Главная >> Диссертации - все темы

Pages: |

| 2 |

«СИСТЕМА ИНТЕРФЕРОНОВ I ТИПА И NK-КЛЕТОК ПРИ ЧАСТО РЕЦИДИВИРУЮЩЕМ ПРОСТОМ ГЕРПЕСЕ ...»

-- [ Страница 1 ] --

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ имени И.М.СЕЧЕНОВА МИНИСТЕРСТВА

ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

Карсонова Антонина Васильевна

СИСТЕМА ИНТЕРФЕРОНОВ I ТИПА И NK-КЛЕТОК ПРИ

ЧАСТО РЕЦИДИВИРУЮЩЕМ ПРОСТОМ ГЕРПЕСЕ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Караулов А.В.

кандидат медицинских наук Пащенков М.В.

Москва -

3.2.4 Оценка особенностей синтеза ИФН- мононуклеарными клетками крови в ответ на вирусные индукторы у пациентов с различными вариантами ответа NK-клеток на стимуляцию рекомбинантным ИФН-...... 3.2.5 Оценка экспрессии ИФН-индуцибельных генов с противовирусной функцией OAS1 и Mx1 у пациентов с ЧРПГ и у здоровых доноров............... ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИE

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВБН – вирус болезни Ньюкасла 2. ВПГ – вирус простого герпеса 3. ВПГ-1 – вирус простого герпеса 1 типа 4. ВПГ-2 – вирус простого герпеса 2 типа 5. ГГ – генитальный герпес 8. ИФН- – интерферон-альфа 9. ИФН- – интерферон-бета 10. МАТ – моноклональные антитела 11. МНК – мононуклеарные клетки 12. МНС – главный комплекс гистосовместимости 13. мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота 14. ОТ – обратная транскрипция 15. ОФГ – орофациальный герпес 16. ПГ – простой герпес 17. ПКС – полная культуральная среда 18. ПЦР – полимеразная цепная реакция 19. РНК – рибонуклеиновая кислота 20. рРНК – рибосомальная рибонуклеиновая кислота 21. ТАР - белок транспортной системы презентации антиген 22. ЦТЛ - цитотоксический лимфоцит 23. ЧРПГ – часто рецидивирующая форма простого герпеса 24. FITC – (fluorescein isothiocynate) флюоресцеина изотиоционат 25. gC – гликопротеин С 26. Ig – иммуноглобулин 27. JAK – (janus kinase) янус киназа 28. Mx1 – ген белка 1 устойчивости к миксовирусам 29. MxA – белок 1 устойчивости к миксовирусам 30. NK – естественные киллеры 31. OAS1 – олигоаденилатсинтетаза 32. PC5 – (phycoerythrin-cyanin 5) фикоэритрин-цианин 33. PC7 – (phycoerythrin-cyanin 7) фикоэритрин-цианин 34. STAT – сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции 35. TCR – Т-клеточный рецептор

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы Простой герпес (ПГ) вызывается вирусами простого герпеса 1-го и 2-го типов (ВПГ-1 и ВПГ-2) и является значимой медико-социальной проблемой.

Согласно клиническим рекомендациям стандартом фармакотерапии пациентов с рецидивирующими формами ПГ является эпизодическая или супрессивная терапия ациклическими нуклеозидами. Однако монотерапия противовирусными препаратами зачастую не позволяет добиться контроля над инфекцией. Высокая частота рецидивов и вторичный иммунодефицит, развивающийся вследствие длительной персистенции вируса, определяют необходимость патогенетического лечения, направленного на коррекцию дефектов иммунного ответа при часто рецидивирующих формах простого герпеса (ЧРПГ). На сегодняшний день в арсенале врача имеется широкий спектр препаратов иммуномодулирующей направленности, список которых постоянно пополняется. В последнее время в терапии ЧРПГ широко применяются препараты рекомбинантного интерферонаальфа (ИФН-) и индукторы ИФН- как с лечебной, так и с профилактической целью. Огромное количество публикаций посвящено применению препаратов данной группы в комплексной терапии ЧРПГ [9, 12, 19, 26, 31, 41, 44, 56, 57, 58, 64, 66, 68, 213]. Однако именно назначение иммуномодулирующей терапии является наиболее сложным вопросом в терапии ЧРПГ. Этому способствует иммунокорригирующей терапии, которая сегодня очень часто назначается эмпирически. Эмпирическое назначение провоцируется отсутствием иммунодиагностического комплекса, позволяющего оценивать вариабельность чувствительности пациента к этим препаратам в динамике клинического иммуномодуляторов, оценивать индивидуальный характер выраженности иммунокорригирующей терапии.

Ключевыми факторами естественной противовирусной резистентности являются интерфероны I типа (ИФН I типа), которые обладают как прямым противовирусным, так и иммуномодулирующим действием. ВПГ-1 и ВПГ- являются мощными индукторами выработки ИФН I типа, в частности ИФН-, мононуклеарными клетками (МНК) крови здоровых людей [240]. Основными предендритные клетки, которые распознают ВПГ с помощью рецептора TLR [188, 234]. При ЧРПГ имеется дефицит выработки ИФН I типа МНК крови [33, 34, 172, 227, 276]. Более того, врожденный дефект генов, отвечающих за индукцию выработки ИФН I типа (UNC93B, TLR3) проявляется именно тяжелыми инфекциями, вызванными ВПГ [103, 295].

Однако иммунологическая недостаточность у пациентов с ЧРПГ может быть вызвана не только недостаточностью интерфероногенеза, но и снижением ответа иммунокомпетентных клеток на эти цитокины. Так, известно, что некоторые белки ВПГ могут ингибировать ответ ряда клеточных линий на ИФНВ клетках, инфицированных ВПГ-1, ингибируется передача активационного сигнала от рецептора к ИФН-/ в ядро, что приводит к подавлению ответа клеток на ИФН- [107]. Эффект связан, в частности, с нарушением активации Jak/STAT-сигнального пути.

репликации ВПГ, являются NK-клетки. В экспериментах на лабораторных животных показано, что ранние стадии герпесвирусной инфекции могут контролироваться исключительно интерферонами, тогда как NK-клетки в сочетании с Т- и B-клетками необходимы для противодействия вирусу на более поздних стадиях инфекции [282]. По данным ряда исследований, при ЧРПГ имеет место снижение цитотоксической активности и дегрануляции NK-клеток [34, 37].

NK-клетки способны к цитолизу вирус-инфицированных клеток без предшествующей активации. Однако ИФН I типа, продуцируемые в ответ на инфекцию, резко повышают цитотоксичность NK-клеток, являясь мощными активаторами NK-клеток [59].

Учитывая снижение функциональной активности NK-клеток у пациентов с ЧРПГ, способность ВПГ ингибировать эффекты ИФН I типа in vitro, часто наблюдаемую во врачебной практике клинико-лабораторную диссоциацию, когда тяжлое течение ПГ и высокая частота рецидивов сопровождаются высокими уровнями ИФН- в интерфероновом статусе, неэффективность интерферонотерапии у некоторых больных ЧРПГ, мы предположили, что при ЧРПГ возможно угнетение ответа клеток иммунной системы, в частности NKклеток, на ИФН I типа. Для оценки функциональной активности NK-клеток помимо стандартного метода - оценки NK-активности, использовали реакцию дегрануляции, функциональная значимость которой доказана предыдущими исследованиями [74, 36, 37, 38].

Способность ВПГ ингибировать эффекты ИФН I типа показана на модельных клеточных линиях (Vero, HeLa) in vitro, тогда как возможность сходных процессов у пациентов с ЧРПГ не исследована. На сегодняшний день становится очевидным, что при выборе вектора иммунокоррекции необходим персонализированный подход с учтом вариабельности «чувствительности»

целевого показателя иммунной системы пациента к потенциальному лечебному воздействию в динамике клинического процесса.

Цель работы: изучить влияние рекомбинантного ИФН- на функциональную активность NK-клеток и экспрессию интерферон-индуцибельных генов с противовирусной функцией в сопоставлении с способностью к синтезу эндогенного ИФН- при часто рецидивирующих формах ПГ.

Задачи исследования:

1) Изучить влияние рекомбинантного ИФН- на дегрануляцию NK-клеток у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и у здоровых доноров 2) Изучить влияние рекомбинантного ИФН- на цитотоксическую активность NK-клеток у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и у здоровых доноров 3) Изучить экспрессию генов основных противовирусных белков OAS1 и Mx1, индуцибельных интерферонами I типа, у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и у здоровых доноров 4) Изучить особенности синтеза эндогенного ИФН- у пациентов с часто функциональной активности NK-клеток 5) Выявить возможные варианты иммунологических нарушений в системе интерферонов I типа и NK-клеток у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ Научная новизна рекомбинантным ИФН- на дегрануляцию NK-клеток и на цитотоксическую активность NK-клеток как у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ, так и у здоровых доноров.

Впервые использован комплексный подход к оценке системы интерферонов восприимчивости к рекомбинантному ИФН- мононуклеарных клеток в целом (на основании изменения экспрессии интерферон-индуцибельных генов) и NK-клеток в частности (по изменению функциональной активности), так и способности к вирус-индуцированному синтезу собственного ИФН- у пациентов с часто рецидивирующими формами ПГ и у здоровых доноров.

Впервые предпринята попытка установления факта ингибирования ИФНсигналинга вирусом простого герпеса посредством оценки изменения экспрессии интерферон-индуцибельных генов не на модельных клеточных линиях, а на рецидивирующими формами ПГ и от здоровых доноров.

Впервые идентифицировано два возможных варианта иммунологических нарушений в системе «ИФН I типа / NK-клетка».

Теоретическая и практическая значимость работы Разработан комплексный подход к оценке иммунологических нарушений в иммунодиагностического комплекса идентифицировано два варианта иммунологических нарушений в системе «ИФН I типа / NK-клетка», что позволит применять индивидуальный, иммунодиагностически обоснованный подход к назначению иммунокорригирующей терапии, в особенности препаратами рекомбинантного ИФН- или индукторами ИФН. Установлено дозозависимое увеличение функциональной активности NK-клеток под влиянием ИФН-, что подтверждает целесообразность применения иммуномодуляторов группы рецидивирующих формах ПГ.

Апробация и публикация результатов диссертационного исследования, практическое внедрение полученных результатов

Работа выполнена на кафедре клинической иммунологии и аллергологии факультета послевузовского профессионального образования врачей ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России и является фрагментом комплексной темы: «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» № госрегистрации 01.2. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при подготовке курсантов-слушателей на кафедре клинической иммунологии и аллергологии факультета послевузовского профессионального образования врачей ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России и используются в иммунодиагностической практике в лаборатории клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России.

Полученные результаты в полном объме опубликованы в 6 печатных работах, включая 3 оригинальные статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XII Международном конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» 11-13 марта 2013 года, Москва (устный доклад и публикация тезисов в материалах конгресса); на Объединенном иммунологическом Форуме 5-9 июля 2013 года в Нижнем Новгороде (устный доклад и публикация тезисов в материалах конгресса); на Конгрессе Европейской академии клинической иммунологии и аллергологии и всемирной организации аллергии (EAACI-WAO) 20-26 июня 2013года в Милане, Италия (стендовый доклад).

Апробация диссертационной работы состоялась 18 июля 2013 года на научно-практической конференции кафедры клинической иммунологии и аллергологии факультета послевузовского профессионального образования врачей ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России.

Структура и объм диссертации Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, состоит из введения, глав обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Содержание работы иллюстрировано 14 рисунками и 13 таблицами. Список литературы включает 71 отечественную и 226 зарубежных работ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Вирусологические и патогенетические аспекты простого герпеса Простой герпес (Herpes simplex) - вирусное заболевание, вызываемое двумя видами альфа-герпесвирусов - вирусом простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) и вирусом простого герпеса 2 типа (ВПГ-2).

Впервые вирусы простого герпеса были идентифицированы в 1912 году, когда W. Gruter выделил ВПГ из отделяемого герпетической везикулы. ВПГ очень чувствителен к этанолу и другим органическим растворителям, инактивируется ультрафиолетовым и рентгеновским излучением [6, 25], термолабилен и инактивируется при 56 °С в течение 30 минут, но устойчив к низким температурам и повторному замораживанию [6, 40]. В 1962 г. Schneweiss среди ВПГ выделил два серологических типа (ВПГ-1 и ВПГ-2). В настоящее время они принадлежат к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesviridae, в которое из патогенных для человека герпесвирусов входит также и VaricellaZoster (герпесвирус 3 типа) [155].

Вирион ВПГ состоит из четырх компонентов: 1) внешняя оболочка с гликозилированными и негликозилированными вирусными белками, липидами и полиаминами; 2) тегумент, представляющий собой аморфный слой белков между внещней оболочкой и капсидом; 3) икосаэдрический капсида, включающий капсомеров; 4) сердцевина с двойной переплетенной линейной ДНК [238].

