[ ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
На правах рукописи
Золотухин Петр Владимирович
Особенности окислительного статуса и регуляции транскриптома в процессе беременности 03.03.01 - физиология
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Т.П. Шкурат Ростов-на-Дону –
СОДЕРЖАНИЕ
Перечень использованных сокращений и терминов
Общая характеристика работы
1 Обзор литературы. Окислительный статус и регуляция транскриптома при беременности
1.1 Окислительный статус клетки и организма
1.2 Окислительный статус при беременности
1.3 Проблемы системной биологии беременности
2 Организация и методы исследования
2.1 Организация исследования
2.2 Методы исследования
3 Результаты исследования
3.1 Разработка интерактивной схемы интерактома окислительного статуса клеток и внеклеточной жидкости человека
3.2 Исследование показателей окислительного статуса при физиологически протекающей беременности
3.3 Изучение окислительного статуса при дисфункциональных отклонениях течения беременности
3.4 Анализ транскриптома экстраэмбриональных тканей при дисфунциональных отклонениях беременности в первом и третьем триместрах
4 Обсуждение результатов исследования
4.1 Аналитически ценные регуляторные контуры про- и антиоксидантной систем, выявленные с помощью карты интерактома окислительного статуса человека
4.2 Особенности антиоксидантной и прооксидантной систем и их взаимоотношений на разных этапах физиологически протекающей беременности
4.3 Особенности окислительного статуса при дисфунциональных отклонениях течения беременности
4.4 Особенности регуляции транскриптома экстраэмбриональных тканей при дисфункциональных отклонениях беременности в первом и третьем триместрах
Выводы
Практические рекомендации
Список использованных источников
Приложение 1 - Контроль качества транскриптомного исследования........... Приложение 2 - Карта интерактома окислительного статуса OSIM 2.7......... Приложение 3 - Результаты транскриптомного исследования хориона с оценкой методами Бэйесовского теста и SAM
Приложение 4 - Результаты транскриптомного исследования хориона по результатам совокупного Бэйесовского-SAM теста отличий в экспрессии генов
ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ТЕРМИНОВ
АФА - активные формы азота;АФК - активные формы кислорода;
ДД - диастолическое давление;
ИМТ - индекс массы тела;
ИЦН - истмико-цервикальная недостаточность;
МДА - малоновый диальдегид;
НБ - неразвивающаяся беременность;
СА - самопроизвольное прерывание беременности (самоаборт);
СД - систолическое давление;
ТГ - тяжелый гестоз;
ХЛ - хемилюминесценция;
ЭПР - эндоплазматический ретикулум;
ЭТЦ - электрон-транспортная цепь;
ACOX - оксидаза Ацил-КоА;
ADH - алкогольдегидрогеназа;
Akt - RAC-альфа серин/треонин-протеинкиназа;
AP1 - активаторный белок 1;
ARE - антиоксидант-респонсивный элемент;
CAT - каталаза;
CYB - цитохром b5;
DAO - оксидаза D-аминокислот;
ERO1L - ERO1-подобный белок;
FOS - протоонкоген Fos;
FOXO - вилочный транскрипционный фактор;
GO - база данных или категории Gene Ontology;
GPD - глицерин-3-фосфат дегидрогеназа;
GPX - глутатионпероксидаза;
GSK3B - гликогенсинтазакиназа 3-бета;
HAO - гликолатоксидаза;
HIF1A - гипоксия-индуцибельный фактор 1-альфа;
HSTF1 - транскрипционный фактор теплового шока 1;
IKkB - киназа ингибиторов ядерного фактора каппа B;
INF-kB - ингибитор ядерного фактора каппа B;
JUN - протоонкоген Jun;
KEAP1 - чашеподобный ECH-ассоциированный белок 1;
Km - константа Михаэлиса-Ментен;
KW - критерий Краскела-Уоллиса;
MAF - транскрипционный фактор MAF;
MAO - моноаминооксидаза;
MAPK - митоген-активируемая протеинкиназа;
mTOR - серин/треонин-киназа mTOR;
MYBBP1A - Myb-связывающий белок 1А;
NF-kB - ядерный фактор каппа B;
NFE2L - фактор, родственный ядерному эритроидному фактору 2;
NOS - NO-синтаза;
Nox - НАДФ•H-оксидаза;
NQO - НАД(Ф)•H-хиноноксидоредуктаза;
OGDH - -кетоглутаратдегидрогеназа;
OSIM - oxidative status interactome map - карта интерактома окислительного статуса;
P4HB - белокдисульфидизомераза;
PAOX - пероксисомальная спермин-оксидаза;
PGH - простагландин;
PI3K - фосфотидилинозитол-3-киназа;
PIPOX - саркозин-оксидаза PIPOX;
Pkc - протеинкиназа C;
PPARGC1A - лиганд-эффект-модулятор 6;
PRDX - пероксиредоксин;
RIN - индекс целостности РНК;
RT-IVT - обратная транскрипция с последующей амплификацией методом in vitro-транскрипции;
SAM - пермутационный анализ значимости отличий для микрочипов;
SHC1 - SHC-трансформирующий белок 1А;
SOD2 - супероксиддисмутаза 2;
SQSTM1 - секвестосома 1;
t-BHQ - терт-бутилгидрохинон;
TNF - фактор некроза опухолей;
TRE - TPA-респонсивный элемент;
TXN (TRX) - тиоредоксин;
TXNRD - тиоредоксинредуктаза;
UPR - ответ на неправильный фолдинг (unfolded protein response);
Wnt - белок Wnt;
XDH - ксантиноксидоредуктаза.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Изучение физиологиче ских особенностей процесса беременности является актуальной задачей, решение которой направлено на сохранение репродуктивного здоровья женского организма - важнейшего социально значимого компонента общего здоровья.
Течение беременности также в значительной степени определяет будущее здоровье ребенка и имеет значительные отдаленные социальные последствия (Погорелова Т.Н. и др., 1999; Зайцева Л.Ю., Калуцкий П.В., 2012; Шогенова Ф.М., 2012; Гинзбург Б.Г., 2013; Эверт Л.С. и др., 2013; Башмакова Н.В. и др., 2014; Колесникова С.М., 2014; Liu X. et al., 2013; Makarova E.N. et al., 2013;
Nathanielsz P.W. et al., 2013; Aris I.M. et al., 2014; Dreier J.W. et al., 2014;
Haugen M. et al., 2014).
значительным изменением физиологических показателей, в том числе, гормонального, метаболического и гомеостатического характера (Гармашева Н.Л., Константинова Н.Н., 1985). Такие изменения предполагают в первую очередь изменение окислительного статуса, интегрирующего состояние различных клеточных систем и организма в целом. В различных исследованиях в прошлые годы показаны постепенные изменения отдельных маркеров или компонент окислительного статуса при беременности (Lash G.E. et al., 2008; Vanderlelie J. et al., 2008; Al-Gubory K.H. et al., 2010; RolandZejly L. et al., 2011; Miranda Guisado M.L. et al., 2012; Das B. et al., 2012).
Однако практически отсутствуют исследования, в которых детально характеризуются тип окислительного стресса и динамика взаимоотношений между про- и антиоксидантными системами при физиологической гестации с позиций системной клеточной биологии.
Помимо фундаментальной необходимости изучения окислительного статуса физиологической беременности, в последние годы большое внимание уделяется роли окислительного статуса организма беременной женщины при различных дисфункциональных отклонениях гестации (Reyes M. et al., 2006;
Vanderlelie J. et al., 2008; Tjoa M.L. et al., 2006; Lash G.E. et al., 2008; Aris A. et al., 2009; Warren J.E., Silver R.M., 2009; Al-Gubory K.H. et al., 2010; Olsson M.G. et al., 2010; Owen J., Mancuso M., 2012). Однако для большинства из них остается открытым вопрос о причинах и закономерностях нарушений адаптивного потенциала про- и антиоксидантной систем клетки, ведущих к наблюдаемому и описываемому в литературе дисбалансу окислительного статуса. Тогда как исследования окислительного статуса при различных дисфункциональных нарушениях беременности позволяют глубже провести анализ характеристик и изучение механизмов генетических, молекулярных и биохимических процессов, определяющих течение физиологической беременности.
значительного числа редокс-чувствительных сигнальных каскадов и транскрипционных факторов, которые, в свою очередь, регулируют активность генома и определяют состояние транскриптома влияющего на окислительный статус (Levy S. et al., 2009; Persichini T. et al., 2010). Таким образом, окислительный статус замыкает один из крупнейших глобальных регуляторных клеточных контуров обратных связей. Однако исследования, учитывающие интегративные свойства окислительного статуса, не проводились. Тогда как для более полного понимания регуляции клеточных процессов, особенно при таком динамичном состоянии, как беременность, необходима интеграция омных данных, осуществляемая интерактомикой.
Существующие алгоритмы разработки интерактомных систем ограничивают возможности интерпретации получаемых данных об уровне физиологических аналитов в клетке.
В этом плане системно-биологическое изучение закономерностей регуляции клеточных систем посредством исследования окислительного статуса и контроля транскриптома открывает широкие перспективы для исследования физиологии беременности, позволяет получить широкий спектр данных, характеризующих состояние отдельных компонентов окислительного статуса и транскриптома в процессе беременности и открывает возможность сформулировать проблему оценки состояния регуляторных каскадов окислительного статуса и контроля активности генома при гестации на основе интегративного подхода.
Цель диссертационного исследования: изучить особенности окислительного статуса и регуляции транскриптома в процессе физиологической беременности.
Задачи исследования:
1. Установить наиболее значимые для физиологического течения беременности регуляторные каскады про- и антиоксидантной систем с помощью интерактомики окислительного статуса;
2. Изучить динамику интегральных показателей окислительного статуса крови и установить особенности его формирования в различные периоды протекания беременности;
3. Определить уровни циркулирующего тиоредоксина 1 в процессе беременности;
4. Оценить состояние адаптивных каскадов антиоксидантной системы и деструктивных контуров прооксидантной системы при беременности;
5. Провести сравнительный полногеномный транскриптомный анализ тканей хориона, эндометрия и плацент женщин с физиологическим течением гестационного процесса и с его дисфункциональными отклонениями.
