WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:     || 2 |

«ЗНАЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО – ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ РАКА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ...»

-- [ Страница 1 ] --

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Санкт – Петербургский государственный

педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения

Российской Федерации

На правах рукописи

Кашинцев Алексей Ариевич

ЗНАЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО – ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В

ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ РАКА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Специальность:

14.01.12 – Онкология 14.01.17 – Хирургия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Имянитов Евгений Наумович, доктор медицинских наук профессор Коханенко Николай Юрьевич Санкт – Петербург -

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И

ТЕРМИНОВ…………………………………………………………………………… Введение………………………………………………………………………… Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………… 1.1 Актуальность проблемы диагностики и лечения рака поджелудочной железы………………………………………………………………………..………... 1.2 Молекулярно-биологические особенности рака поджелудочной железы……………………………………………………………………………….… 1.2.1 Роль повреждения генетического аппарата в развитии рака поджелудочной железы………………………………………………………………. 1.3 Современные методы диагностики рака поджелудочной железы…... 1.4 Хирургическое лечение рака поджелудочной железы……….………. 1.5 Химиотерапия в лечении рака поджелудочной железы…………...…. 1.6 Значение молекулярно - генетических методов в диагностике и лечении рака поджелудочной железы……………………………………...………. 1.7 Роль супрессорных генов BRCA1, BRCA2 и PALB2 при раке поджелудочной железы………………………………………………………………. Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……....……… 2.1 Характеристика исследованных больных……………………………… 2.2 Оценка чувствительности различных инструментальных методов……. 2.3 Оценка результатов лечения больных раком поджелудочной железы... 2.4 Молекулярно – генетические методы………………………...…….…... 2.4.1 Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови……………... 2.4.2 Метод выделения РНК из парафиновых блоков…………...…………. 2.4.3 Реакция обратной транскрипции………………………………………. 2.4.4 Выделение ДНК из парафиновых блоков…………………………...… 2.4.5 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени………... 2.5 Статистическая обработка полученных данных………………………. Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛИНИКИ,

ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ РАКА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ

ЖЕЛЕЗЫ……………………………………………………………………………... 3.1 Анализ общей группы больных…………………………………….…… 3.2 Особенности клинического течения рака поджелудочной железы…….. 3.3 Диагностика заболевания………………………………………………... 3.4 Результаты хирургического лечения……………………………………. 3.5 Результаты химиотерапевтического лечения…………………………... 3.6 Значение карбогидратного антигена СА 19-9 в диагностике и прогнозе заболевания при лечении рака поджелудочной железы………………………...…. Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОВЕДЕННЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ…………………………………………………..……………… 4.1 Анализ частоты мутации генов BRCA1, BRCA2 у больных раком поджелудочной железы…………………………………………………………….… 4.2 Клиническая характеристика носителей мутации генов BRCA. Опыт применения специфической химиотерапии ……………………………………...… 4.3 Анализ частоты мутации гена PALB2…………………………………... 4.4 Анализ экспрессии генов KRAS, PSCA, CDX2, CDH17, F5, LIPF, UGRP, UPK2, TG2……………………………………………………………….…… Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ………...… ВЫВОДЫ……………………………………………………………………… ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ…………………………………… ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ……………. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ…………………….…

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ТЕРМИНОВ

BRCA1 – ген рака молочной железы 1 (breast cancer 1) BRCA2 - ген рака молочной железы 2 (breast cancer 2) PALB2 – партнер и локализатор гена BRCA2 (partner and localizer of BRCA2) KRAS – онкоген саркомы мышей, вызванный вирусом Kirsten (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) CA 19-9 – карбогидратный антиген 19-9 (carbohydrate antigen 19-9) SPB – белок сурфактанта B (surfactant protein B) PSCA – антиген стволовых клеток простаты (prostate stem cell antigen) CDX2 – ген краниокаудальной дивергенции 2 (caudal related homebox gene2) CDH17 – кадерин 17 (cadherin – 17) F5 – ген кодирующий простациклин (coagulation factor 5) LIPF – ген кодирующий желудочную липазы (lipase gene) UGRP – утероглобин- связывающий протеин (uteroglobin – related protein) UPK2 – уроплакин 2(uroplakin 2) TG2 – тиреоглобулин LPB – липофилин Б FOLFIRINOX – 5 – фторурацил, иринотекан, лейковорин, оксалиплатина ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ – дезоксинуклеотидтрифосфат кДНК – комплементарная ДНК мРНК – матричная ДНК п.о. – пара оснований ПЦР – полимеразная цепная реакция РНК – рибонуклеиновая кислота РПЖ – рак поджелудочной железы mut – мутантный аллель wt – аллель дикого типа (не мутантный) УЗИ – ультразвуковое исследование ЭндоУЗИ – эндоскопическое УЗИ МСКТ – мультиспиральная компьютерная томография МРХПГ – магнитно – резонансная томография с холангиопанкреатографией ХТ - химиотерапия

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы Лечение рака поджелудочной железы представляет собой один из трудных и актуальных вопросов современной хирургии и онкологии. Причина плохих эффективности современных лечебных тактик (Чиссов В.И., 2013; Siegel M., 2013).

';

Для улучшения результатов авторы предлагают формировать группы риска среди пациентов с экзогенными факторами, в частности сахарным диабетом, и эндогенной (наследственной) или генетической предрасположенностью, например среди лиц с семейной формой рака молочной железы, яичников, ассоциированной с мутацией генов BRCA1, BRCA2, PALB2. Среди больных раком поджелудочной железы на момент установления диагноза, частота нарушения углеводного обмена достигает 80% и поэтому диабет может рассматриваться как первый ранний симптом заболевания (Wang F., et al., 2003;

Chari S., et al., 2009).

Степень разработанности темы исследования По данным литературы среди больных раком поджелудочной железы, частота носительства аллеля генов BRCA1 составляет от 0 до 4.7%, BRCA2 – 4,1 – 17,2%, а PALB2 – 2,1 – 4,3% (Lal G.I., et al., 2000; Hahn S.A., et al., 2003; Couch F.J., et al., 2007; Axilbund J.E., et al., 2009; Ferrone C.R., et al., 2009; Jones S., et al., 2009; Ghiorzo P., et al., 2012). Данные гены используются в качестве предикторов для химиотерапии при раках других локализаций, относительно опыта применения их при раке поджелудочной железы в мировой литературе сообщения основываются на маленьких выборках (Birsky T., et al., 2009; Moiseyenko V.M., et al., 2010; Lowery M.A., et al., 2011; Tran B., et al., 2012).

При наличии вышеперечисленных факторов риска у пациента, актуальной остается проблема инструментального обследования с целью ранней диагностики рака, так как авторы предлагают комбинирование различных методов. При этом только эндоскопическое ультразвуковое исследование с тонкоигольной аспирацией рекомендовано всеми (Ludwig E., et al., 2011; Schneider R., et al., 2011;

Vasen H.F., et al., 2011; Canto M.I., et al., 2012). При применении последнего метода возникает проблема с цитологическим исследованием, так частота ложноотрицательных заключений достигает 60% (Correa-Gallego C., et al., 2010).

Поэтому применение молекулярно – генетических маркеров может с одной стороны помочь при раннем выявлении заболевания, а с другой необходимо для подтверждения диагноза в случае карцином с неизвестной первичной локализацией, когда инструментальные методы не эффективны. В качестве таковых рассматриваются СА 19-9, чувствительность которого оценивают в 79 – 81%, однако колебания его значений при прогнозе результатов лечения широко варьируют (Safi F., et al., 1987; Katz M.H.G., et al., 2010; Ballehanina U.K., 2012). В качестве генетического маркера наиболее часто применяется KRAS, частота мутации которого колеблется от 80 до 95% (Hruban R.H., et al., 2000; Aguire A.J et al., 2003). Рядом авторов для диагностики предлагаются PSCA, F5, при этом чувствительность при аденокарциноме поджелудочной железы может достигать 79,5% и 83% соответственно (Talantov D., et al., 2006; Yang W.B., et al., 2009; Saeki N., et al., 2011; Baine M.J., et al., 2012).

Таким образом, необходимо изучение значения молекулярно – генетических методов в диагностике и лечении рака поджелудочной железы.

Цель исследования Улучшить диагностику и результаты лечения рака поджелудочной железы путем применения молекулярно-генетических методов и соответствующих схем химиотерапии.

Задачи исследования 1. Оценить клиническую картину, частоту нарушения углеводного обмена и чувствительность инструментальных методов в диагностике раннего рака поджелудочной железы.

2. Определить чувствительность молекулярно- генетических методов при раке поджелудочной железы, уточнить их роль в установлении первичной локализации опухоли и стадии заболевания, доказать генетическую неоднородность опухолей поджелудочной железы.

3. Оценить влияние уровня онкомаркера СА 19-9 на возможность выполнения радикальной операции и на прогноз заболевания.

4. Выявить частоту мутаций генов BRCA1, BRCA2, PALB2 у больных РПЖ и оценить влияние семейного анамнеза на встречаемость мутантных аллелей этих генов.

5. Показать необходимость специфической химиотерапии у носителей мутации в BRCA генах.

Научная новизна исследования.

Впервые установлена частота носительства мутации BRCA1 5382insC в группе больных раком поджелудочной железы. Разработан алгоритм отбора пациентов с данным заболеванием для генетического тестирования.

Определена распространенность семейной формы рака поджелудочной железы.

Оценена частота мутации KRAS, экспрессия РНК генов в метастазах рака поджелудочной железы и сформирована диагностическая панель, состоящая из KRAS, PSCA, CDX2, CDH17, позволяющая с чувствительностью 61,3% подтвердить наличие рака поджелудочной железы среди карцином с неизвестной первичной локализацией.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Выполненные генетические исследования позволили оценить частоту встречаемости мутаций генов BRCA1, BRCA2, PALB2 среди больных раком поджелудочной железы. Разработан принцип выбора первой линии химиотерапии для носителей аллелей генов BRCA.

Предложен алгоритм для формирования группы риска развития рака поджелудочной среди больных сахарным диабетом, план обследования и наблюдения за этими пациентами.

Разработана методика оценки экспрессии генов с целью установления первичной локализации опухоли при помощи ПЦР в реальном времени.

Методология и методы исследования Данная научная работа была выполнена в соответствии с отечественным и мировым опытом. В основу диссертации легли этические принципы и правила доказательной медицины. Методология включала в себя разработку дизайна исследования, определение принципов отбора и объема выборки пациентов, а также подбора математического аппарата для статистической обработки полученных данных. Для проведения исследования использовали клинико – морфологические, инструментальные, гистологические, молекулярно – генетические методы.



Положения, выносимые на защиту 1. Наблюдение за больными, включенными в группу риска с впервые выявленным сахарным диабетом, позволяет диагностировать новообразование поджелудочной железы на более ранних стадиях.

Наибольшей чувствительность при выявлении рака поджелудочной железы обладают эндоскопическое ультразвуковое исследование, магнитно-резонансная томография с холангиопанкреатографией и спиральная компьютерная томография с внутривенным контрастированием.

2. Прогноз заболевания и результаты хирургического лечения ухудшаются при увеличении уровня онкомаркера СА 19-9 выше 100 Ед/мл.

3. Оценка молекулярно- генетических маркеров (уровень CА 19-9, экспрессия KRAS, CDH 17, PSCA и CDX2) позволяет установить первичную локализацию опухоли, оценить стадию заболевания и дальнейший прогноз.

4. Носительство мутации генов BRCA1 5382insC и BRCA2 является редким среди больных раком поджелудочной железы. Для российской популяции не характерно наличие аллеля BRCA2 6174delT.

5. Наличие наследственной мутации обусловливает чувствительность опухоли к ДНК - повреждающим агентам.

Степень достоверности и апробация результатов Для обеспечения достоверности полученных результатов было включено в исследование 257 наблюдений. Полученные данные обрабатывались с помощью программного пакета для статистического анализа SPSS 17.0, что позволило доказательно аргументировать полученные выводы.

панкреатологическом симпозиуме и удостоены награды молодого исследователя (Майями, США, 2012); 2-ом международном научном и обучающем форуме «Хирургия и Онкология - 2012», где была получена почетная грамота; 49-ом ежегодном международном симпозиуме Американского общества клинических онкологов (ASCO, Чикаго, США, 2013); в ходе работы международной программы, обучающей клиническим исследованиям – ICTW, организованное Американским обществом клинических онкологов и Российским обществом химиотерапевтов (ASCO и RUSSCO, Санкт-Петербург, Россия, 2013); седьмом российском онкологическом форуме (Санкт- Петербург, Россия, 2013г) а также «Gastrointestinal cancer symposium» (Сан – Франциско, США, 2014).

По результатам исследования опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад автора При выполнении исследования автор лично участвовал в его разработке и исполнении. Проанализирован мировой опыт в изучении поставленной задаче.

Осуществлен набор клинического материала, многоплановый анализ, документация и систематизация полученных результатов.