Тегумент Ройзмана и Фарлонга содержит белки, вовлеченные в начальные фазы вирусной инфекции и репликации, такие как транспорт вирусной ДНК из капсида вируса, раннее подавление синтеза клеточных белков и инициирование транскрипции вирусных генов [199]. Липидный бислой внешней оболочки пронизывают 11 гликопротеинов: gB, gC, gD, gE, gG, gH, gl, gL, gM, gJ, gN, хотя наличие двух последних убедительно не показано [238]. Гликопротеин gD является наиболее антигеннозначимым белком и вызывает выработку вируснейтрализующих антител. Гликопротеин gC играет роль рецептора СЗкомпонента комплемента, подавляя активацию системы комплемента и лизис инфицированной клетки. Гликопротеин gE способен связывать Fc-фрагмент IgG, препятствуя антител-зависимой противовирусной защите [83].

Геном ВПГ представлен двухспиральной ДНК и включает длинную (L) и короткую (S) часть, которые ковалентно связаны между собой и содержат открытые рамки считывания, 84 из которых кодируют полипептиды [199, 238].

Геном ВПГ-1 и ВПГ-2 составляет 152 тпн и 155 тпн соответственно, при этом гомология в ДНК составляет около 83% в кодирующих белки регионах [260].

Вирусные гены экспрессируются по группам, классифицированным как непосредственно ранние альфа-гены (immediate early - IE, ), ранние бета-гены (early -E,) и поздние гамма-гены (late ), каждый с определенной группой промоторов, регулирующих последовательную экспрессию [238]. Продукты генов - индукторы транскрипции, продукты -генов - вирусные ферменты, такие как тимидинкиназа и вирусная ДНК-полимераза, и продукты - генов структурные вирусные белки. Большая часть ферментов, необходимых для репликации вирусной ДНК, кодируется в геноме ВПГ, что принципиально для репликации ВПГ в нейронах [55].

Инфицирование вирусом простого герпеса начинается с прикрепления вирусной частицы посредством гликопротеинов gB и gC к клеточным рецепторам, роль которых выполняют гликозамингликаны. Процесс прикрепления является обратимым, и служит для удержания вирусных частиц в непосредственной близости к клетке и локализации инфекции на определенном участке [199, 238]. В следующем этапе проникновения ключевая роль принадлежит гликопротеину gD, который связывается с 3 типами рецепторов: 1) герпесвирусный медиатор прониконовения HVEM, (позже названный как HveA герпесвирусный белок проникновения A); 2) нектины: HveC - герпесвирусный белок проникновения С (нектин-1) и HveB - герпесвирусный белок проникновения B (нектин-2); 3) геперансульфатные цепи, модифицированные 3О-сульфотрансферазами [199, 238]. После связывания с одним из этих рецепторов конформационные изменения в гликопротеине gD приводят к взаимодействию с gB или gH-gL димером, что приводит к слиянию мембран. После слияния нуклеокапсид ВПГ транспортируется по микроканальцам к ядерной мембранной поре, где вирусная ДНК проникает в ядро. Как продукты вирусной оболочки, так и клеточные киназы ответственны за инициирование транскрипции -гена [260].

В инфицированной клетке образуется большое количество вирусных структурных белков, капсидные белки проникают в клеточное ядро, где ассоциируются с вновь синтезированной вирусной ДНК. Нуклеокапсиды соединяются с модифицированными участками ядерной мембраны, и вирусные частицы отпочковываются в околоядерное пространство, затем они транспортируются в аппарат Гольджи и оттуда выносятся на поверхность плазматической мембраны.

Таким образом, вирусное потомство приобретает иную оболочку, чем внутренняя ядерная мембрана, что доказано анализом мембранных липидов [260].

По ходу этих начальных событий определение развития инфекции по литическому пути или латентному состоянию, зависит в значительной степени от типа зараженных клеток [130]. Ключевым моментом, возможно, является ранняя индукция белков-транскриптов, отвечающих за латентное состояние, путем подавления активности белков ICP0 и ICP4 [146, 207]. Белок ICP участвует в установлении латентного состояния ВПГ-1 и его реактивации [93, 130]. В латентном состоянии вирусный геном переходит в нереплицирующееся состояние, которое обеспечивают несколько генов вируса: ген, кодирующий синтез самого раннего белка (синтезируется до репликации вирусной ДНК и вовлекается в процесс транскрибирования) и поздний ген вируса (вероятно, для тимидинкиназы). Предполагается, что этот процесс регулируется не самим вирусом, а генным аппаратом клетки хозяина. Для ВПГ характерна пожизненная персистенция в виде двунитчатых кольцевых форм ДНК в нейронах чувствительных ганглиев и в коже (в провоцировании рецидива заболевания наибольшее значение имеют вирусы, сохраняющиеся в ганглиях). Механизм, ответственный за репликацию, неизвестен, но предполагают, что включаются факторы, важные для регуляции нейронной генной транскрипции. В начальной фазе литического цикла продукты IE-гена, помимо того, чтобы быть факторами транскрипции для следующей волны вирусных белков, регулируют функции клетки в пользу репликации вируса и уклонения от иммунного ответа [146].

1.2 Механизмы ускользания ВПГ от противовирусного надзора Характер течения ВПГ-инфекции является результатом взаимодействия биологических свойств штамма ВПГ и особенностей функционирования иммунной системы хозяина, поэтому для ВПГ-инфекции характерен широчайший диапазон клинических форм — от латентной инфекции и бессимптомного вирусовыделения до тяжлых диссеменированных форм. Типоспецифический иммунный ответ формируется в течение 14-28 дней как при манифестном, так и при бессимптомном инфицировании [53, 100, 144].

Одной из первых в механизмах ускользания ВПГ от иммунного ответа была установлена роль продукта немедленно-раннего гена US12 белка ICP47. Вскоре после инфицирования белок ICP47 связывается с белком-транспортером ТАР1/ТАР2, участвующим в процессинге антигена, что приводит к нарушению транспорта вирусных пептидов в ЭР для связывания с молекулой МНС I класса [82, 199, 291]. Нарушение процессинга приводит к нарушению презентации антигена молекулами HLA I и ускользанию от распознавания вириона и его ранних белков посредством CD8+ ЦТЛ. Показана различная чувствительность к ингибирующему влиянию ICP47 у разных клеток in vitro: фибробласты и кератиноциты высоко чувствительны, в то время как В- и Т-лимфоциты менее чувствительны [192]. IFN- предупреждает подавление экспрессии HLA I класса в кератиноцитах и фибробластах in vitro [250]. Под влиянием секреции ИФНпроисходит восстановление экспрессии молекул класса HLA на кератиноцитах, что является необходимым для распознавания инфицированных клеток посредством CD8+ ЦТЛ [200]. Взаимовлияния ВПГ и ИФН- на экспрессию HLA I класса при ПГ изучены недостаточно. Однако даже в случае успешной презентации и распознавания эпитопа CD8+ лимфоцитом, продукт вирусного гена Us3 способен ингибировать TCR-сигналинг на стадии связывания инфицированной клетки с ЦТЛ, инактивируя цитотоксичекую функцию CD8+лимфоцитов [255,256].

ВПГ ингибирует процессинг антигена и его презентацию как молекулами HLA I, так и II класса. По данным литературы вирусный белок ICP22 ингибирует способность В-лимфоцитов к презентации эпитопов ВПГ в комплексе с МНС II класса CD4+ Т-клеткам [81]. Механизмы, лежащие в основе данного явления не изучены. Мишенями для специфического ответа CD4+ Т-клеток являются на структурном уровне белки внешней оболочки (gB, gC, gD, gE и gH), тегумента (VP11/12, VP13/14, VP16, VP22) и капсида (VP5), присутствующие на инфицированных клетках. В литературе задокументированы случаи цитотоксичности СD4+клеток в отношении инфицированных кератиноцитов в присутствии ИФН-, в частности такие клетки обнаружены на слизистой шейки матки и в области герпетических повреждений кожи [225]. Клетки памяти CD4+ к антигенам ВПГ-1, ВПГ-2 составляют приблизительно 0,2 % циркулирующих CD Т-лифоцитов [79].

ВПГ способен инфицировать дендритные клетки (ДК) [133] и нарушать созревание ДК [246], что частично обусловлено ингибированием в ДК экспрессии генов вирусными белками vhs и ICP27 [238]. Нарушение процесса созревания приводит к нарушению процесса активации ДК, движения ДК к лимфатическим узлам и в конечном итоге к нарушению антиген-презентирующей способности [238]. Наконец, некоторые штаммы ВПГ способны вызывать апоптоз ДК [161], что также снижает эффективность процесса презентации АГ. Однако имеются данные о том, что неинфицированные ДК способны поглощать апоптотические ДК и в конечном итоге презентировать эпитопы ВПГ [91]. К настоящему времени, точно не определены вирусные структуры, ответственные за подавление функции дендритных клеток.

ВПГ-инфекция активирует TLR2-сигналинг, что приводит к синтезу провоспалительных хемокинов моноцитами, нейтрофилами, клетками ЦНС (астроцитами, клетками микроглии) [134, 173, 285]. ВПГ-инфекция также активирует TLR9-сигналинг в плазмацитоидных ДК и синтез интерферонов I типа [134, 188]. Вирусный белок ICP0 способен подавлять оба вышеописанных сигналинга [238]. Экспрессия одного только ICP0 достаточна для блокировки ответа на вирусные и невирусные лиганды посредством TLR2 сигналинга [280].

Механизмы данного явления не ясны, указывается роль адаптерного белка MyD и способность ICP0 снижать уровень MyD88 и Mal(TIRAP) в клетке [280].

Вируснейтрализующие АТ покрывают поверхность вируса, тем самым препятствуя его прикреплению к клетке и проникновению его внутрь. С помощью АТ происходит опсонизация вируса, способствующая фагоцитозу и АЗКЦТ. ЦИК, состоящий из вирусных частиц и АТ, связывается с Fc-рецептором МФ с последующим его фагоцитозом и лизисом вируса [119, 242]. Гликопротеин ВПГ- gE в комплексе с гликопротеином gI формируют высокоафинный Fc-рецептор [159], связывающий Fc фрагметы IgG и препятствующий нейтрализации ВПГ посредством антител. Этот процесс был назван биполярным связыванием противовирусных IgG [137]. Этот же механизм защищает ВПГ-инфицированные клетки от АТЗКЦ [125] и фагоцитоза [210]. При незавершенном фагоцитозе вокруг вириона образуются дополнительные мембранные слои за счет компонентов клетки-фагоцита, вследствие чего ВПГ приобретает возможность персистирования. Зрелые вирионы с дополнительными мембранными слоями определяются в материале из очагов инфекции, а преимущество внеклеточных форм ВПГ способствует высокой контагиозности заболевания [129].

Система комплемента необходима в реализации гуморального ответа на ВПГ [120]. Гликопротеин gC ВПГ-1 и ВПГ-2 способен связывать компонент С3b комплемента, прерывая активацию системы и уменьшая эффективность комплемент-зависимой нейтрализации вируса посредством IgМ [152].

Блокирование активности рецепторов комплемента гликопротеином gC предложено в качестве метода оценки противовирусной активности антител [83].

Вируснейтрализующие АТ улавливают свободные вирионы, находящиеся во внеклеточном пространстве при распространении из одной клетки в другую, однако ВПГ обладает способностью распространяться на соседние клетки напрямую через клеточные контакты по цитоплазматическим мостикам, избегая контакта с циркулирующими АТ и системой комплемента [199].

ВПГ-инфекция, относится к инфекциям с нетипичной динамикой антителообразования, когда появление IgM не всегда служит надежным маркером рецидива заболевания [18]. До настоящего времени, не выявлено корреляции между тяжестью инфекции и уровнем антител, их подклассами, функциональной активностью или специфичностью. Возможно, уровень и быстрота специфического гуморального ответа являются факторами, определяющими распространение ВПГ [262]. По данным А.А. Халдина у больных герпесом наряду с клеточным иммунным ответом на активацию ВПГ встречается парадоксальный тип иммунных реакций, когда в ответ на обострение инфекции активируется гуморальное звено[60].

Показано подавление уровня синтезируемых провоспалительных цитокинов в МФ мышей, инфицированных диким типом ВПГ-1, при сравнении с клетками, инфицированными мутантным ВПГ-1 по вирусному белку VP16 (белок, участвующий в индукции вирусных генов). Механизм подобного влияния на экспрессию цитокинов был связан со способностью дикого типа ВПГ-1 снижать стабильность мРНК провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ФНО-), таким образом избегая противовирусного ответа организма [204].

При изучении механизмов реактивации ПГ установлена корреляция между повышением уровня ФНО-, ИФН-, ИЛ-6 и ИЛ-10, и развитием антигенемии, что дат основание предполагать роль цитокинов в реактивации ГВИ [188].

Много работ посвящено сравнению соотношения цитокинов Th-1- и Th-2происхождения при ГВИ. В экcпериментах на лабораторных животных показано, что в первые сутки после ВПГ-инфицирования мышей в пораженных тканях значительно повышается концентрация ИЛ-2 и ИФН-, в то время как ИЛ- определяется только на 7-14-й день и в значительно меньших количествах [253].