методологической основе исследования лежат системный подход (Анохин П.К., 1970; Sanchez C. et al., 1999; Papp D. et al., 2012); интерктомное профилирование состояния клеточных каскадов (Ross J.S. et al., 2008);
принцип интеграции окислительного статуса в метаболическую и сигнальную системы клетки с использованием регуляторных клеточных контуров обратных связей (Ushio-Fukai M., 1998; Lee R. et al., 2012); принцип функциональной кластеризации компонентов транскриптома (Ausubel F.M. et al., 2003).
Теоретической основой проекта являются идеи о функциональной системе (Анохин П.К., 1970); об интегративных свойствах сигнальных каскадов (Parikh J.R. et al., 2010); функциональной классификации компонентов окислительного статуса (Cullinan S.B., Diehl J.A., 2006); о клеточных каскадах антиоксидантной защиты клетки (Kim Y.C. et al., 2003;
Jaiswal A.K., 2004; Iwasaki K. et al., 2006; Dinkova-Kostova A.T., Talalay P., 2010; Poljsak B., Milisav I., 2012); роли нарушения работы адаптивных каскадов в развитии дисфункциональных отклонений (Wruck C.J. et al., 2009;
Poljsak B., Milisav I., 2012); составе циркулирующих в крови компонентов систем окислительного статуса (Glantzounis G.K. et al., 2005; Sautin Y.Y. et al., 2007; Bao X.M. et al., 2010; Yu M. et al., 2011; Sipkens J.A. et al., 2012);
способах функциональной категоризации компонентов транскриптома (Luiking Y.C. et al., 2010; Papp D. et al., 2012).
Научная новизна работы заключается в том, что в рамках настоящего исследования впервые:
- с помощью разработанной в настоящем исследовании карты интерактома окислительного статуса человека выявлено, что в работе систем окислительного статуса у человека, в том числе в процессе беременности, большо е значение имеет функционирование положительных и отрицательных контуров обратных связей; один из наиболее деструктивных положительных контуров прооксидантной системы включает НАДФ•Hоксидазы, ксантиноксидоредуктазу, мочевую кислоту и гомоцистеин, тогда как функционирование значительной части антиоксидантной системы взаимозависимо с экспрессией редокс-регуляторного белка тиоредоксина 1;
- выявлено возрастание в процессе физиологической беременности интенсивности прооксидативных процессов в крови, сопровождающееся постепенным увеличением антиоксидантной емкости и падением роли тиоредоксин 1-зависимых контуров ее регуляции к концу беременности;
обнаружены индукторные эффекты мочевой кислоты на тиоредоксин 1 в первом триместре гестации, показано, что при физиологической гестации замыкание высоко деструктивного контура NOX/XOR не происходит;
- установлены диапазоны содержания тиоредоксина 1 в плазме крови беременных по триместрам гестации у человека и выявлены особенности его функционального вовлечения в контроль окислительного статуса в процессе беременности - положительные корреляционные связи с мочевой кислотой в первом триместре, светосуммой и стабилизированной ХЛ во втором и третьем триместрах физиологической гестации со снижением роли в контроле окислительного статуса к концу беременности;
- выявлены отклонения окислительного статуса и регуляции транскриптома при дисфункциональных нарушениях беременности:
антиоксидантных систем, а также значительное повышение экспрессии фактора 3, родственного ядерному эритроидному фактору 2 (NFE2L3), и нарушение экспрессии генов, связанных с иммунной функцией организма в хорионах при самопроизвольном прерывании беременности; показан характер мажорного эффекта контура положительных обратных связей тиоредоксина 1 в обеспечении функционирования антиоксидантной системы на клеточном уровне при неразвивающейся беременности, установлен аномальный характер нарушения окислительного статуса при истмикоцервикальной недостаточности - дисфункция прооксидантных систем;
функционирования клеточных систем, а также значительное повышение экспрессии NFE2L3 и снижение экспрессии NFE2L1 при осложнении беременности третьего триместра.
Положения, выносимые на защиту:
1.В работе систем окислительного статуса у человека, в том числе в процессе беременности, большое значение имеет функционирование положительных и отрицательных контуров обратных связей. Один из наиболее деструктивных положительных контуров прооксидантной системы включает НАДФ•H-оксидазы, ксантиноксидоредуктазу, мочевую кислоту и гомоцистеин, тогда как функционирование значительной части антиоксидантной системы взаимозависимо с экспрессией редоксрегуляторного белка тиоредоксина 1.
2. Во втором триместре, относительно первого триместра, нарастает интенсивность прооксидативных процессов, а параллельно этому, особенно к концу третьего триместра, повышается антиоксидантная емкость сыворотки крови. Замыкание высоко деструктивного контура NOX/XDH во всех трех триместрах физиологической беременности не происходит.
3. Динамика общего окислительного статуса при физиологическом течении беременности определяется изменением не только интенсивности прооксидантных проце ссов, но и функциональным со стоянием антиоксидантных систем: тиоредоксин 1 в значительной степени вовлечен в контроль окислительного статуса при беременности, на что указывают его положительные корреляционные связи с быстрой вспышкой, светосуммой, стабилизированной ХЛ; к середине беременности возрастает, затем к концу беременности снижается роль тиоредоксин-зависимых антиоксидантных контуров, тогда как содержание тиоредоксина 1 в крови беременной женщины относительно стабильно в первом и втором триместрах и снижается в конце гестации.
4. Дисфункциональные нарушения гестации характеризуются специфическими отклонениями окислительного статуса и регуляции транскриптома. При самопроизвольном прерывании беременности окислительный стресс связан с дисфункцией антиоксидантных систем. При неразвивающейся беременности контур положительных обратных связей тиоредоксина 1 имеет характер мажорного эффекта в обеспечении функционирования антиоксидантной системы на клеточном уровне, а при истмико-цервикальной недостаточности нарушена функция прооксидативных систем организма на фоне отсутствия гиперактивации антиоксидантной системы; при осложнении беременности третьего триместра отсутствуют значительные нарушения общего окислительного статуса и не происходит замыкание мощных де структивных контуров. В хорионах при самопроизвольном аборте и в плаценте при осложнении третьего триместра изменено состояние транскриптома, нарушена работа одного из центральных адаптивных контуров антиоксидантой системы человека - каскада фактора 2, родственного ядерному эритроидному фактору 2; в тканях хориона нарушена экспрессия генов, связанных с иммунной функцией организма; в эндометрии отличия от физиологической беременности отсутствуют, что указывает на первичную роль регуляции генома плода, а не матери в развитии локальных предпосылок спонтанного аборта.
Теоретическая значимость работы. В рамках исследования разработан принципиально новый аналитический подход, основанный на применении карты интерактома окислительного статуса, для планирования исследований, обработки и интерпретации данных. В общетеоретическом плане полученные результаты расширяют представления о биохимических процессах, сопровождающих физиологическое течение беременности, о динамике окислительного статуса организма женщины в процессе беременности, механизмах функционирования клеток, тканей, органов, принципов их системной организации.
Результаты исследования особенностей окислительного статуса на разных этапах гестации углубляют современные представления о закономерностях и механизмах поддержания постоянства внутренней среды организма. Данные о роли тиоредоксина 1 в формировании окислительного статуса и результаты применения системного подхода к изучению процесса гестации дополняют теорию о молекулярных и биохимических процессах, определяющих динамику, взаимодействие и интеграцию физиологических функций.
Практическая значимость. В рамках исследования создана карта интерактома окислительного статуса человека, с помощью которой выявлены регуляторные контуры про- и антиоксидантной систем, анализ которых использовался для изучения физиологии беременности. В результате проведения комплексных исследований по изучению особенностей регуляции транскриптома и контроля окислительного статуса при различных вариантах беременности получены новые данные, позволяющие планировать исследовательскую работу в области многомерных молекулярнобиологических и биомедицинских исследований от теоретического до экспериментальных молекулярно-биологических и биохимических данных, разрабатывать качественно новые подходы к дифференциальной диагностике сложных, гетерогенных групп заболеваний; находить новые пути к определению этиологии некоторых заболеваний, таких как тяжелый гестоз, инсулинрезистентные состояния и др.
Разработан и апробирован оригинальный алгоритм применения интерактомных данных для целей практической биомедицины и проведения фундаментальных исследований в области эмбриологии. Методологической особенностью использованного подхода в работе является то, что оценивались в большей степени не концентрации или активность отдельных факторов, а состояния каскадов, их регулирующих.
Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на международной научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине" (Санкт-Петербург, 2011); на IV и V международных научнопрактиче ских конференциях “Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины” (Ростов-на-Дону, 2011; 2013); на I-III международных научно-практических конференциях “Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине" (Москва, 2010;
Новосибирск, 2011; Казань, 2012); на 49-й и 51-й международных научных студенче ских конференциях «Студент и научно-техниче ский прогресс» (Новосибирск, 2011; 2013); на VI региональном и XII всероссийском научных форумах «Мать и дитя» (Москва, 2011; Ростов-наДону, 2012); на XIX международной конференции "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Украина, Гурзуф, 2011); всероссийской научно-практической конференции "Модернизация науки и образования" (Махачкала, 2011); на I международном форуме «Молекулярная медицина – технологии, экономика, образование» (Санкт-Петербург, 2013); на международном семинаре «Nanodesign: Physics, Chemistry, Computer Modelling» (Ростов-на-Дону, 2013); научных сессиях факультета биологических наук ЮФУ (2009 – 2013 гг.); на 81-й всероссийской научнопрактической конференции с международным участием “Актуальные вопросы современной медицины” (Иркутск, 2014); на 8-й Всероссийской научно-практиче ской конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (Москва, 2014); на 18-й международной школе-конференции молодых ученых “Биология - наука XXI века” (Пущино, 2014).