В ходе работы получена приоритетная справка на изобретение метода диагностики панкреатической гипертензии: МПК А61В 8/13, А61К 49/10»,- № 2013127373 от 14.06.13.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами, 17 рисунками.

Работа состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 297 источника, в том числе 33 отечественных и 264 иностранных авторов.

1.1 Актуальность проблемы диагностики и лечения рака поджелудочной железы Заболеваемость раком поджелудочной железы (РПЖ) за последние 30 лет увеличилась на 30% и составляет в России 9,5 среди мужчин и 7,6 - женщин на 100000 населения (Демин Д.И. и др., 1997; Павловский А.В., 2004; Чисов В.И., 2013). По частоте заболеваемости среди онкологической патологии РПЖ занимает 6 место и составляет 3% (Мерабишвили В.М., 2006; Siegel R., et al., 2013), а среди причин смерти в развитых странах - четвертое (Ferlay J., 2010;

Malvezzi M., et al., 2012). В 2002 году в России были выявлены 453256 новых случаев злокачественных новообразований, что на 10,7% больше, чем в 1993 г. На фоне снижения численности населения, это обстоятельство свидетельствует о росте онкологической заболеваемости (Чисов В.И., 2012г.). Чаще всего раком поджелудочной железы заболевают в возрасте старше 55 лет (Hiripi E., at al., 2009). За последние 26 лет показатели смертности населения Санкт - Петербурга от онкологических заболеваний возросли у мужчин на 1,6%, у женщин – на 0,7%.

Это связано с продолжающимся процессом старения населения (Мерабишвили В.М., 2006). Рост числа больных со злокачественными опухолями поджелудочной железы (ПЖ) является одной из наиболее сложных проблем не только онкологии, но и хирургии (Шихман М.Е., 1993; Долгушин Б.И., 2004; Путов Н.В., 2005).

Согласно Cancer statistic 2013, количество заболевших в 2012 году составляет 45220, умерших - 38460 (Siegel R., Jemal A., 2013). Средняя продолжительность жизни больных после установления диагноза, без специфической терапии, колеблется от 4 до 15 месяцев (Sohn T.A., 2000; Ghaneh P., 2007), а 5 летняя выживаемость после перенесенной панкреатодуоденальной резекции - часто менее 5%. Обычно опухоль локализуется в головке поджелудочной железы (70 реже - в теле (11 - 14%) и в хвосте (7-10%), тотальное поражение отмечено у 6% больных (Ханевич М.Д., Манихас Г.М., 2011; Greenhalf W., 2006;). Опухоли поджелудочной железы в 85-95% представляют собой аденокарциному и развиваются в основном из эпителиальных протоков экзокринной части органа (Коханенко Н.Ю. 2002; Патютко Ю.И., 2011). В среднем от размера опухоли T1 до Т3, когда наиболее часто появляются симптомы заболевания, проходит 6,5 - лет, это является одной из причин того, что, не смотря на развитие методов диагностики, на момент постановки диагноза уже имеется распространенный процесс (Сhang Z., 2013).

1.2. Молекулярно-биологические особенности рака поджелудочной желез Как и ряд других эпителиальных опухолей, протоковая аденокарцинома резистентна к химио - и лучевой терапии. Подобная ситуация складывается из-за особенностей биологии опухоли ПЖ. РПЖ всегда плохо васкуляризован и поэтому клетки, которые составляют не более 20% от массы опухоли, находятся в состоянии относительной гипоксии, окружены плотной стромой, формирующейся в результате десмопластической реакции, состоящей из экстрацеллюлярного матрикса и занимающей основной объем опухоли (Kalluri R., Zeisberg M., 2006).

По этой причине крайне сложно доставить активный компонент химиопрепарата к месту его действия (Chu G.C., et al, 2007; Olive K.P., et al, 2009). В экспериментальной работе M.A. Jacobetz с соавт., (2012) показано, что при разрушении стромы с помощью веществ, в частности ингибитора hedgehog, увеличивается васкуляризация и биодоступность агента. Однако значимого клинического ответа авторами получено не было. По мере роста опухоли, по периферии образуется воспалительный инфильтрат, состоящий как из клеток иммунной системы, так и их антиподов, таких как тумор - ассоциированные фибробласты и макрофаги, плазмацитарные дендритные клетки (Witkiewicz A., 2008; Mackenzie R.P., McCollum A.D., 2009). После открытия в 1999 году «звездчатых клеток» (stellate cells), относящихся к миофибробластам, многие ученные, изучающие биологию рака поджелудочной железы, считают, что основное значение в прогрессировании и метастазировании принадлежит строме опухоли (Erkan M., 2012; Apte M.V., 2013). Данные клетки отвечают не только за синтез коллагена, васкуляризации опухоли, но и активно перестраивают её структуру, синтезируя металлопротеиназы (Masamune A., 2013). В настоящее время в химиотерапии РПЖ применяются препараты, воздействующие непосредственно на опухолевые клетки и исследуются действующие на строму аденокарциномы. Компоненты матрикса имеют схожий перекрестный антигенный профиль с нормальными тканями, что делает иммунотерапию малоэффективной (Pardoll D., 2003; Dodson L.F., 2011). Более того, опухолевая ткань активно подавляет иммунный ответ, благодаря секреции гуморальных факторов: цитотоксичного Т – лимфоцитассоциированного протеина 4, В и Т – лимфоцитарного атенуатора (Fong L., 2008, Paulos C.M., 2010). В результате жизнедеятельности опухолевых клеток в крови повышается количество Трегуляторов, которые подавляют иммунный ответ как в отношении собственных, так и чужеродных антигенов (Ikemoto T., 2006; Nomi T., 2007).

Следующей причиной неэффективности лечения рака поджелудочной железы является способность опухоли развивать резистентность к химиотерапевтическим агентам. Различают следующие механизмы развития устойчивости: снижение проникновения через клеточную стенку, увеличение экспорта из клетки, синтез «комплексов - ловушек» с последующей элиминацией препарата, моделирование точки воздействия, репарация генетического аппарата.

В работе W. Hagmann, R. Jesnowski (2010), посвященной устойчивости к гемцитабину указывается, что снижение чувствительности опухоли к этому препарату связано со снижением экспрессии специфических, высокоаффинных рецепторов группы ENT или CNT (equilibrative или concentrative nucleoside transporter), что приводит к снижению биодоступности препарата. Похожий механизм описывается в работе M.D. Hall с соавт., (2008): благодаря снижению уровня транспортера ОСТ2 появляется устойчивость к цисплатину. Из-за увеличения концентрации АТФ- зависимых экспортирующих каналов группы MRP, или медь - зависимых АТР7А и 7В возникает ситуация, приводящая к быстрой элиминации агента (Komatsu M., et al., 2000). Эти свойства опухоли наблюдаются в частности при сверхэкспрессии гена MLR. Увеличение внутриклеточной концентрации глутатиона или глутатион- С- трансферазы приводит к активному связыванию (trapping) препарата и экскреции (Kelley S.L., et al., 1988; Hrubisko M., et al., 1993). Помимо воздействия на пути поступления препарата, был открыт оригинальный механизм смещения рамки считывания генома, вызывающий снижение эффективности терапевтических агентов, связывающихся с ДНК опухолевой клетки (Edwards S.L, et al., 2008; Sakai W., et al, 2008). В опухолевой клетке повышены процессы репарации по сравнению с нормальной (Vilpo J.A., et al., 1995). Восстановление связанной ДНК с препаратом происходит путем эксцизии участка, с последующей гомологичной рекомбинацией. Оба эти механизма катализируются мульти-белковым комплексом. В частности данный механизм обеспечивается генами группы BRCA, о которых будет сказано ниже (Borst P., et al., 2008). Несмотря на множественные механизмы развития резистентности к химиотерапевтическим веществам, не стоит забывать тот факт, что раковая опухоль обладает высокой генетической гетерогенностью, это означает - часть клеток в опухоли или метастазах при назначении химиотерапии будет к ней чувствительна, а другая нет. Все эти механизмы наследственно детерминированы, эволюционно закреплены и также свойственны клеткам нормального эпителия, выстилающего протоковую систему пищеварительных желез и кишечника.

Другими факторами, определяющими неблагоприятный прогноз при РПЖ, являются раннее метастазирование в забрюшинные лимфатические коллекторы, распространение опухолевых клеток по воротной системе в печень и поздняя обращаемость больных - наиболее частой стадией является III (Nagai H., et al., 1986; Siegel R., et al., 2013). На момент верификации опухоли более чем у 40% больных уже имеется локально распространенное заболевание, а у 45% нерезектабельный рак с отдаленными метастазами (Greer J.B., et al., 2007; Philip P.A. 2008; Ferlay J., et al., 2010). Данная ситуация развивается в результате каскада реакций, запускаемых стромальными опухолевыми клетками: Cox-2, TGF- (фактор роста опухоли), PDGF (тромбоцитарный ростовой фактор), интегрины и хемокины (ИЛ-1, ИЛ-6), металлопротеиназы (ММР), элементы механизма hedgehog,- в результате происходит ремоделирование ткани, окружающей опухоль и активный, агрессивный рост последней (Jaster R. et al 2004, Massague J.,et al 2006, Deryugina E.I., Quigley J.P., 2006). Синтезируемые эпителиальные факторы роста сосудов (VEGF-A), вызывая васкуляризацию РПЖ, способствуют активной диссеминации в региональные и отдаленные органы- мишени благодаря воздействию хемокинов (Hanahan D., 1996).

1.2.1. Роль повреждение генетического аппарата в развитии рака поджелудочной железы А.Warthin в 1913 году ввел понятие «раковая семья». Семейная форма РПЖ составляет 3-10% среди впервые выявленных случаев, при этом риск развития заболевания увеличивается в 2 - 5 раз, при наличии одного прямого родственника с подтвержденным диагнозом рака поджелудочной железы (Hiripi E., et al., 2009, Hruban R.H., et al., 2010; Klein A.P., et al., 2013).

Для наследственной формы заболевания, характерно наличие мутации в герминальной клетке. Проявление же данного нарушения зависит от пенетрантности гена. Фенотип наследственной опухоли характеризуется ранней манифестацией, а также певично - множественной локализацией.

Выделяют следующие наследственные заболевания, предрасполагающие к характеризующийся гиперпигментацией губ, слизистой полости рта, формированием гамартомных полипов толстой кишки, обусловлен наличием аутосомно-доминантной мутации STK11/LKB1(Su G.H., et al.,1999).

Семейная форма панкреатита, обусловленная мутацией в гене PRSS1, характеризуется синтезом дефектного трипсиногена, при этом вероятность развития РПЖ увеличивается в 50-80 раз (Lowenfels A.B., et al.,1997).

Синдром семейных множественных, атипичных злокачественных меланом (FAMM), в 30-40% случаев обусловлен мутацией в p16/CDKN2A гене, при этом риск развития РПЖ у пациентов до 70 лет выше на 10-17% (Bartsch D.K., et al., 2002).

Середина 70-х годов ознаменовалась появлением молекулярной онкологии как самостоятельного направления. Проведенные исследования позволили в настоящее время понять ключевые моменты канцерогенеза. В 2008 году в своей работе S. Jones et al., выделил 12 основных сигнальных путей, наиболее часто задействованных в развитии рака поджелудочной железы. Более того, в 90-х гг.

специфического лечения РПЖ (Имянитов Е.Н., 2007).

канцерогенезе была представлена на схематической модели A. Maitra (Рисунок 1).

Рис. 1. Этапы трансформации эпителия поджелудочной железы в протоковую аденокарциному Канцерогенез, является мультифакториальным и многоступенчатым механизмом, но ключевую роль играют соматические мутации, вызывающие генетические перестройки (амплификации, точечные мутации, рекомбинации, участвующих в регуляции пролиферации, дифференцировки и гибели клеток.

После этого на фоне инактивации антионкогена (супрессора), окончательно происходит трансформация в злокачественную клетку (Knudson A.G., 1971;

Meszoely I.M., et al., 2001,). Считается, что генетический дефект, располагающийся ближе к старт - кодону, 5’-концу, проявляется чаще, чем располагающийся со стороны 3’-конца. В первом случае формируется стоп-кодон и нарушается транскрипция, как следствие понижается экспрессия м-РНК, либо синтезируется не функционирующий белок, во втором случае мутация рассматривается зачастую как полиморфизм гена.

туморогенеза. Подобные генетические элементы в норме чаще всего участвуют в позитивном контроле клеточного деления, а также в угнетении апоптоза.

Активация онкогена чаще всего проявляется в увеличении количества их функционировать в раковых клетках. В литературе хорошо изучены гены Pdx1, Pax6, в норме, отвечающие за начало дифференцировки мультипотентных бластных клеток в - ацинарный аппарат (Sandgren E.P., et al., 1993; Feldman G., et al. 2008). При построении модели на мышах было отмечено, что при канцерогенезе отмечалась реактивация этих генов в эпителии. Также широко обсуждается значение активации Notch (путь межклеточного взаимодействия) при индукции туморогенеза в протоковом эпителии поджелудочной железы (Murtaugh L.C., et al., 2003; Chu G.C., Kimmelman A.C., et al 2007). В норме данный путь отвечает за дифференцировку тканей, путем межклеточного взаимодействия, посредством рецепторов Notch-2, Notch-3, активации генов Hes-1, Hey-4, что приводит к трансформации бластной клетки в униполярную.