В других экспериментальных работах было установлено, что цитокиновый ответ на ВПГ-инфекцию преимущественной включает провоспалительный и Thlпрофиль. Однако, в период латентной инфекции в пораженных клетках отмечается выработка и ИЛ-4 [100]. При введении рекомбинантного ИЛ- экспериментальным животным значительно уменьшается репликация ВПГ в тканях, а введение рекомбинантного ИЛ-4 наоборот усиливает размножение вируса. У мышей, дефектных по синтезу ИЛ-2, чаще развиваются летальные формы герпетической инфекции по сравнению с мышами, не синтезирующими ИЛ-4 [232]. У женщин репродуктивного возраста с ГГ выявлены высокий уровень ФНО- и преобладание цитокинов Th-1-хелперов (ИФН-) над цитокинами Th-2хелперов (ИЛ-4), причм данное явление отмечалось как в ремиссию, так и в обострение заболевания [69]. Но стоит отметить, что в большинстве работ по сравнению соотношения цитокинов профилей Тh1- и Th2-происхождения у ВПГинфицированных людей, имеющих клинические проявления заболевания и без проявлений, не выявило статистически значимых различий, хотя показаны тенденции к более сильному протективному действию Th1- ответа [54, 253]. При выраженном уровне секреции ИФН- отмечается более продолжительный период ремиссии у пациентов с ВПГ-2 инфекцией генитальной локализации [253].

CD8+ ЦТЛ способны разрушить все свободные вирионы в кровотоке и в межклеточном пространстве, а также инфицированные клетки, кроме клеток ганглиев периферической нервной системы, являющихся "резервуаром" для ВПГ [46, 148, 177, 228]. По данным литературы фаза обострения РПГ характеризуется снижением ИРИ за счт снижения количества СD4+ клеток и некоторого увеличения количества CD8+ клеток [20, 23, 54, 231]. Фаза ремиссии по одним данным сопровождается снижением количества СD4+ клеток [46, 65], по другим данным в период реконвалесценции уровень СD4+ клеток нормализуется [27].

Выявленные нарушения предопределяют продолжительную персистенцию ВПГ в организме с установлением рецидивирующего течения заболевания.

Механизмы ускользания ВПГ от действия ИФН и NK-клеток описаны в соответствующих разделах.

1.3 Система интерферонов I типа в противовирусной защите В настоящее время у человека выделяют 9 видов интерферонов, обозначаемых греческими буквами :,,,,,, 1, 2, 3 [59, 71, 156]. Такие виды человеческого интерферона как,,,,, связываются с одним общим рецептором IFNAR(1/2) и объединены в семейство интерферонов I типа.

Рецептор для ИФН I типа состоит из двух субъединиц IFNAR1 и IFNAR2 и экспрессируется практически всеми клетками организма. Их количество на поверхности клетки колеблется от 200 до 6000 на клетку [59] и характеризуются высокой афинностью. Молекула ИФН I типа связывается одновременно с обеими молекулами рецептора, встраиваясь между ними. Сигнал от IFNAR(1/2) рецептора передается JAK/STAT сигнальным путем: связывание молекулы ИФН I типа с рецептором приводит к его олигомеризации, в результате чего связанные с транскрипционные факторы STAT1 и STAT2, что необходимо для гомо- и гетеродимеризации молекул STAT и их последующей миграции в ядро, где молекулы STAT связываются с промоторными участками ДНК генов-мишеней и индуцируют их экспрессию. [211, 217, 267]. ИФН- имеет 13 разновидностей.

Каждый вид и разновидность кодируется отдельным геном. Некоторые гены существуют в нескольких аллельных вариантах, которым соответствуют изоформы ИФН- (2а, 2b, 2c). Существует только одна разновидность ИФНкодируемая геном, также расположенным в кластере ИФН I типа на хромосоме 9 для человека.

ИФН II типа представлены только одним видом - ИФН- [250]. Структурно ИФН- отличается от ИФН I типа и взаимодействует с другим рецептором.

Продуцентами ИФН- могут быть различные типы клеток: NKT-клетки, NKклетки, плазмацитоидные ДК и МФ, CD8+ ЦТЛ, CD4+ Th1 клетки [59, 71, 140, 180]. По некоторым данным к продукции ИФН- способны B-лимфоциты и нейтрофилы [59]. Индукция выработки ИФН- в клетках, не относящихся к Тлимфоцитам (например, NK-клетки), происходит под влиянием цитокинов, особенно ИЛ-12 совместно с другими провоспалительными цитокинами, продуцируемыми мононуклеарными фагоцитами [24, 66, 229, 232, 249, 266].

ИФН- взаимодействует с рецептором IFNGR1/R2,состоящим из двух субъединиц R1 и R2. После связывания ИФН- с рецепторным комплексом происходит фосфорилирование ферментов JAK2 и затем JAK1. В результате происходит закрепление рецептора и комплекс R1- STAT1 перемещается к ядру, где связывается с ДНК и вызывает первую волну ответа [169, 218]. Многие из этих начальных продуктов являются факторами транскрипции, участвующими в дальнейшем регулировании ИФН- опосредованного клеточного ответа. Среди данных продуктов - ИФН- регулирующие факторы (IRFs), которые стимулируют или подавляют транскрипцию ИФН-генов. ИФН- участвует во всех иммунных реакциях макрофагов и нейтрофилов и обладает множественным действием, усиливая взаимодействие между лимфоцитами и нелимфоидными клетками (за счет стимуляции экспрессии антигенов МНС на клетках эндотелия, многих эпителиальных клетках и клетках опухолевых линий) и активируя макрофаги и способствуя эффективному уничтожению внутриклеточных микроорганизмов [166].

Помимо двух традиционных групп ИФН была описана III группа ИФНподобных цитокинов и названа ИЛ-28А (ИФН-1), ИЛ-28В (ИФН-2) и ИЛ- (ИФН-3). Эти цитокины представляют собой противовирусные белки, взаимодействующие с рецептором, состоящим из ИФН-ARl и ИЛ-10R2 (содержит цепь, общую с рецептором для ИЛ-10). Хотя идентичность по аминокислотному составу между ИФН- и ИФН- составляет не более 20%, функционально интерфероны III типа сходны с ИФН I типа и обладают сильной противовирусной активностью [59, 129].

ВПГ являются мощными индукторами выработки ИФН I типа (в частности, ИФН -) МНК крови здоровых людей [193, 240]. Хотя практически все клетки, инфицированные вирусами или бактериями, могут синтезировать ИФН I типа, наиболее мощными их продуцентами являются плазмацитоидные ДК, которые распознают вирус с помощью рецептора TLR9 и синтезируют ИФН / в раз больше, чем любой другой клеточный тип [188, 234]. ДК, инфицированные in vitro ВПГ, экспрессировали мРНК ИФН-, ИЛ-1 и ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12, ГМ- КСФ и ФНО- от 4 ч до 12 ч после инфицирования [192]. Установлено, что при РПГ имеется дефицит выработки ИФН I типа МНК крови [32, 33, 34, 172, 227, 276]. Более того, врожденный дефект генов, отвечающих за индукцию выработки ИФН I типа (UNC93B, TLR3) проявляется именно тяжело протекающими инфекциями, вызванными ВПГ [103, 295]. Все эти данные послужили теоретической основой для целого ряда клинических испытаний препаратов ИФН I типа и индукторов ИФН при РПГ, лечебный эффект которых связан как с прямым противовирусным, так и с иммуномодулирующим действием ИФН I типа. [9, 12, 13, 19, 41, 56, 57, 58, 64, 66].

ИФН образуют автономную группу цитокинов, общее свойство которых – наличие у них противовирусной активности. В то же время, подобно другим цитокинам, они участвуют в регуляции иммунных процессов. Сочетание этих свойств делает ИФН важными факторами врожднного (а в случае ИФН- ещ и адаптивного) иммунитета и служит основанием для широкого применения ИФН в качестве лечебных препаратов [11, 32, 33, 34, 71, 208, 244] В частности, ИФН I типа обладают противовирусным и антипролиферативным действием, активируют Т-лимфоциты, естественные киллеры, моноциты, МФ и ДК, повышают экспрессию молекул MHC-I, активируют про-апоптотические гены и ингибируют анти- апоптотические механизмы, модулируют дифференцировку клеток и блокируют ангиогенез [14, 24, 32, 33, 34, 200, 240, 245].

Для целого ряда вирусов описаны белковые структуры, вызывающие цитокиновый ответ организма [24]. Ранняя продукция цитокинов может зависеть от типа проникшего вируса в организм. Для ВПГ центральным белком, вызывающим первичный цитокиновый каскад, является гликопротеин D (gD).

Этот этап выработки цитокинов включает продукцию ИФН/ и ФНОпосредством активации протеинкиназ. В экспериментах на лабораторных животных показано, что ранние стадии ГВИ могут контролироваться исключительно ИФН, тогда как NK-клетки в сочетании с Т- и B-клетками необходимы для противодействия вирусу на более поздних стадиях инфекции [282]. Дополнительно к немедленной gD-зависимой продукции цитокинов ВПГ вызывает выработку других цитокинов - ИЛ-6 и ИЛ-12 путем активации других более медленных механизмов. Многочисленными работами показано, что продукция и секреция провоспалительных цитокинов (ИФН /, ИЛ-1, ФНО, ИЛявляется ранним неспецифическим ответом организма на ГВИ [24, 32, 33, 34, 70]. Таким образом, ранняя фаза иммунного ответа на первичное инфицирование или рецидив ВПГ-инфекции возникает в первые 6—12 ч развития инфекционного процесса и обеспечивается в основном выработкой ИФН I типа [282]. ВПГ — мощный индуктор ИФН, этот эффект опосредуется распознаванием вирусных нуклеиновых кислот паттерн-распознающими рецепторами TLR3, TLR9 и DAI [103, 272, 295]. Продуцентами ИФН I типа могут быть как инфицированные эпителиоциты, так и лейкоциты, среди которых основной вклад вносят плазмацитоидные дендритные клетки [252]. Ранняя продукция ИФН-/ коррелирует с устойчивостью к ВПГ. ИФН-/ препятствуют экспрессии немедленно-ранних генов ВПГ как в ганглиях, так и в эпителиоцитах [126]. Кроме того, ИФН I типа активируют протеинкиназу R, которая фосфорилирует фактор элонгации трансляции eIF-2, что ведет к остановке трансляции в клетке. Другой мишенью ИФН-/ является РНКаза L, которая неизбирательно разрезает иммунорегуляторным действием, в частности индуцируют экспрессию хемокинов, активируют МФ, ДК и NK-клетки. Врожденные дефекты индукции интерферонового ответа проявляются именно тяжелой ВПГ-инфекцией в форме энцефалита [103, 126, 295].

Несмотря на множество механизмов, посредством которых ИФН I типа и другие цитокины могут подавлять репликацию вирусов, ВПГ обладает способностью подавлять продукцию ИФН и/или других провоспалительных цитокинов, препятствовать или прерывать сигнальные и антивирусные пути их действия. По сравнению с другими вирусными инфекциями ингибирующее влияние ИФН-/ на ВПГ-инфекцию сравнительно невелико [126], что обусловлено способностью ВПГ вызывает деградацию компонентов сигнального пути от рецептора ИФН-/, блокировать синтез ИФН и/или других провоспалительных цитокинов, препятствовать или прерывать сигнальные и антивирусные пути их действия различными путями, снижая ответ клеток на эти цитокины ВПГ [107, 160, 192, 207]. ИФН I типа индуцируют в инфицированных клетках синтез профермента протеинкиназы R, которая активируется при взаимодействии с двухцепочечной РНК [288]. PKR фосфорилирует эукариотический фактор элонгации трансляции eIF-2, что ведет к остановке трансляции всех белков в инфицированной клетке. Продукт гена 134.5 ВПГ- подавляет вызванное ИФН- фосфорилирование ранних генов вируса, а именно:

дефосфорилирует альфа субъединицу eIF-2, в результате чего трансляция в инфицированной клетке несмотря на действие ИФН I типа продолжается [107, 126, 149]. Белок VHS, кодируемый геном UL41 и находящийся в инфицированных клетках как компонент вириона, обладает эндорибонуклеазной активностью и расщепляет транскрипты, индуцированные ИФН- [107, 194, 241, 253]. Белок ICP0, кодируемый одним из немедленно-ранних генов ВПГ, вызывает деградацию клеточных белков, включая протеосомы [147, 194, 207]. В частности ICP вызывает деградацию белка PML (promyelocytic leukemia protein), чем отменяет ингибирующее действие интерферонов I типа на репликацию ВПГ [147, 207, 237].

ICP0 вызывает деградацию IRF-3, но даже в случае отсутствия ICP0, ВПГ способен блокировать индукцию синтеза ИФН- через RIG-1, в том числе посредством секвестрации IRF3 от гена-мишени [194] и блокирования PKRопосредованных эффектов на трансляцию. ВПГ способен блокировать индукцию как генов ИФН, так и генов-мишеней ИФН [127] посредством блокирования образования транскрипционного фактора IRF-3 в ответ на внутриклеточный рецептор RIG-1 [181, 194].

