«АНАЛИЗ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВИРУСОВ ПАНДЕМИЧЕСКОГО ГРИППА A(H1N1) pdm09, ЦИРКУЛИРОВАВШИХ В РОССИИ В ПЕРИОД С 2009 ПО 2013 ГГ. ...»

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГРИППА

На правах рукописи

ДАНИЛЕНКО

Дарья Михайловна

АНАЛИЗ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ И БИОЛОГИЧЕСКИХ

СВОЙСТВ ВИРУСОВ ПАНДЕМИЧЕСКОГО ГРИППА A(H1N1) pdm09, ЦИРКУЛИРОВАВШИХ В РОССИИ В ПЕРИОД С 2009 ПО 2013 ГГ.

03.02.02 – вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук М.Ю. Еропкин

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………………………………….. ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………………... ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………… Пандемии гриппа: краткий обзор…………………………………………... 1.1.

Механизмы формирования эпидемических/пандемических 1.2.

вирусов гриппа………………………………………………………………… 1.2.1. Гипотезы о возникновении пандемических штаммов……………………..... 1.2.2. Гипотезы «вымирания» пандемических штаммов………………………….. Пандемический грипп A(H1N1)pdm09………………………………………. 1.3.

1.3.1. Краткий обзор событий пандемии 2009-2010 гг. в мире и в РФ………...…. 1.3.2. Биологические свойства вирусов гриппа A(H1N1)pdm09………………….. 1.3.3. Эволюция и механизмы изменчивости вирусов гриппа A(H1N1) и A(H1N1)pdm09………………………………………………………………… 1.3.3.1. Вирусы гриппа A(H1N1) 1918-2009 гг…………………………………… 1.3.3.2. Изменчивость НА вирусов гриппа A(H1N1) 1918-2009 гг. выделения и роль позитивной селекции………………………………………………… 1.3.3.3. Эволюционная изменчивость НА вирусов гриппа A(H1N1)pdm09…….. 1.3.3.4. Биологические свойства и эволюционная изменчивость NA вирусов гриппа A(H1N1) и A(H1N1)pdm09………………………………………... Заключение………………………………………………..…………………… 1.4.

ГЛАВА 2: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………………. 2.1. Материалы исследования……………………………………………….……….. 2.2. Методы исследования…………………………………………………….……… ГЛАВА 3: СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………………. ……..

3.1. ОСОБЕННОСТИ ВЫДЕЛЕНИЯ И АНТИГЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ВИРУСОВ ГРИППА A(H1N1)pdm09 ……………………………………………….. 3.1.1. Выделение вирусов гриппа A(H1N1)pdm09 с использованием клеточных линий MDCK, MDCK-Siat1, CaCo-2 и куриных эмбрионов………………………... 3.1.2. Заключение……………………………………………………………..……….

3.2. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ПАНДЕМИЧЕСКИХ ВИРУСОВ ГРИППА A(H1N1)pdm09 И ДРУГИХ ВИРУСОВ ГРИППА А ПТИЦ, ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА………………………………… 3.2.1. Особенности репликации вирусов гриппа птиц, животных и человека в перевиваемых культурах клеток……………………………………………………. 3.2.1.1. Отбор и восстановление музейных штаммов вирусов гриппа А………… 3.2.1.2. Сравнительное изучение репродукции вирусов гриппа А на клеточных культурах человека и животных…………………………………………………….. 3.2.2. Особенности гибели перевиваемых клеток человека в культуре при инфицировании вирусами гриппа птиц, животных и человека……………............ 3.2.2.1. Изучение апоптоза в клеточных линиях человека с использованием световой люминесцентной микроскопии и красителя Hoechst-33258……………. 3.2.2.2. Использование биохимических маркеров для выявления апоптоза, индуцируемого вирусами гриппа А, в клеточных линиях человека……………… 3.2.3. Характеристика активности NA вирусов гриппа A(H1N1)pdm09 в сравнении с другими вирусами гриппа птиц, животных и человека………………………….. 3.2.4. Заключение……………………………………………………………………. 3.3. АНТИГЕННЫЙ АНАЛИЗ ВИРУСОВ ГРИППА A(H1N1)pdm09, выделенных в 2009-2013 гг………………………………………………………………………...... 3.3.1. Сравнение данных антигенного анализа, полученных с использованием хорьковых и крысиных антисывороток…………………………………………… 3.3.2. Антигенный анализ вирусов гриппа A(H1N1)pdm09 2009-2013 гг.