Генетически процесс трансформации мономорфного зачатка в истинную поджелудочную железу, состоящую из различных отделов, происходит благодаря механизму Hedgehog (Berman D.M. et al., 2003; Lau J., 2006). Этот путь обеспечивает не сегментарный рост и развитие органа, а краниокаудальную детерминированность. История открытия его принадлежит Christiane NssleinVolhard и Eric F. Wieschaus, выделивших в 70-ые годы дефектный ген у дрозофил, приводящий к сегментарному развитию эмбрионов. SHH- лиганд, синтезируемый hedgehog- геном, связывается с трансмембранным PTCH-1 рецептором, оксистерола, вызывая накапливание последнего в цитоплазме клетки. Оксистерол связывается с SMO протеином, одной из функций которого является фосфорилирование транскрипционного фактора Gli, тем самым ингибируя его активность. В данной ситуации свободные Gli1 и Gli2 накапливаются в ядре клетки, активизируют синтез SHH- лиганда, факторы роста и повышая митотическую активность клетки. Далее выделяемый SHH в межклеточное пространство активизирует прилежащие ткани, тем самым активизируется рост определенного сегмента зародыша (Ingham P., 2001; Corcoran R.B., 2006). Ряд авторов, занимающихся изучением уровня SHH, SMO наглядно показали разрабатываются режимы химиотерапии, направленные на ингибирование данного пути (Feldman G., et al., 2008; Hwang R.F., et al., 2012).

Активация онкогена приводит к активации различных процессов, чаще всего проявляется накоплением продуктов его деятельности. Ген K-Ras, является одним, из наиболее изученных при РПЖ, располагается в 12p хромосоме. Частота данной мутации встречается при раке поджелудочной железы в 60 - 95% (Hruban R.H., et al., 1993; Yamamoto H., et al., 2001). Активация онкогена происходит путем аминокислотной замены. Мутация происходит в 12 кодоне, при этом глицин замещается на валин или аспаргин. Белок синтезируемый данным геном представляет собой фиксированную к мембране ГТФ- азу. Он играет ключевую роль в передаче сигнала фактора роста, активируя ряд белков путем их фосфорилирования, тем самым запускает каскад реакций, приводящих к пролиферации, адаптации, дифференцировки, а также активируя ангиогенез (Fleming J.B., et al., 2005).

По данным Aguirre A.J. с соавт., (2003) при наличии мутации в K-Ras у мышей быстро развивалась метаплазия протокового эпителия (PanIN-2), однако дальнейшая малигнизация была возможна только при наличии дефекта в антионкогене. Таким образом, наличие мутации генов семейства RAS считается ранним событием и может быть обнаружена на самых ранних стадиях опухолевого процесса и в любом биологическом материале (Mulcahy H.E., at al., 1998, Deramaudt T., et al., 2006; Feldman G., et al. 2008). При анализе группы здоровых людей, имеющих данную мутацию, в сроки от 5 до 14 месяцев в 20% случаев развился доказанный рак поджелудочной железы (Rowinsky E.K., et al 1999). В своем докладе J. Ling и соавт., (2012), показал, что частота мутации в генах Ras после 60-лет неуклонно растет, однако прямой зависимости данного события и увеличения заболеваемости РПЖ получено не было.

Туморогенез сопровождается повреждением в антионкогенах. При этом развитие опухоли ассоциировано с прекращением экспрессии супрессорного гена.

В основе этого процесса лежит гиперметилирование промоторных участков. В ряде случаев уровень экспрессии белка остаётся прежним, но из-за нуклеотидных замен он становится неполноценным и не выполняет свою функцию.

Классическим примером этого могут служить мутации в супрессорном ТР (Olivier M., 2010). Данный ген локализуется в 17р хромосоме. Он синтезирует белок р53, играющий большую роль в регуляции цикла и апоптоза, также участвуя в механизмах стабилизации при цитотоксическом воздействии:

непосредственные повреждения ДНК (классический стимул); повреждения аппарата сегрегации генетического материала (например, митотического веретена); уменьшение концентрации свободных рибонуклеотидов, гипоксия, тепловой шок, высокая концентрация NO (монооксида азота), ионизирующее излучение (Hermeking H., et al., 1997). Частота данного нарушения составляет 50 Rozenblum E., et al., 1997). Согласно модели A. Maitra (2002), отражающей процесс трансформации протокового эпителия в аденокарциному, повреждение P53 происходит на поздних стадиях метаплазии.

1.3. Современные методы диагностики рака поджелудочной железы Выявление опухоли ПЖ на ранней стадии является одной из наиболее сложных проблем диагностики. Это влияет на своевременный выбор лечебной тактики, а, следовательно, на непосредственные и отдаленные результаты (Долгушин Б.И., соавт., 2004).

Ультразвуковое исследование (УЗИ) - один из наиболее информативных и доступных методов, позволяющих выявить новообразование поджелудочной железы (Martinez-Noguera A., 2008).

Основным признаком опухолевого поражения железы является локальное или диффузное увеличение и деформация органа с изменением его структуры.

Контур поджелудочной железы при раке неровный. Приблизительно у 25% больных можно выявить инфильтрацию опухолью окружающих органов и тканей, сопровождающуюся нечеткостью границ новообразования. В ряде случаев между опухолевым узлом и окружающей тканью прослеживается гипоэхогенная зона, окаймляющая периферию объемного образования. Внутренняя структура злокачественной опухоли может быть различной – от выраженного гиперэхогенной до отчетливо гипоэхогенной. При дегенеративных изменениях характерно чередование зон различной акустической плотности (Минько Б.А. и соавт., 2001).

Актуальной является проблема отличия рака от псевдотумарозного панкреатита и метастатического поражения поджелудочной железы (Путов Н.В., и соавт., 2005; Evans J.D. et al., 1997). Указанные патологические изменения часто имеют общую ультразвуковую картину (Рысс Е.С., Фишзон-Рысс Ю.И., 1994).

Более того, метастатические опухоли необходимо дифференцировать, прежде всего, клинически, поскольку при цитологическом исследовании они бывают, неотличимы от опухолей поджелудочной железы. Раковые опухоли другой локализации могут метастазировать в ПЖ, например: рак молочной железы, яичников, легких, злокачественной меланомы и др.

Наряду с опухолями, хронический панкреатит является наиболее частой причиной увеличения размеров поджелудочной железы, и изменения контура, что представляет основную проблему дифференциальной диагностики РПЖ (Данилов М.В., Федоров В.Д., 2003; Senzatimore S., 1994; Andren- Sandberg A. et al., 1997).

прогностическим фактором у больных РПЖ (Kayahara M.et al., 1995). При метастатическом поражении лимфатического узла происходит увеличение содержания в нем жидкости вследствие нарушения оттока лимфы, что делает его более заметным при УЗИ. Однако более часто изменение размеров узлов связано с их фолликулярной гиперплазией. Чувствительность УЗИ в выявлении пораженных регионарных лимфатических узлов составляет 78,9% (Трофимова Е.Ю. и соавт., 1998). Авторы полагают, что УЗИ не решает проблему ранней диагностики лимфогенных метастазов. Однако пункционная биопсия под распространенности опухолевого процесса. По данным УЗИ, удается диагностировать метастазы размером 0,8см и более. Для выявления одиночных метастазов печени малых размеров решающее значение также имеет игольная биопсия.

Введение ультразвукового датчика в брюшную полость при лапароскопии также позволяет получить дополнительные данные. При исследовании печени можно выявить располагающиеся интрапаренхиматозно мелкие метастазы до 0,5см, оценить связь опухоли с крупными сосудами, выполнить биопсию (Старков Ю.Г., 2000; Minnard E.A.et al., 1998).

Применение УЗИ с прицельной чрескожной тонкоигольной биопсией, является специфическим исследованием, дающее возможность установить характер объемного изменения тканей поджелудочной железы и является стандартной процедурой перед началом лечения РПЖ. Тонкоигольная трепанбиопсия иглами Chiba диаметром от 20 до 25 G позволяет получить материал для гистологического исследования (Павловский А.В., и соавт., 2003; David B.R., et al., 1995). Данный метод является безопасным, даже при неоднократном повторении попыток получения материала (Долгушин Б. И., и соавт., 2004; Person L., Palmer C.H., 1989). Существенным недостатками метода являются возможность ложноположительных или ложноотрицательных результатов цитологического исследования вследствие механической травмы при получении клеточных элементов поджелудочной железы, а также имплантация опухоли по ходу биопсийного канала. Чувствительность тонкоигольной аспирационной биопсии в диагностике рака поджелудочной железы составляет 70-80 % (Харченко В.П. и соавт., 1992; Robins D.B.et al., 1995).

Частота осложнений при чрескожной биопсии опухоли поджелудочной железы не превышает 0,006-0,02% (Fornani F., et al., 1992; Di Stasi M.et al., 1998).

Чаще всего отмечаются кровотечения, ранения панкреатического протока, нагноение в месте пункции, развитие имплантационных метастазов по ходу пункционного канала (Catureli E.et al, 1985; Denton K.et al., 1990; Smith E.H., 1991).

Метод эндоскопической ультразвуковой диагностики (ЭндоУЗИ) был билиопанкреатодуоденальной зоны (DiMagno E.P., Buxton J.L., 1980). Он представляет собой комбинирование методов эндоскопии и внутриполостного УЗИ. Датчики работают в частоте 5-30 MHz. За последние 30 лет развитие последних привело к тому, что увеличилась разрешающая способность метода, благодаря программному обеспечению стало возможным выполнить допплерографию и эластографию панкреатодуоденальной зоны, оценить связь опухоли с сосудами, а эффективность дифференциальной диагностики между хроническим панкреатитом и РПЖ составляет 94% (Ogawa M., et al., 2011, Iglesias-Garcia J., 2013). Данный метод позволяет верифицировать опухоли и наличие региональных метастазов размером от 2 мм, при этом чувствительность метода составляет 94 – 100 % (DeWitt J., et al., 2004; Yasuda I., et al., 2011). При исследовании раковая опухоль поджелудочной железы выглядит как диффузная гипоэхогенная масса с ровными округлыми контурами, или неоднородная с узловыми включениями. Установить стадию по Т и N данным методом можно с достоверностью в 69 – 94% и 54 – 80 % случаев соответственно (Ahmad N.A., et al., 2002).

Новый виток развития в изучении и диагностике РПЖ был получен с внедрением в 1992 году тонкоигольной аспирационной биопсии при ЭндоУЗИ.

Данный метод дает возможность получить цитологический материал, что позволяет дифференцировать кистозные образования от РПЖ (Jani N., et al., 2011).

Так как процедура выполняется из просвета двенадцатиперстной кишки, это нивелирует шанс метастазирования по пункционному каналу (Voss M. et al., 2000; Binmoeller K.F., 2013). Чувствительность данного метода составляет 88 – 92% (Agarwal B., Abu-Hamda E., et al., 2004, Chari S.T., 2007). Однако существует несколько слабых мест: во-первых, в аспират зачастую не попадают опухолевые клетки, что ведет к ложноотрицательному результату, а во-вторых, решающее значение имеет опыт цитологов для подтверждения или опровержения диагноза.

Поэтому многие авторы отдают предпочтение trucut (TCB) биопсии- трепан биопсии с помощью side-port системы (Kaffes A., Corte C., 2012). Для этого необходима специальная игла с ножом, при введении которой получают гистологический материал (Levy M.J., et al., 2003).

принципиально новый этап развития этап в развитии современных рентгендиагностических систем. Чувствительность CКТ при раке поджелудочной железы варьирует между 89 и 97% (Zeiss J.et al., 1990; Valls C et al., 2002). КТ – исследование не является таким оператор – зависимым исследованием, как УЗИ.

Оценку результатов можно производить после получения данных на мониторе или по копиям на пленке. По мнению П.В. Власова (1998), основными признаками рака поджелудочной железы при КТ являются локальное увеличение, деформация органа, разрушение капсулы и изменение денситометрических показателей.