По теме диссертационного исследования опубликовано 39 работ, в том числе 12 из них в периодических изданиях из Перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.
Внедрение результатов исследования. Полученные в результате выполнения работы новые экспериментальные данные внедрены в лабораторную и практическую деятельность КДЛ «Наука», МЛПУЗ “Городская поликлиника № 42”, МЛПУЗ “Городская больница № 20”, ООО “Центр репродукции человека и ЭКО”, кафедры Акушерства и гинекологии № 1 РостГМУ, а также используются при чтении лекций и проведении семинаров в общих курсах “Биология развития и размножения” и “Биоинформационные базы данных” и специальных курсах “Предиктивная медицина”, “Медицинская генетика”, “Генетика человека” и “Генетика репродукции” в Южном федеральном университете и Ростовском государственном медицинском университете. Карта интерактома окислительного статуса человека используется в лабораториях генетики человека ЮФУ, эксперимент а льного мут агене за ЮФУ, группы биоинформатики кафедры алгебры и дискретной математики ЮФУ, кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Курского ГМУ, МГНЦ РАМН, ВНИИВВиМ РАСХН, в лаборатории окислительного стресса и на факультете медицины университета Любляны (Словения), в компании InterMune (США), центре водных и морских ресурсов Канады, на кафедрах генетики университетов земли Саар (Германия) и Будапештского университета (Венгрия).
Диссертационная работа соответствует паспорту специальности 03.03.01 - физиология по областям исследования: 1. Изучение закономерностей и механизмов поддержания постоянства внутренней среды организма; 2. Анализ механизмов нервной и гуморальной регуляции, генетических, молекулярных, биохимических процессов, определяющих динамику и взаимодействие физиологических функций; 5. Исследование динамики физиологических процессов на всех стадиях развития организма;
6. Изучение механизмов функционирования клеток, тканей, органов, принципов их системной организации; 11. Изучение молекулярной и интегративной организации физиологических функций.
Работа выполнена в рамках госзадания Минобрануки РФ БЧ № 213.01-11/2014-32 “Разработка фундаментальных аспектов молекулярной диагностики и митохондриальной фармакологии”, в рамках гранта ФЦП “Разработка технологии мониторинга репродуктивной функции человека и развития плода с использованием новых геномных и постгеномных маркеров” (ГК№ 02.740.11.0501), грант а “Разработка спо соба индивидуальной оценки течения беременности и развития плода” (проект № 13153 программы У.М.Н.И.К. Фонда содействия развития малых форм “Системный биоинформационный анализ интерактома окислительного статуса клеток различных тканей человека” (соглашение № 14.132.21.1315).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, организации и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы, включающего 23 отечественных и 210 зарубежных источников, четырех приложений. Работа содержит 19 таблиц, иллюстрирована рисунком.
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Окислительный статус и регуляция транскриптома при беременности 1.1 Окислительный статус клетки и организма Понятие окислительного статуса в последние годы все больше входит в категориальный аппарат биологии и медицины и определяется как качественная и количественная суперпозиция про- и антиоксидантов всех клеточных компартментов и внеклеточного пространства (Burton G.J., Jauniaux E., 2010). В связи с тем, что для многих составляющих окислительного статуса продукция или утилизация активных форм кислорода (АФК) и азота (АФА) - не первичная функция, системы окислительного статуса оказываются глубоко интегрированными в жизнедеятельность клетки в самых разных ее аспектах, как компартментых, так и функциональных (Попова Т.Н. и др., 2008; Klaassen C.D., Reisman S.A., 2010). Этот факт обуславливает чрезвычайно широкий спектр патологий, ассоциированных с нарушениями окислительного статуса разных типов, среди которых исторически наиболее интенсивно изучается окислительный стресс (Burton G.J., Jauniaux E., 2010).
Достижения молекулярно-клеточной биологии последних лет указывают на то, что окислительный стресс, которому ранее было посвящено огромное количество работ, и связанные с ним нарушения функционирования различных клеточных систем - это отдаленное последствие возмущений, возникающих как минимум в одном из регуляторных контуров окислительного статуса (Wruck C.J. et al., 2009; Poljsak B., Milisav I., 2012).
Регуляторные контуры окислительного статуса, которые должны обеспечивать взаимоадекватные продукцию и утилизацию свободных радикалов, зависимы от универсальных, общеклеточных сигнальных каскадов (Ushio-Fukai M. et al., 1998), а значит системное изучение окислительного статуса может быть ценным инструментом для исследования молекулярных основ развития патологических процессов (Lee R. et al., 2012).
Методологической особенностью такого подхода является то, что должны оцениваться не концентрации или активность отдельных факторов, а состояния каскадов, их регулирующих (Ross J.S. et al., 2008).
Окислительный статус регулируется на каждом из иерархических уровней его компонент (Cullinan S.B., Diehl J.A., 2006), представленных:
1. Внешними по отношению к клетке сигналами и соответствующими рецепторами;
2. Высшими клеточными сигнальными каскадами и их отдельными компонентами, прямо воздействующими на ниже лежащие компоненты окислительного статуса;
3. Модуляторами активности транскрипционных факторов окислительного статуса;
4. Сайтами связывания транскрипционных факторов про- и антиоксидантной систем;
5. Транскрипционными факторами;
6. Транскрипционными коактиваторами;
7. Транскрипт-вариантами генов компонент окислительного статуса;
8. Некодирующими РНК-регуляторами разных типов;
9. Пептидными и белковыми компонентами;
10. Низкомолекулярными соединениями, ионами и свободными радикалами.
Таким образом, адаптивный потенциал клетки в аспекте окислительного статуса определяется эффективностью работы клеточных регуляторных контуров, включающих компоненты различных уровней, и в том числе высшие, общеклеточные, сигнальные каскады. Так, один из высших клеточных регуляторных каскадов - система сигналов PI3K/Akt напрямую модулирует активность ядерных компонент окислительного статуса: HIF1A, HSTF1, TNF, комплексов реактивных антиоксидантных транскрипционных факторов Nfe2l(1/2)/Maf(A/B/F/G/K); блокирует ядерный экспорт NFE2L2 посредством ингибирования GSK3B; активирует диссоциацию субъединиц комплекса NF-kB от ингибиторов в цитоплазме (Papp D. et al., 2012). Эффекты сигнального каскада PI3K/Akt разнонаправленны, зависят от входящих сигналов и во многом от индивидуальных эффектов AKT1, AKT2, AKT3. Весь комплекс эффектов системы PI3K/Akt на перечисленные компоненты окислительного статуса имеет отдаленные последствия для функционирования других ключевых транскрипционных регуляторов факторов данной клеточной системы (Uniprot; Dimmeler S. et al., 1999; Zelzer E. et al., 1998; Shih S.C. et al., 2001;
Stiehl D.P. et al., 2002; Zhou J. et al., 2004; Schmidt A. et al., 2006; Sonderegger S. et al., 2010; Pendyala S. et al., 2011).
Pkc, компоненты сигнальных путей кальция и Wnt, способны инактивировать INF-kB и тем самым инициировать ядерную транслокацию NF-kB (Sugino N. et al., 2002; Niederberger E., Geisslinger G., 2010);
нижележащие сигналы или прямая активность Pkc (под контролем со стороны активного рецептора ангиотензина 2) индуцируют экспрессию мощных прооксидантных ферментов семейства Nox (Doughan A.K. et al., 2008); Pkc препятствуют полиубиквитинированию NFE2L2 в цитоплазме, чем поддерживают функционирование значительной части антиоксидантной компоненты окислительного статуса (Taguchi K. et al., 2010).
Компонент сигнального каскада MAPK, “киназа p38” (MAPK11, MAPK12, MAPK13, MAPK14), ингибирует GSK3B, ядерный регулятор MYBBP1A, активирует с борку сложного антиоксидантного транскрипционного фактора-комплекса AP1, стабилизирует антиоксидантный и энергетический транскрипционный коактиватор PPARGC1A, активирует ядерные компоненты NF-kB (кроме p65 - мощного ингибитора антиоксидантных транскрипционных факторов) (Fan M. et al., 2004; Clark J., Simon D.K., 2009; Persichini T. et al., 2010).
Как видно из приведенных данных, окислительный статус регулируется несколькими высшими клеточными сигнальными каскадами;
действие этих высших регуляторов часто неоднозначно. Такие тенденции пересекающаяся сигнализация и часто совмещенная регуляция и про-, и антиоксидантов - сохраняются и на более низких уровнях контроля окислительного статуса. Например, NFE2L2 контролирует экспрессию прооксидантного фермента NOX4, а NF-kapapB - экспрессию антиоксиданта SOD2. Низкомолекулярные компоненты клетки, непосредственно являющиеся прооксидантами и(/или) антиоксидантами, оказываются одновременно сигнальными молекулами, играющими важнейшую роль в функционировании, в том числе, других систем клетки (Freinbichler W. et al., 2011).
В свою очередь, эффекторные звенья окислительного статуса (в т.ч.
низкомолекулярные прооксиданты) влияют на высшие клеточные регуляторные каскады. Показано, что р38 MAPK может быть активирована целым рядом стресс-воздействий, и, в том числе, прооксидантным воздействием (Ushio-Fukai M. et al., 1998; UniProt). Активные формы кислорода и/или азота активируют Pkc (Jaiswal A.K., 2004), Akt (Suliman H.B.
et al., 2007; Zhang Q. et al., 2010), IKkB (Newsholme P. et al., 2007). В связи с этим такие процессы, как ангиогенез, миграции трофобласта, импорт глюкозы, глюконеогенез, острая фаза воспаления, биогенез митохондрий, апоптоз, ответ на неправильный фолдинг белков (UPR) не только смежны с окислительным статусом и имеют с ним общие регуляторы, но и в разной степени, прямо или косвенно, зависят от него (Muto A. et al., 2002; Scarpulla R.C., 2002; Kortylewski M. et al., 2003; Klinge C.M., 2008; Gao L., Mann G.E., 2009; Patel N., Kalra V.K., 2010; Pendyala S., Natarajan V., 2010; Shoag J., Arany Z., 2010; Sonderegger S. et al., 2010; Uniprot; KEGG). По разным данным, целый ряд компонентов и процессов всех трех фаз детоксификации находится под прямым контролем антиоксидантной подсистемы окислительного статуса (Kensler T.W. et al., 2007; Hayes J.D., McMahon M., 2009; Song N.Y. et al., 2009).