ВПГ вызывает синтез неактивных аналогов 2’,5’-олигоаденилатов, которые конкурируют с активными формами 2’,5’-олигоаденилатов и препятствуют активации РНКазы L [1].

В клетках модельной клеточной линии Vero, Hela, инфицированных ВПГ-1, ингибируется передача активационного сигнала от рецептора к ИФН-/ в ядро, что приводит к подавлению ответа клеток на ИФН-, в частности, посредством ингибирования фосфорилирования STAT1 киназой Jak1 [107, 290].

ВПГ-инфицированные клетки способны синтезировать растворимые гомологи цитокиновых рецепторов. В частности обнаружен гомолог, связывающий ИФН-, что способствует ингибированию противовирусного и иммуномодулирующего действия этого цитокина [39, 204]. Белок ICP27 ВПГ вызывает секрецию ВПГ-инфицированными клетками термостабильного белка — антагонист интерферонов I типа, блокирующего ИФН-/ рецептор и/или передачу сигнала от него в ядро [160], что приводит к ингибированию эффектов ИФН I типа, в т.ч. активирующего действия на NK-клетки.

1.4 NK-клетки 1.4.1 Характеристика NK-клеток Поскольку в настоящее время не выявлено специфических маркров NKклеток предлагается следующее определение NK-клеток: NK-клетки – это NKp46+CD3-, IL-15 зависимые, IL-12- индуцируемые лимфоциты, присутствующие у человека и у всех видов млекопитающих, способные быстро развивать цитотоксическую активность по отношению к различным клеточным мишеням, не имеющим молекул МНС I класса и экспрессирующим стрессиндуцируемые (лиганды для NKG2D) или микробные молекулы [59, 284].

В отсутствии известных специфических маркров главными маркрами NKклеток считаются молекулы CD56 и CD16 [59]. CD 16 –низкоаффинный рецептор для Fc-фрагментов антител субклассов IgG1 и IgG3 (у человека) [145, 156], является одним из наиболее мощных активационных рецепторов NKклеток, представляет собой трансмембранный белок суперсемейства иммуноглобулинов. Различают две изоформы этого антигена — CD16a (FcIIIA) и CD16b (FcIIIB); NK-клетки экспрессируют только первую из них. Антитела субклассов IgG1 и IgG3 играют роль опсонинов, своими Fab-фрагментами взаимодействуя с поверхностными антигенами клеток-мишеней, а Fcфрагментами — с CD16, что индуцирует литическую атаку NK-клеток против мишеней, покрытых антителами (АЗКЦТ). CD 56 - адгезивная молекула из семейства молекул адгезии нервной системы (N-CAM) из суперсемейства разделяются на основную субпопуляцию (CD56dim), составляющую около 90 % NK-клеток крови и минорную субпопуляцию (CD56 bright ), составляющую около 10 % крови. Между этими субпопуляциями имеются существенные различия [115, 116, 132, 292]. Две субпопуляции NK-клеток первоначально рассматривались как независимые: CD56dim субпопуляция — как «эффекторная», CD56bright — как «регуляторная». Однако в последующем было показано, что CD56bright и CD56dim NK-клетки представляют собой последовательные стадии дифференцировки [106, 154, 239]. CD56bright NK-клетки, по сравнению с CD56dim, характеризуются: 1) низкой или отсутствующей экспрессией CD16 (CD16 ) и KIR; 2) высокими уровнями -цепи рецептора для IL-2 (CD25+++); 3) низкой экспрессией перфорина и гранзимов, низкой цитотоксичностью в реакциях естественной цитотоксичности и АЗКЦТ; 4) высокой продукцией ИФН- при активации цитокинами ИЛ-12 и ИЛ-15; 5) высокой экспрессией NCR, NKG2D и CD94/NKG2A; 6) наличием экспрессии хемокинового рецептора CCR7, который дает возможность CD56bright NK-клеткам мигрировать в Т-клеточные зоны вторичных лимфоидных органов (CD56dim NK-клетки, на которых CCR отсутствует, мигрируют преимущественно в нелимфоидные ткани) [114, 132, 288].

предшественника пре-NKT в костном мозге [138]. Дифференцировка NK-клеток контролируется факторами транскрипции Ets1 и Id2 [71]. NK-клетки, как и Тклетки зависят от одних и тех же ростовых факторов (ИЛ-15, ИЛ-7, ИЛ-2), но основным дифференцировочным и антиапоптотическим фактором NK-клеток функционально эквивалентный селекции Т-клеток в тимусе. Суть обучения состоит в том, что цитотоксический потенциал приобретают только те NK-клетки, которые могут распознать собственные молекулы MHC организма хотя бы через один ингибиторный рецептор (как правило, CD94/NKG2A и/или KIR) [151, 216].

NK-клетки, не отвечающие этим условиям, являются гипореактивными (неспособны лизировать клетки-мишени), хотя у них сохранена экспрессия перфорина/гранзимов, а также способность секретировать цитокины [76].

Описанный механизм позволяет предотвратить случайное повреждение здоровых клеток организма NK-клетками, ингибиторные рецепторы которых не распознают MHC-лигандов. NK-клетки, не распознавшие MHC-лиганд, не погибают, а циркулируют в крови в составе CD56dimCD16+ субпопуляции, а литическая функция «необученных» NK-клеток может быть восстановлена под действием цитокинов, вырабатываемых, например, при острых вирусных инфекциях [269].

На сегодняшний день существуют несколько моделей для объяснения данного процесса - «вооружения», «разоружения», реостатная модель, но молекулярные основы обучения NK-клеток по большей части неясны [95, 143, 160, 165].

Наиболее ранним маркером NK-клеток, развивающихся in vitro и во вторичных лимфоидных органах in vivo, является CD161 (NKR-P1A) [84, 138]. Клетки с фенотипом CD3–CD56–CD161+ способны продуцировать цитокины, в частности ФНО- [84], но не обладают перфорин-зависимой цитотоксичностью [294]. С появлением маркеров CD56, CD94, NKG2D и NKp46 NK-клетки вторичных лимфоидных органов приобретают способность к выработке ИФН- и перфоринзависимому киллингу [138, 294]. CD56bright NK-клетки крови приобретают цитотоксические свойства в ходе дальнейшей дифференцировки, которая сопровождается нарастанием экспрессии цитотоксических белков, а также снижением экспрессии CD56 и появлением CD16, в результате чего NK-клетки приобретают фенотип CD56dimCD16+ (основная субпопуляция NK-клеток крови).

Скорее всего, этот процесс идет через промежуточную стадию CD56brightCD16+ клеток [87]. Превращение CD56bright NK-клеток в CD56dimCD16+, видимо, сопровождается несколькими клеточными делениями, что ведет к укорочению теломер [106, 239]. С приобретением фенотипа CD56dimCD16+ дифференцировка NK-клеток не заканчивается. CD56dim NK-клетки постепенно утрачивают экспрессию CD94/NKG2A, приобретают экспрессию одного или нескольких ингибиторных KIR-рецепторов, а также CD57 — маркера терминальной дифференцировки NK-клеток и Т-клеток [89, 187, 292]. Это сопровождается снижением способности пролиферировать и вырабатывать ИФН-. Естественная цитотоксичность NK-клеток в ходе терминальной дифференцировки существенно не меняется, однако CD57+ NK-клетки являются более мощными эффекторами АЗКЦТ [187]. Таким образом, NK-клетки и T-клетки имеют много общего и при первичных иммунодефицитах функции NK-клеток и CD8+ Т-клеток, как правило, страдают одновременно [135].

NK-клетка распознает потенциальную мишень с помощью двух типов рецепторов — ингибиторных и активационных. Ингибиторные рецепторы распознают поверхностно экспрессированные молекулы MHC I, что блокирует активацию [174,176]. Соответственно, собственные клетки организма с частичной или полной утратой поверхностной экспрессии молекул MHC I класса являются основными мишенями NK-клеток, что было впервые сформулировано H.-G. Ljunggren и K. Krre в гипотезе «отсутствия своего» (missing self) [183, 184].

Активационными рецепторами NK-клеток взаимодействуют с молекулами, индуцируемыми клеточным стрессом [77, 175, 205], появляющимися на поверхности клеток, инфицированных вирусом или злокачественно трансформированных клеток, а также вирусными белками, экспонированными на поверхности инфицированной клетки, в связи с чем NK-клетки участвуют в ранней фазе иммунного ответа на вирусную инфекцию [156] и способны распознавать самые ранние этапы онкогенной трансформации [279]. Описаны также случаи прямого распознавания вирусных белков NK-клетками: так, рецептор Ly49H, экспрессирующийся на небольшой субпопуляции NK-клеток мышей, распознает белок m157 мышиного цитомегаловируса [77]. В редких случаях NK-клетки могут распознавать и убивать непосредственно клетки возбудителя; NK-чувствительные микроорганизмы, как правило, относятся к эукариотам [189]. NK-клетки, прямо распознающие вирусные белки, после распознавания антигена могут подвергаться клональной экспансии, а в последующем ускоренно и усиленно реагируют на повторный контакт с вирусным белком, т.е. ведут себя как клетки памяти [268, 270].

Запуск литической атаки NK-клетки определяется суммой сигналов от активационных и ингибиторных рецепторов. Активационные рецепторы либо сами содержат активационные ITAM-мотивы (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs), либо взаимодействуют с ITAM-содержащими адаптерами.

ITAM-мотивы, фосфорилированные по остаткам тирозина, служат сайтами прикрепления киназ Syk и ZAP-70, которые активируются и фосфорилируют GEF-белок VAV1 (GEF = guanine nucleotide exchange factor) [150, 156]. Активный VAV1 индуцирует переход молекулы адгезии LFA-1 из закрытой в открытую (активную) конформацию [96]. Активный LFA-1 взаимодействует с лигандами на поверхности клетки-мишени (CD54, CD50), что приводит к формированию прочного межклеточного контакта [96]. ITAM-ассоциированные киназы ZAP-70 и Syk активируют фосфолипазу C, которая расщепляет фосфатидилинозитолбисфосфат (PIP2) на диацилглицерол (ДАГ) и инозитолтрифосфат (IP3); ДАГ активирует протеинкиназу C, тогда как инозитолтрифосфат индуцирует вход ионов Ca2+ в цитозоль [156]. Эти события важны как для индукции дегрануляции, так и для передачи активационного сигнала в ядро NK-клетки.

Ингибиторные рецепторы содержат ITIM-мотивы (immunoreceptor tyrosinebased inhibition motifs), служащие сайтами связывания фосфатаз SHP-1, SHP-2 и SHIP, которые дефосфорилируют VAV1 и ряд других ключевых сигнальных молекул, участвующих в активации клетки [96,221]. Если на поверхности мишени присутствует достаточное количество лигандов, распознаваемых ингибиторными рецепторами NK-клеток, то в результате LFA-1 остается в неактивной конформации и NK-клетка отделяется от мишени.

реорганизации актинового цитоскелета, перестройке ИС с образованием центрального активационного комплекса (cSMAC), в котором концентрируются активационные рецепторы и формированию устойчивого активационного сигнала в NK-клетке и периферического (pSMAC), который кольцом окружает cSMAC — молекулы адгезии (CD2, CD11a/CD18, CD11b/CD18), которые связываются со своими лигандами на поверхности клетки-мишени. отграничивает полость ИС от окружающей среды [214]. Ключевую роль в передаче активационного сигнала с мембранных рецепторов на сеть актиновых микрофиламентов играет белок синдрома Вискотта—Олдрича (Wiskott-Aldrich syndrome protein или WASP) [190], который регулирует переход актина из глобулярной формы в полимерную фибриллярную — f-актин.

Для индукции естественной цитотоксичности и реализации эффективного киллинга необходима одновременная стимуляция как двух активационных рецепторов (в случае с АЗКЦТ достаточно одного рецептора CD16), так и рецептора LFA-1, т.к. дегрануляция приобретает направленность на клеткумишень в том случае, если мишень экспрессирует лиганды для LFA-1 [97, 98].

Азурофильные гранулы NK-клеток содержат цитотоксические белки:

перфорин, сериновые протеазы гранзимы (A и B), небольшой сапозинподобный белок гранулизин и полипептид LL-37 [59, 73, 170]. Гранулы NK-клеток являются секреторными лизосомами т. е. лизосомами, способными к экзоцитозу содержимого [224] и имеют многочисленные сходства с последними, в частности:

1) кислый pH (около 5—5,5); 2) присутствие лизосомальных гидролаз, в частности катепсинов; 3) присутствие протеазоустойчивых протеогликанов (серглицин); 4) присутствие мембранных лизосомальных белков (в частности, белков CD107a, CD107b и CD63 из семейства LAMP — lysosome-associated membrane proteins) на лимитирующей мембране гранул [167, 168, 224].

