезы, контрастированные уранил – ацетатом и цитратом свинца.

Ультратонкие срезы исследовались на трансмиссионном электронном микроскопе Technai G2 Spirit TWIN (Голландия) и растровом электронном микроскопе Hitachi S3400 (Япония).

Консультация морфологических исследований проведена зав. каф.

гистологии АГМА, д.м.н. С.С. Целуйко.

В 10 мл 100% спирта растворяли 2 г кристаллического гематоксилина и добавляли 200 мл 10% водного охлажденного и профильтрованного раствора калийных квасцов. Раствор «созревает» на свету в течение 4-5 недель, перед употреблением раствор краски фильтруется (Коржевский Д.Э., 2007).

Выбор оптимальной модельной системы для определения АОА дигидрокверцетина и токоферола в условиях in vitro В качестве модельной системы для скрининга АОА препаратов принято использовать Fe 2+- зависимое ПОЛ в липопротеидах яичных желтков, однако скорость ПОЛ в яичных липопротеидах очень незначительна, что затрудняет получение четких результатов при оценке АОА исследуемых веществ. Согласно работам М.А. Штарберга (1998), оптимальным субстратом для тест-системы скрининга АОА различных препаратов являются микросомы печени, так как скорость и неферментативного (аскорбат-зависимого), и ферментативного (НАДФН-зависимого) ПОЛ в микросомах значительно превышает скорость окисления других потенциальных субстратов ПОЛ (липопротеиды яичных желтков, плазма крови, мембраны эритроцитов, липосомы и мицеллы из фосфолипидов различного происхождения). Поэтому в настоящей работе при оценке АОА исследуемых нами ДКВ и токоферола в условиях in vitro мы использовали в качестве модельной системы аскорбат - и НАДФН-зависимое ПОЛ в микросомах печени крыс. Стандартным временем инкубации для аскорбат-зависимой и НАДФН-зависимой систем было выбрано 5 и 20 минут соответственно, а в качестве стандартной концентрации микросом выбрана концентрация 0,5 мг фосфолипида/мл инкубационной смеси. Такой выбор прямопропорционально времени инкубации и концентрации микросом, т.е.

скорость ПОЛ постоянна (Штарберг М.А., 1998).

ПОЛ в суспензии микросом печени крыс, содержащей 0,8 м/М аскорбат (или 1 мМ НАДФН); 0,2 мМ пирофосфат натрия; 50 мМ трис-НСl буфер, рН 7,4; 0,5 мг фосфолипида/мл (1,0 белка) микросом инициировали внесением ионов Fe2+в конечной концентрации 12 мкМ. Общий объем инкубационной смеси 1 мл. Продолжительность инкубации в большинстве экспериментов добавлением 30% раствора ТХУ с ЭДТА в концентрации 1,5 мМ. По окончании инкубации в пробах определяли количество образовавшегося МДА по цветной реакции с ТБК (Штарберг М.А., 1998).

Определение АОА ДКВ и токоферола в условиях in vitro АОА ДКВ и токоферола оценивали по их способности тормозить аскорбат- и НАДФН-зависимое ПОЛ в суспензии микросом и выражали в процентах. Опытная инкубационная смесь объемом 1 мл содержала 0,8 м/М аскорбат (или 1 м/М НАДФН); 0,2 м/М пирофосфат натрия; 50 м/М трис-НСl буфер, рН 7,4; 0,5 мг фосфолипида (или 1 мг белка) микросом, 5*10 -6 Моль, 5*10-5 Моль, 5*10-4 Моль, 5*10-3 Моль, что сопоставимо с дозами 0,1; 1,10, мг/кг и 2,5*10-3 Моль (50 мг/мг) ДКВ в 0,1 мл буферного раствора, 11*10-4 Моль и 11*10-3 Моль (30мг/кг и 300мг/кг массы) эмульсии масляного раствора токоферола в 0,1 мл буферного раствора. Две контрольные пробы аналогичного состава не содержали раствора ДКВ или токоферола (контроль 1) или микросом (контроль 2). АОА рассчитывали по формуле:

АОА= -------------------------------------------------------------------- х 100% Индукция ПОЛ в организме животных в условиях in vivo Эксперименты проводили на беспородных крысах - самцах массой -200 г. С целью активации ПОЛ в организме животных была использована холодовая модель эксперимента (Доровских В.А., 1987). Ежедневно в утреннее время животных помещали на 3 часа в климатокамеру фирмы «Fentron» (ГДР) при температуре – 150С при 50% влажности в течение 7, 14, 21 дней. В работе предупреждения кислородной гипоксии и создавался режим охлаждения. В созданных условиях происходят значительные биохимические изменения, проявляющиеся в колебании содержания перекисных продуктов в соответствии с развитием стадий приспособительного процесса.

Ежедневно на протяжении 7, 14, 21 дня животным перорально вводили дигидрокверцетин, токоферол и помещали в климатокамеру. Одновременно исследовали 4 групп животных по 10 особей в каждой группе: 1 группа – интактная – животные находились в стандартных условиях вивария; 2 группа – контрольная – крысы подвергались холодовому воздействию при температуре –15оС в течение 21 дня по 3 часа ежедневно; 3, 4, группы – подопытные – дигидрокверцетин в дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг, массы животного соответственно.

Забой животных декапитацией проводили на 7, 14, 21 сутки.

Ежедневно на протяжении 7, 14, 21 дня животным перорально вводили дигидрокверцетин, токоферол и помещали в климатокамеру. В ходе эксперимента исследовали 6 групп животных по 10 особей в каждой группе: группа – интактная – животные находились в стандартных условиях вивария; группа – контрольная – крысы подвергались холодовому воздействию при температуре –15оС. в течение 21 дня по 3 часа ежедневно; 3, 4, 5 группы – подопытные – животным за 20 минут перед охлаждением перорально вводили дигидрокверцетин в дозе 10 мг/кг, 1 мг/кг и 0,1 мг/кг массы животного соответственно; 6 группа – подопытная – животным за 20 минут перед охлаждением перорально вводили 10% масляный раствор витамина Е в дозе мг/кг массы животного. Забой животных путем декапитации осуществляли на 7, 14, 21 сутки эксперимента.

Биохимическому исследованию подвергались кровь и ткань печени, в которых определяли продукты ПОЛ (ДК, ГП, МДА) и компоненты АОС (каталаза, церулоплазмин, Гл-6-ф и витамин Е).

Определение содержания малонового диальдегида МДА определяли в цельной крови, гомогенате печени по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой (Колесова О.Е., 1984). Для этого в пробирки с исследуемой средой добавляли 1 мл 30% трихлоруксусную кислоту и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. К 2 мл надосадочной жидкости добавляли 1 мл 0,8% тиобарбитуровой кислоты и ставили на кипящую водяную баню на 15 мин. По окончании инкубации пробирки охлаждали, добавляли 1 мл хлороформа и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин для удаления мутности. Верхнюю окрашенную фазу осторожно переносили в кювету и измеряли светопоглощение при 532 нм на фотоэлектроколориметре. При расчете содержания МДА в пробе использовали коэффициент молярной экстинкции 1,56х10-5М -1см-1 (Доровских В.А., 1987).

Содержание МДА выражали в нмолях на грамм ткани или мл крови.

Определение содержания диеновых конъюгатов 0,1 мл спиртового раствора липидов (экстракт) помещали в кювету спектрофотометра СФ-16, в которой находилось 2,9 мл абсолютного спирта.

Оптическую плотность проб измеряли при длине волны 233 нм с ходом луча мм. Для пересчета использовали коэффициент молярной экстинкции 2,2 х 10-5М-5см-5 (Доровских В.А., 1987). Величину диеновых конъюгатов выражали в нмолях на г ткани и мл крови.