метаболизмом клетки и оксилительным статусом связано во многом с тем, что продукция широкого спектра прооксидантов (и, соответственно, разные механизмы ее контроля) характерна для всех компартментов клетки и внеклеточного пространства, и функциональная роль прооксидантов чрезвычайно разнообразна.
Прооксиданты клетки представлены двумя типами соединений:
низкомолекулярными веществами и белками-прооксидантами разных классов. Генерация разных классов реактивных соединений белками (как ферментами, так неферментами, содержащими металлы переменной валентности), как правило, неспецифична, и в связи с этим метаболомный и протеомный уровни прооксидантной системы обычно рассматриваются отдельно. Подавляющее большинство, как по типам, так и по количеству, реактивных метаболитов клетки и внеклеточного пространства относится к активным формам азота и активным формам кислорода (Garcia-Garcia A. et al., 2012).
К активным формам азота относятся оксид азота II (NO) и пероксинитрит. Моноксид азота – регуляторное соединение, обладающее вазодилататорным эффектом и повышенной химической активностью благодаря наличию одного неспаренного электрона на орбитали 2р атома азота. Стабильно сть уровня моноксида азота зависит от компартментализованной концентрации L-аргинина, активности Nos, активности аргиназ и уровня супероксид-аниона. Связь концентраций NO с аргиназной системой обусловлена тем, что аргиназы – ключевые ферменты в метаболизме аргинина (несмотря на значительно более низкую Km NOсинтаз - она компенсируется тысячекратно более высокой максимальной активностью аргиназ), и повышенная активность аргиназ делает аргинин локально недоступным для ферментов семейства Nos, что приводит к разобщению последних и продукции ими супероксид-аниона (Bernardi F. et al., 2008; Caldwel R.B. et al., 2010). Супероксид-анион, первичный тип активных форм кислорода, продуцируемый, в том числе, Nos, активно взаимодействует с моноксидом азота, причем скорость такого взаимодействия выше, чем скорость обезвреживания супероксида ферментами семейств Sod или Nqo (катализирующих образование из супероксид-аниона перекиси водорода) (Bernardi F. et al., 2008; Dinkova-Kostova A.T., Talalay P., 2010).
Продуктом взаимодействия супероксида и NO является пероксинитрит (ONOO•-) (Bernardi F. et al., 2008), способный взаимодействовать с двуокисью углерода с образованием карбоксильного радикала (CO3•-) (Glantzounis G.K. et al., 2005).
Гидроксил-радикал, продукт одноэлектронного восстановления перекиси или трехэлектронного восстановления молекулярного кислорода (в т.ч. в присутствии Fe2+), атакуя углеводородные цепи жирных кислот, приводит к образованию углерод-центрического (липидного) радикала (RНС•--R), электрон которого может быть перенесен на молекулярный кислород с образованием супероксид-аниона (Burton G.J., Jauniaux E., 2010).
(Гидро)пероксильный радикал - продукт окисления перекиси в присутствии ионов Fe3+, а также протонирования супероксид-аниона (Burton G.J., Jauniaux E., 2010).
В работах коллектива Wentworth P. Jr. и соавторов (2003) выдвигается идея о возможной «маскировке» радикалов озонового или триоксидводородного происхождения (гидротриоксид-радикал, HO3•-) под гидроксилрадикал (Wentworth P. Jr. et al., 2003).
Несколько в стороне от других АФК стоит синглетный кислород (молекулярный кислород в возбужденном состоянии), продуцирующийся в результате высокоэнергетических химических реакций (Lledas F., Hansberg W., 1999; Llurba E. et al., 2004; PubChem Compound). Синглетный кислород высокоэффективный ингибитор каталазы (для сравнения, каталаза не повреждается супероксид-анионом или перекисью водорода) (Lledas F., Hansberg W., 1999). Из-за высокой реакционной активности синглетного кислорода и опасности его для биосистем, P. Wentworth P. Jr. с соавт. (2001) указывают на возможную защитную антиоксидантную роль антител, проявляющуюся при продукции ими другой, менее опасной, АФК – перекиси водорода (Wentworth P. Jr. et al., 2001).
Первичные и вторичные АФК, описанные выше, являются родоначальниками процессов генерации других типов радикалов, часть из которых представлена производными низкомолекулярных антиоксидантов.
Мочевая кислота после “обезвреживания” свободных радикалов, приобретает один неспаренный электрон. Этот электрон делокализуется в пуриновом кольце, поэтому радикал мочевой кислоты не способен взаимодействовать с кислородом. При этом радикал мочевой кислоты неинертен в биосистемах: известны как минимум два фермента, инактивируемых именно урат-радикалом (Adh дрожжей и альфа-1антипротеиназа человека) (Glantzounis G.K. et al., 2005).
Эстрогеновые хиноны могут быть переведены в состояние радикалов.
При условии одноэлектронного восстановления такие хиноны могут входить в циклические реакции, сопряженные с продукцией супероксид-аниона и семихинонов (Dinkova-Kostova A.T., Talalay P., 2010). Сходные процессы могут происходить с целым рядом веществ, в том числе широко используемым антиоксидантом терт-бутил-гидрохиноном (deStafney C.M. et al., 1986). Редокс-циклы характерны и для ионов железа - с окислением от + до +3 и +4 (и, наоборот, последующим восстановлением) (Olsson M.G. et al., 2010).
Клеточные (в т.ч. сигнальные) эффекты прооксидантов находятся в зависимости от времени полужизни конкретной активной формы кислорода или азота. Так, гидроксил-радикал - самый активный из АФК и АФА, в частно сти по этому он не утилизирует ся изве стными с егодня ферментативными системами (Burton G.J., Jauniaux E., 2010) и вряд ли может играть контролируемую клеткой сигнальную роль. Супероксид-радикал способен преодолевать расстояния до 0.4 мкм, что делает его исключительно локальным, но потенциально контролируемым с точки зрения сигнализации, фактором (Myatt L., 2010). Резко отличные от гидроксил-радикала свойства имеют перекись водорода и пероксинитрит: время их полужизни относительно велико, они способен перемещаться на значительные расстояния (перекись способна преодолевать мембраны, а пероксинитрит диффундировать до 5 мкм). Особенностью пероксинитрита является его способность нитрозилировать белки, что имеет сходные эффекты с фосфорилированием. Пероксинитрит и перекись, способная мигрировать через мембраны, таким образом, являются важными участником аутокринной регуляции ферментативной активности и работы клеточных каскадов (Myatt L., 2010). Моноксид азота способен диффундировать на расстояния до мкм (Myatt L., 2010).
В связи с многогранностью эффектов АФК и АФА ни один из известных их типов не может рассматриваться только в аспекте окислительного стресса и исключительно негативных эффектов на функционирование клетки и организма. Если еще недавно активно велся поиск «центрального», «ключевого» продуктора свободных радикалов в клетке, а сама продукция активных форм кислорода и азота понималась как «необходимое зло», то ряд новейших экспериментальных данных позволяет взглянуть на функционирование окислительного статуса клетки совершенно иначе (Скулачев В.П., 2007; Bayir H., Kagan V.E., 2008; Freinbichler W. et al., 2011). Сегодня доказано, что продукторы активных формы кислорода и азота локализуются во всех компартментах клетки:
• В митохондриях АФК продуцируются в основном комплексами I и III ЭТЦ (Hung T.H., Burton G.J., 2006), а также моноаминооксидазами MAOA и MAOB (Uniprot), -кетоглутаратдегидрогеназой OGDH, глицерин-3-фосфат дегидрогеназами (GPD1, GPD2), изоформой p66 SHC1 (Starkov A.A. et al., 2008).
• В эндоплазматической сети АФК генерируются цитохромами P450, ферментами b5 (CYB5A, CYB5B) (Gross E. et al., 2006; Uniprot). Также в эндоплазматической сети локализована микросомальная монооксигеназная электрон-транспортная цепь (Lampe J. et al., 1984; Kapitulnik J., Strobel H.W., 1999), которая играет важную роль в АФК-опосредованной сигнализации и является значимым источником АФК (Bondy S.C. et al., 1994; Rashba-Step J. et al., 1994). Эндоплазматический ретикулум, играя значимую роль в фолдинге белка, непрерывно участвует в генерации АФК. Три фермента ЭР: P4HB, ERO1L и EROL1B, - являются ведущими в формировании дисульфидных связей при фолдинге белков (Tu B.P., Weissman J.S., 2004; Gross E. et al., 2006;
UniProt). Реакции, катализируемые этими ферментами, включают перенос электронов и окисление остатков цистеина; сопряженный термодинамически выгодный перенос электронов на молекулярный кислород приводит к образованию значительных количеств АФК (Tu B.P., Weissman J.S., 2004;
Gross E. et al., 2006).