Активность синтезированного перфорина ингибируется кальретикулином, а также аутоингибируется собственным C-концевым фрагментом, содержащим крупный остаток гликана, который отщепляется в кислой среде гранул, способствуя образованию зрелого перфорина [230, 278]. Внутри гранул зрелый перфорин остается неактивным вследствие отсутствия свободного Ca2+ (ионы Ca2+ связываются кальретикулином) и образования комплекса с серглицином, что создает стерическое препятствие для мультимеризации перфорина [230].

Перфорин секретируется в едином комплексе с серглицином и гранзимом B [198], однако, попав в слабощелочную или нейтральную межклеточную среду, вероятно, освобождается от серглицина [168]. Свободный Ca2+, взаимодействуя с C2-доменом, переводит перфорин в активную конформацию. Согласно «классической» модели, выведенной из опытов на искусственных фосфолипидных мембранах, молекулы перфорина с помощью C9-гомологичного домена встраиваются в поверхностную мембрану клетки-мишени, где мультимеризуются и образуют каналы, через которые в цитозоль клетки-мишени проникают гранзимы, запускающие процесс апоптоза [230]. Предшественники гранзимов в гранулах тоже остаются в неактивном состоянии вследствие связи с серглицином и другими протеогликанами [162]. В настоящее время открыто более 10 видов гранзимов, из которых у человека экспрессируются гранзимы A, B, K и M; из них гранзим В обладает наиболее значимыми эффекторными свойствами [118, 258]. Гранзим B, попав при помощи перфорина в цитозоль, путем ограниченного протеолиза активирует проапоптотический белок BID, который запускает митохондриальный путь апоптоза и ряд прокаспаз (в т.ч. прокаспазу-3), которые запускают каспазный апоптотический каскад [118]. Мишенями гранзима A являются различные нуклеопротеины [118]. Кроме того, гранзимы A и B могут активировать ИЛ-1-конвертазу (каспазу-1), вследствие чего атака NK-клеток или ЦТЛ против моноцитов или МФ, содержащих про-ИЛ-1, вызывает секрецию активного ИЛ-1, что способствует индукции воспалительного ответа [197].

Кроме того, через образовавшиеся поры мишень теряет ионы, что ведет к осмотическому лизису. Эти события объединяют термином «летальный удар».

Многие авторы высказывают мнение о том, что реальный механизм действия перфорина и гранзимов, вероятно, сложнее и указывают на роль эндоцитоза [78, 85, 139, 198, 230, 273].

Перфорин-гранзим-зависимый механизм клеточной гибели может быть заблокирован, в результате чего клетка-мишень приобретает устойчивость к действию NK-клеток. Данное явление может быть обусловлено, в частности, экспрессией у клеток-мишеней антиапоптотического фактора Bcl-2 и описано у опухолевых клеток костномозгового происхождения [271], а также у клеток, пораженных вирусом Эпштейна—Барр [289]. Помимо основного перфорингранзим-зависимого механизма, NK-клетки располагают другими средствами киллинга, в частности посредством Fas-лиганда (FasL/CD178) [251]. В покоящихся цитотоксических лимфоцитах FasL находится на внутренней поверхности мембраны литических гранул и в результате дегрануляции экспонируется на поверхности NK-клетки [92, 297]. Однако эффективность этого механизма киллинга невысока, т. к. FasL быстро «срезается» с поверхности клетки металлопротеазами [202]. В гранулах, имеющих морфологию мультивезикулярных телец, FasL находится на поверхности внутренних везикул, которые отшнуровываются от лимитирующей мембраны гранулы в ее просвет.

При дегрануляции эти везикулы секретируются в виде экзосом, что является очень эффективным средством доставки FasL к мембране клетки-мишени [157].

Хотя перфорин/гранзимы и FasL хранятся в одних и тех же органеллах, условия, необходимые для их мобилизации на поверхность цитотоксического лимфоцита могут различаться [163]. FasL связывается с молекулами Fas (CD95) на поверхности клетки-мишени (при условии, что мишень экспрессирует Fas) [247];

в результате в клетке-мишени индуцируется рецептор-зависимый путь апоптоза с участием адаптора FADD и каспаз-8 и -10. В роли индуктора рецепторзависимого апоптоза может выступать другая поверхностная молекула семейства ФНО - TRAIL/CD253, взаимодействующая с рецепторами TRAILR1 и TRAILR2.

TRAIL экспрессируется в основном незрелыми CD56–CD161+ NK-клетками [294].

ФНО-, секретируемый NK-клетками, тоже может вызывать апоптоз некоторых мишеней через рецептор TNFR1 (CD120a, p55).

Кроме того, как было рассмотрено ранее, благодаря экспрессии Fcрецепторов, NK-клетки могут участвовать в реакциях антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦТ), т.е. уничтожать мишени, опсонизированные IgG [156].

Продукция цитокинов и хемокинов является второй важнейшей функцией NK-клеток. Стимуляция активационных рецепторов приводит к активации митоген-индуцируемых протеинкиназ и протеинкиназы C, активации факторов транскрипции NF-B и AP-1 [153] и индукции экспрессии генов, в частности провоспалительных цитокинов (ИФН- -) и воспалительных хемокинов MIP-1/ и RANTES, тем самым вовлекая в иммунный ответ другие клетки иммунной системы [115, 116, 131, 158]. Одним из инициаторов МAP-киназного каскада является упоминавшийся выше белок VAV1 [156]. Описаны и так называемые регуляторные NK-клетки, вырабатывающие преимущественно интерлейкин-10 (ИЛ-10) и способствующие подавлению иммунного ответа [122].

1.4.2 NK-клетки и ВПГ-инфекция В отличие от ИФН I типа, NK-клетки вступают в действие на более позднем этапе ответа на ВПГ-инфекцию [282], и их активность во многом регулируется ИФН, продуцируемыми на ранней стадии. Стимуляция цитотоксической активности NK-клеток является одним из основных эффектов ИФН I типа [124]. Кроме того, ИФН-индуцибельные цитокины (RANTES, IP-10) привлекают NK-клетки в очаг инфекции [235]. Основная функция NK-клеток при ВПГ-инфекции — лизис вирус-инфицированных клеток. NK-клетки ингибируют репликацию ВПГ-1 in vitro [136] и in vivo [282]. В отсутствие Т-клеток NK-клетки достаточны для предотвращения летального исхода ВПГ-энцефалита у мышей [72]. В то же время пациенты с дефицитом NK-клеток [88] или их киллерной функции [215] страдают именно от тяжелых форм ВПГ-инфекции. NK-клетки способны распознавать ВПГ-инфицированные мишени на самых ранних стадиях инфекции, причем для распознавания инфицированной мишени и ее киллинга по механизму естественной цитотоксичности достаточно экспрессии немедленнораннего гена ICP0 в клетке-мишени [109]. Кроме того, NK-клетки распознают и убивают мишени, покрытые антителами к ВПГ [112]. Помимо киллинга мишеней, NK-клетки продуцируют цитокины, наиболее важными из которых являются ИФН- и ФНО-. ИФН-, наряду с ИФН I типа, препятствует репликации вируса [121], сенсибилизирует клетки-мишени к цитотоксическому действию перфорина [85], а также обладает многочисленными иммунорегуляторными эффектами.

ВПГ обладает богатым набором средств противодействия NK-клеткам.

Контакт с ВПГ-инфицированными клетками-мишенями приводит к «разоружению» NK-клеток, т.е. потере ими цитотоксических свойств [113];

механизм этого эффекта до сих пор не ясен [293]. ВПГ ингибирует экспрессию лигандов NKG2D инфицированными клетками, препятствуя их распознаванию активирующими рецепторами NK-клетками [248], а некоторые вирусные белки способны взаимодействовать с ингибирующими рецепторами NK-клеток [20,111].

При ЧРПГ, как правило, описывают снижение NK-активности [36, 37, 48, 53, 60, 104, 108, 178, 254], однако детали этих работ разнятся. Сухих с соавт.

отмечают снижение цитотоксической активности NK-клеток приблизительно у 60% больных с манифестными формами ГВИ. Отмечена четкая тенденция к понижению цитотоксичности NK- клеток в среднем за 7 дней до очередного рецидива и последующее е повышение в острый период ГВИ. По данным А.А.

Халдина [60], у больных редко рецидивирующим герпесом цитотоксическая активность NK-клеток снижена незначительно, до 35-40% (норма 45-50%), при частых обострениях снижение более значительное - до 20-25%. По данным С.Б.Чекнева и соавт., снижение NK-активности при рецидивирующем генитальном герпесе более выражено в стадию ремиссии заболевания [108]. Cauda и соавт., напротив, сообщают о снижении NK-активности и содержания NKклеток (определяемых как CD16+ лимфоциты) преимущественно в ходе обострения генитального герпеса, с нормализацией во время ремиссии [104], Leszczyszyn-Pynka приводит сходные данные для рецидивирующего лабиального герпеса [178]. Наконец, по данным Sirianni и соавт., NK-активность при рецидивирующем генитальном герпесе снижена независимо от стадии заболевания, причем это снижение обратно коррелирует с повышенным процентным содержанием NK-клеток, которые определяли как HNK-1+ (CD57+) лимфоциты [254]. Трактовка данных Sirianni и соавт. затруднена, поскольку CD не является специфичным маркером NK-клеток. По данным Муругина и соавт.

NK-активность также снижена при ЧРПГ в ремиссию и имеет нормальные показатели в обострение [36, 37]. Муругин и соавт. исследовали у пациентов с ЧРПГ помимо стандартного параметра NK-активности, дегрануляцию NK-клеток и отмечают, что как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии у пациентов с ЧРПГ умеренно снижена дегрануляция NK-клеток в ответ как на рецепторную, так и на нерецепторную стимуляцию. Достоверное снижение NK-активности имеется только в стадии ремиссии. В стадию обострения, но не в стадию ремиссии, нарушена корреляция между NK-активностью и процентом NK-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с K562. В целом, данные по состоянию NK-клеток при ЧРГ противоречивы.

1.4.3 Современные методы исследования функциональной активности NKклеток: оценка дегрануляции NK-клеток.

Из рассмотренных выше механизмов цитотоксичности NK-клеток дегрануляция — главный механизм, с помощью которого NK-клетки осуществляют киллерную функцию, поэтому ее исследование необходимо для оценки состояния NK-клеток. Поляризации гранул, т.е. движению литических гранул в зону ИС, является Ca-зависимыми и обеспечиваются тубулиновым цитоскелетом (микротрубочками) в направлении активированного LFA-1 [97]. В передаче сигнала с LFA-1 на тубулиновый цитоскелет участвуют белки талин, WASP и CIP-4, устанавливающий связь между WASP и центром организации микротрубочек (ЦОМТ) [80]. Поляризованные гранулы скапливаются непосредственно под ИС у поверхностной мембране NK-клетки [233]. Возможно, в окончательном движении гранул от ЦОМТ к мембране участвуют актиновые филаменты и миозин II [75]. Во взаимодействии гранул с поверхностной мембраной выделяют несколько этапов: прикрепление (docking), подготовку к слиянию (priming) и слияние (fusion). Прикрепление обеспечивается малой ГТФазой Rab27, которая ассоциирована с наружной поверхностью гранул, тогда как в подготовке к слиянию ключевую роль играет белок Munc13-4 [135].

Интересно, что в покоящихся клетках Rab27 и Munc13-4 связаны не с гранулами, а, соответственно, с поздними и с рециклизирующимися эндосомами. Слияние Rab27+ и Munc13-4+ везикул с гранулами происходит непосредственно перед прикреплением гранул к мембране и, вероятно, представляет собой еще один механизм, препятствующий случайной дегрануляции [194]. Слияние мембраны гранул с поверхностной мембраной NK-клетки обеспечивается взаимодействием белков v-SNARE (со стороны гранулы) и t-SNARE (со стороны поверхностной мембраны) [135, 214]. В результате слияния мембран происходит собственно дегрануляция, т.е. выход содержимого цитотоксических гранул в щель ИС — полость глубиной около 50 нм [191], отграниченную от межклеточной среды барьером из молекул адгезии (pSMAC). Гранула при этом запустевает, а ее мембрана встраивается в наружную мембрану NK-клетки. Однако возможна и неполная дегрануляция, когда содержимое гранулы секретируется лишь частично, после чего сообщение полости гранулы с внеклеточной средой закрывается и гранула отходит от мембраны в глубь цитоплазмы [182]; значение и механизмы этого явления неясны. После дегрануляции NK-клетка остается конъюгированной с клеткой-мишенью около часа, что, вероятно, необходимо для индукции апоптоза [214], а также, возможно, для эндоцитоза цитотоксических белков (в частности, гранзима B), выделившихся в полость ИС, но не поглощенных клеткой-мишенью для быстрого восстановления литического потенциала [179].

Наиболее очевидный способ оценки дегрануляции — измерение уровней содержимого гранул в культуральном супернатанте NK-клеток (например, с помощью Вестерн-блоттинга, иммуноферментного анализа или путем измерения активности гранзимов) [198]. Кроме того, количество клеток, секретирующих перфорин, можно оценить методом ELISPOT (enzyme-linked immunospot) [296].