Выделения…………………………………………………………………………… использованием крысиных антисывороток, полученных к современным вирусам гриппа A(H1N1)pdm09, выделенным на куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK……………………………………………………………………………....... 3.3.4. Антигенные карты для вирусов гриппа A(H1N1)pdm09…………………... 3.3.5. Заключение……………………………………………………………………. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ВИРУСОВ ГРИППА A(H1N1)pdm09, 3.4.

ОПРЕДЕЛЯЕМОЕ ПОВЕРХНОСТНЫМИ БЕЛКАМИ ВИРУСА ГРИППА……

3.4.1. Анализ аминокислотного состава НА вирусов гриппа A(H1N1)pdm09 в период с 2009 по 2013 гг……………………………………………………………. 3.4.2. Роль мутации D222G в НА вирусов гриппа A(H1N1)pdm09 и ее взаимосвязь с тяжелыми случаями течения гриппа……………………………………………… 3.4.3. Оценка сайтов позитивной селекции в молекуле НА вирусов гриппа A(H1N1)pdm09. Филогенетические группы……………………………………….. 3.4.4. Анализ аминокислотного состава NА вирусов гриппа A(H1N1)pdm09 в период с 2009 по 2013 гг…………………………………………………………….. 3.4.5. Оценка сайтов позитивной селекции в молекуле NА вирусов гриппа A(H1N1)pdm09. Филогенетические группы……………………………………….. 3.4.6. Заключение……………………………………………………………………. ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ………………………………………………………….. ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………….. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………...………… СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА………………………..……… ПРИЛОЖЕНИЕ………………………………………………………………..…….

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

НА - гемагглютинин MUNANA - 2-4(4-метилумбеллиферил)--D-N-ацетилнейраминовая кислота NA - нейраминидаза ВОЗ – Всемирная Организация Здравоохранения ГПЗ – гриппоподобное заболевание КЭ – куриные эмбрионы РГА – реакция гемагглютинации РТГА – реакция торможения гемагглютинирующей активности СЦ – сотрудничающий центр Ф.с. – фетальная сыворотка

ВВЕДЕНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Грипп – это тяжелая вирусная инфекция, занимающая наряду с другими острыми респираторными вирусными инфекциями, первое место в мире в структуре всех инфекционных заболеваний человека. Заболевания гриппом протекают с различной степенью тяжести и могут сопровождаться смертностью, особенно часто регистрируемой для маленьких детей и лиц пожилого возраста.

Известно, что эпидемии гриппа возникают ежегодно и охватывают до 15% населения Земли, в то время как пандемии гриппа являются более редким событием, возникающим раз в 10-40 лет. В 2009 была зарегистрирована первая в 21 веке пандемия гриппа. Подготовка к пандемии активно велась под эгидой Всемирной Организации Здравоохранения на протяжении последних 10 лет, однако в отличие от ожидаемого и предсказанного многими экспертами высокопатогенного вируса гриппа птиц подтипа A(H5N1) возбудителем этой пандемии оказался вирус с известной антигенной формулой A(H1N1).

Уникальность нового возбудителя состояла в сложной комбинации сегментов генома, имеющих происхождение от разных линий вирусов гриппа свиней и птиц, в то время как от вирусов гриппа человека сохранился лишь один из полимеразных генов. Возникновение «тройных реассортантов» вирусов гриппа было отмечено в популяциях свиней в США еще в 1998 году, отмечалось спорадическое инфицирование людей такими штаммами, однако устойчивой передачи таких вирусов не регистрировалось, в связи с чем эти вирусы не учитывались, как возможные агенты будущей пандемии.