К недостаткам КТ можно отнести «жесткую привязку» полученных изображений к поперечной плоскости и наличие возможных пропусков срезов (во время дыхания). Последняя проблемы решается при объемном (спиральном) сканировании. Пространственное разрешение КТ можно увеличить, используя специальную тонкосрезовую технику. В настоящее время при проведении исследования необходимо обязательное внутривенное контрастирование (Kaneko K.et al., 1983; Louer E.M.et al., 1996; Wong J.C., et al., 2008). По данным L.Van Hoe и соавт. (1995) чувствительность этого метода значительно возрастает в диагностике васкуляризованных опухолей поджелудочной железы. При двухфазовой спиральной КТ появляется возможность сканировать поджелудочную железу, как в артериальной, так и в паренхиматозной фазе, что позволяет выявлять опухоль размерами 1,5см и более с чувствительностью более 95% (Legmann P., et al., 1998). КТ дает возможность выявить увеличение лимфатических узлов, инвазию в соседние органы, метастазы в печень. При этом чувствительность в выявлении сосудистой инвазии остается на уровне 50- 84% (Lu D.S.K., et al., 1999). В случае нерезектабельного РПЖ, при полном прорастании верхней брыжеечной вены, появляется симптом слезы (Hough T.J., et al., 1999). Увеличенные в результате метастатического поражения лимфатические узлы видны как патологические узловые структуры более 1см в диаметре в области аорты, нижней полой вены, в парапанкреатической области. Под контролем СКТ возможно выполнение тонкоигольной биопсии (Sklair-Levi M.et al., 1997). Появление 64-срезовых КТ датчиков, а также трехмерного моделирования исследуемой зоны позволяет значительно улучшить результаты исследования (Olivie D., et al., 2007; Callery M.P., et al., 2009).

Магнитно-резонасная томография (МРТ). В 2012 году данный метод включили в стандарт диагностики опухолей поджелудочной железы, как альтернативу СКТ (NCCN guidelines version 2.2012, pancreatic adenocarcinoma).

Удовлетворительные результаты визуализации поджелудочной железы возможны при исследовании на магнитно – резонансных томографах со средней и высокой напряженностью поля (от 0,5 до 2Т) и в настоящее время считается «золотым стандартом» диагностики РПЖ (Schima W., et al., 2007).

По мнению R.C. Semelka и соавт.(1991), использование программ с определением протонной плотности ткани поджелудочной железы, окружающих структур и получение изображений в технике быстрого измерения не дают особых преимуществ в диагностике заболеваний поджелудочной железы.

Весьма перспективным считается использование специальных программ холангиопанкреатографии. На Т1-взвешенных изображениях аденокарцинома видна как зона низкой интенсивности сигнала. Если имеется жировая инфильтрация поджелудочной железы, опухоль будет хорошо видна на этом фоне. Как раз для подавления сигнала от окружающих тканей и жидкости используют Т2- взвешанные изображения, протоковая аденокарцинома может быть видна как зона высокой интенсивности сигнала при наличии зон некроза опухоли (Vachiranubhap B., et al., 2009).

T.Gabata и соавт.,(1994) указывают на увеличение чувствительности при использования парамагнитных контрастных веществ, в частности гадолиния, в диагностике аденокарцином, после внутривенного введения гадолиния зона опухоли становится более заметной, а также более контрастной по отношению к окружающим структурам.

Применение магнитно-резонансной ангиографии брюшной полости обеспечивает бесконтрастную визуализацию регионарных сосудов. Иногда фиброз и параканкрозные воспалительные изменения могут имитировать опухолевую инвазию, поэтому, несмотря на КТ и МРТ - данные, необходимо дальнейшее гистологическое исследование для оценки критериев опухолевой инвазии (Nichiharu T.et al., 1999).

Определенный интерес вызывает секретин-стимулированная МРХПГ, при этом исследование проводится на фоне относительной панкреатической гипертензии, таким образом, четко визуализируется уровень препятствия, а также соотношение и функциональные особенности главного и добавочного протоков железы (Ariyama J. 1999; Akisik M.F., et al., 2006).

В настоящее время разрабатывается новый контрастный агент NODA- Ga, это нано молекулярная система, которая при поглощении опухолевой клеткой начинает «светиться», что позволяет совмещать ПЭТ и МРТ (Locatelli E., et al., 2012).

Позитронная эмиссионная томография (ПЭТ) принцип действия, которой был открыт Гордоном Броунеллом и основан на улавливании опухолью высокоэнергетических фотонов. Таким образом ПЭТ, в отличии от предыдущих исследований, является, специфическим методом, отображающим физиологические, биологические и биохимические процессы в опухоли (Hicks R.J., Hofman M.S., 2012). Чувствительность этого метода составляет 85%, а специфичность 84% (Zimny M., et al., 1997) Данное исследование дает наглядную картину распространенности процесса, однако при этом отсутствует анатомичность, поэтому в современном виде ПЭТ всегда комбинируют с КТ. Способность моделирования трехмерного изображения позволяет провести оценку биохимических процессов и процессов обмена веществ, как для всего тела, так и отдельных органов (Parlak C., et al., 2012). ПЭТ-КТ позволило увеличить чувствительность метода до 89,1% (Lemke A.J., et al., 2004).

Однако использование этого метода для исследования поджелудочной железы еще мало изучено. Многие утверждают, что большим минусом данной методики является дороговизна, однако за последнее десятилетие цена исследования снизилась на 50% (Pichler B.J., et al., 2008). На основании изменения ПЭТ изображений в динамике оценивают эффективность химиотерапии (Murakami K., et al., 2011).

Таким образом, несомненный прогресс топических методов диагностики позволяет не инвазивными способами установить наличие объемного образования поджелудочной железы, а также состояние желчных и панкреатических протоков.

Однако все эти изменения указывают на опухоль лишь косвенным образом.

Дифференциальную диагностику усложняет высокая частота встречаемости острого и хронического панкреатита, в результате которых также наблюдается похожие изменения в поджелудочной железе и протоках. К сожалению, диагноз рака поджелудочной железы на современном этапе может быть установлен с высокой степенью вероятности только при размере опухоли более 1,5см, когда зачастую имеются отдаленные метастазы. При местно распространенном раке неизбежно возникают сложности дифференциальной диагностики, которые может разрешить только гистологическое исследование.

1.4. Хирургическое лечения рака поджелудочной железы В настоящее время радикальным методом лечения РПЖ является хирургический. Более чем у половины пациентов на момент диагностики уже имеется местнораспространенный РПЖ. Таким образом, основной задачей лечения у большинства больных является облегчение симптомов заболевания и продление жизни (Гарин А.М., Базин И.С., 1999; Борисов В.И 2002; Fortner J.G.,1996).

Три четверти больных РПЖ нуждаются в хирургическом лечении, но только у 10-20% из них образования оказываются резектабельными (Патютко Ю.И., Котельников А.Г., 2011; Diener M.K., et al., 2011; Verbeke C.S., et al., 2013).

Основными признаками невозможности удалить опухоль является наличие отдаленных метастазов в парааортальные лимфоузлы, печень, охват тканью опухоли более чем на 180 верхней брыжеечной артерии, не восстанавливаемая протезированием окклюзия воротной и/или верхней брыжеечной вен, вовлечение чревного ствола или аорты, поражение лимфоузлов вне зоны операции (Callery M.P., et al.,2009; protocol PANC-B, 2012). Вместе с тем, в литературе описывается опыт применения хирургического лечения у больных РПЖ на всех этапах развития образования, включая IV стадию (Дронов А.И. и соавт., 2011).

В настоящее время наиболее часто применяемым методом хирургического лечения злокачественной опухоли головки ПЖ продолжает оставаться стандартная гастропанкреатодуоденальная резекция (ГПДР), или операция Уиппла, модифицированная рядом хирургов (Whipple A.O., et al., 1935, Cattell R.B., 1948, Child C.G.M., 1994, Haniu F., Imaizumi T., 1996). При локализации опухоли в теле или хвосте - дистальная панкреатэктомия. До сих пор остается дискутабельным вопрос о показаниях к классической или пилорусохраняющей резекции. Часть хирургов считают что, для увеличения радикальности, а также профилактики синдрома отключенного желудка классическая ГПДР является вариантом выбора (Malleo G., et al., 2010; Hackert T., et al.,2013). Однако ряд работ указывают на то, что в случае пилоруссохраняющей панкреатодуоденальной резекции (ПДР), уменьшается частота послеоперационных осложнений, а также улучшается нутритивный статус больных после операции (Diener M.K., et al., 2007; Muniz C.K., et al., 2012). В 1992 году M. Gagner и A. Pomp впервые выполнили лапароскопическую панкреатодуоденальную резекцию. Данная методика развивается параллельно с эндовидеохирургическими технологиями (Kendrick M.L., et al., 2010, Aly M.Y., et al., 2010) К сожалению, отдаленные результаты ГПДР являются неудовлетворительными. Более чем у половины больных в течение года после оперативного лечения возникает местный рецидив опухоли и/или метастатическое поражение печени (Child C.G.M., 1994). В зависимости от стадии заболевания средняя продолжительность жизни больных после ГПДР колеблется от 4 до 22мес (Pedrazzoli S., et al., 1999, Sierzega M., et al., 2006). При наличии гистологически подтвержденных метастазов в регионарные лимфатические узлы, больные имеют наименьшие сроки выживания. Пятилетняя выживаемость отмечается только у больных со стадией заболевания, Т1.

Подобные данные публикуют G.H. Lewis с соавт., (2013). По данным клиники онкологии СПб ГМУ им И.П. Павлова, медиана выживаемости при 0 стадии рака головки поджелудочной железы составила 60 мес, при I - 41,2 мес, при II - 23, мес, при III - 12,8мес, при IV - 4 - 6 мес (Коханенко Н.Ю., и соавт., 2002). На продолжительность жизни больных после ГПДР влияет несколько факторов, в том числе размер первичной опухоли. У пациентов, имеющих диаметр опухоли меньше 2,5см, отмечается наибольшая продолжительность (Allema J.H., 1995, Fortner J.G., 1996). По данным Н.Ю. Коханенко и соавт. (2002), при опухоли 0,5см медиана выживаемости составила 39 мес, а от 2,6 до 4см - 15,5 мес, более 4см - 5,5 мес. J. Ariama (1997) отмечает, что при опухоли менее 1,0 см пациенты живут более 5 лет. Однако другие хирурги не разделяют мнения, что размер опухоли является ведущим фактором, определяющим успех хирургического лечения (Ischikawa O., 1996, Egawa S., et al., 2012).

В то же время большинство исследователей сходятся во мнении, что основным фактором, определяющим длительность жизни больных после ГПДР, является наличие метастазов в лимфатические узлы (Hartel M., et al., 2002;

Riediger H., et al., 2009). Авторы показывают, что ни один пациент с РПЖ, имеющий пораженные лимфатические узлы, не доживает до 5 лет. Несомненно, также влияние гистологической структуры опухоли на отдаленные результаты высокодифференцированным РПЖ при диагностике на ранней стадии и своевременном хирургическом лечении, по мнению Н.Ю. Коханенко и соавт (2002), в 3 раза превышала таковую у больных с низкодифференцированной формой рака. Однако другие исследователи не отмечают столь значительной зависимости продолжительности жизни больных от степени дифференцировки опухоли (Котельников А.Г., 2002 Bottger T.C., 1994).

гастропанкреатодуоденальной резекции остаются плохими. В качестве метода радикального хирургического лечения была предложена расширенная ГПДР.

Расширенная ГПДР, помимо гастропанкреатодуоденльного комплекса с регионарными лимфоузлами, удаляемыми при стандартной ГПДР, предполагает резекцию ПЖ на границе тела и хвоста органа, удаление единым блоком прилегающих к панкреатодуоденальному комплексу жировой ткани, нервных сплетений, лимфатических сосудов и узлов в следующих границах: верхняя уровень аортального отверстия диафрагмы, нижняя - уровень устья нижней брыжеечной артерии, правая - ворота правой почки, левая - левая почечная ножка (Патютко Ю.И., Котельников А.Г. 2011; Kayahara M., 1993; Ischikawa O., et al., 1996). В этих пределах осуществляется удаление клетчатки вокруг всех крупных артерий и вен. Удаление лимфатических коллекторов является стандартом при хирургическом лечении опухолей многих локализаций. Однако при РПЖ лимфодиссекция не может быть "совершенной", в силу отсутствия четких фасциальных границ в забрюшинном пространстве и наличия большого числа жизненно важных сосудов, поэтому отдаленные результаты стандартной и расширенной панкреатодуоденальной резекции практически не отличаются друг от друга (Fortner J.G., et al.,1996; Pedrazolli S.,et al., 1999). Стоит отметить, что расширенная ГПДР, характеризуется большой травматичностью и увеличением осложнений в послеоперационном периоде, таких как плазмаррагия, кровотечения, инфекционные осложнения (Glanemann M., et al., 2008; Tan W.J., et al 2010).

Другим прогностическим фактором ПДР является оценка краев резекции поджелудочной железы и наличие в них опухолевой ткани при гистологическом исследовании уменьшает медиану выживаемости в 2 раза (Sohn T.A., et al., 2000, Bilimoria K.Y., et al., 2008).

Для улучшения результатов хирургического лечения рядом авторов предлагается интраоперционное криовоздействие на ткань опухоли, при этом отмечается увеличение 3-ех летней выживаемости с 16,7% до 35,9% (Ханевич М.Д., Манихас Г.М., 2011).