Количество гидроперекисей липидов определяли на основе их способности окислять ионы Fe2+ с последующей реакцией на Fe3+ с тиоцианатом аммония (Романова Л.А., 1977). Модификация метода заключалась в том, что к 1 мл раствора липидов в этаноле добавляли 1,7 мл этанола и 0,2 мл 3% НСl на этаноле, 0,1 мл 0,17% раствора Fe4 (NH 2SO4 * 6H2О на 3% HCl в этаноле), перемешивали и через 30 секунд добавляли 0,1 мл 20% раствора NH 4CNS.

Оптическую плотность проб измеряли через 15 минут при длине волны 490 нм против раствора сравнения, который вместо экстракта содержал 1 мл абсолютного этилового спирта. С целью пересчета содержания гидроперекисей липидов в мольные концентрации строили калибровочную кривую для определения ионов Fe3+ по реакции с NH 4CNS и считали, что ионы Fe 2+ вступают в реакцию с гидроперекисями в эквимолярных количествах: ROOH + Fe2+ RO*+ Fe3+ + OH-.

Измеренный нами коэффициент молярной экстинкции образующегося цветного комплекса Fe[Fe(CNS)]6 при 490 нм составляет 1,1х10 5М-1см -1, а в расчете на ион Fe3+ 0,55х105М-1см -1 (Доровских В.А., 1987). Величину гидроперекисей выражали в нмолях на г ткани и мл крови.

Определение церулоплазмина в сыворотке крови Принцип метода основан на окислении р-фенилендиамина при участии церулоплазмина (Камышников В.С., 2000). В пробирку вносили 0,1 мл сыворотки, 8 мл 0,4 М ацетатного буфера, рН 5,5 и 1 мл 0,5% водного раствора солянокислого р-фенилендиамина, тщательно перемешивали и помещали на час в водяную баню при температуре 37 0С. Реакцию останавливали добавлением 2 мл 3% раствора фтористого натрия, перемешивали, помещали в холодильник на 30 минут. Пробы колориметрировали в кюветах толщиной мм при 530 нм. В контрольные пробы фтористый натрий вносили до начала инкубации.

Содержание витамина Е определяли в липидных экстрактах из крови и тканей по цветной реакции с дипиридилом и FeCl3 (Киселевич Р.Ж., 1972) в нашей модификации. К аликвоте раствора липидов в этаноле добавляли этанол до общего объема 2 мл и далее последовательно вносили 0,2 мл хлороформа, 0,2 мл 0,2% раствора дипиридила в этаноле, 0,2 мл 0,2% раствора FeCl3 в этаноле и сразу же измеряли поглощение проб при 540 нм в кювете толщиной 0,5 см.

Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы определяли в гемолизате крови. Для приготовления гемолизата к 0,5 мл цельной крови добавляли 0,7 мл 0,05 М триэтаноламинового буфера, рН 7,6; 1 мл дистиллированной воды и 0, мл насыщенного раствора дигитонина, перемешивали, оставляли на 10 мин и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. Метод основан на спекрофотометрическом определении восстановленного НАДФН в среде, содержащей 0,05 М триэтаноламиновый буфер, рН 7,6; 0,05 М НАДФ 5+ 0; 0, М глюкозо-6-фосфатдинатриевую соль и 0,05 мл гемолизата крови. Изменение поглощения измеряли на фотоколориметре КФК-2МП при длине волны 340 нм в кювете толщиной 0,5 см через 1 мин течение 6 мин. Активность фермента выражали в мкмолях НАДФН с-1 л -1 крови (Штарберг М.А., 1998).

Активность каталазы определяли в гемолизате крови на основе способности Н2О2 образовывать окрашенный комплекс с молибдатом аммония.

Модификация была связана с подбором оптимального количества вносимого биологического материала и измерением величины коэффициента мольной экстинкции цветного комплекса Н2О2 и молибдата аммония. Инкубационная смесь объемом 2 мл содержала 0,03% Н 2О2. Реакцию инициировали внесением 0,1 мл разведенного биологического материала. Оптимальные конечные разведения для крови и печени 1:1000. Продолжительность инкубации 10 мин.