Стремительное распространение пандемического вируса еще раз доказало, что предсказать место и время появления нового вирусного агента пока не представляется возможным, в то же время быстрое обнаружение и установление антигенной формулы возбудителя и его реассортантной природы позволило в кратчайшие сроки создать вакцинные штаммы и получить моновалентные пандемические вакцины для иммунизации населения. По мнению международных экспертов, именно вакцинация, наряду с эффективными мерами этиотропной противовирусной терапии и разработанными планами пандемической готовности, привели к тому, что последствия данной пандемии гриппа расценивали как «мягкое» течение пандемии.

В России новый возбудитель был впервые зарегистрирован в мае 2009 г, однако доминирование вирусов гриппа A(H1N1)pdm09 пришлось на осенний сезон. Несмотря на широкое распространение вирусов пандемического гриппа в последние пять лет стоит отметить, что в сезон 2011-2012 гг. их удельный вес в этиологической структуре гриппозной эпидемии был минимален, но уже в следующем сезоне они вновь активно циркулировали на территории РФ.

Анализ антигенной изменчивости нового возбудителя представляет собой важнейшую задачу, т.к. именно он позволяет отслеживать антигенный дрейф вирусов и вовремя вносить изменения в состав противогриппозных вакцин.

Помимо антигенных свойств не менее важным является анализ генетической изменчивости возбудителя, с тем, чтобы определить, какие варианты наиболее успешно распространяются по миру и установить возможную направленность изменчивости возбудителя.

Появление пандемических штаммов также ставит вопросы об их биологических свойствах как в экспериментах in vitro, так и in vivo. Сравнение свойств новых штаммов с уже охарактеризованными референс-вирусами прошлых лет позволяет делать прогнозы относительно возможной вирулентности и трансмиссивности этих возбудителей, а также о патогенезе инфекции, вызываемой такими вирусами.

В этой связи изучение антигенных и биологических свойств вирусов A(H1N1)pdm09, циркулирующих в России, и их сравнение с другими изолятами, выделенными в мире, является актуальным и имеет не только теоретический интерес, но и важно с практической точки зрения.

Степень разработанности проблемы.

Вопросы надзора за пандемическим гриппом A(H1N1)pdm09, эволюционной изменчивости и генетического разнообразия этого возбудителя широко освещаются в работах отечественных и зарубежных авторов: О.И. Киселева, Д.К.

Львова, А.А. Сомининой, Е.И. Бурцевой, М.Ю. Щелканова, М.Ю. Еропкина, М.П.

Грудинина, Е.А. Смородинцевой, Y. Kawaoka, R. Fouchier, A.M.E. Osterhaus, A.I.

Klimov, N. Cox, P. Palese, R. Webster, J. McCauley, M. Matrosovich, J. Van-Tam, H.D. Klenk, R. Donis, J. Belser, A.H. Reid, J.K. Taubenberger, M. Worobei, D. Smith, C.A.

Russell, C. Brown, C. Scholtissek и многих других.

Их работы содержат фундаментальные основы понимания механизмов формирования и возникновения современных пандемических и потенциально пандемических штаммов, а также анализ событий, приведший к развитию первой в 21 веке пандемии гриппа. В этих работах рассмотрены основные свойства нового пандемического штамма, возможные факторы патогенности возбудителя, проведен детальный генетический анализ, позволяющий сопоставить штаммы A(H1N1)pdm09 с ранее циркулировавшими пандемическими и эпидемическими штаммами гриппа человека, а также вирусами гриппа птиц, свиней и других животных.

Труды отечественных авторов в значительной мере способствовали изучению особенностей распространения нового возбудителя по территории нашей страны, содержат подробный эпидемиологический анализ событий, как отдельных сезонов, так и общий анализ распространения и циркуляции В этих работах отражены также особенности клинического течения гриппа, вызванного новым возбудителем, описаны генетические мутации, связанные с тяжелыми случаями течения гриппа, отдельные исследования посвящены течению гриппа у беременных женщин и других лиц, относящихся к группам риска.