1.5. Химиотерапия в лечении рака поджелудочной железы В 1985 году Gastrointestinal Tumor Study Group впервые сообщили, что при назначении химиотерапии в послеоперационном периоде вдвое увеличивается медиана выживаемости больных РПЖ (Moertel C.G., et al., 1981, Kalser M.H., et al., 1985). На данный момент химиотерапия при раке поджелудочной железы, является обязательным компонентом лечения злокачественных опухолей поджелудочной железы (Saufferlein T., et al., 2012). Учитывая, что в 80- 85% случаев выявляется нерезектабельная опухоль, единственным методом лечения являются симптоматическое и химиотерапевтическое.

В качестве адъювантной терапии после ПДР, рекомендуется назначение в течение 6 месяцев 5 –фторурацила (5-ФУ) с фолиевой кислотой или гемцитабина (Гем). Согласно многоцентровому исследованию ESPAC-3, у пациентов после хирургического лечение R0/R1 не было получено достоверной разницы в выживаемости между двумя схемами химиотерапии. При этом 5-летняя выживаемость в обеих группах увеличилась с 9 до 20%, а медиана составила месяца при использовани 5-ФУ и 23,6 - Гем (Neoptolemos J.P., et al., 2010; Oettle H., et al., 2013).

В основном химиотерапевтическое лечение применяется в качестве паллиативной терапии.

5-ФУ относится к группе фторпиримидинов, данный препарат обладает умеренной токсичностью и применяется в качестве монотерапии, однако чаще и эффективнее - в сочетании с другими препаратами (цисплатин, митомицин).

Эффективность его варьирует от 9 до 20% (Cullinan S.A., et al., 1985, Regine W.F., et al., 2008).

Гемцитабин является нуклеозидным аналогом, при встраивании его метаболитов в ДНК опухолевой клетки, вызывает ингибирование дальнейшего синтеза ДНК. В настоящее время данный антиметаболит является основным препаратом в первой линии терапии рака поджелудочной железы и все новые схемы лечения всегда оцениваются в сравнении с ним. В 1997 году Moore M.J et al., впервые показали эффективность данного препарата по сравнению с 5-ФУ.

При применении в IV стадии заболевания медиана выживаемости составляет 6, месяца, а годичная выживаемость 20% (Sultana A., et al., 2007). Комбинирование его с другими препаратами, например платины (цисплатин, оксалиплатин), доцетакселом и капецитабином, иринотеканом, экзатеканом, перметрексатом не дали значительного увеличения продолжительности жизни (Fine R.L., et al., 2008;

Heinemann V., et al., 2008; Cunningham D.,et al 2009).

В 2012 году в качестве выбора предложена схема FOLFIRNOX, включающая 5-ФУ, лейковорин (фолиевая кислота), оксалиплатин и иринотекан.

При этом в III стадии рандомизированного исследования было показано, что уровень ответа составил 31,6%, медиана продолжительности жизни составила 11,1 месяц, годичная выживаемость достигла 48,4%. Главным минусом этой схемы, как показало многоцентровое европейское исследование PRODIGE, является высокая токсичность, поэтому в данную группу могут попасть относительно «крепкие» пациенты (Conroy T., et al., 2011).

Патогенез рака поджелудочной железы связан с множеством аутокринных и паракринных механизмов, реализующихся через каскады мембранных рецепторных систем, таких как HER2/neu, EGRF, VEGF, VEGFR и другие (Overholser J.P., et al., 2000). Однако, несмотря на использование различных таргетных химиотерапевтических агентов, значимого эффекта не получено (Philip P.A., et al., 2010). Единственным апробированным препаратом в лечении аденокарцином, является эрлотиниб (Tarceva®) (Vickers M.M., et al., 2012). Его эффект основан на ингибировании EGFR тирозин-киназы. В результате рандомизированного исследования, где оценивали эффективность схемы эрлотиниб + гемцитабин, относительно гемцитабина, было получено достоверное увеличение медианы выживаемости (6,24 против 5,91 месяца у гемцитабина), годовой выживаемости (23% против 17%). Однако, столь незначительное улучшение и высокая стоимость терапии, ставят под сомнение целесообразность данного режима химиотерапии (Saufferlein T., et al., 2012).

Относительно новым направлением в лечении рака поджелудочной железы, является био или иммунотерапия. В настоящее время существуют следующие типы вакцин: цельноклеточные, пептидные, ДНК-вакцины, вирусные вакцины, моноклональные антитела. Однако оценка их эффективности пока исследуется (Dodson L.F., et al., 2011).

1.6. Значение молекулярно – генетических методов в диагностике и лечении рака поджелудочной железы В 1979 году H. Koprowski с соавторами выделили, используя гибридому, моноклональные антитела к карбогидратному антигену СА 19-9. Изначально, данный гликопротеид был выделен из ткани колоректальной аденкарциномы.

Позже было установлено, что и при других гастроинтестинальных раках характерно увеличение его концентрации. СА 19-9 является результатом аберрантного пути синтеза Lewis-a (Le) антигена, в норме присутствующего на поверхности клеток. Он участвует в межклеточной адгезии, инвазии и метастазировании (Safi F.,et al., 1987; Vestergaard E.M., et al., 1999; Liao Q., et al., 2007). Его диагностическая значимость актуальна только у пациентов с группой крови Le (-+), Le(+-). У больных с Le(--) фенотипом, а его частота 5-10%, имеется недостаточность фермента 1,4-фукозил трансферазы, необходимого для синтеза эпитопа СА 19-9. Поэтому невозможно провести иммуноферментный анализ и в данной группе значение этого антигена будет отрицательным (Ritts R.E., et al., 1998, Goonetilleke K.S., et al., 2007).

Несмотря на поиски более эффективных агентов, на данный момент, СА 19остается единственным относительно информативным маркером, используемым специфичность – 68 - 91%. Несмотря на то, что ряд авторов связывали определенные надежды с использованием СА 19-9 для скрининга РПЖ, последующие исследования показали низкую его эффективность (Safi F., et al., 1987; Satake K., et al. 1994; Duraker N., et al 2007).

ложноположительного увеличения уровня антигена (Ballehanina U.K., et al. 2012;

Seuferlein T., et al., 2012). Однако некоторые исследователи считают, что прямой зависимости нет (Fritz S., et al. 2011). Вместе с тем, все авторы согласны, что при повышении уровня СА 19-9, возможность выполнения радикальной операции и эффективность химиоадъювантной терапии снижается, а прогноз течения заболевания ухудшается, но показатели антигена и результаты исследований категорически разнятся (Halm U., et al., 2006; Bernhard J., et al., 2010; Chiang K., et al., 2012).

Для улучшения диагностики с помощью онкомаркеров рекомендуется одновременно оценивать несколько различных маркеров. В исследовании R.E.

Brand с соавторами 2011 год, было проанализировано 83 потенциальных биомаркера, в результате было показано, что панель, состоящая из СА19-9, ICAM-1 (молекула межклеточной адгезии 1), OPG (остеопротегерин), обладает наибольшей чувствительностью и специфичностью.

MGB (маммаглобин) – белок, относящийся к группе секретоглобинов, представляет собой гликопротеин. M.A. Watson и соавторы (1996), впервые выделили из протокового эпителия молочной железы, а его гиперпродукция отмечена при раке молочной железы. При дальнейшем исследовании экспрессию маммаглобина выявили при злокачественных образованиях легких, яичников, желчевыводящих протоков (Ouellete R.J., et al., 2004; Sjdin A., et al., 2008; Tassi R., et al., 2009).

Ген, кодирующий данный белок состоит из 502 нуклеотидов, имеет 3 экзона и 2 интрона, располагается в 11 хромосоме (11q12.3-13.1). Масса его составляет порядка 20кДа. В клетке находится зачастую в виде дидимера, данный комплекс фиксируется в мембране и способен переносить стероидные и бифинильные молекулы в клетку, поэтому в настоящее время маммаглобин рассматривают как потенциальный маркер для таргетной терапии (Carter D., et al., 2002; Zuo L., et al., 2009).

Для раннего выявления рака наиболее эффективно определение мРНК маммаглобина. Однако её выделение имеет ряд сложностей, из-за нестабильности м - РНК. Чувствительность и специфичность данного метода составляет 95-100% (Grnewald K., et al., 2000) Учитывая, что РПЖ уже на ранних стадиях способен давать отдаленные метастазы, то для уточнения первичной локализации опухоли, возможно, определить репликативную активность РНК следующих генов SPB, PSCA, CDX2, CDH17, F5, LIPF, UGRP, UPK2, TG-2.

SPB белок сурфактанта B (surfactant protein B), кодируется SFTPB геном и участвует в образовании поверхностно – активного липопротеидного комплекса – сурфактанта и отвечает за его стабилизацию (Lin Z., et al., 2001). Является гидрофобным белком, состоящим из 79 аминокислот. Данный маркер используется при иммуногистохимическом исследовании с целью подтверждения диагноза аденокарциномы легких. Частота положительного ответа наблюдается на уровне 53 – 60% (Khoor A., et al. 1997; Talantov D., et al.2006).

PSCA (prostate stem cell antigen) является небольшим гликопротеином, функция которого до конца не ясна, однако он участвует в клеточной дифференциации. Данный белок синтезируется на поверхности эпителиальных клеток предстательной железы, мочевого пузыря, почек, желудка, желчного пузыря и поджелудочной железы (Bahrenberg G., et al., 2000; Saeki N., et al., 2011).

О последней находке было впервые доложено Argani P., с соавторами (2001), при определении мРНК в нескольких культурах клеток аденокарциномы, а также нормальной ткани ПЖ, авторы пришли к выводу, что PSCA синтезируется только в злокачественных опухолях. В данном сообщении, также было проанализировано присутствие данного антигена в PanIn, в результате он был выявлен только в типе дисплазии, являющимся предраком. При дальнейшем изучении было установлена высокая эффективность данного маркера для дифференциальной диагностики рака, доброкачественных заболеваний поджелудочной железы, а также рака яичников (McCarthy D.M., et al.,2003; Cao D., et al., 2005). Однако в работе Ono H., с соавторами (2012) доказано, что PSCA может также встречаться и в клетках ткани нормальной поджелудочной железы.

CDX2 ген, синтезирует интестинальный специфический транскрипционный фактор, в норме он играет важную роль в краниокаудальном развитии желудочнокишечного тракта (Suh E., et al., 2001; Mizoshita T., et al., 2004). Ингибируя пролиферацию на стадии транскрипции генов, он стимулирует дифференцировку клеток эпителия, путем активации синтеза антигенов: MUC2, сукразы, изомальтазы. Карбоангидразы I. В целом данная группа генов, в частности CDX является протоонкогеном, однако доказано, что в случае колоректального рака он выступает тумор- супрессором (Bonhomme C., et al., 2003; Baba Y., et al., 2009).

Чаще всего РНК этого гена определяют при дифференциальной диагностике между метастатическими гастроинтестинальными раками и рака яичников.

При раке поджелудочной железы, экспрессия CDX2 и MUC2 не типична и наблюдается редко, в 5-10% случаев (Moskaluk C.A., et al., 2003). При внутрипротоковых муцинозных опухолях поджелудочной железы (ВМО) выявление MUC2 CDX2 редко, но характерно для интестинального типа ВМО и коллоидной карциномы (Adsay N.Y., et al.,2004; Levi E., et al., 2004; Yopp A.C., 2010).

Другим продуктом функции CDX2 является кадерин 17 (CDH17), данная молекула адгезии синтезируется в интестинальном эпителии и является маркером рака толстой кишки. Он связывает трансмембранный регион с помощью формировании структуры ткани. Снижение синтеза кадерина в некоторых карциномах характеризуется злокачественным течением (Jeanes A., et al., 2008;

Makrilia N., et al., 2009). При раке поджелудочной железы, данный фактор выявляется в 53-70% случаев и в 40% в метастазах, синтез его носит фокальный характер и определяется не во всех участках опухоли. CDH17 чаще наблюдается в низкодифференцированных. Таким образом, можно считать, что кадерин является благоприятным прогностическим фактором при РПЖ (Takamura M., et al., 2003; Su M.C., et al.,2008; Panarelli N.C., et al., 2012).

Ген F5 кодирует фактор коагуляции 5-проакцелерин, при дефекте в нем развиваеются заболевания связанные с коагулопатией. Однако продукт F5 гена, взаимодействуя с VH3 доменом иммуноглобулина Е, участвует в активации интерлейкина 4, который играет немаловажную роль в пролиферации, дифференцировке, хемотаксисе и развитии Т и В- лимфоцитов. Таким образом, снижение активности F5 может способствовать снижению гуморального и клеточного иммунитета. Как показал в своем исследовании M.J. Baine с соавт., (2012) на ранней стадии РПЖ в крови снижается уровень F5. При использовании в дифференциальной диагностике между хроническим панкреатитом и аденокарциномой, этот ген в комбинации с СА5В, SSBP2, и MIC1 показали чувствительность 83%.