• В пероксисомах содержится группа ферментов, которые генерируют супероксид-анион, перекись водорода, или монооксид азота в качестве нормальных и сопряженных продуктов метаболизма (Antonenkov V.D. et al., 2010, Van Veldhoven P.P., 2010). Пероксисомальные оксигеназы катализируют окисление различных классов жирных кислот, пуринов, D- и L-аминокислот, полиаминов, а-гидрокси-кислот, передавая водород, извлеченный из соответствующего субстрата непосредственно на кислород, с образованием перекиси водорода. К АФК-продуцирующим ферментам пероксисом относятся, например, оксидаза D-аминокислот DAO (Kawazoe T. et al., 2006), оксидазы Ацил-КоА ACOX1, ACOX2 (Oaxaca-Castillo D. et al., 2007), саркозин-оксидаза PIPOX (IJlst L. et al., 2000), пероксисомальная сперминоксидаза PAOX (Wang Y. et al., 2003), гликолатоксидазы (HAO1 и HAO2) (Jones J.M. et al., 2000; Murray M.S. et al., 2008). Активные формы азота и супероксид-анион продуцируются идуцибельной формой NO-синтазы (NOS2) (Stolz D.B. et al., 2002). Ксантиноксигеназа (XDH), участвующая в катаболизме пуринов, существует в двух функционально различных формах (дегидрогеназой и оксигеназой), при чем оксидазная форма в норме генерирует супероксид-анион и перекись водорода (Engerson T.D. et.al., 1987; Hung T.H., Burton G.J., 2006; Burton G.J., Jauniaux E., 2010). Ivashchenko O. и соавторы (2011) обнаружили, что продуцирующиеся в пероксисомах АФК нарушают окислительно-восстановительный баланс даже в митохондриях, т.е. пероксисомы могут выступать в качестве инициаторов интенсификации продукции митохондриальных АФК (Ivashchenko O. et al., 2011).
• В цитозоле и на цитоскелете также присутствует значительное количество индивидуальных ферментов-продукторов АФК и АФА, в том числе: моноаминоксидаза AOC2 (изоформа 2), NO-синтаза 3 (эндотелиальная NOS), арахидонат-липоксигеназы и PGH-синтазы (Kukreja R.C. et al., 1986;
Roy P. et al., 1994; Scott B.T. et al., 2004; Cho K.J. et al., 2011; Uniprot).
моноаминоксидазы AOC2, аминооксидазы AOC3, НАДФ•H-оксидаз (NOX1- и их активаторов и коферментов) (O’Donnell V.B., Azzi A. 1996; Nsse O., 2011); NOS1 и NOS3 (UniProt).
• В лизосомах. В последние годы было показано, что лизосомный катаболизм является мощным источником АФК, и нарушения лизосомальных сигнальных каскадов mTOR могут вести к повышенной продукции лизосомами свободных радикалов (Kubota C. et al., 2010; Hamacher-Brady A.
et al., 2011; Roczniak-Ferguson A. et al., 2012).
• В ядре локализуется достаточно широкий спектр физиологических продукторов АФК: арахидонат-5-липоксидаза ALOX5 и ее активатор ALOX5AP (Woods J.W. et al., 1993; Strid T. et al., 2009; Cho K.J. et al., 2011;
UniProt); фермент метаболизма полиаминов SMOX (Murray M.S. et al., 2008);
транскрипционный репре ссор, участник ответа на гипоксию и эпигенетический модулятор - гомолог 2 лизилоксидазы LOXL2 (Schietke R.
et al., 2010; Barker H.E. et al., 2011; Rodriguez H.M. et al., 2010; Herranz N. et al., 2012; UniProt).
• Помимо широкого спектра внутриклеточных процессов, для которых характерна сопряженная или физиологическая продукция АФК и АФА, во внеклеточном пространстве также происходит формация высокореактивных соединений с участием таких ферментов, как, например, диаминоксидаза ABP1 (Uniprot), ксантиноксидаза/дегидрогеназа XDH (McNally J.S. et al., 2003; Yamaguchi Y. et al., 2007; Burton G.J., Jauniaux E., 2010), секретированная форма LOXL2 (Schietke R. et al., 2010; Barker H.E. et al., 2011; Rodriguez H.M. et al., 2010; Herranz N. et al., 2012; UniProt); также вклад в продукцию супероксида во внеклеточном пространстве делают мембранные ферменты семейства Nox (Nsse O., 2011; Uniprot); спонтанные редокс-циклы железа гемоглобина - значимый источник супероксид-аниона в кровотоке (Olsson M.G. et al., 2010); аналогично любому внутриклеточного компартменту, вне клетки также происходит редокс-циклирование (Klaassen C.D., Reisman S.A., 2010; Dinkova-Kostova A.T., Talalay P., 2010); NO, будучи способным преодолевать значительные для активного соединения расстояния, является нормальным прооксидантным компонентов межклеточного пространства (Myatt L., 2010).
Вклад отдельных компартментов клетки в продукцию АФК и АФА может быть различным в зависимости от изучаемого типа свободных радикалов, типа клетки и микро- и макросреды.
Исходя из сказанного, выявить единственный, центральный продуктор АФК/АФА, «главного виновника», невозможно; и напротив, даже одно и то же соединение (будь то антиоксидант - тиоредоксин 1, или прооксидант перекись водорода) в разных компартментах клетки и в разных условиях может играть совершенно разные роли (Clark J., Simon D.K., 2009;
Freinbichler W. et al., 2011; Cheng Q. et al., 2012).
Анализ клеточных про- и антиоксидантов, проведенный S. Cullinan и J. Diehl (2006), позволил выдвинуть идею о том, что клеточные ферментативные и другие белковые защитные системы можно подразделить на несколько классов по их участию в адаптации клетки к продукции АФК и АФА. Большое количество данных свидетельствует о том, что перечисленные выше источники химически активных соединений “сопровождаются” соответствующими антиоксидантными факторами, составляющими первый класс антиоксидантов - нереактивные, сопровождающие защитные системы.
Пиковые, наложенные метаболические или средовые явления могут вызывать кратковременную гиперпродукцию АФК и АФА, и если она не будет быстро заблокирована, произойдет замыкание положительных контуров регуляции и цепных реакций продукции реактивных метаболитов.
Блокаторами таких событий являются ферменты, которые могут быть определены как “реактивные” антиоксиданты, т.е. индуцирующиеся именно в ответ на прооксидантные изменения окислительного статуса, а не все время сопровождающие метаболические каскады. И для сопровождающих, и для реактивных антиоксидантов справедливо, что существуют ферменты, для которых утилизация низкомолекулярных реактивных интермедиатов является не основной функцией (например, это характерно для ферментов второй фазы детоксикации), такие факторы могут быть обозначены как ко-операторы. Те же факторы, для которых утилизация АФК и АФА - первичная функция определяются как операторы. Как операторы, так и ко-операторы могут быть сопровождающими и реактивными (Cullinan S.B., Diehl J.A., 2006).
Таким образом, антиоксидантная система клетки представлена операторными и ко-операторными РНК, белками и транскрипционными факторами, а также низкомолекулярными соединениями. Основными участниками регуляции антиоксидантных операторов и ко-операторов являются NF-kB (разные варианты гетеродимеров NF-kB по-разному влияют на антиоксидантную систему), транскрипционный кофактор PPARGC1A (с участием транскрипционных факторов FOXO1 и FOXO3a), группа факторов Nfe2l (NFE2L1, NFE2L2, NFE2L3 и их изоформы и протеолитические фрагменты), факторы подсемейств Jun (JUN, JUNB, JUND) и Fos (FOS, FOSB, FOSL1, FOSL2) - компоненты транскрипционного фактора-комплекса AP1.
Антиоксидантные факторы, подчиняющиеся NF-kB и PPARGC1A, это факторы “сопровождения метаболизма”: CAT, SOD2, TXN2, TXNRD2, PRDX5, PRDX3, GPX4. По-видимому, экспрессия этих факторов должна соответствовать регуляции метаболизма пероксисом и митохондрий (где все они находятся, в разном сочетании). Доказательством этого является, например, то, что одним из ключевых факторов контроля биогенеза митохондрий является PPARGC1A. Таким образом, перечисленные операторные антиоксиданты-эффекторы не являются основным средством реагирования на проокислительные пробои в метаболизме (Cullinan S.B., Diehl J.A., 2006).
Более важный, с точки зрения адаптации к сложным и накладывающимся влияниям среды и явлениям метаболизма, клеточный защитный механизм предст авлен факторами, непо средственно реагирующими на окислительно-восстановительные условия клетки реактивными антиоксидантными РНК и белками. Уже упомянутый сопровождающий антиоксидантный фактор NF-kB является редоксчувствительным, но это связано скорее с другими его функциями (он также является прооксидантным и воспалительным ТФ и контролирует экспрессию HIF1A). Сложность его регуляции чрезвычайно высока, и отчасти потому, что его активность зависит от регуляции двух других семейств редоксрегуляторов - Nfe2l-факторов и компонент AP1, которые и являются контролерами реактивных макромолекулярных антиоксиданов, в том числе через антиоксидантно-регуляторный белок тиоредоксин 1 - TXN (Levy S. et al., 2009).
Компоненты окислительного ст атус а подс емейства Nfe2l представлены транскрипционными факторами NFE2L1, NFE2L2, NFE2L3.
Функции первых двух факторов во многом пересекаются. При этом NFE2L2 ц и т о з о л ь н ы й ф а к т о р, с в я з а н н ы й с K E A P 1, о б е с п еч и в а ю щ и м полиубиквитинирование NFE2L2 и его последующую деградацию. Несколько цистеиновых остатков KEAP1 являются критическими для удержания NFE2L2 в цитоплазме, и их окисление и восстановление обеспечивают соответственно распад и формирование комплекса NFE2L2-KEAP1. Помимо KEAP1, посттрансляционное состояние NFE2L2 контролируется каспазами семейства ICE (фрагментирующими NFE2L2, фNFE2L2 также может быть импортирован в ядро), белком SQSTM1 (конкурирует с NFE2L2 за KEAP1, чем противодействует деградации первого). Получены данные о посттранскрипционной регуляции NFE2L2 и KEAP1: NFE2L2 является мишенью MIR28 и MIR144, а KEAP1 - мишенью MIR200A. Помимо цитоплазматического уровня регуляции активности NFE2L2, существует также ядерный уровень. В ядро импортируются как полный, так и фрагментарный варианты NFE2L2, причем по следний является транскрипционным репрессором обычных мешений, активируемых NFE2L2.
KEAP1 присутствует не только в цитоплазме; ряд факторов обеспечивает его импорт в ядро, где функции его аналогичны цитоплазматическим. Помимо этого, NFE2L2 экспортируется из ядра под действием сигнальных эффектов GSK3B и, возможно (у человека), киназной активности YES1, FGR, SRC (Papp D. et al., 2012).