Однако в значительной части эти исследования охватывают только отдельные аспекты пандемии (например, только эпидемиологические или только вирусологические, или только отдельные сезоны). В этой связи стоит вопрос о проведении исследований, объединяющих данные пятилетних наблюдений за циркуляцией A(H1N1)pdm09 в России, с объединением данных надзора за гриппом и его генетической изменчивостью, а также анализом дальнейшей эволюции возбудителя.

Цель исследования: охарактеризовать антигенные, биологические и молекулярно-биологические свойства вирусов гриппа A(H1N1)pdm09, циркулировавших в России в период с 2009 по 2013 гг. и выявить направления изменчивости данного возбудителя.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности выделения нового возбудителя A(H1N1)pdm09 в эпидемические по гриппу сезоны в России в период с 2009 по 2013 гг.

2. Оценить интенсивность репродукции в разных клеточных линиях и индукцию апоптоза, вызываемого вирусами A(H1N1)pdm09, в сравнении с эпидемическими вирусами гриппа человека, птиц и свиней.

3. Охарактеризовать антигенные свойства вирусов A(H1N1)pdm09, выявить эволюционные связи с эталонными штаммами, циркулировавшими в мире в разные годы и провести антигенное картирование российских изолятов 2009-2013 гг. выделения.

4. Выявить основные аминокислотные позиции в молекулах поверхностных белков HA и NA, которые повлияли на антигенные и биологические свойства современных российских изолятов A(H1N1)pdm09 с помощью серологических, биохимических и молекулярно-генетических методов.

5. Оценить аминокислотные позиции в молекулах HA и NA, находящиеся под действием позитивной селекции и проанализировать их роль в дальнейшей эволюции возбудителя.

Научная новизна работы.

A(H1N1)pdm09, изолированных на базе ФГБУ «НИИ гриппа» Минзрава России и в 49 опорных базах Национального Центра по гриппу на территории России в период с 2009 по 2013 гг. Изучены особенности выделения данного возбудителя на клеточных культурах и куриных эмбрионах, описаны особенности выделения вирусов данного подтипа из секционных материалов.

Продемонстрирована антигенная однородность исследованных штаммов на протяжении всего периода исследования. При этом установлено, что генетическое разнообразие этих вирусов позволяет выделять не менее 8 генетических групп, большинство из которых было зарегистрировано в России.

Впервые проведено исследование биологических свойств вирусов гриппа A(H1N1)pdm09 в сравнении с широким спектром эпидемических вирусов гриппа человека прошлых лет, а также вирусами гриппа свиней и птиц. Установлено, что вирусы пандемического гриппа, так же, как и вирусы гриппа свиней, демонстрируют пониженную репродукцию на клеточных культурах человека в сравнении с другими вирусами гриппа. При этом способность данных вирусов индуцировать апоптоз в исследуемых клеточных линиях также сравнима с таковой для вирусов гриппа свиней и штаммов эпидемического гриппа подтипа A(H1N1).

Изучена нейраминидазная активность широкого спектра вирусов гриппа птиц, свиней и человека, и установлено, что нейраминидаза вирусов гриппа A(H1N1)pdm09 обладает активностью, сравнимой с таковой для эпидемических вирусов гриппа A(H1N1) и вирусов гриппа свиней независимо от системы выделения вируса.

Впервые проведен подробный анализ аминокислотного состава молекул HA и NA российских изолятов A(H1N1)pdm09 2009-2013 гг выделения. Определены основные аминокислотные позиции, подверженные изменениям в ходе циркуляции вируса за пятилетний период. Проанализированы сайты в молекулах HA и NA, находящиеся под действием позитивной селекции и описана их значимость для дальнейшей эволюции вирусов гриппа A(H1N1)pdm09.

Практическая значимость работы.