Недостаток данного подхода — необходимость использовать очищенные NKклетки, т.к. иначе нельзя точно судить об источнике перфорина/гранзимов. Кроме того, поскольку значительная часть перфорина и гранзимов поглощается клетками-мишенями, то измерение их свободных уровней в супернатанте ведет к недооценке их реальной секреции.

Другой подход — измерение убыли секретируемых белков внутри клетки, например с помощью иммунофлюоресцентной окраски и проточной цитометрии.

Чувствительность этого подхода невысока, т. к. при однократной литической атаке NK-клетка выбрасывает лишь небольшую часть цитотоксических белков, потери которых к тому же восполняются за счет повторного использования или синтеза de novo.

Наконец, еще один подход основан на том факте, что при дегрануляции NKклетки происходит слияние мембраны литических гранул с поверхностной мембраной, в результате чего мембранные белки, располагающиеся на внутренней поверхности гранул, оказываются на поверхности NK-клетки (экстернализируются), где могут быть выявлены с помощью иммунофлюоресцентной окраски. К числу таких белков относятся CD107a (LAMP-1 или lysosome-associated membrane protein-1) и родственный ему CD107b (LAMP-2) [224]. Эти два высокогликозилированных белка составляют около 50% мембранных белков лизосом и их производных [141]. Вероятно, они защищают мембрану гранул, а после дегрануляции — также и поверхностную мембрану цитотоксического лимфоцита от повреждения цитотоксическими белками.

Экстернализация CD107a была предложена в качестве маркера дегрануляции вначале для CD8+ Т-клеток [86], а затем для NK-клеток [74] и CD4+ Т-клеток [102]. Экстернализацию CD107a оценивают после кратковременной (2—4 ч) стимуляции клеток in vitro. В качестве стимуляторов NK-клеток обычно используют клетки K562 (MHC-I-негативная клеточная линия, полученная от больного эритромиелоидным лейкозом и являющаяся классической мишенью NK-клеток), другие NK-чувствительные клеточные линии, моноклональные антитела к активационным рецепторам NK-клеток, а также нерецепторные стимулы (форбол-12-миристат-13-ацетат в сочетании с иономицином) [74].

Результаты теста на экстернализацию CD107a обычно оценивают с помощью проточной цитометрии [74, 99]. Тест получил широкое распространение, что обусловлено следующими его преимуществами: 1) относительная простота; 2) высокая чувствительность; 3) возможность визуализировать и подсчитывать «настоящие» эффекторные лимфоциты, т.е. клетки, отвечающие на ту или иную стимуляцию выбросом цитотоксических белков; 4) возможность определять фенотип дегранулирующих клеток; 5) возможность одновременно исследовать другие функции дегранулирующих и недегранулирующих клеток, в частности продукцию ими цитокинов. По данным Tomescu и соавторов, CD107a+ и CD107a– NK-клетки, полученные после 3-часовой коинкубации с клетками K562, не различаются по внутриклеточному содержанию перфорина и гранзимов [275], неизвестно, существуют ли более чувствительные маркеры дегрануляции, чем CD107a/b.

Значение CD107a как маркера дегрануляции NK-клеток, а также значимость реакции дегрануляции NK-клеток в оценке функций NK-клеток при первичных иммунодефицитах подтверждена в работах Муругина и соавт. [36, 37, 38].

Муругин и соавт. отмечают, что CD107a является более чувствительным и специфичным маркером дегрануляции NK-клеток, чем CD63 [36]. Лишь небольшая часть циркулирующих NK-клеток и их CD56dim субпопуляции дегранулирует при взаимодействии с NK-чувствительными клетками-мишенями K562, при этом значительная часть NK-клеток активируется, но не дегранулирует, причм более высокий процент дегранулирующих клеток наблюдается в субпопуляции CD56dim CD159a+ CD94bright CD335dim NK-клеток [36]. У здоровых доноров в возрасте до 50 лет NK-активность МНК коррелирует с процентным содержанием NK-клеток среди МНК и с процентом NK-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с клетками K562, но не коррелирует с внутриклеточным содержанием перфорина в NK-клетках и с количеством гранул, выбрасываемых в среднем одной NK-клеткой при взаимодействии с клетками K562. У лиц пожилого возраста (старше 65 лет) снижена дегрануляция NK-клеток в ответ на различные виды стимуляции при неизмененной NK-активности МНК; нарушена корреляция между NK-активностью и процентом NK-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с K562 [38].

При синдроме Вискотта—Олдрича резко снижена дегрануляция NK-клеток в ответ на рецепторный стимул (K562), в меньшей степени на нерецепторные стимулы, что сопровождается резким снижением NK-активности у этих больных, корреляция между показателями дегрануляции NK-клеток и NK-активностью МНК отсутствует [36]. При хронической гранулематозной болезни функциональные показатели NK-клеток существенно не изменены. У пациентов с часто рецидивирующим герпесом как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии умеренно снижена дегрануляция NK-клеток в ответ как на рецепторную, так и на нерецепторную стимуляцию. Достоверное снижение NKактивности имеется только в стадии ремиссии. В стадию обострения, но не в стадию ремиссии, нарушена корреляция между NK-активностью и процентом NK-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с K562 [37].

1.5 Современные подходы к терапии простого герпеса 1.5.1 Ациклические нуклеозиды Элиминирование вируса из организма на данный момент развития науки не представляется возможным вследствие уникальной способности альфагерпесвирусов формировать состояние латентности в нейронах регионарных ганглиев [238]. Если элиминировать вирус невозможно, то необходимо добиться контроля над инфекцией, в связи с чем основными целями лечебных мероприятий при ПГ являются: а) ускорение разрешения клинических проявлений б) предупреждение развития осложнений в) уменьшение частоты рецидивов и улучшение качества жизни г) снижение риска передачи ВПГ здоровому партнру новорожденному [47, 105, 220] Стандартом фармакотерапии пациентов с ЧРПГ является эпизодическая или супрессивная терапия ациклическими нуклеозидами (АЦН) [47, 105, 220]. Первый АЦН был создан и внедрн в практику в 1974 г.

британской фирмой Glaxo Wellcome Foundation LTD. Ацикловир – 9[(2гидроксиэтокси-)-метил]-гуанин – синтетический ациклический аналог пуринового нуклеозида дезоксигуанозина, нормального компонента ДНК.

Гуанозин – один из самых частых концевых и внутренних нуклеозидов ДНК герпесвирусов и составляет 16% всех повторов в цепях ДНК герпеса. Механизм действия ацикловира складывается из трех основных компонентов:1) Ацикловир высокоспецифичен ферменту тимидинкиназе именно герпесвирусов, поэтому АЦВ ингибирует in vitro и in vivo репликацию герпесвирусов человека, включая следующие (перечислены в порядке снижения противовирусной активности ацикловира в культуре клеток): вирус Herpes simplex 1 и 2 типов, вирус Varicella zoster, вирус Эпштейна-Барр и ЦМВ; 2) Тимидинкиназа герпесвирусов в тысячи фосфорилированный ацикловир накапливается практически только в инфицированных клетках (в остальных клетках его содержание не более 1%), чем объясняется отсутствие цитотоксических, тератогенных и мутагенных свойств; 3) вирусная ДНК-полимераза включает ацикловира трифосфат в цепочку вирусной ДНК вместо естественного дезоксигуанозинтрифосфата, что вызывает обрыв цепи и блокирует дальнейшую репликацию вирусной ДНК без повреждения клеток хозяина [45].

репликации вирусов на любой стадии и новые генерации вирусов не образуются.

Будучи включенным в какой-либо участок новой ДНК, ацикловир никогда не заменяется естественным гуанином [142].

Установлено, что у 5–7% пациентов, страдающих рецидивирующим герпесом (РГ), в процессе лечения развивается резистентность к ацикловиру или он изначально не оказывает лечебного действия. В большинстве клинических изолятов, полученных от АЦВ-резистентных больных, обнаруживается относительный дефицит вирусной тимидинкназы или ДНК-полимеразы, либо нарушение структуры ферментов вследствие генной мутации, что приводит к нарушению субстратной специфичности [РЛС]. Кроме того, АЦВ обладает низкой биодоступностью при пероральном приме (10-20%) и требует частого прима по 200 мг 5 раз в сутки или по 400мг 3 раза в сутки [47, 105, 220]. Вс это обусловило появление в клинической практике двух новых ациклических нуклеозидов – валацикловира и фамцикловира.

Валацикловир (Валтрекс) представляет собой L–валиновый эфир АЦВ.

Эфирная надстройка обеспечивает высокий уровень всасываемости после перорального прима, повышая биодоступность до 50-70% в зависимости о дозы [286]. Благодаря высокой биодоступности валтрекс является лидером по комплаентности среди аналогов нуклеозидов [128]. Механизмы действия валтрекса и АЦВ отличаются только на первом этапе: в кишечнике и печени валтрекс гидролизуется под действием фермента валацикловир-гидралазы и освобождается от эфирной надстройки, полностью (около 99%) превращаясь в АЦВ, который далее включается в синтез дефектных вирусных ДНК [286, 259].

Валацикловир является эффективным средством подавления рецидивов ГГ независимо от иммунокомпетентности пациентов [Марченко 2000, Corey 2004].

Достоинство валацикловира в сравнении с ацикловиром состоит в том, что его оральный прием создает концентрации ацикловира в сыворотке крови и других внутренних средах, эквивалентные тем, которые достигаются только при внутривенном введении ацикловира. Именно это позволяет пациенту уменьшить число приемов препарата при рецидиве до 2–х раз в день (в отличие от ацикловира, который принимают 5 раз в день) и принимать валацикловир 1 раз в день при супрессивной терапии.

Фамцикловир (Фамвир) является пролекарством другого синтетического аналога дезоксигуанозина – пенцикловира. Биодоступность и противовирусный спектр пенцикловира при пероральном приме сопоставимы с таковыми для АЦВ[ Spruance 1996] Биодоступность пенцикловира значительно повышается при применении его пролекарства – фамцикловира [94]. При применении фамцикловира биодоступность пенцикловира составляет 77% [223, 277], что превосходит биодоступность АЦВ при применении валацикловира, составляющую около 55 % [281]. Фамцикловир обладает рядом существенных преимуществ в сравнении с АЦВ. Это прежде всего его высокий аффинитет к тимидинкиназе, значительное блокирование синтеза ДНК in vitro в инфицированных клетках, более выраженное блокирование репликации вируса между примами препарата. Время, необходимое для достижения максимальной концентрации препарата, почти в 2 раза меньше, чем у АЦВ, соотношение концентрации препарата в клетках, поражнных вирусом, к концентрации в здоровых клетках 16,95:1 In vivo резистентность ВПГ к фамцикловиру не превышает 0,3%.

Валацикловир и фамцикловир имеют важные различия в тропности к ферментам герпесвирусов. Так, фамцикловир в 75-100 раз активнее валацикловира фосфорилируется тимидинкиназой, что создат перевес синтетического нуклеозида над естественным. В свою очередь, валацикловир в 160 раз активнее фамцикловира тропен к вирусной ДНК-полимеразе, что обрывает процесс наращивания цепи вирусной ДНК. Многочисленными исследованиями доказана эффективноть терпи фамцикловиром ГГ. Так, в исследовании Diaz-Mitoma et al. доказана эффективность всех трх режимов дозирования фамцикловира в сравнении с плацебо (125х3, 250х3, 250х2) [123]. В противорецидивной терапии ГГ фамцикловир при приме внутрь 2 раза в сутки, также как и валацикловир [90, 277], был сопоставим по эффективности с АЦВ, принимаемым 5 раз в сутки [110]. Накопленные данные позволяют говорить об абсолютной безопасности, высокой эффективности, хорошей переносимости препаратов и отсутствии значимых побочных эффектов при применении АЦВ [274]. Не отмечено и тератогенных эффектов АЦВ и валтрекса при приме во время беременности [265].

На данный момент согласно международным стандартам лечения ГВИ препаратами выбора являются Ацикловир, Валтрекс, Фамвир, показавшие равную эффективность и безопасность в ходе многочисленных клинических исследований [105, 200].

В настоящее время существует два варианта терапии рецидивирующего ПГ с использованием АЦН: эпизодическая и превентивная (супрессивная) терапия.

Стратегию лечения больных с РПГ определяется рядом факторов: частота рецидивов, тяжесть клинических симптомов (на основании субъективной оценки больного), состояние иммунной системы, психосоциальные особенности, наличие риска передачи инфекции половому партнеру или новорожденному, а также экономические аспекты терапии.