Регуляция NFE2L1 совершенно отлична от NFE2L2, несмотря на сходные функции. NFE2L1 - трансмембранный белок эндоплазматического ретикулума (изоформа p120). При наступлении стрессорных состояний NFE2L1 транслоцируется в ядро в двух возможных изоформах: p (репрессорная форма) и p95 (активаторная форма). Соотношение образующихся и транслоцируемых изоформ NFE2L1 зависит от клеточных условий. При гипоксии, например, NFE2L1 p120 фрагментируется преимущественно до p95, а продукция p65 блокируется (Zhao R. et al., 2011).
NFE2L3 - самый слабо изученный фактор рассматриваемого семейства. Функциональные геномные исследования не выявили какой-либо значимой роли NFE2L3 в формировании фенотипа у нокаутных организмов.
Показано, что NFE2L3 является скорее транскрипционным репрессором генов-мишеней NFE2L1 и NFE2L2. NFE2L3, возможно, участвует в формировании гладкой мускулатуры (Chevillard G., Blank V., 2011). Недавние исследования указывают на его связь с факторами AP1 (Chepelev N.L. et al., 2011).
AP1 - продукт вариативной гетеродимеризации факторов подсемейств Jun и Fos (JUN, JUNB, JUND, FOS, FOSB, FOSL1, FOSL2) или гомодимеризации Jun (гомодимеры Jun - очень слабые транскрипционные факторы). Активность большинства компонент AP1 находится в зависимости от их редокс-состояния в ядре. Окисление активирует формирование AP1, однако дальнейшая активность комплекса полностью зависит от восстановления компонент тиоредоксином 1, как и в случае с NF-kB.
Показано также, что FOSL1 и FOSL2 могут быть активированы тертбутилхиноном, но вопрос об истинном значении этого явления остается открытым (считается, что t-BHQ - эффективный фенольный антиоксидант, при этом in vivo входящий в редокс-циклирование; его эффекты на клеточную машинерию имеют прооксидантную природу) (Yoshioka K. et al., 1995; Sun Y., Oberley L.W., 1996).
С функциональной точки зрения факторы Nfe2l-факторы и AP1 в некоторой степени пересекаются. Сайт связывания NFE2L-факторов антиоксидант-респонсивным элемент (ARE). Сайт связывания AP1 - TPAреспонсивный элемент (TRE) (Hirota K. et al., 1999). Частотная диаграма последовательности ARE представлена на рисунке 1.
Рис. 1. Частотная диаграмма сайта связывания NFE2L2 (ARE) по данным Следует обратить внимание на то, что часто за ARE принимают его удвоенный (иногда с инверсией) вариант с небольшим спейсером (Jaiswal A.K., 2000). Это скорее несправедливо, так как многие гены имеют ряд особенностей по наличию ARE, и часто функциональный ARE представлен одной копией коровой последовательности. Одна из первых сложностей с интерпретацией ARE была описана еще в начале 90х годов: у гена NQO1, одной из самых популярных ARE-моделей и по сей день, был описан как раз двойной с инверсией ARE. Jaiswal A.K. с соавт. неоднократно было показано, что в регуляторной области NQO1 может работать не только NFE2L2, но и AP1, так как “двойной ARE” NQO1 представляет собой один истинный AP1элемент (TRE) и один измененный и инвертированный TRE. Пожалуй, именно момент открытия этого псевдо-ARE можно считать отправной точкой изучения проблем взаимоотношений Nfe2l-факторов и AP1 (Jaiswal A.K., 2000; Reichard J.F. et al., 2007).
Эта проблема обусловлена сходством коровых последовательностей ARE и TRE, частотная диаграмма которой представлена на рисунке 2.
Рис. 2. Частотная диаграмма сайта связывания AP1 (TRE) по данным Jaspar Помимо конкуренции за связывание, дальнейшие вопросы в функциональной детерминации контроля ARE- и TRE-зависимых генов связаны с тем, какие на этих ССТФ могут образовываться комплексы. Так, NFE2L1, NFE2L2, NFE2L3 являются строго гетеродимеризационными транскрипционными факторами. “Каноничные” Nfe2l-комплексы образуются с малыми белками семейства Maf (MAF, MAFA, MAFB, MAFF, MAFG, MAFK), способными к семейственной гомодимеризации. Maf-белки могут также гетеродимеризоваться с транскрипционными рецепторами BACH1 и BACH2, сходными по вторичной структуре с Nfe2l-факторами (ТФ типа цинковых молний). При этом пока нет достаточных данных об индивидуальных ролях факторов семейства Maf в индукции тех или иных генов, хотя частотные характеристики компексов с белками Maf вариативны (Kaspar J.W. et al., 2009).
Сложности комплексообразования, связанные с многовариантной гетеродимеризацией, внутри классов Nfe2l и AP1 - не единственная проблема в описании индивидуальных ролей данных ТФ. В последние годы появляется все больше информации о кросс-гетеродимеризации компонент семейств NFE2L, BACH и комплекса AP1. Так, NFE2L3 способен к связыванию с ARE при гетеродимеризации с различными компонентами AP1 (в т.ч.
подтвержденно - с семейством JUN, белками FOSL1, FOS) (Zhang Y. et al., 2009). NFE2L2 может гетеродимеризоваться с факторами JUN с сохранением трансактиваторной функции (существует подтверждение функционального комплекса NFE2L2-JUND) (Chepelev N.L. et al., 2011). Аналогичные NFE2L свойства характерны и для NFE2L1 (Chepelev N.L. et al., 2011). И не менее интересно то, что и комплексы с участием NFE2L-факторов (в т.ч.
“каноничные”), и комплексы AP1 (независимо от состава) собираются с участием белка APEX1, а их индивидуальная активность может подавляться BACH2 (Iwasaki K. et al., 2006). Следует отметить, что большинство этих взаимоотношений возможны или доказаны и для различных фрагментарных изоформ описываемых факторов, т.е. фNFE2L2 и NFE2L1 p65 также способны к гетеродимеризации со многими (если не всеми) из обычных для этих семейств партнерами. Общий безвероятностный паттерн связывания факторов с ARE и TRE представлен на рисунке 3.
Рис. 3. Факторы семейств Nfe2l, Fos, Jun и их партнеры, способные связываться с ARE и TRE. Обозначение фактора “Aaa” указывает на то, что Сложность взаимодействий в регуляции экспрессии РНК реактивных взаимоотношениями транскрипционных факторов. Для окислительного статуса, как было показано ранее, характерно наличие большого количества положительных и отрицательных контуров обратных связей. В этом высший регуляторный уровень реактивной антиоксидантной защиты не является исключением. К генам, транскрипционно подчиняющимся описанным взаимоотношениям, относятся KEAP1, Jun, Fos (индивидуальный контроль описан плохо, но общая тенденция известна), BACH1, TXNRD1 (ядерная и цитоплазматическая редуктаза TXN), а также тиоредоксин 1 (Sun Y., Oberley L.W., 1996; Hirota K. et al., 1999; Reichard J.F. et al., 2007).
Б ол ь ш о е кол и ч е с тво данных указывает на чре звычайно многообразные роли тиоредоксина 1 не только как эффекторного антиоксидантного белка, но и как регулятора функционирования транскрипционных факторов окислительного статуса и как подчиненного этим факторам компонента окислительного статуса (Hirota K. et al., 1999).
Суммируя разрозненные данные, тиоредоксин 1 представляет собой точку пересечения каскадов контроля окислительного статуса на разных уровнях:
как сенсор прооксидантных смещений (Hirota K. et al., 1999), как регулятор активности и связывания транскрипционных факторов с последовательностями ARE/TRE (Nordberg J., Arnr E.S., 2006; Kim Y.C. et al., 2003), как фактор, зависимый от собственной ARE-последовательности (Yu M. et al., 2011), как цитоплазматический протектор спектра перекисьутилизирующих ферментов - пероксиредоксинов (Uniprot). Таким образом, тиоредоксин 1 представляет собой потенциальный высокоинформативный маркер окислительного статуса клетки и развивающегося окислительного стресса - особенно в свете того, что он экспортируется в межклеточное пространство множественными транспортными механизмами (Rubartelli A. et al., 1992).
Окислительный стресс – это дисбаланс в системе прооксидантов и антиоксидантов с преобладанием первой группы соединений, ведущий к потенциальным повреждениям биополимеров (ДНК, белков) и липидов.
(MeSH). Проблема взаимодействия свободных радикалов и клетки связана с тем, что контроль антиоксидантов над прооксидантами и свободными радикалами весьма условен, и полное исключение прооксидантов (оксидантов) из жизни клетки невозможно (в т.ч. из-за их важнейшей роли в контролируемая сопровождающими и реактивными антиоксидантными системами продукция свободных радикалов. Окислительный стресс, начинаясь с дисбаланса соотношения отдельных молекул в ограниченном объеме клетки, развивается с повреждением отдельных компартментов клетки, распространяется в пространстве (к другим клеткам) и времени (клональные нарушения метаболизма в результате мутаций), и, в конце концов, приводит к дестабилизации функционирования организма (Bayir H., Kagan V.E., 2008; Murphy M.P., 2009; MeSH). Одной из характеристик происходящих при этом процессов является замыкание одного или нескольких разобщенных в норме (и при достаточной адаптивной емкости клетки) контуров регуляции: аргиназно-NO-синтазного, стресса ЭПР, и множественно замыкаемого мощного прооксидантного контура НАДФ•Hоксидазы/ксантиндегидрогеназы/мочевой кислоты.
Если клетка обладает достаточной антиоксидантной емкостью или адаптивным потенциалом, возможна локализация и блокировка жизнеспособность, но несет повреждения компонент, в том числе ДНК, а это функционирования ее потомков (Fernandez-Gomez F.J. et al., 2005; Chen J.H. et al., 2007). Вследствие высокой опасности для окружающих клеток окислительного стресса, в эволюции сформировались зависимые от окислительного статуса механизмы индукции запрограммированной клеточной гибели. Впрочем, апоптоз является энергозатратным процессом, а клетки, находящиеся в состоянии окислительного стресса могут не иметь возможности выработать достаточно энергии. В таком случае развиваются запрограммированной гибели не срабатывает (Антоненко Ю.Н. и др., 2008;
Uetrecht J., 2010).