В период с 2009 по 2013 гг проводилась изоляция и идентификация вирусов гриппа, на основании которых была определена этиология эпидемий гриппа в России. В результате проведенных исследований было проведено типирование и антигенный анализ 968 штаммов вирусов гриппа A(H1N1)pdm09. Изучение антигенных и молекулярно-биологических свойств этих изолятов позволило установить, что абсолютное большинство вирусов данного подтипа, выделенных в России, были антигенно схожи с эталонным вирусом, кандидатом в вакцинные штаммы А/Калифорния/07/09. Эти данные были важны для оценки необходимости обновления штаммового состава гриппозных диагностикумов и вакцин.

Результаты работы использовались при проведении практических занятий по выделению и идентификации вирусов гриппа учебных курсов ВОЗ по повышению квалификации врачей-вирусологов в мае 2011 г. и ноябре 2013г.

В рамках сотрудничества с ВОЗ за пятилетний период передано 137 штаммов вирусов гриппа A(H1N1)pdm09 в референс-лаборатории (CDC&P, Атланта, Джорджия, США и NIMR, Лондон, Великобритания) с целью международного мониторинга за гриппом, 3 из которых были выбраны в качестве репрезентативных штаммов (А/Санкт-Петербург/27/2011, А/Санкт-Петербург/100/2011, А/Астрахань/1/2011).

Методология и методы исследования.

Методологической основой исследования послужили работы отечественных и западных исследователей в области классической вирусологии, используемой при надзоре за гриппом, и стандартизованные в рекомендациях Всемирной Организации Здравоохранения, а также современные разработки в области молекулярной биологии и биоинформатики, позволяющие оценить эволюционную изменчивость вирусов гриппа на генетическом уровне и предсказать возможные направления их дальнейшей эволюции с использованием различных подходов моделирования. Методология экспериментов определялась в соответствии с поставленными задачами исследования.

В работе использованы как классические вирусологические методы (выделение вирусов гриппа, постановка реакции гемагглютинации, реакции торможения гемагглютинации, получение иммунных антисывороток, работа с клеточными линиями), наряду с современными методами антигенного анализа (антигенное картирование), так и методы молекулярной биологии (выделение РНК, постановка ПЦР, секвенирование) и методы компьютерного анализа (множественное выравнивание последовательностей, филогенетический анализ, компьютерное моделирование, анализ позитивной селекции).

Положения, выносимые на защиту.

1. Для вирусов пандемического гриппа А(H1N1)pdm09 наблюдается тенденция к более предпочтительному размножению в куриных эмбрионах, чем на клеточной культуре MDCK, а при работе с секционным материалом КЭ являются лучшей системой выделения, как с точки зрения эффективности выделения вирусов, так и с точки зрения быстроты получения результата.

2. Вирусы пандемического гриппа А(H1N1)pdm09, также как и вирусы гриппа свиней, обладают пониженной репродукцией в клеточных линиях человека и вызывают слабую индукцию апоптоза; в то же время вирусы гриппа птиц подтипа А(H5N1) обладают широким спектром инфекционной активности в отношении клеточных линий как животного, так и человеческого происхождения и эффективно вызывают апоптоз во всех изученных культурах.

3. Антигенный анализ вирусов А(H1N1)pdm09, выделенных за пятилетний период, показывает их антигенную однородность.

4. За исследуемый период в России наблюдалась циркуляция всех наиболее распространенных в мире генетических групп и подгрупп вирусов A(H1N1)pdm09. Основные аминокислотные замены в НА произошли вблизи рецептор-связывающего сайта (позиция 222), а также в позициях (антигенный сайт Cb), 203, 321, 499. В NA основные изменения зафиксированы для позиций 106, 248 и 351.

5. Анализ сайтов, находящихся под действием позитивной селекции в НА показал, что давление отбора наиболее выражено для позиций 222 и 223, а также позиции 374. Действие позитивной селекции в отношении NA вирусов гриппа на данном этапе циркуляции вирусов не выражено.