Эпизодическая терапия подразумевает пероральный прием препаратов в момент обострения инфекции. Для эпизодической противовирусной терапии ГГ Центром по контролю за заболеваемостью рекомендовано начало терапии в продромальный период, но не позже 1 суток появления кожных проявлений [105] в одном из следующих режимов: АЦВ 400 mg 3 раза в сутки в течении 5 дней, либо 800 мг 2 раза в сутки в течение 5 дней, либо 800 мг 3 раза в сутки в течение дней, или фамцикловир 125 мг 2 раза в сутки в течение 5 дней, либо 1000 мг раза в сутки в течение 1 дня, либо 500 мг однократно, затем 250 мг 2 раза в сутки в течение 2 дней, или валацикловир 500 мг 2 раза в сутки в течение 3 дней, либо 1г 1 раз в сутки в течение 5 дней. Клиинические рекомендации Российского общества дерматовенерологов [47] предписывают следующие режимы эпизодической терапии ГГ: АЦВ 200 мг 5раз в сутки в течение 5 дней, либо 400мг 3раза в сутки в течение 5 дней, или валацикловир 500мг 2 раза в сутки в течение дней,или фамцикловир 125 мг 2 раза в сутки в течение 5 дней. Такой метод терапии показан больным с редкими, клинически невыраженными обострениями и при наличии четко определяемого продромального синдрома, во время которого следует начинать прием препаратов [265].

Супрессивная терапия подразумевает постоянный прим (часто годами) препарата с превентивной целью и для большинства больных с частыми рецидивами более целесообразна, чем эпизодическое лечение. Такой режим приема препаратов показан больным с редкими, но тяжелыми рецидивами, в дискордантных по ГГ парах с целью профилактики передачи инфекции, при наличии выраженных психосоциальных и психосексуальных реакций на рецидивы, а также при значительном влиянии инфекции на качество жизни больного [105]. СDC рекомендует следующие схемы супрессивной терапии ГГ:

АЦВ 400мг2 разав сутки, или валацикловир 500мг1развсутки, либо 1г 1 разв сутки ( при очень часто рецидивирующем герпесе более 10 эпизодов в год), или дерматовенерологов рекомендует назначение следующих схем: АЦВ 400 мг 2 раза в сутки, валацикловир 500 мг 1 разв сутки, фамцикловир 250 мг 2 раза в сутки [47].

В ходе научных исследований [236] было показано, что наибольшая эффективность ацикловира (79% по сравнению с плацебо) при превентивной терапии достигается при приеме препарата в дозе 200 мг 4 раза в день. Однако дозировка ацикловира 400 мг 2 раза в день при несколько меньшей эффективности стала стандартной в США благодаря оптимальному сочетанию эффективности и удобства [236, 287]. S. Eisen и соавт. [128] показали, что прием валтрекса по 500 мг в день в непрерывном режиме является самой комплаентной схемой превентивной терапии ГГ. Супрессивная терапия аналогами нуклеозидов улучшает психологическое состояние пациентов [105].

Помимо снижения частоты рецидивов, супрессивная терапия уменьшает асимптоматическое выделение вируса – одного из основных факторов передачи вируса. По данным A. Wald [283], непрерывный прием ацикловира или валтрекса в оптимальных дозах может ослаблять бессимптомное вирусовыделение более чем на 85% по сравнению с плацебо; доля времени, в течение которого отмечалось выделение вируса, при приеме препаратов и плацебо составила 0,3% и 6,9% соответственно. Однако в ряде случаев даже на фоне длительной супрессивной терапии могут возникать обострения и эпизоды бессимптомного вирусовыделения, при которых не исключена возможность неумышленного инфицирования половых партнеров. Это объясняется прежде всего развитием устойчивости вируса герпеса к ацикловиру.

В настоящее время описаны 3 основных механизма резистентности к ацикловиру. Наиболее известный среди них обусловлен отсутствием индукции вирусом специфической тимидинкиназы. Второй механизм - тимидинкиназа продуцируется, однако этот фермент генетически изменен и не может фосфорилировать ацикловир. Третий механизм связан с мутацией в гене ДНКполимеразы, в результате чего снижается чувствительность к тормозящему действию ацикловир-трифосфата. Поэтому в случаях резистентности к ацикловиру следует использовать противовирусные препараты, не требующие их активации упомянутыми ферментами.

Были проведены исследования для выяснения связи длительного приема ацикловира с появлением устойчивых штаммов вирусов [196]. Однако ими не было обнаружено вирусов-мутантов у больных с обострениями и без таковых на фоне супрессивной терапии. Подобные же данные были получены и другими исследователями, анализировавшими результаты лечения ацикловиром на протяжении 1 года приема препарата. Таким образом, помимо резистентности к ацикловиру результаты лечения возможно зависят и от других факторов.

В последнее время в литературе обсуждается поиск новых препаратов, обладающих противогерпетической активностью в отношении штаммов вируса, устойчивых к ациклическим нуклеозидам [206]. Выявлены новые мишени для влияния химиопрепаратов - ферменты, участвующих в синтезе ДНК (хеликаза и праймаза). Эти ферменты работают на начальных этапах синтеза ДНК до ДНКполимеразы - хеликаза способствует расплетанию двойной цепи ДНК, праймаза синтезирует РНК праймеры по одноцепочечной нити ДНК. Ингибирование работы этих ферментов приводит к нарушению размножения вируса и прекращению развития вирусной инфекции. На моделях экспериментальных животных показана эффективность этих препаратов, как в отношении острой инфекции, так и последующих рецидивов [166]. Кроме того, новые препараты обладают синергичным действием с ациклическими нуклеозидами и рассматривается их применение для комбинированной терапии при тяжелом течении герпесвирусной инфекции (менингит, диссеминированная форма инфекции).

Много внимания в последнее время уделяется психологической помощи, как неотъемлемой составляющей комплексной терапии ЧРПГ. Многие пациенты испытывают эмоциональный дискомфорт, который связан с ожиданием рецидива заболевания, опасениями инфицировать своих настоящих или будущих партнеров, возможными проблемами с беременностью. У части больных возможно развитие неврозов, депрессии, снижение самооценки, стремление к ограничению круга общения [28].

позволяет добиться контроля над инфекцией. Элиминация вируса из организма на данный момент развития медицинской науки не представляется возможным, вследствие уникального свойства альфа-герпесвирусов формировать состояние латентности в ганглиях. И соответственно после отмены противовирусных препаратов возможно возобновление продолжение рецидивов заболевания с прежней частотой. Длительное персистирование вируса приводит к развитию иммунодефицитного состояния, в связи с чем лечение больных РПГ представляет сложную проблему. В связи с чем в настоящее время существуют два основных направления в лечении простого герпеса [30,50]: 1) использование противовирусной химиотерапии, основное место в которой отводится ациклическим нуклеозидам и в первую очередь ацикловиру; 2) комплексный метод лечения, сочетающий противовирусную терапию с иммунокорригирующей терапией. Применение комплексной терапии с использованием препаратов иммуномодулирующей направленности широко распространено на территории нашей страны. Отечественные специалисты считают правомочным применение иммуномодулирующих средств [31, 61], но иммуномодуляторы должны применяться после предварительного изучения количества и функционального резерва клеток-мишеней иммунной системы, так как ограничение иммунного ответа, вызванное специфическим иммунодефицитом, не может быть преодолено слабым неспецифическим стимулом[30]. Наиболее перспективным им представляется последовательное использование химиопрепаратов и иммунотерапии. Большинство же зарубежных специалистов отдают предпочтение противовирусной химиотерапии, так как применение иммуномодулирующих средств, по их мнению, нецелесообразно в связи с несформированной окончательно концепцией иммунодефицита, возникающего при ГГ.

Частые рецидивы ГВИ, вторичный иммунодефицит, развивающийся вследствие длительной персистенции вируса, определяют необходимость патогенетического лечения, направленного на коррекцию дефектов иммунного ответа. По мнению многих авторов рецидивирующая герпесвирусная инфекция является иммунологической проблемой и оптимальной является только комплексная терапия, сочетающая этиотропное лечение ациклическими нуклеозидами и патогенетическое лечение иммунотропными препаратами, [2,3,5,6,7,16,17,20,23,26,29,31,32,42,44,53,60,61,68,201].

1.5.2 Вакцинотерапия противогерпетических лечебных вакцин (L.Fournier и C.Levadity в 1928 году на моделях животных, а затем R.T.Brain в 1936 и S.B.Frank в 1938 в клинических испытаниях у больных РПГ) в разных странах мира применили более десятка модификаций инактивированных (цельновирионных) и рекомбинантных вакцин для лечения десятка больных с рецидивирующим герпесом [20, 262, 264]. В РФ зарегистрированы две герпетические вакцины «Витагерпавак» и «Герповакс».

Обе вакцины применяются исключительно в период ремиссии с целью профилактики рецидивов заболевания. «Витагерпавак» - культуральная инактивированная вакцина разработанная учеными НИИ вирусологии им. Д.И.

Ивановского (Витафарма, Москва), Вакцина содержит специфические инактивированные антигены вирусов простого герпеса (ВПГ) и серотипов, полученного путем репродукции в культуре перевиваемых клеток Vero B. Курс вакцинотерапии составляет 5 внутрикожных инъекций, которые проводят с интервалом 7-10 дней [48]. Как отмечают некоторые авторы, вакцинация современным вакцинным препаратом Витагерпавак в лекарственной форме в виде свечей обладает хорошей переносимостью и лечебной эффективностью [3].

«Герповакс»- инактивированный формалином вирус простого герпеса I и II антигенных типов, выращенный на культуре клеток ткани фибробластов куриных эмбрионов. Производит вакцину Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов, г. Санкт-Петербург.

Цикл лечения состоит из 5 инъекций, которые проводят с интервалом в 3-4 дня.

Основной курс включает 1 или 2 таких цикла с интервалом между ними в 7- дней. Через 6 месяцев проводят повторный курс вакцинации (1-2 цикла по инъекций) [35,45]. До настоящего времени не сформировалась научнообоснованная концепция положительного эффекта вакцинотерапии. Хотя в 90-х годах прошлого века применение противогерпетических вакцин было достаточно популярным. По опубликованным данным, клиническая эффективность специфической иммунотерапии в виде стойких ремиссий в течение года составляет от 30 до 80 % среди пациентов, прошедших полный курс лечения [287], при кожных формах положительный эффект выявлялся в90% случаев, при ГГ рецидивы прекратились у 60 % больных [15]. Большинство исследователей считают, что эффективность герпетической вакцины в основном связана со стимуляцией реакций клеточного иммунитета, В.Н.Гребенюк в 1983 г.

проводя сравнение между действием вакцины и лиофилизированного интерферона на интерфероновый статус и цитотоксическую активность NKклеток у больных ПГ, выявил, что в отличие от ИФН, вакцина не усиливает выработку ИФН-, основной же эффект связан с активацией T-лимфоцитов и клеток моноцитарно-макрофагального ряда [2].

Несмотря на многочисленные исследования, до сих пор не было получено ни одной эффективной профилактической вакцины против ВПГ 1и 2 типов. В США проводились попытки использования рекомбинантных вакцин, содержащих вирусные гликопротеины В и D, в сочетании с иммуномодуляторами в качестве адъювантов [263]. В предыдущем тексте мировых руководств по ведению пациентов с генитальным герпесом говорилось о проводимых испытаниях герпетических вакцин. Эффективность использования вакцины против ВПГ-2 в сравнении с плацебо проявляется только у женщин, серонегативных как по ВПГ-1,так и по ВПГ-2 [117, 257]. Однако уже в новой редакции Европейских рекомендаций по ведению больных с ГГ от 2010г [220] отмечается провал клинических испытаний данных вакцин и внимание противогерпетической вакцинотерапии не уделяется.

1.5.3 Иммуномодулирующая терапия Комплексный метод лечения, сочетающий противовирусную терапию с использованием препаратов иммуномодулирующей направленности нашл широкое применение на территории нашей страны. Большинство зарубежных специалистов отдают предпочтение противовирусной химиотерапии, так как применение иммуномодулирующих средств, по их мнению, нецелесообразно в связи с несформированной окончательно концепцией иммунодефицита, возникающего при ГГ, в связи с чем иммуномодулирующая терапия даже не упоминается в текстах мировых рекомендаций по ведению пациентов с рецидивирующей ГВИ [ ].

Страницы российских научных журналов, посвящнных терапии ГВИ, большей частью заняты публикациями на тему применению препаратов данной группы в комплексной терапии ЧРПГ, отечественные специалисты считают правомочным применение иммуномодулирующих средств при ЧРПГ, причм наиболее перспективным им представляется последовательное использование химиопрепаратов и иммунотерапии, [5, 8, 10, 26, 31, 44, 51, 61, 65, 68, 69]. В зарегистрированы, рекомендуется и широко используется огромное количество препаратов иммуномодулирующего действия, список которых постоянно «Иммуномодуляторов в России» раздел противогерпетических препаратов насчитывает около 34 наименований препаратов с иммуномодулирующим действием в отношении терапии ГВИ [35]. Как показал проведенный нами анализ иммуномодуляторы: Акридонуксусная кислота (Циклоферон), Аллоферон («Аллокин-альфа»), Дезоксирибонуклеат натрия с железом («Ферровир»), Натрия рибонуклеат (Ридостин), Глицирризиновая кислота («Эпиген Интим»), Полудан, Полиоксидоний, Ликопид Имунофан, Изопринозин, Гиаферон, Галавит,Виферон, Тилорона дихлорид («Тилорон», «Лавомакс» и «Амиксин»), Кагоцел [7, 9, 12, 16, 19, 42, 52, 57, 58, 63, 64, 164]. Зарегистрированные показания «поражения кожи и слизистых, вызванные вирусом Herpes simplex 1 и 2 типов» в РФ имеют также Стимфорте, Ингарон, Имунофан, Иммуномакс, Панавир, Неовир, Ломагерпан, Миртоплекс, Гипорамин, Виру-Мерц Серол, Арпефлю, Биопин, Анаферон, Гроприносин, Арбидол, Локферон, Офтальмоферон, Лайфферон, Кипферон, Инфагель, Миелопид [35, 45] и список постонно пополняется.