Результатом развития окислительного стресса является потеря клеточности (в лучшем случае - путем апоптоза) и/или появление клеток с множеством повреждений и компрометированной функцией, либо иммортализация клеток (Salmon T. et al., 2004; Dimri G.P., 2005; FernandezGomez F.J. et al., 2005; Chen J.H. et al., 2007).
Резюмируя сказанное выше, в последние годы окислительный статус стал пониматься как сложная многоуровневая клеточная система, управляемая значительным числом клеточных каскадов, часть из которых служит только для поддержания адекватного окислительного статуса клетки и организма. В то же время на с егодняшний день изучение функционирования каскадов про- и антиоксидантной систем окислительного статуса только начинается, и лишь малое количество исследований взаимоотношений, механизмов поддержания окислительного гомеостаза и роли смещений окислительного статуса в работе клеточных систем и всего организма. В связи с этим тормозится и практическое применение фундаментальных знаний такого рода в области патофизиологии и изучения этиологии различных заболеваний. Следует о собенно отметить необходимость изучения окислительного статуса при беременности, так как такие исследования помогут расширить понимание происходящих при гестации изменений метаболизма и сигнализации, а также адаптивного потенциала организма.
1.2 Окислительный статус при беременности При беременности практически во всех системах организма матери наблюдаются серьезные физиологиче ские преобразования. Это сопровождается изменением энергетических запросов организма, удовлетворение которых критично для течения и исхода гестации.
Увеличение потребления кислорода, призванное установить соответствие метаболизма энергетическим потребностям организма матери и плода, приводит к высокоинтенсивной продукции активных форм кислорода. При беременности плацента – главный источник АФК (в первую очередь супероксид-аниона), и функционирование прооксидантной системы оказывается чрезвычайно важным для прогресса гестации (Reyes M. et al., 2006).
Продукция АФК с течением физиологической беременности нелинейна и имеет тенденцию к росту и пику в конце первого триместра.
После происходящего в конце первого триместра окислительного взрыва антиоксидантная емкость тканей возрастает и в дальнейшем, несмотря на продолжающийся рост продукции реактивных метаболитов, в норме поддерживает адекватный окислительно-восстановительный баланс на протяжении оставшегося периода беременности (Chamy V.M. et al., 2006;
Vanderlelie J. et al., 2008). Окислительный взрыв в конце первого триместра беременности при физиологическом ее течении связан со снятием блокады спиральных артерий. При этом в плаценте постепенно от периферии к центру устанавливается кровоток, следствием чего являются высокий уровень реоксигенационного окислительного стресса. С развивающимся локальным окислительным стрессом плаценты ассоциирован апоптоз клеток периферической части плаценты. Считается, что таким образом окислительный стресс через индуцированный им апоптоз делает вклад в регрессию ворсин и формирование гладкого хориона (Jauniaux E. et al., 2003;
Tjoa M.L. et al., 2006). В исследовании Tjoa M.L. и соавторов (2006) было показано, что пик уровня внеклеточной плодовой ДНК - маркера массированнной гибели клеток - приходится на 10-12 недели, когда регрессия ворсин максимальна, что как раз соответствует сроку начала мощного снабжения кислородом ткани плаценты (Tjoa M.L. et al., 2006). Среди тканей синцитиотрофобласт - благодаря наружному расположению в ворсине и пониженному содержанию основных антиоксидантных ферментов. Прямым следствием этого при некоторых осложненных вариантах течения беременности является образование дебриса синцитиотрофобласта синцитиальных узелков (Jauniaux E. et al., 2003; Wruck, 2009).
Происходящие в плаценте изменения окислительного статуса, отражающиеся в материнском кровотоке увеличением ко второму триместру беременности интенсивности прооксидантных процессов, характерны для большинства вариантов течения беременности (рисунок 4) (Jauniaux E. et al., 2000; Lash G.E. et al., 2008).
Рис. 4. Схема, отражающая происхождение и возможные эффекты окислительного стресса симпластотрофобласта. Действие модулирующих степень окислительного стресса факторов показано пунктирными стрелками Не смотря на общие механизмы происходящих смещений окислительного статуса, дальнейшее развитие и последствия этих процессов при различных вариантах течения беременности отличаются (Jauniaux E. et al., 2000).
В современной Ро ссии значительная доля беременно стей сопровождается осложнениями, угрожающими здоровью и жизни матери и ребенка (Росстат). Разработка методов диагностики, профилактики и терапии нарушений эмбриогенеза человека осложнена недостаточно изученными этиологией и патофизиологией эмбриональных нарушений. Помочь решить эту проблему может изучение окислительного статуса не только физиологически протекающей беременности, но и ее осложненных вариантов.
Как следствие различных нарушений эмбриональных процессов 30-50% наступивших беременностей заканчиваются спонтанным абортом или неразвивающейся беременностью уже в первом триместре (Абрамченко В.В., Шабалов Н.П., 2004; Сидельникова В.М., Сухих Г.Т., 2010; Милованов А.П., Серова О.Ф., 2011). Чаще всего спонтанные аборты происходят при имплантации и оказываются ассоциироваными с дисфункциями компонент окислительного статуса. При неразвивающейся беременности, связанной с нарушениями имплантации, ряд авторов отмечают аномальный паттерн окислительного статуса в плаценте (Jauniaux E. et al., 2000; Al-Gubory K.H. et al., 2010).
Имплантация - очень тонко регулируемый процесс, развитие которого зависит от сложного взаимодействия между эмбрионом и окружением его в матке (Шабалов Н.П., Цвелев Ю.В., 2004; Баранов В.С., Кузнецова Т.В., 2007). Ряд авторов указывают на то, что маточно-эмбриональные взаимодействия могут быть нарушены окислительным стрессом конца первого триместра беременности, а значит аномалии окислительного статуса могут лежать в этиологии данного состояния. В поддержку этой идеи свидетельствует то, что спонтанные аборты ассоциированы с повышенным количеством полиморфноядерных лейкоцитов в плаценте, и в аспекте окислительного статуса такие изменения иммунной системы связаны с сигнальными эффектами прооксидантной компоненты окислительного статуса, способной напрямую модулировать активность и экспрессию рецепторов цитокинов, цитокинов и адгезинов (Agarwal A. et al., 2006).
Неразвивающаяся (замершая) беременность - феномен неотторжения погибшего плода в течение продолжительного времени. Группа E. Jauniaux E.
и G. Burton (2003) показала, что при неразвивающейся беременности плацентарный кровоток устанавливается преждевременно и в центральной, а не периферической, части, как это происходит при физиологической гестации. В результате наблюдаются обширные повреждения трофобласта, вызванные окислительным стрессом. В этом же исследовании показано, что первичной причиной указанных нарушений является неправильная плацентация и, как следствие, недостаточная закупорка спиральных артерий (Jauniaux E. et al., 2003).
Одно из наиболее опасных осложнений беременности второго триместра - истинная угроза прерывания, или истмико-цервикальная характеризующееся пассивным безболезненным расслаблением шейки матки без сокращения матки, кровотечением и выходом амниотической оболочки через расслабленную шейку (MeSH). Частота истинной угрозы прерывания беременности составляет порядка 10% от всех беременностей (Owen J., Mancuso M., 2012).
Истинная угроза прерывания беременности охарактеризована как исключительно гетерогенное состояние (Warren J.E., Silver R.M., 2009; Owen J., Mancuso M., 2012). Анатомические характеристики шейки матки коррелируют с риском преждевременных родов, но эта корреляция не абсолютна. Если в случае спонтанных абортов этиология, хоть и разная, но в принципе описана, то для истинной угрозы она неизвестна. Связано это с плохо изученной патофизиологией данного состояния, с тем, что оно далеко не всегда повторяется, если уже было в анамнезе, и с тем, что короткая шейка матки, будучи рисковым фактором, часто функционально состоятельна (Warren J.E., Silver R.M., 2009; Owen J., Mancuso M., 2012). Факторы, которые, как считается, делают вклад в развитие состояния истинной угрозы прерывания беременности, включают и генетические, и средовые: инфекции, воспаление, активность матки, аномальная имплантация, адаптация к средовым воздействиям на уровне клетки. Существуют убедительные данные о роли цитокиновой системы в наступлении преждевременных родов, что в целом указывает на роль иммунной системы и воспаления в развитии истинной угрозы прерывания беременности. (Warren J.E., Silver R.M., 2009;
Owen J., Mancuso M., 2012).
Тяжелый гестоз (преэклампсия) – это осложнение беременности, характеризующееся комплексом симптомов, таких как гипертензия, протеинурия, и, в ряде случаев, отеки (MeSH). Обычно тяжелый гестоз диагностируется после 20-й недели беременности, а при нарушениях морфогенеза трофобласта симптомы проявляются даже раньше (MeSH;
Walker J.J., 2000). Тяжелый гестоз развивается при беременности с частотой от 0.4 до 2.8 % в развитых странах и до 10 % в развивающихся (Borekc B. et al., 2006). В РФ этот показатель имел пиковые значения более 20 % в году, постепенно снижается, и в 2011 году составил 17,4 %. Хотя в индустриально развитых странах мира за последние десятилетия заметно упала частота материнской и детской заболеваемости и смертности как результат преэклампсии, она по-прежнему является основной причиной материнской и детской смертности (Авруцкая В.В. и др., 2007; Walker J.J., 2000; Tranquilli A.L., Landi B., 2010).