Личный вклад автора состоит в самостоятельном выполнении всех основных разделов работы. Автором проведено выделение, типирование и антигенный анализ большинства исследованных изолятов. Автором также получены все крысиные антисыворотки, использованные в ходе данного исследования, проведено антигенное картирование изолятов. Автором выполнен основной объем работ по изучению репродукции вирусов гриппа на клеточных линиях человека и животных и индукции апоптоза. Большая часть исследований, посвященных молекулярно-биологическому и филогенетическому анализу последовательностей HA и NA, а также оценки позитивной селекции, также проведены лично автором.

Вклад соавторов заключается в предоставлении клеточных линий и работе, связанной с пересевом и поддержанием исследуемых линий, использованных в ходе настоящего исследования, проведении ПЦР-диагностики в режиме реального времени, секвенировании изолятов, консультаций по проведению филогенетического анализа, оценки активности нейраминидазы и в помощи при проведении микроскопических исследований с использованием люминесцентного микроскопа и выполнении фотографий.

Достоверность данных исследования подтверждается использованием значительной выборки анализируемых штаммов (свыше 900 изолятов), а также применением адекватных методов статистической обработки данных и использованием методов компьютерного моделирования. Материалы диссертации были представлены на II Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 29-31 марта 2010, а также на четырех международных конференциях: Options for the control of influenza VII, HongKong, 3-7 сентября 2010;

II-nd International Influenza Meeting, Mnster, Germany, 12-14 сентября 2010; III-d International Influenza Meeting, Mnster, 2-4 сентября Germany 2012; Options for the control of influenza VIII, Cape Town, South Africa, 5-10 сентября 2013.

Публикации. Результаты диссертации отражены в 15 печатных работах, в том числе в 7 статьях в 3 реферируемых российских журналах из списка ВАК и в международных журналах, а также в тезисах докладов на российских и международных конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на печатных листах, состоит из: введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы собственных исследований, обсуждения, заключения, списков литературы и иллюстративного материала, а также приложения.

Работа иллюстрирована 29 таблицами и 30 рисунками. Список литературы содержит источника, в том числе 20 на русском языке и 214 на иностранных языках.

Глава 1: ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Вирусы гриппа А широко распространены в природе и поражают как людей, так и целый ряд млекопитающих и птиц. В настоящее время известно 18 подтипов гемагглютинина (НА) и 11 подтипов нейраминидазы (NA) вирусов гриппа А, циркулирующих среди позвоночных (Tong S. et al., 2013). Природным резервуаром всех вирусов гриппа типа А служат водоплавающие птицы. У них вирусы гриппа вызывают инфекцию кишечного тракта без видимых клинических проявлений.

Большинство известных подтипов вирусов гриппа циркулируют именно среди диких водоплавающих птиц, и они рассматриваются как предшественники всех вирусов гриппа А, обнаруживаемых у других видов позвоночных, включая человека (Olsen B. et al., 2006). Вирусы гриппа А водоплавающих птиц могут передаваться домашней птице (например, при использовании одних и тех же водоемов, т.к. в подходящих условиях они сохраняются в воде около месяца), вызывая спорадические вспышки заболеваемости. Несколько линий вирусов гриппа А различных подтипов закрепились в популяции домашней птицы и теперь их эволюция протекает независимо от эволюции вирусов, циркулирующих в диких птицах. В отличие от асимптоматической инфекции кишечного тракта, вызываемой вирусами гриппа А у диких водоплавающих птиц, при инфицировании домашней птицы наблюдается инфекция респираторного тракта с умеренными клиническими проявлениями. Вирусы, вызывающие такой тип инфекции, называют низкопатогенными вирусами гриппа птиц, или LPAIV (low pathogenic avian influenza viruses).

подтипов А(H5) и А(H7) вызывают системную инфекцию с поражением многочисленных внутренних органов, характеризующуюся высокой и быстрой смертностью. Такие вирусы принято называть высокопатогенными вирусами гриппа птиц, или HPAIV (highly pathogenic avian influenza viruses) (Kuiken T. et al., 2005). Вирусы гриппа птиц могут инфицировать млекопитающих: они могут вызывать отдельные случаи заболевания, локальные вспышки и крупные эпидемии. В последнем случае это приводит к адаптации вируса к новому хозяину и его устойчивой циркуляции в новой популяции. Такие случаи передачи вируса отмечены для свиней, лошадей и собак, у которых некоторые подтипы вирусов гриппа А циркулируют и эволюционируют независимо от вирусов гриппа птиц (Reperant L.A., Osterhaus D.M.E., 2013).