С учетом всех трудностей лечения рецидивирующей герпетической инфекции, как у нас в стране, так и за рубежом в последние годы значительно расширился интерес к применению препаратов растительного происхождения.

Фитопрепараты с наиболее выраженной противогерпетической активностью Протефлазид, Хелепинин-Д, Алпизарин [4, 67].

В иностранной литературе встречаются сообщения об успешном применении иммуномодуляторов местного действия [258]. Имиквимод (торговое название Aldara) - первый иммуномодулятор, разрешенный для лечения генитальных бородавок. Применяется местно в форме 5% крема. Это иммуномодулятор с непрямым противовирусным действием, in vivo обладает противогерпетической активностью за счет индукции цитокинов (ИФН- и ИЛи Т-клеточного ответа. Резиквимод (resiquimod) - аналог имиквимода.

Стимулирует моноциты/макрофаги, дендритные клетки и В-лимфоциты к продукции цитокинов (ИФН-, ИЛ-12, ФНО- и ИФН-), которые способствуют развитию Тh1-типа иммунного ответа.

В качестве «других препаратов и методик» [47] в последнее время успешно применяются препараты рекомбинантного ИФН- и индукторы ИФН- как с лечебной, так и с профилактической целью, однако не у всех пациентов иммуномодуляторы начали использовать в 70-80-х годах прошедшего столетия для патогенетической терапии ГВИ, тогда они и получили название индукторов интерферона [10, 11, 12, 13, 14, 51, 60, 65]. Это разнородные по составу высоко- и низкомолекулярные природные и синтетические соединения, способные стимулировать выработку эндогенного ИФН путем "включения" собственной интерфероновой системы. Препараты индуцируют образование эндогенных ИНФ (/, ) Т- и В- лимфоцитами, энтероцитами, гепатоцитами. Их действие связано со стимуляцией пролиферации и дифференцировки клеток костного мозга, активацией макрофагов, ЦТЛ, В-лимфоцитов, естественных киллеров [64]. По химической структуре индукторы интерферона подразделяют на синтетические и природные соединения. К синтетическим относят низкомолекулярные вещества (амиксин, циклоферон, неовир) и полимеры (полудан). Природные соединения включают производные госсипола (кагоцел, саврац, рогасин, гозалидон) и полимеры (ларифан, ридостин) [5, 56, 66].

Pages: |

| 2 |

Главная >> Диссертации - все темы

[ СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА .pdf ]

Похожие работы:

«vy vy из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Даровская^ Надежда Дмитриевна 1. Индивидуальные особенности психической адаптации личности в опасных профессиях 1.1. Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2003 Даровская^ Надежда Дмитриевна Индивидуальные особенности психической адаптации личности в опасных профессиях[Электронный ресурс]: На материале деятельности инкассаторов : Дис. канд. психол. наук : 19.00.03.-М.: РГБ, 2003 (Из фондов Российской Государственной библиотеки)...»

«Абызов Алексей Александрович ОБЕСПЕЧЕНИЕ БЕЗОТКАЗНОСТИ ЭЛЕМЕНТОВ ХОДОВЫХ СИСТЕМ БЫСТРОХОДНЫХ ГУСЕНИЧНЫХ МАШИН ПРИ ПРОЕКТИРОВАНИИ НА ОСНОВЕ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПРОЦЕССОВ ЭКСПЛУАТАЦИИ И ФОРМИРОВАНИЯ ОТКАЗОВ Специальности: 05.05.03 – Колесные и гусеничные машины 01.02.06 – Динамика, прочность...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Терещук, Филипп Александрович Особенности расследования насильственных преступлений с летальным исходом потерпевшего в больнице Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Терещук, Филипп Александрович Особенности расследования насильственных преступлений с летальным исходом потерпевшего в больнице : [Электронный ресурс] : Дис. . канд. юрид. наук : 12.00.09. Владивосток: РГБ, 2006 (Из фондов Российской...»

«ВЕЛЬМИСЕВА ЕКАТЕРИНА НИКОЛАЕВНА РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЕМОВ ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИКАЛЕНДУЛЫ (CALENDULAOFFICINALISL.) В УСЛОВИЯХ ЛЕСОСТЕПИ СРЕДНЕГО ПОВОЛЖЬЯ Специальность: 06.01.01 – общее земледелие, растениеводство ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный...»

«UNIVERSITE JOSEPH FOURIER UNIVERSITE D’ETAT DE ROSTOV-SUR-LE DON DOCTORAT Physique de la Matire Condense et du Rayonnement Elena Nazarenko tel-00136821, version 1 - 15 Mar 2007 Structures locales de la magntite et de zirconates de type perovskite par diffraction rsonante et absorption X Thse dirige par Yves Joly et Rostislav Vedrinskii Date de la soutenance: le 25 janvier JURY L. Bugaev V. Dmitriev Rapporteur Y. Gufan Rapporteur Y. Joly K. Protassov Prsident R. Vedrinskii МИНИСТЕРСТВО...»

«ДЫМО АЛЕКСАНДР БОРИСОВИЧ УДК 681.5:004.9:65.012 ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ УПРАВЛЕНИЯ ПРОЕКТАМИ РАЗРАБОТКИ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ С ОТКРЫТЫМ ИСХОДНЫМ КОДОМ 05.13.22 – Управление проектами и программами Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель Шевцов Анатолий Павлович, доктор технических наук, профессор Николаев – СОДЕРЖАНИЕ...»

«Арансибия Суазнабар Эдгар Роландо Эффективность селекции свиней породы ландрас по фенотипу и её влияние на показатели естественной резистентности 06.02.07 – разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный...»

«из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Эйснер, Олег Владимирович 1. КонкурентоспосоБность отрасли 1.1. Российская государственная Библиотека diss.rsl.ru 2003 Эйснер, Олег Владимирович КонкурентоспосоБность отрасли [Электронный ресурс]: Региональные условия, методы оценки, перспективы развития : Дис.. канд. экон. наук : 08.00.04.-М.: РГБ, 2003 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки) Региональная экономика Полный текст: http://diss.rsl.ru/diss/03/0279/030279033.pdf Текст...»

«Хайбрахманов Сергей Александрович Остаточное магнитное поле аккреционных дисков молодых звезд Специальность 01.04.02 — Теоретическая физика Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель : д.ф.-м.н., профессор Дудоров А.Е. Челябинск – Содержание Введение 1. Аккреционные диски молодых...»

«Джаграева Милена Левоновна Коммуникативно-прагматические особенности фразеологической деривации 10. 02. 19 – Теория языка Диссертация на соискание ученой степени кандидата филологических наук Научный руководитель доктор филологических наук, доцент С.В. Серебрякова Ставрополь 2005 2 Содержание Введение.. 4 Глава 1. Теоретические основы исследования динамических процессов в сфере...»

«Феоктистова Илсэяр Рустамовна ПРОБЛЕМА ИМИДЖА ПОСТСОВЕТСКОЙ РОССИИ: ИСТОРИКО-ПОЛИТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ Специальность 23.00.01 - Теория политики, история и методология политической науки (по историческим наукам) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата исторических наук...»

«Филиппова Мария Викторовна ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНИЛИНА И ЕГО ХЛОРПРОИЗВОДНЫХ В ВОДЕ С ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫМ БРОМИРОВАНИЕМ Специальность 02.00.02 – Аналитическая химия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель – доктор химических наук, профессор И. Г. Зенкевич Санкт-Петербург – 2014...»

«Жердев Павел Александрович ПЕРВОНАЧАЛЬНЫЙ ЭТАП РАССЛЕДОВАНИЯ ПРЕСТУПЛЕНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ПОДДЕЛКОЙ ИЛИ УНИЧТОЖЕНИЕМ ИДЕНТИФИКАЦИОННОГО НОМЕРА ТРАНСПОРТНОГО СРЕДСТВА В ЦЕЛЯХ ЭКСПЛУАТАЦИИ ИЛИ СБЫТА Специальность 12.00.12 – криминалистика; судебно-экспертная деятельность; оперативно-розыскная деятельность Диссертация на соискание...»

«САМБУУ Анна Доржуевна СУКЦЕССИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ В ТРАВЯНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ ТУВЫ 03.02.01 – Ботаника 03.02.08 – Экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант – доктор биологических наук, профессор А.А. Титлянова Кызыл – СОДЕРЖАНИЕ Введение... Глава 1....»

«Гаганов Виктор Александрович Исследование и разработка программных средств распознавания образов для решения задачи трехмерного моделирования в микроскопии Специальность 05.13.11 – математическое и программное обеспечение вычислительных машин, комплексов и компьютерных сетей ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель к. ф.-м. н. Баяковский Ю.М. Москва – 2011 2 Содержание Введение Глава 1. Задача построения трехмерной...»

«ФИРСОВ-ШИБАЕВ ДЕНИС ОЛЕГОВИЧ ДИАГРАММООБРАЗУЮЩАЯ СИСТЕМА ОПТИЧЕСКОГО ТИПА ДЛЯ МНОГОЛУЧЕВЫХ АФАР Специальность 05.12.07–Антенны, СВЧ устройства и их технологии Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель – доктор технических наук,...»

«ГУЩИНА Дарья Юрьевна МОДИФИКАЦИЯ ЭЛЬ-НИНЬО В УСЛОВИЯХ МЕНЯЮЩЕГОСЯ КЛИМАТА: МОНИТОРИНГ, ПРИЧИНЫ, УДАЛЕННЫЙ ОТКЛИК 25.00.30 – метеорология, климатология, агрометеорология диссертация на соискание ученой степени доктора географических наук Москва, 2014 2 Содержание ВВедение ГлаВа 1. Эль-ниньо – Южное колебание и Внутрисезонная тропическая изменчиВость: мониторинГ и механизмы формироВания 1.1....»

«Платонов Сергей Александрович ТВЕРДОТЕЛЬНЫЕ ИМПУЛЬСНЫЕ МОДУЛЯТОРЫ ГЕНЕРАТОРНЫХ ЭЛЕКТРОВАКУУМНЫХ ПРИБОРОВ СВЧ Специальность 05.12.04 “Радиотехника, в том числе системы и устройства телевидения ” Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель : кандидат технических наук, доцент Казанцев В. И. Москва, 2014 2 Оглавление Основные обозначения и сокращения Введение Глава 1. Состояние вопроса и постановка...»

«Ле Чунг Хьеу МАТЕМАТИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕТОДОВ РАСПОЗНАВАНИЯ ОБРАЗОВ ПРИ ОБРАБОТКЕ ТЕКСТОВ НА ВЬЕТНАМСКОМ ЯЗЫКЕ 05.13.11 Математическое и программное обеспечение вычислительных машин, комплексов и компьютерных сетей Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель д. ф.-м. н., проф. О.Н.Граничин Санкт-Петербург 2011 Оглавление Введение.........................»

«Кадырова Айгуль Октябревна ПЬЕСЫ ИСХАКИ НА ТЕМУ ИНТЕЛЛИГЕНЦИИ АСПЕКТ НОВОЙ ДРАМЫ Диссертация на соискание ученой степени кандидата филологических наук Специальность 01.01.02. - литература народов Российской Федерации (Татарская литература) НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор филологических наук профессор Миннегулов Х.Ю. КАЗАНЬ - 2007 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава I НА ПУТИ К ТЕМЕ ИНТЕЛЛИГЕНЦИИ ПЬЕСА МУГАЛЛИМ (УЧИТЕЛЬ)...»

наверх

<< ГЛАВНАЯ | КОНТАКТЫ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

«СИСТЕМА ИНТЕРФЕРОНОВ I ТИПА И NK-КЛЕТОК ПРИ ЧАСТО РЕЦИДИВИРУЮЩЕМ ПРОСТОМ ГЕРПЕСЕ ...»

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

СИСТЕМА ИНТЕРФЕРОНОВ I ТИПА И NK-КЛЕТОК ПРИ

ЧАСТО РЕЦИДИВИРУЮЩЕМ ПРОСТОМ ГЕРПЕСЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА (Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

«СИСТЕМА ИНТЕРФЕРОНОВ I ТИПА И NK-КЛЕТОК ПРИ ЧАСТО РЕЦИДИВИРУЮЩЕМ ПРОСТОМ ГЕРПЕСЕ ...»

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

СИСТЕМА ИНТЕРФЕРОНОВ I ТИПА И NK-КЛЕТОК ПРИ

ЧАСТО РЕЦИДИВИРУЮЩЕМ ПРОСТОМ ГЕРПЕСЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)