Более полувека назад было показано, что тяжелый гестоз сопровождается окислительным стрессом, хотя практически все это время появляются данные о том, что это мнение, возможно, не соответствует истине (Roberts J.M., Cooper D.W., 2001; Llurba E. et al., 2004). В большинстве работ описывается более интенсивная продукция метаболитов, являющихся продуктами взаимодействия биомолекул со свободными радикалами или активными формами кислорода или азота (Aris A. et al., 2009). При этом в отдельных работах часто изучается очень ограниченный круг соединений, и в результате в одних исследованиях в плаценте описывается повышенный уровень МДА (Aikgoz S. et al., 2006; Breki B. et al., 2006), а в других - не отличающиеся количества аддуктов МДА (Wiktor H., 2001; Hnat M.D. et al., 2005). В ряде исследований продемонстрировано, что в плацентах и (или) в крови при тяжелом гестозе понижена активность Sod, Gpx, тиоредоксина, тиоредоксинредуктаз (Llurba E. et al., 2004; Vanderlelie J. et al., 2008).
Аналогично вопросу о принципиальном наличии окислительного стресса при тяжелом гестозе, некоторые авторы обнаруживают повышенные активности некоторых из перечисленных антиоксидантных факторов (Roland-Zejly L. et al., 2011; Miranda Guisado M.L. et al., 2012; Das B. et al., 2012). Изучение тяжелого гестоза осложняется не только его гетерогенностью, но и большим количеством противоречивых данных.
Таким образом, лишь для некоторых из наиболее социально значимых осложнений беременности установлены нарушения окислительного статуса.
Как правило, в таких случаях данные фрагментарны и характеризуют изменения уровня отдельных показателей окислительного стресса или компонентов про- и антиоксидантной систем. В случае истмикоцервикальной недостаточности, впрочем, даже такие данные нами в литературе обнаружены не были. Тяжелый гестоз, в свою очередь, характеризуется значительным количеством противоречивых данных. Еще более важно то, что системное изучение окислительного статуса включающее оценку со стояния регуляторных контуров про- и антиоксидантной систем - ранее не проводилось, что объясняется только начавшимся изменением парадигмы окислительного статуса.
1.3 Проблемы системной биологии беременности Многие, в том числе охарактеризованные, осложненные варианты течения беременности - спонтанные аборты, угроза прерывания, тяжелый гестоз - ассоциированы с дисфункциями тех или иных систем окислительного статуса (Cullinan S.B., Diehl J.A., 2006; Chose O. et al., 2008;
Burton G.J., Jauniaux E., 2010; Chandel N.S., 2010; McCance D.R. et al., 2010;
Hahn S. et al., 2011). Большинство из перечисленных патологических состояний имеют общую черту – по-видимому, все они являются генетически гетерогенными (Roberts J.M., Cooper D.W., 2001; Chose O. et al., 2008;
Williams P.J., Pipkin F.B., 2011). Эта сложность обуславливает отсутствие данных о причинах развития данных патологий (Chose O. et al., 2008) или вообще об их этиологии, а также о характерных типах нарушений окислительного статуса при данных состояниях (Williams P.J., Pipkin F.B., 2011). В связи с этим большие усилия прилагаются исследователями по всему миру в области изучения рассматриваемых осложненных вариантов течения гестации с помощью новых молекулярных методов “широкого спектра действия”.
Сегодня наиболее распространены два типа исследований, направленных на изучение молекулярно-биологических основ клеточных процессов, – функционально-геномные (основанные на генном нокауте, нокдауне или введении дополнительных копий генов или функциональных РНК) (Hayes J.D., McMahon M., 2009; Marcu K.B. et al., 2010; Miyamoto N. et al., 2011; Zhang L. et al., 2012) и исследования по крупномасштабному профилированию (транскриптома, экзома, генома) (Hoegh A.M. et al., 2010;
Loset M. et al., 2011; Williams P.J., Pipkin F.B., 2011). Исследования первого типа нацелены на детальное описание роли отдельных, конкретных факторов в биологии клетки; вторые стремятся выявить общие закономерности формирования фенотипа как функции межфакторного взаимодействия, при этом основываясь на массивном математическом аппарате (Ausubel F.M. et al.
(eds.), 2003; Cullinan S.B., Diehl J.A., 2006; Dinkova-Kostova A.T., Talalay P., 2010; Loset M. et al., 2011).
И тот, и другой метод были многократно использованы при попытках определения отправных точек в изучении патофизиологии и этиологии осложненных вариантов течения беременности.
Помимо того, что масс-скрининговые методы чипирования и секвенирования сталкиваются с проблемой гетерогенности образцов, оба типа исследований имеют ограничения: функциональные исследования дают разрозненные данные об отдельных факторах и только о их глобальной роли в формировании фенотипа, и в случае применения техники нокаута результаты таких исследований очень сложно экстраполировать на человека (Kensler T.W. et al., 2007; Fowden A.L. et al., 2011); результаты крупномасштабных исследований очень часто противоречивы и дают недостаточный выход данных, что во многом связано с используемым математическим подходом (Ausubel F.M. et al. (eds.), 2003; Centlow M. et al., 2008; Hoegh A.M. et al., 2010; Loset M. et al., 2011; Williams P.J., Pipkin F.B., 2011).
Однако благодаря этим двум методам сегодня накоплен огромный массив информации, который позволяет разработать аналитические системы Транскриптомно-интерактомные подходы, основанные на применении системной биологической информации, высоко информативны и уже входят в медицинскую практику, несмотря на технические сложности работы с РНК и только начавшееся развитие интерактомики (Sanchez C. et al., 1999). Однако существующие принципы построения схем интерактома, генных сетей сохраняют некоторые ограничения, налагаемые принципами основных подходов к исследованию молекулярной биологии клетки: результирующие системы ограничены одним или несколькими уровнями факторов-эффекторов (протеомным, геномным, транскриптомным или эпигеномным), как результат, приложение таких схем к анализу экспериментальных данных или для планирования экспериментов имеет пониженную эффективность, а интегративная мощность их низка (Luiking Y.C. et al., 2010; Papp D. et al., 2012; KEGG).
В 2012 году в KEGG были добавлены интерактомные взаимодействия в каскадах NF-kB (рисунок 5) и HIF1A (рисунок 6). Важная практическая значимость этих сигнальных каскадов требует более детального отображения информации, в том числе ссылок на источники экспериментальных данных, однако пока KEGG сохраняет ограничения, связанные с изначальной логикой разработки данной базы.
Рис. 5. Сигнальный каскад NF-kB (KEGG) Рис. 6. Сигнальный каскад HIF-1 (KEGG) Широкомасштабные методы молекулярного профилирования сегодня полностью зависят от использования категориального аппарата Gene Ontology и KEGG, так как без функционального анализа даже статистически обработанные результаты не могут быть достоверными (Illumina technical notes). Дальнейшее развитие аналитической интерактомики связано сегодня с интеграцией одноуровневых омик и функционально-геномных данных (Parikh J.R. et al., 2010).
Итак, практически ни одно из наиболее распространенных и одновременно наиболее опасных о сложнений беременно сти не охарактеризовано с точки зрения молекулярной патофизиологии и этиологии, а главное, системное изучение нормальной клеточной и организменной физиологии беременности становится возможным только сейчас. Сегодня появились высокоэффективные методы для масштабного анализа клеточных систем, наибольшее развитие среди которых получили техники анализа транскриптома; разработаны подходы к созданию аналитических систем, позволяющих систематизировать уже полученные экспериментальные данные и на их о снове разрабатывать высоко информативные экспериментальные схемы; получены данные об окислительном статусе, как системе, сопровождающей другие метаболические системы клетки и дифференциальным показателем функционирования клетки и организма в целом.
В связи с вышеизложенным, целью данной работы было изучение особенностей окислительного статуса и регуляции транскриптома в процессе физиологической беременности.
2 ОРГАНИЗАЦИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Организация исследования Исследование выполнено на базе Академии биологии и биотехнологии ЮФУ. Все исследования проводились с соблюдением биоэтических норм и требований.В исследовании приняли участие беременные женщины на разных сроках физиологически протекающей гестации (всего 131 участница): в первом (5-8 недель; N=18; группа К1), втором (14-25 недель; N=42; группа К2) и третьем (37-41 недель; N=71; группа К3) триместрах.
Обследованные на момент исследования находились на учете в родовспомогательных учреждениях г. Ростова-на-Дону (роддоме № 5;
городcкой больнице № 8; кафедре акушерства и гинекологии Ростовского государственного медицинского университета). Все женщины, принявшие участие в исследовании были анкетированы, ими было подписано информированное согласие на участие в исследованиях. Анкеты содержали общую информацию и анамнез участника исследования, анамнез течения беременности и графы для клинико-генеалогического анализа.
В исследовании приняли участие условно здоровые женщины, которые до настоящей беременности и в течение ее не имели в анамнезе выраженной соматической патологии: витаминодефицитных состояний (витамины В6, В12), сахарного диабета, гипотиреоза, а также инфекционных патологий. У всех обследованных фиксировались показатели роста, массы, систолического и диастолического давления, рассчитывался индекс массы тела.
Отдельная серия экспериментов была проведена с участием женщин с дисфункциональными нарушениями беременности (всего 68 участниц):
спонтанным абортом (5-8 недель; N=18; группа сравнения 1 - СА) и неразвивающейся беременностью (5-8 недель; N=19; группа сравнения 2 НБ) в первом триместре, истмико-цервикальной недостаточностью во втором триместре (14-25 недель; N=17; группа сравнения 3 - ИЦН) и тяжелым гестозом в третьем триместре (37-41 недель; N=14; группа сравнения 4 - ТГ).
Все участницы исследования родились и проживали в Ростовской области и г.
Ростове-на-Дону.
Возрастные характеристики и сроки гестации исследуемых групп представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Характеристики исследуемых групп - указаны 5..95 процентили срока гестации; данный показатель не обрабатывается статистически в связи со строгим целевым отбором участников групп по данному показателю;
- показатель, анализируемый без предположения о распределении, приведены медиана, 25-й и 75-й процентили;
* - уровень значимости наличия отличий по всем группам по результатам применения критерия Краскала-Уоллиса;
«