Пандемии гриппа вызываются вирусами гриппа А животных – птиц или млекопитающих - попадающими в человеческую популяцию, не имеющую (устойчивого) предсуществующего иммунитета к данному подтипу возбудителя.

Все охарактеризованные на сегодняшний день пандемии были вызваны вирусами гриппа птиц или свиней (см. рис.1.1).

Рисунок. 1.1. Временная шкала с нанесенными пандемическими событиями и этиологическими агентами пандемий (по книге Pandemic influenza, 2nd ed., 2013).

Пандемия – это редкое событие, возникающее с периодичностью раз в 10- лет. Для развития пандемии должны быть соблюдены 4 основных критерия (Monto A.S., Sellwood C., 2013):

1. Необходимо возникновение принципиально нового вируса гриппа типа А антигенно отличного от циркулирующих предпандемических штаммов, способного устойчиво циркулировать в человеческой популяции 2. В популяции не должно существовать сколько-нибудь значимого предсуществующего иммунитета к новому возбудителю 3. Новый агент должен вызывать значимую клиническую картину заболевания 4. Вирус должен эффективно передаваться от человека к человеку, что обеспечит его глобальное распространение По данным вирусологических, иммунологических и сероархеологических исследований, эпидемии и пандемии, начиная с 1889 г., были вызваны вирусами, имеющими гемагглютинины подтипов Н1, Н2 или Н3 и нейраминидазы N1 или N2.

Эти возбудители объединены в три подтипа вируса гриппа А человека: А (H1N1), А (H2N2) и А (H3N2). В появлении данных подтипов в человеческой популяции прослеживается определённая цикличность (Cox N. J., Kawaoka Y, 1998; Cox N. J., Subbarao K., 2000).

За последние 100 лет зафиксированы и изучены 4 пандемических цикла вируса гриппа. Подтип вируса гриппа с антигенной формулой А (H1N1) и его варианты HswN1, H0N1, H1N1, H1N1pdm09 вызвали пандемии и эпидемии 1918гг., 1929-1946 гг., 1946-1956 гг., 2009- 2010 гг., 2010 – (и по настоящее время) - соответственно. Подтип вируса гриппа А (H2N2) был причиной пандемии и последующих эпидемий в течении 1957-1968 гг. В конце 1968 г. на смену этому возбудителю пришел вирус гриппа А (H3N2), на фоне активной циркуляции которого в 1977 г. на эпидемическую арену вернулся вирус А (H1N1) (Webby R. J., Webster R. G., 2003; Monto A.S., Sellwood C., 2013).

Вирусы гриппа А подвергаются двум видам антигенных изменений. Появление принципиально новых подтипов вирусов гриппа связано с резкой сменой поверхностных белков вируса - гемагглютинина и/или нейраминидазы -и называется антигенным «шифтом» (Nelson M.I., Holmes E.C., 2007).

Сегментированность генома вируса гриппа обеспечивает возможность реассортации вирусных геномов в том случае, если животное или человек были одновременно заражены разными вирусами гриппа. В процессе реассортации НА вируса гриппа (и реже NA) могут быть замещены соответствующим геном, кодирующим белок другого подтипа. При этом сегменты, кодирующие внутренние белки вируса, могут остаться без изменений, а могут также подвергаться реассортации.

Типичным примером реассортации вирусов гриппа птиц и вирусов гриппа человека могут служить вирусы, вызвавшие пандемии 1957 и 1968 гг. Имеются убедительные доказательства того, что пандемические варианты – азиатский 1957г.