LIPF ген, располагается в 10 хромосоме и отвечает за синтез желудочной липазы. Существует несколько вариантов данного гена (LIPA, LIPJ, LIPK, LIPM, LIPN), которые локализуются в различных клетках организма. Именно LIPF участвует в переваривание пищевых триглицеридов до жирных кислот и отвечает за расщепление 30% поступающих жиров. Исследования уровня экспрессии гена при раке желудка показали, что вследствие снижение липолитической функции, отмечается отрицательная регуляция в клетках (Zhang X., et al., 2010; Hudler P., et al., 2011).

UGRP, является антионкогеном, его белок синтезируется в эпителии бронхов и обладает противовоспалительной активностью. Относительно недавно было показано, что при аденокарциномах легких увеличивается его экспрессия (Tachihara-Yoshikawa M., et al., 2008). Гены, относящиеся к данной группы также участвуют в синтезе маммаглобина А и липофилина В, которые являются маркерами аденокарцином другой локализации (Watson M.A., et al.,1999; Zafrakas M., et al., 2006). Таким образом, при РПЖ вопрос о целесообразности исследования UGRP остается открытым.

UPK2 (уроплакин 2) синтезирует уротелий- специфический белок, участвующий в укреплении стенки эпителиоцитов мочеиспускательного канала.

При раке желчного пузыря в 90% случаев находят уротелиально-клеточную карциному. Выявление данного гена, является прогностически неблагоприятным признаком (Li S.M., et al., 1999) Трансглутаминаза-2 (TG-2), кодируется геном TGM2. Данный фермент играет огромную роль в формировании межклеточного матрикса, главным образом, связываясь с витронектином, фибрином, коллагеном, ламинином, остеопонтином препятствует деградации и стабилизирует клеточномежклеточные взаимодействия. Из этого следует, что данный ген ингибирует инвазию и метастазирование рака (Haroon Z.A., et al., 1999; Jones R.A., et al., 2006). В работе G. Feldman и соавт., (2008) было показано, что у мышей в процессе канцерогенеза рака поджелудочной железы отмечается мутация в TGM2. При иммуногистохимическом исследовании данный маркер используется для подтверждения диагноза, при этом положительный результат отмечается в среднем в 39% случаев (Talantov D., et al., 2006; Cheung W., et al. 2007) При исследовании резистентности злокачественных опухолей различной локализации к доксорубицину было показано увеличение синтеза трансглутаминазы.

LPB (липофилин B) – высокоспецифичный секретоглобин, повышение экспрессии которого характерно при раке молочной железы. При этом отмечается его высокая чувствительность – 65%, но низкая специфичность, так как в случае фиброаденом, частота положительного ответа 77% (Culleton J., et al., 2007) 1.7. Роль BRCA1, BRCA2 и PALB2 при раке поджелудочной железы Наиболее впечатляющим открытием 90-х, стала идентификация генов наследственного рака молочной железы и яичников – BRCA1, BRCA2 (Breast cancer associated gene). Однако как показали последние исследования третьей по частоте нозологией, встречающейся при дефекте этих генов, является рак поджелудочной железы (Greer J.B., Whitcomb D.C., 2007). Ген BRCA 1, относится к генам - супрессорам, его белок, входит в состав комплексов, участвующих в репарации двухцепочечного повреждения ДНК, регулировании пролиферции, транскрипции, клеточного цикла, росте и дифференцировки клеток. В его состав входит 22 экзона и 2 интрона. Располагается в 17 хромосоме, локус 17q12-21 и занимает 100кб. Масса фосфопротеина, кодируемого BRCA1 220кДа, включает 1863 аминокислоты, 60% его массы кодирует 11 экзон. В терминальной части белка находится цинк-фингер связывающий домен. Он необходим для связывания с другими белками, в результате образуется комплекс, участвующих в гомологичной рекомбинации двухцепочечных повреждений ДНК (Scully R., et al., 2001).

Оценить распространенность мутации в BRCA1 при раке поджелудочной железы тяжело из-за малого опыта в изучении данной проблемы. Опираясь на данные исследователей, изучающих рак молочной железы, рак яичников, можно считать, что какие-либо «горячие точки» в этом гене отсутствуют, и мутации могут располагаться по всей длине гена. В 80% случаев они носят характер стопкодонов или сдвига рамки считывания, что приводит к остановке или неправильному синтезу белка (Somasundaram K., et al., 1997).

Локус мутации зависит от этнической принадлежности больного. Так при раке яичников среди жительниц восточной Европы харктерны аллели BRCA 5382insC, 4153delA, C61G (Цыбакова, Н.Ю., 2012; Sokolenko A.P., et al., 2010). У евреек- ашкенази в 90% характерны 5382insC, 4153delA, у скандинавок в 50% случаев встречаются 1675delA, 1135insC (Moslehi R., et al., 2000; Couch F.J., et al., 2013). В Российской федерации подавляющее большинство мутаций в гене BRCA1 представлено единственным вариантом - аллелем 5382insC (Sokolenko A.P., et al., 2010). При раке поджелудочной железы различными ученными были выявлены повреждения 5382insC, 185delAG (Ferrone C.K., et al., 2009; Stadler Z.K., et al., 2012). При семейной форме РПЖ мутации в BRCA1 не было выявлено (Axilbund J.E., et al., 2009).

В литературе описано около 500 различных значимых изменений в BRCA гене и порядка 300 в BRCA2. На территории России мутации в последнем встречаются относительно редко, при этом их спектр не ограничивается повторяющимися повреждениями (Sokolenko A.P., et al., 2007).

Как показали в экспериментальной работе G. Feldman и соавт., (2011), при нарушении функции BRCA2 у мышей, через 8 месяцев при гистологическом исследовании ткани поджелудочной железы выявляли PanIN, а через 15 месяцев инвазивную аденокарциному.

Риск развития онкологических заболеваний у данной группы больных в 8 – 10 раз выше, а конкретно РПЖ более чем в 2 раза (Thompson D., et al. 2002; Shi C., et al., 2009). Наличие мутации в данных генах относятся к семейным раковым синдромам, именно они являются одной из основных причин канцерогенеза (Hruban H., et al., 2010). Дефектный ген наледуется по аутосомно – доминантному пути, пенетрантность достигает 80%. По разным данным частота встречаемости мутации в BRCA 1 не более 1,1%, а BRCA 2 доходит у ряда авторов до 7% (Lowery M.A., et al., 2011).

поджелудочной железы, отсутствует возможность оценить характер течения этого заболевания у носителей. При анализе BRCA- ассоциированных групп больных раком яичников, молочной железы многие авторы считают, что для носителей этого гена характерен более молодой возраст, в среднем на 5 - 10 лет (Narod S.A., et al., 2001; Pal T., et al., 2005). После проведенного многоцентрового исследования American Association of Clinical Oncology пришли к выводу, что при наличии дефекта в генах BRCA у женщин после завершения репродуктивной функции и/или в возрасте до 40 лет следует выполнять, профилактическую оварэктомию. При этом уменьшается риск рака яичников до 90%, рака молочной железы на 50%. При мутации в BRCA1 рядом авторов предлагается выполнять мастэктомию (Смирнова Т.Ю., и соавт., 2007; Blanchard D.K., 2000; Brose M.S., et al., 2002).

На практике доказано, что онкологические больные, имеющие мутации в генах BRCA1, чувствительны к препаратам платины, при этом у них редко развивается резистентность к этим препаратам (Borst P. Et al., 2008; Imyanitov E.N.

2009).

Пациентов с наследственным раковым синдромом выделяют в отдельную группу, так как отмечено, что наследственные опухоли молочной железы, ободочной кишки, желудка, характеризуются более благоприятным прогнозом (Hruban R.H., et al., 2010). При данной патологии зачастую отмечают наличие мутации в генах BRCA. Учитывая, наличие «дефективного» процесса репарации поврежденных нитей нуклеиновых кислот, препаратами выбора являются ДНК – связывающие агенты, такие как митомицин и цисплатин. Относительно РПЖ проведено ряд исследований с положительным результатом, однако учитывая небольшие группы данных больных, они не являются достоверными (Colucci G., Giuliani F., 2002). Для таргетной терапии опухолей поджелудочной железы были использованы ингиботоры полиаденозиндифосфат полимеразы (PARP)- олапариб, фермента активизирующегося в условиях дефектного BRCA гена, участвующего в рекомбинации поврежденной одной цепи ДНК, с определенным положительным эффектом in vitro (Heinemann V., Quietzsch D. et al.,2006). Однако первый опыт использования олапариба не дал значимого положительного эффекта (Lowery M.A., Kelsen D.P., 2011).

распространенности мутации BRCA среди больных РПЖ, а также использования специфической терапии среди них.

С 2009 года стали активно изучать частоту встречаемости гена PALB2 при раке поджелудочной железы. Учитывая, что он является антионкогеном и функция его тесно связана с функцией генов BRCA, то можно коротко заключить, что основная функция заключается в репарации двухцепочечных повреждений нитей ДНК. Стоит добавить, что чаще всего наличие повреждения в PALB ассоциируют с семейной формой рака поджелудочной железы. В своей работе Jones S., с соавторами, 2009 год, проанализировал 96 больных РПЖ с наличием прямых родственников с таким же заболеванием, при этом выявил 3 случая (3,1%). По данным E.W. Hofstafer с соавт., 2011, эта частота составляет 2,1%.

Однако выявление дефекта в PALB2 может помочь в выборе схемы химиотерапии в пользу применения ДНК – повреждающих препаратов.

Глава 2. МАТЕРАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Характеристика исследованных больных Исследованы 257 больных раком поджелудочной железы IB – IV стадиях, проходившие лечение в ГБУЗ «Городская Мариинская больница», ГБУЗ «Покровская больница», НИИ скорой помощи им. проф. И.И. Джанелидзе, ГБУЗ Ленинградский областной онкологический диспансер с 2009 по 2012 годы.

Сбор данных и материала производилось после разъяснительной беседы и добровольного согласия пациента.

В ходе исследования для анализа медицинской документации (истории болезней, амбулаторные карты), данных опроса пациента была разработана анкета, пример которой представлен в приложении 1.

В таблице 2.1 представлены данные об исследуемых больных.

Характеристика исследуемых больных Характеристики Возраст соматического статуса по шкале Продолжение таблицы 2.1 - Характеристика исследуемых больных Характеристики заболевания Радикальная операция дифференцировк и опухоли Как следует из таблицы, рак поджелудочной железы чаще наблюдался у мужчин, чем у женщин – 61,5% (n = 158) и 38,3% (n = 99) соответственно.

Средний возраст больных составил 62,4 года, при этом интервал составил от 22 до 87 лет, при этом превалировали пациенты старше 65 лет - 56,4% (n = 145).

Соматический статус больных по шкале ECOG чаще всего соответствовал баллам (58.8%). Регионарное метастазирование на момент установления диагноза выявлено у 54,5% (n = 140), инвазия в крупные сосуды – 28,4% (n = 73), отдаленные метастазы – 39,7% (n = 102) больных. При этом радикальное оперативное лечение выполнено – 30,4% (n = 78) пациентам, операции выполнялись в ГБУЗ «Мариинская больница», ГБУЗ «Ленинградский областной онкологический диспансер», ГБУЗ «Городской онкологический диспансер». При гистологической верификации наиболее часто встречалась умеренно дифференцированная аденокарцинома – 52,3% (n = 68).

2.2. Оценка чувствительности различных инструментальных методов Диагноз РПЖ был поставлен на основании клинической картины, инструментальных методов исследования (ультразвукового, эндоскопического ультразвукового, мультиспиральной компьютерной томографии с и без Трансабдоминальное ультразвуковое исследование выполнялось на аппарате Voluson 730 Pro, General Electric, 2008. Эндоскопическое ультразвуковое исследование – Olympus UCM – 160, 2008. Для проведения мультиспиральной компьютерной томографии применяли Definition AS 64, Siemens, 2010. Магнитно – резонансная томография осуществлялась на Magnitom Avanto Siemens 1,5T, 2008.

разработанной Международным противораковым союзом, 7 пересмотр, 2010г (Edge S.B., Byrd D.R., et al., 2010).

2.3. Оценка результатов лечения больных раком поджелудочной железы Были опрошены и проанализированы медицинские карты 78 (30,4%) панкреатодуоденальная резекция (n = 69), дистальная резекция поджелудочной железы (n = 9). Результаты хирургического лечения оценивали по следующим параметрам: длительность операции, осложнения в послеоперационном периоде, длительность пребывания в стационаре, летальность. Время до рецидива заболевания определялось, как промежуток между датами операции и документально зарегистрированным прогрессированием заболевания. Общая выживаемость оценивалась от дня начала лечения до смерти пациента. Последние два показателя удалось проанализировать у 59 пациентов (75,6%).

Изучены результаты химиотерапии, проведенной у пациентов без радикального оперативного лечения. Она была выполнена 19 пациентам: 3 тегафуром, в дозировке 800 мг/м2 2 раза в день, суточная доза не более 1,6 г в течение 14 дней, 16 – гемцитабином 1000мг/м2 в 1, 8 и 15 дни.