Температура 250С. По окончании инкубации добавляли 1 мл 4% молибдата аммония и измеряли поглощение при длине волны 410 нм. Измеренный нами коэффициент мольной экстинкции цветного комплекса Н 2О2 и молибдата аммония составил 102 М -1см-1. Активность каталазы выражали в ммолях Н 2О с-1 л-1 крови.

Полученные цифровые данные имели нормальное распределение, поэтому обработаны статистически стандартными параметрическими методами с использованием t-критерия Стьюдента.

2.2. Результаты биохимических исследований 2.2.1. Исследование влияния дигидрокверцетина на процессы перекисного Прежде чем исследовать влияние ДКВ на процессы ПОЛ в условиях in vivo, предварительно исследовали его действие в сравнении с токоферолом на свободнорадикальные процессы в условиях in vitro, используя в качестве модельной системы аскорбат-зависимое и НАДФН-зависимое ПОЛ в препаратах микросом печени крыс.

Исследование влияния ДКВ на интенсивность процессов аскорбат- и НАДФН-зависимого ПОЛ в условиях in vitro в микросомах печени крыс В данной серии опытов в качестве модельной системы для исследования АОА ДКВ мы использовали аскорбат-зависимое ПОЛ в субстрате микросом печени крыс. Концентрация микросом в инкубационной среде составляла 2 мг белка на мл. Влияние ДКВ на скорость ПОЛ оценивали по изменению образования МДА в суспензии микросом во время инкубации и выражали в процентах. В суспензии микросом в стандартных условиях инициировали аскорбат-зависимое ПОЛ. В опытные пробы до начала инкубации добавляли раствор ДКВ в молярной концентрации 5*10-6 Моль, 5*10-5 Моль, 5*10-4 Моль, 5*10-3 Моль, что сопоставимо с дозами 0,1; 1,10,100 мг/кг и 2,5*10-3 Моль соответствует дозе ДКВ 50 мг/кг массы животного вводимого in vivo. Витамин Е в молярной концентрации 11*10-4 Моль и 11*10-3 Моль (30мг/кг и 300мг/кг массы).

Показатели МДА и АОА дигидрокверцетина и токоферола в аскорбат- и НАДФН-зависимой системе ПОЛ в микросомах печени крыс

МДА АОА МДА АОА

Микросомы + ДКВ 5*10-6 13,924±0,058 – 9,3% 2,769±0,034 –7,02% Моль Микросомы + ДКВ 5*10-5 12,117±0,033 4,5% 2,251±0,037 9,8% Моль Микросомы + ДКВ 5*10-4 8,543±0,107 32,7% 0,385±0,043 84,5% Моль Микросомы + ДКВ 2,5*10-3 0,346±0,03 97,2% 0,262±0,027 89,9% Моль Микросомы + ДКВ 5*10-3 1,324±0,03 89,6% 0,193±0,011 92,5% Моль Моль Моль Оценивая результаты эксперимента, было констатировано, что в условиях in vitro в аскорбат-зависимой системе ПОЛ в микросомах печени крыс ДКВ проявляет антиоксидантные свойства (таб. 2). АОА ДКВ в данных условиях составила в концентрации 5*10-6 Моль – 4,5%, 5*10-5 Моль – 32,7%, 2,5*10- Моль – 97,2%, что подчеркивает прямую дозозависимость ДКВ (с увеличением дозы ДКВ АОА возрастает) и сопоставимо с АОА токоферола, которая составила 85,4% (11*10-4 Моль) и 98,3% (11*10-3 Моль).

Аналогичные тенденции прослеживались и в НАДФН-зависимой системе ПОЛ в микросомах печени крыс (таб. 2): ДКВ проявляет антиоксидантный эффект, прямопропорциональный дозе вводимого соединения. АОА в данных условиях составила в концентрации 5*10-5 Моль – 9,8%, 5*10-4 Моль – 84,5%, 2,5*10-3 Моль – 89,9%. АОА токоферола составила 72,2% (11*10 -4 Моль) и 100% (11*10-3 Моль).