При этом перед началом терапии проводили отбор пациентов по общему соматическому статусу по шкале ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group):

0 - пациент активен, способен полностью выполнять обычную 1 - больной может выполнять только легкую работу на дому или в 2 - пациент может полностью себя обслуживать;

3 - положение в основном сидя или лежа, может частично себя 4 - положение пассивное, больной не способен к самообслуживанию.

В исследуемой группе ХТ проводилась только больным с ECOG 0 и 1 балла, без лабораторных отклонений и вне обострения хронических заболеваний.

Оценку её эффективности осуществляли по критериям RECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) (Eisenhauer E., et al., 2009). Степень ответа опухоли оценивали путем сравнения данных спиральной компьютерной томографии и/или ультразвукового исследования до назначения схемы терапии и спустя 28 дней после окончания цикла. Для этого выбирали маркерные очаги, т.е., метастатические образования с четкими контурами, округлой или близкой к ней формы, с размерами более 20 мм при измерении его с помощью УЗИ или более мм - при СКТ. Выбирали не более 5 маркерных очагов из одного органа, измеряли наибольший диаметр каждого, и суммировали, полученная сумма – максимальный диаметр (МД) маркерных очагов. Узлы с размерами меньше выше указанных, считали не измеряемыми, сюда же относили асцит, поражения плевры, лимфангит.

Оценка эффекта по измеряемым очагам производилась путем вычисления изменения МД. Полный ответ - исчезновение всех очагов; частичный ответ уменьшение МД на 30% и более; прогрессирование - увеличение МД на 20% и более или возникновение новых очаговых образований; стабилизация незначительное изменение МД, не позволяющее определить частичный это ответ или прогрессирование. Дополнительным критерием оценки ХТ было определение изменения уровня СА 19-9.

2.4. Молекулярно – генетические методы Для определения уровня в периферической крови онкологического маркера СА 19-9 выполняли иммуноферментный анализ посредством высокоафинных антител, последующая количественная оценка осуществлялась с помощью автоматических фотометров и автоматических анализаторов при длине волны 450 нм.

В протокол генетического тестирования были включены следующие гены (BRCA 1 5382insC, BRCA2 6174delT, KRAS, маммоглобин, PSCA, CDX2, CDH17, F5, LIPF, UGRP, UPK2, TG-2), методика определения описана ниже.

Наличие мутации в гене KRAS изучено ретроспективно у 19 пациентов, которые проходили лечение в «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова», оценка экспрессии РНК маммоглобина, PSCA, CDX2, CDH17, F5, LIPF, UGRP, UPK2, TG-2 осуществлена в 17 случаях.

В направлении на генетическое исследование, фиксировали не только возраст пациента, но и семейный анамнез, наличие предшествующих онкологических заболеваний, стадию заболевания по системе TNM, гистологическую характеристику, размер опухоли, характер лечения. Для выделения ДНК осуществляли забор венозной крови в вакуумные пробирки с антикоагулянтом (этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА)) из расчета мкл на 1 мл крови. Кровь в маркированной пробирке с прилагаемой копией направления доставляли в лабораторию молекулярной онкологии НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова.

2.4.1. Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови Для оценки наличия мутации в гене BRCA1, BRCA2 использовали лейкоциты периферической крови. Выявление аллеля BRCA1 5382 insC выполнено в 150 случаях, при этом 116 из них были отобраны случайным образом (2009 – 2011г.), а последующие 34 (2011 - 2012), по наличию в анамнезе рака молочной железы, рака яичников и/или присутствия в семейном анамнезе родственников с онкологическими заболеваниями. У 22 больных, выполнен анализ наличия повторяющейся мутации BRCA2 6174delT. В 8 случаях при подозрении на семейную форму рака поджелудочной железы осуществлено секвенирование полной кодирующей последовательности гена BRCA2 и PALB2.

Данные контроля популяционной встречаемости аллеля BRCA1 5382insC были предоставлены лабораторией молекулярной генетики НИИ онкологии им.

Н.Н.Петрова, для этого использовались образцы ДНК, полученные от здоровых лиц среднего возраста.

С целью выявления демографических и клинических особенностей носителей BRCA мутаций всех генетически обследованных больных (n = 150) в зависимости от количества родственников с онкопатологией в семейном анамнезе разделили на 3 группы: А – отсутствие таковых (n = 94), B – наличие одного родственника с онкологической патологией (n = 35), С – 2 и более родственника со злокачественными заболеваниями (n = 21).

модифицированного соль-хлороформного метода (Mullenbach et al., 1989). Кровь собирали в пробирки, содержащие 0,5 М раствор ЭДТА из расчета 30 мкл на 1 мл крови. Гипоосмотический лизис эритроцитов достигался посредством 3-кратного разведения 5 мл крови дистиллированной водой, охлажденной до 44° С. Затем лейкоциты осаждали центрифугированием. Полученный осадок ресуспендировали в 1 мл раствора Трис-НС1 (рН = 8,3), 1 мМ ЭДТА. Для разрушения цитоплазматической мембраны клеток добавляли Тритон Х - 100 до конечной концентрации 1%. Ядра осаждали центрифугированием. Осадок вновь ресуспендировали в 1 мл Трис - HCl (рН = 8,3) и лизировали посредством добавления лаурилсульфата натрия до конечной концентрации 1%. Протеолиз белков и деградация комплексов «белок-ДНК» осуществляли посредством инкубации пробы в присутствии протеиназы К (200 мкг/мл) при +60° С в течение 12 часов. Затем к лизату добавляли раствор хлорида натрия до конечной концентрации 1,5 М и равный объем хлороформа. Экстракцию проводили в течение 30 минут при медленном покачивании с целью удаления из раствора ДНК нерастворимых компонентов клеточного лизата - белков и липидов. При необходимости процедура повторялась дважды.

Последующее центрифугирование приводило к образованию в пробирке трех четко различимых фаз. Верхняя водная фаза содержала растворенную ДНК и неорганические соли, промежуточная - белки и нижняя, хлороформная, гидрофобные компоненты. Для осаждения ДНК к осторожно отобранной верхней фазе добавляли два объема абсолютного этанола и оставляли на 20 минут при температуре - 20 °С. Осадок затем собирали центрифугированием в течение минут при 12000 g. Отмывание осадка от солей производили в 1 мл 70% этанола и затем, после центрифугирования, растворяли в 0,5 мл 200 мМ раствора ТрисЭДТА (рН = 7,6). В результате был получен раствор с искомой ДНК, который можно было хранить при температуре -20 С.

2.4.2. Метод выделения РНК из парафиновых блоков Срезы парафиновых блоков проводили под контролем световой микроскопии, чтобы доля опухолевой ткани была более 80%. Депарафинизацию осуществляли ксилолом, с последующей регидратацией путем последовательной инкубации в 96%, затем 80% и 70% растворах этилового спирта. Лизирование клеток проводили в течение 16 часов, при температуре 60 С, путем добавления буфера: 10 мМ Трис-HCl (ph = 8,3), 0,1 мМ ЭДТА, 2% SDS и 500 мкг/мл протеиназы К. Кислый фенол (ph = 4,0) и хлороформ добавлялся для экстракции РНК. Затем м – РНК обрабатывали изопропанолом в присутствии 1 мкл гликогена (20 мг/мл), однократно промывали 70% этанолом и растворяли в 10 мкл воды. Исходный раствор с РНК использовали в реакции обратной транскрипции для синтеза комплиментарной ДНК (кДНК).

2.4.3. Реакция обратной транскрипции Для этой реакции необходим фермент обратная транскриптаза, в работе использовали M-MLV (Promega), в количестве 50 единиц. Для проведения синтеза помимо фермента добавляли 4 мкл 5 - кратного буфера, 1 мкл- праймеров, 1 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфата (дНТФ), 8 мкл ингибитора РНК-аз и 10 мкл исходного раствора РНК. Далее полученный раствор нагревали: 5 минут при температуре 20С, затем 30 минут при 38С и 5 минут при 95С.

2.4.4. Выделение ДНК из парафиновых блоков В целом процесс схож с выше указанным при выделении РНК: производили депарафинизацию в ксилоле с последующей регидратацией последовательно в 96%, 80% и 70% растворах этилового спирта. После испарения этилового спирта на воздухе, добавляли лизирующий раствор в объеме 200 мкл (10 мМ Трис-HCl (ph=8,3), 0,1 мМ ЭДТА, 2% SDS и 500 мкг/мл протеиназы К). Лизис проводился в течении 12 - 24 часов при температуре +95С до полной инактивации протеиназы К. Полученную суспензию разводили бидистиллированной водой и она была готова для проведения полимеразной цепной реакции.

2.4.5. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (РВ-ПЦР) Метод оценки уровня экспрессии в режиме реального времени является наиболее точным и позволяет получить точный результат при маленьком количестве материала. Всего проведено 150 анализов последовательностей генов BRCA1 5382insC, и 22 - BRCA2 6174delT. Для анализа генетических мутаций в генах BRCA1 5382insC, BRCA2 6174delT, KRAS, PSCA, CDX2, CDH17, F5, LIPF, UGRP, UPK2, TG-2 использовали следующие локус специфические праймеры и зонды:

Мутация BRCA1 5382insC 5’ – AAG CGA GCA AGA GAA TTC CAG – 3’ (общий) 5’ – AGC GAG CAA GAG AAT TCC CA – 3’ (wt) 5’ – AGA ACC TGT GTG AAA GTA TCT AGc ACT G – 3’ (mut) wt – праймер, специфичный к нормальному аллелю.

mut – праймер, специфичный к мутированному Мутация BRCA2 6174delT 5’-CATAACCAAAATATGTCTGGATTGGAG-3’ (общий) 5’-CTGATACCTGGACAGATTTTCCAC-3’ (wt) 5’-CCTGGACAGATTTTCCCTTGC-3’(mut) Праймеры для определения экспрессии мРНК генов PSCA, CDX2, CDH17, F5, LIPF, UGRP, UPK2, TG2:

PSCA-F TGTGCTGCTTGCCCTGTTGA

PSCA-R GTTGCTCACCTGGGCTTTG

CDX2-F GCGGAACCTGTGCGAGTG

CDX2-R GCCGCTGGTGGTCCGTG

CDH17-F TGAAGGCCAAGAACCGAGTC

CDH17-R TCTGTCTCCCCAGTTAGTTC

F5-F ATGCTGAAGTCGGAGACATC

F5-R GTGTGGTCAAGGTAAGAAGC

LIPF-F CCCAGTTCAGAATAGGATGC

LIPF-R CCTTGCCACCGTTCCACAC

UGRP-F GTCATGAAGCTGGTAACTATC

UGRP-R AGGTGCCAACTTGTCAACAG

UPK2-F CCTGATTCTGCTGGCTCTG

UPK2-R ACAGGGGGGCAAGGCAAC

TG-F TGAAGAGGCCACCCACATC

TG-R CATGGGTGGAAATGGGCAC

Экспрессия выполнена в 18 случаях из парафиновых блоков.

Праймеры для детекции мутаций в гене KRAS методом высокоточного анализа кривых плавления с последующим секвенированием:

KRAS-F AATGACTGAATATAAACTTGTGG

KRAS-R CAAGATTTACCTCTATTGTTGG

Анализ выполнен у 19 пациентов с диагнозом РПЖ и в 2 случаях у больных с хроническим панкреатитом для исключения рака.

При наличии в анамнезе прямых родственников с установленным диагнозом рак поджелудочной железы, выполнялось секвенирование полной последовательности гена PALB2 выполнено в 7 случаях, а для BRCA2 у пациентов. При этом применялся HRM-анализ (high-resolution melting analysis) с последующим секвенированием аномально плавящихся фрагментов.

Последовательности праймеров и условия реакции предоставлены сотрудниками Медицинского центра г. Лейдена (Leiden University Medical Center, Dr. Ninke van der Stoep, персональное сообщение). Секвенирование осуществлялось на аппарате SEQ-8000 (Beckman-Coulter, США).

Для постановки реакции использовали ПЦР - амплификаторы iCycler iQ Real-Time PCR Detection System и CFX-96 (Bio-Rad Laboratories, USA). При этом соблюдали следующие условия, в объеме 20мкл, содержалось 50 нг геномной ДНК, добавляли 1Ед «hot start» Taq - полимеразы «Thermostar» («Синтол», Москва), однократный ПЦР - буфер (ph= 8,3), 1,5- 3,0 мМ MgCb, по 200 мкМ каждого из дезоксинуклеотиддифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ) и 100 нМ каждого олигонуклеотида или праймера. К полученной смеси добавляли интеркалирующий краситель SYBR green I (20 кратный раствор, добавляется из расчета 1/100 объема реакции), данное вещество, связываясь с ДНК начинает «светиться».

Реакция начиналась с активации ДНК-полимеразы при температуре 95 С, в течение 10 минут. Последующие 45 циклов состояли из фаз денатурации при температуре 95 С в течение 15 сек, затем отжига при 60 С - 30 сек, и синтеза при 72С- 30 сек.

Детекция мутации в генах осуществлялась благодаря анализу высокоточной кинетики плавления, основанный на сравнивании динамики кривых плавления гена- рефери и исследуемого амплификата (wt, mut). Наличие дефекта в исследуемом образце проявлялось в виде минимальной разницей кривых амплификации (минимальным Сt), Рисунок 2.

Рис. 2. Примеры кривых амплификации в режиме реального времени Примечание: а) есть мутация, б) отсутствует wt (нормальная последовательность) mut (мутированная последовательность) 2.5. Статистическая обработка полученных данных Обработку данных проводили с помощью статистического аппарата SPSS Version 17.0 (SPSS inc.), Microsoft Excel 2007, а также Epi Info, version 6.

В анализе полученных данных использовали описательную статистику (частота, среднее значение, стандартное отклонение, медиана, стандартная ошибка среднего, доверительный интервал). Математико – статистический анализ выживаемости больных осуществляли методом Каплан - Мейера. Выяснение силы и характера связи дискретных значений проводили непараметрическим методом Спирмена, а также путем парного сравнения, Мантель - Кокса.

Подтверждение гипотезы относительного риска выполняли параметрическим методом Фишера.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛИНИКИ, ДИАГНОСТИКИ

И ЛЕЧЕНИЯ РАКА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

3.1 Анализ общей группы больных Исследовано 257 больных, среди них женщин (ж) – 158 (61,5%), мужчин (м) – 99 (38,5%). Возраст пациентов колебался от 22 до 87 лет, средний составил 62, ± 18,2 года. Распределение пациентов по возрасту представлено в таблице 3. Распределение больных по возрасту (по классификации ВОЗ, 1963г.) Возраст (годы) Как следует из таблицы, частота встречаемости РПЖ находится в прямой зависимости от возраста больных, с максимальным значением у лиц старше 60 лет (73.6%).

При оценке общего состояния больных по шкале ECOG только у больных (11.7%) соматический статус составил 0 баллов, 1 балл у 48 (18,7%), балла у 151 (58,8%), 3 балла у 23 (8,9%), 4 балла у 5 (1,9%). Таким образом, более чем у половины пациентов отмечалось ограничение трудоспособности, но при этом они способны были полностью себя обслуживать. При изучении больных по стадии заболевания получены следующие результаты: IB – 4 (1,6 %), IIA – (4,2 %), IIB – 67 (26,1 %), III – 73 (28,4 %), IV – 102 (39,7 %). В основном устанавливали диагноз уже, когда имелись регионарные и отдаленные метастазы.

Распределение больных в зависимости от стадии заболевания по классификации TNM, представлено в таблице 3.2.

Распределение пациентов по классификации TNM в зависимости от стадии заболевания Примечание: Any- любое количество пораженных лимфатических узлов Из полученных данных следует, что на момент постановки диагноза в случаях (51,4%) первичная опухоль распространялась на крупные сосуды, в (77,1%) наблюдениях имелись регионарные метастазы, а в 102 (39,7%), отдаленные. Из представленных в таблицах 2.1 и 3.2 результатов следует, что рак поджелудочной железы выявлялся поздно, и только у 4 больных (1,6 %) диагностирован в IB ст., а в остальных же 253 (98,4 %) случаях имелось распространение опухоли за пределы поджелудочной железы, либо диссеминация процесса.

Радикальные операции выполнены в 78 случаях (30,4%). По результатам умереннодифференцированную аденокарциному, что продемонстрировано на рисунке 3.

новообразований прооперированных больных умереннодифференцированная у 41 (52,6 %), низкодифференцированная у 18 (23,1 %), не дифференцированная у 3 (3.8 %).

3.2. Особенности клинического течения рака поджелудочной железы Основными симптомами проявления заболевания были: желтуха – 84,7%, боли – 69,4%, нарушение метаболизма углеводов - 72,7%, снижение массы тела – 45,1%, диспепсические явления – 6,8%. А также согласно шкале общего соматического статуса ECOG, состояние у 121 (58,8%) больного оценено в балла, то есть отмечалось снижение работоспособности.



Pages:     || 2 |
Похожие работы:

«Туфанов Игорь Евгеньевич МЕТОДЫ РЕШЕНИЯ ОБЗОРНО-ПОИСКОВЫХ ЗАДАЧ С ПРИМЕНЕНИЕМ ГРУПП АВТОНОМНЫХ НЕОБИТАЕМЫХ ПОДВОДНЫХ АППАРАТОВ Специальность 05.13.18 – Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ Диссертация на соискание учёной степени кандидата технических наук Научный руководитель – чл.-корр. РАН, д.т.н. А.Ф. Щербатюк Владивосток – СОДЕРЖАНИЕ Содержание Список...»

«Максимишин Сергей Валентинович СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ КОРЫ БОЛЬШОГО МОЗГА ПРИ ОСТРОЙ ИШЕМИИ И ИХ КОРРЕКЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЕРФТОРАНА (экспериментально-клиническое исследование) 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология 14.00.37 – анестезиология и реаниматология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные...»

«Ван Шилу ИНТЕРНЕТ-ЗАВИСИМОСТЬ У УЧАСТНИКОВ КОМПЬЮТЕРНЫХ ИГР (НА МАТЕРИАЛЕ КИТАЙСКОЙ КУЛЬТУРЫ) 19.00.01 – Общая психология, психология личности, история психологии Диссертация на соискание ученой степени кандидата психологических наук Научный руководитель : кандидат психологических наук, старший научный сотрудник Войскунский А.Е. Москва – СОДЕРЖАНИЕ _стр. ВВЕДЕНИЕ ТЕОРЕТИКО-МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЙ...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Кожанов, Виктор Иванович Применение системы рейтингового контроля в управлении физическим воспитанием студентов Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Кожанов, Виктор Иванович.    Применение системы рейтингового контроля в управлении физическим воспитанием студентов [Электронный ресурс] : Дис. . канд. пед. наук  : 13.00.08, 13.00.04. ­ Чебоксары: РГБ, 2006. ­ (Из фондов Российской Государственной Библиотеки)....»

«Орлянский Сергей Александрович ТРАНСФОРМАЦИЯ ОБРАЗА МУЖЧИНЫ В СОВРЕМЕННОЙ КУЛЬТУРЕ Специальность 09.00.13 – Религиоведение, философская антропология, философия культуры Диссертация на соискание учёной степени кандидата философских наук Научный руководитель : доктор философских наук, профессор Авксентьев В.А. Ставрополь ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА 1. Философско-культурологические...»

«НОВОХАЧЁВА НАТАЛЬЯ ЮРЬЕВНА СТИЛИСТИЧЕСКИЙ ПРИЁМ ЛИТЕРАТУРНОЙ АЛЛЮЗИИ В ГАЗЕТНО-ПУБЛИЦИСТИЧЕСКОМ ДИСКУРСЕ КОНЦА XX – НАЧАЛА XXI ВЕКОВ специальность 10.02.01 – русский язык ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата филологических наук Научный руководитель – доктор филологических наук, профессор В.М. Грязнова Ставрополь – -2ОГЛАВЛЕНИЕ Введение..3- Глава 1. Литературная аллюзия в...»

«Постовалов Сергей Николаевич ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ ДЛЯ РАСШИРЕНИЯ ПРИКЛАДНЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ КЛАССИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПРОВЕРКИ СТАТИСТИЧЕСКИХ ГИПОТЕЗ 05.13.17 – Теоретические основы информатики Диссертация на соискание ученой степени доктора технических наук...»

«АБДУРАШИТОВ ФОЗИЛ МАМАТОВИЧ ИСТОРИЧЕСКИЙ ОПЫТ ВНУТРЕННЕГО СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО ПЕРЕСЕЛЕНИЯ В ТАДЖИКИСТАНЕ (1924 – 1990гг.) Специальность 07. 00. 02 – Отечественная история Диссертация на соискание ученой степени доктора исторических наук Душанбе – 2014 –2– ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава 1. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ И ОСОБЕННОСТИ ПЕРЕСЕЛЕНЧЕСКОЙ ПОЛИТИКИ В ТАДЖИКИСТАНЕ 1.1 Основные этапы и тенденции...»

«из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Зинченко, Ольга Петровна 1. ОсоБенности псикическозо развития младжик сиБсов в семь як наркотизирдютцикся подростков 1.1. Российская государственная Библиотека diss.rsl.ru 2003 Зинченко, Ольга Петровна ОсоБенности псикического развития младшик си5сов в семьях наркотизирующихся подростков [Электронный ресурс]: Дис.. канд. психол. наук : 19.00.13.-М.: РГБ, 2003 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки) Психология — Социальная психология —...»

«Пименова Надежда Борисовна Формирование эффективно функционирующей производственной инфраструктуры отрасли льноводства (на материалах Удмуртской Республики) Специальность: 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством (экономика, организация и управление предприятиями, отраслями, комплексами АПК и сельское хозяйство)...»

«УДК 530.145 51-71 512.54 Алексеев Олег Вадимович Физические состояния в некоторых точно решаемых моделях двумерной квантовой теории поля Специальность 01.04.02 Теоретическая физика Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель : доктор физико-математических наук Белавин Александр Абрамович Черноголовка 2012 Оглавление...»

«СОНИНА АНЖЕЛЛА ВАЛЕРЬЕВНА Эпилитные лишайники в экосистемах северо-запада России: видовое разнообразие, экология 03.02.08 – экология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Петрозаводск 2014 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Степень изученности эпилитных...»

«ПИЧУГИНА Виктория Константиновна РАЗВИТИЕ АНТРОПОЛОГИЧЕСКОГО ДИСКУРСА ЗАБОТЫ О СЕБЕ В ИСТОРИИ АНТИЧНОЙ ПЕДАГОГИКИ Специальность 13.00.01 – общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени доктора педагогических наук Научный консультант : доктор пед. наук, профессор...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Костина, Ольга Алексеевна Психическое здоровье как проблема возрастной и педагогической психологии в наследии В. М. Бехтерева Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Костина, Ольга Алексеевна.    Психическое здоровье как проблема возрастной и педагогической психологии в наследии В. М. Бехтерева [Электронный ресурс] : Дис. . канд. психол. наук  : 19.00.07, 19.00.01. ­ Н. Новгород: РГБ, 2006. ­ (Из фондов Российской...»

«ПЕТРОСЯН Лилит Грантовна ОЦЕНКА НЕЙРОПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ КСЕНОНА ПРИ ОПЕРАЦИЯХ У БОЛЬНЫХ С ОБЪЕМНЫМИ ОБРАЗОВАНИЯМИ ГОЛОВНОГО МОЗГА 14.01.20 – Анестезиология и реаниматология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор В.М. МИЗИКОВ Москва – ОГЛАВЛЕНИЕ Список сокращений Введение ГЛАВА 1. Современные проблемы защиты мозга....»

«УДК 519.72,519.68 Домахина Людмила Григорьевна СКЕЛЕТНАЯ СЕГМЕНТАЦИЯ И ЦИРКУЛЯРНАЯ МОРФОЛОГИЯ МНОГОУГОЛЬНИКОВ 01.01.09 - Дискретная математика и математическая кибернетика. Диссертация на соискание степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель доктор технических наук, профессор Л.М. Местецкий Москва...»

«Корухова Юлия Станиславовна СИСТЕМА АВТОМАТИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПРОГРАММ Специальность 05.13.11 – математическое и программное обеспечение вычислительных машин, комплексов и компьютерных сетей Диссертация на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель : кандидат физико-математических наук, доцент В.Н. Пильщиков Москва...»

«Ваганов Михаил Александрович Резонансный метод бесконтактного анализа оптических спектров и его техническая реализация для решения задач контроля процессов горения Специальность 05.11.13 - Приборы и методы контроля природной среды, веществ, материалов и изделий ДИССЕРТАЦИЯ на...»

«Тарасов Алексей Григорьевич Система мониторинга вычислительного кластера расширенной функциональности 05.13.11 математическое и программное обеспечение вычислительных машин, комплексов и компьютерных сетей Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель чл.-корр. РАН, д.ф.-м.н. Смагин С. И. Хабаровск 2011 2 Оглавление Введение 1 Архитектура системы мониторинга...»

«Михайлов Виктор Алексеевич РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ И МОДЕЛЕЙ АНАЛИЗА И ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОГО ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ БОРТОВЫХ ЦИФРОВЫХ ВЫЧИСЛИТЕЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ В УСЛОВИЯХ ПРЕДНАМЕРЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ СВЕРХКОРОТКИХ ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ИЗЛУЧЕНИЙ Специальность 05.12.13 – Системы, сети и устройства телекоммуникаций Диссертация на соискание ученой степени доктора технических наук Научный консультант : доктор технических наук,...»






 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.