Оценивая полученные результаты, можно сделать вывод: ДКВ в условиях in vitro проявляет выраженную антиоксидантную активность, сопоставимую с активностью классического антиоксиданта – токоферола.

2.2.2. Исследование влияния ДКВ на процессы ПОЛ in vivo Изучив влияние ДКВ на процессы ПОЛ в системе in vitro, мы поставили перед собой задачу исследовать антиоксидантные свойства ДКВ в условиях искусственной активации свободнорадикальных процессов в живом организме, т. е. в условиях in vivo. Из литературных данных известно о прооксидантном действии холода на организм, вызывающем активацию процессов ПОЛ в органах и тканях [39]. Принимая во внимание вышесказанное, нами была использована "холодовая" модель активации ПОЛ в условиях in vivo, поскольку последняя является наиболее удобным и подробно изученным способом активации свободнорадикальных реакций в организме лабораторных животных, при котором отмечаются типичные и стабильные изменения содержания продуктов ПОЛ и активности компонентов АОС в тканях различных органов, а также низкая летальность животных, что способствует получению статистически достоверных результатов.

Действие на организм низких температур сопровождается активацией ПОЛ и накоплением продуктов пероксидации в крови и тканях, напряжением и последующим истощением АОС тканей. Г.К. Дорошенко (1995) проведено исследование состояния ПОЛ и АОС тканей крыс при воздействии холода, установлены характерные изменения АОС, заключающиеся в активации продуцирующего НАДФН пентозного цикла окисления глюкозы (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа), истощении в тканях резервов аскорбиновой кислоты и витамина Е, снижении активности каталазы в тканях ряда органов. В результате холодового воздействия формируются общие признаки изменения гомеостаза организма, которые можно обнаружить в различных органах и тканях. Именно поэтому была исследована кровь как самая реактивная ткань, биохимические изменения которой отражают все патологические процессы в организме, ткани печени и легких.

Степень выраженности антиоксидантного эффекта ДКВ оценивали в сравнении с антиоксидантной активностью токоферола.

Антиоксидантные свойства ДКВ изучались на лабораторных животных (белые крысы – самцы) по изменению содержания продуктов ПОЛ (ГП, ДК, МДА) и компонентов АОС (церулоплазмин, витамин Е, каталаза, Г-6-ФДГ) в крови и печени крыс, подвергнутых длительному холодовому воздействию.

Определение нами ГП, ДК, МДА обусловлено тем, что данные продукты ПОЛ характеризуют в основном промежуточный и конечный этапы пероксидации мембранных фосфолипидов, содержание их в тканях более стабильно, чем начальных продуктов свободнорадикального окисления и имеет четкую зависимость от интенсивности процессов ПОЛ. Исследование биохимических показателей проводили на 7, 14, 21 дни холодового воздействия.

2.2.3. Влияние дигидрокверцетина на содержание продуктов ПОЛ в крови экспериментальных животных при холодовом воздействии Семидневное охлаждение животных сопровождалось выраженным достоверным повышением содержания продуктов ПОЛ в крови крыс контрольной группы в сравнении с интактными животными : содержание гидроперекисей липидов выросло на 46% (с 4,60±0,066 нмоль/мл до 8,506±0,082 нмоль/мл), диеновых конъюгатов – на 47% (с 93,912±0, нмоль/мл до 176,420±0,787 нмоль/мл), уровень МДА – на 40% (с 1,152±0, нмоль/мл до 1,897±0,042 нмоль/мл). (таб. 3) Содержание продуктов ПОЛ (нмоль/мл) в крови крыс на фоне применения дигидрокверцетина в дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг (7й день холодового воздействия) животные Контрольные 8,506±0,068* 176,420±0,787* 1,897±0,042* животные (холод) ДКВ 50 мг/кг 3,005±0,058** 65,608±0,837** 0,653±0,013** + холод ДКВ 100 мг/кг 3,500±0,081** 87,692±0,566** 0,755±0,013** + холод Примечание. Значимость различий контроль (интактные крысы) – опыт (холод)