и гонконгский 1968 г. – возникли в результате реассортации между человеческими и птичьими вирусами. Так, пандемический вирус 1957 г. возник за счет реассортации вирусов гриппа человека A(H1N1) с вирусами гриппа птиц A(H2N2), в результате чего новый пандемический вирус содержал гены гемагглютинина, нейраминидазы и одного из белков полимеразного комплекса (РВ1) вирусов гриппа птиц. Вирус А(H3N2) 1968 г. содержал гены гемагглютинина и полимеразы РВ гриппа птиц. Остальные пять (или шесть) генов этих пандемических штаммов схожи с аналогичными генами более ранних человеческих вирусов А (H1N1) и A (H2N2). Ещё одним примером реассортации вирусов гриппа является выделение вирусов с антигенной формулой А (H1N2). Хотя подтипы вируса гриппа А (H1N1) и A (H3N2) социркулируют с 1977 г., появление реассортантных комбинаций HA и NA этих субтипов встречалось крайне редко. Впервые А (H1N2) реассортант был обнаружен в Японии в 1983 г. в единичном случае (Nakajima S. et al., 1983). В сезон 1988-1989 г.г. подобные вирусы циркулировали в Китае, в 1994 впервые зарегистрированы в Англии, а на сегодняшний день вирусы А (H1N2) обнаружены в 20 странах на четырёх континентах (Brown I.H. et al., 1995; Brown I.H. et al., 1998;

Guo Y. et al., 1992). Изучение ранних и более поздних случаев реассортации указывало на то, что данные вирусы могли появиться в Южной Азии и постепенно распространиться в Африке, Европе и Северной Америке, при этом они не вызвали обширной пандемии и не являлись причиной тяжёлых случаев или случаев с летальным исходом. Вероятно, это связано с их антигенной и генетической структурой, которая по результатам проведённых исследований оказалась подобной современным вирусам гриппа, широко циркулирующим во всём мире.

Так, НА данных реассортантов был родственен НА кандидата в вакцинные штаммы А (H1N1) А/Новая Каледония/20/99, а NA и 6 внутренних генов были подобны генам вируса А (H3N2) А/Москва/10/99, который также входил в состав гриппозной вакцины. Однако наиболее «сложным» примером реассортации генетических сегментов вирусов гриппа при формировании пандемических штаммов безусловно можно считать вирус А(H1N1)pdm09, вызвавший пандемию 2009- распространившийся в мире в 2009 г., является тройным реассортантом (см.

рис.1.2). Сегменты РВ2 и РА имеют «птичье» происхождение и были интродуцированы в популяцию вирусов гриппа свиней в 1998 г. Сегмент РВ происходит от вирусов гриппа человека подтипа A (H3N2), но, как известно, этот сегмент также был получен в результате реассортации с вирусами гриппа птиц в 1968 г. Сегменты НА, NР, NS филогенетически близки генам вируса 1918 г. и принадлежат линии так называемого «классического» гриппа свиней, в то время как оставшиеся сегменты NA и М относятся к Евроазиатской линии вирусов гриппа свиней и были интродуцированы в популяцию в 1979 г.

Рисунок 1.2. Происхождение геномных сегментов вирусов пандемического гриппа 2009 г (Garten R. et al., 2009).

Другой тип антигенных изменений, характерный для вирусов гриппа, называется антигенным дрейфом. Антигенный дрейф происходит в результате точечных мутаций в геноме, что в свою очередь приводит к изменению антигенных детерминант белков до такой степени, что они перестают распознаваться иммунной системой хозяина. Именно мутации, включающие замены, делеции и инсерции, ответственны за возникновение новых антигенных вариантов.

Постоянные изменения областей НА и в меньшей степени NA, которые распознаются антителами, помогают вирусу гриппа ускользать от иммунитета хозяина (Gorman O.T. et al., 1992; Webster R.G. et al., 1992; Wilson I.A. et al., 1981).

Однако если изменения происходят в высоко консервативных участках НА или NA или количество замен достаточно велико, может произойти существенное нарушение структуры и функций белков вируса, и такие изменения не фиксируются естественной селекцией. Интенсивность антигенного дрейфа вирусов косвенно можно отследить по замене штаммов, входящих в состав гриппозных вакцин. Так, за период десятилетний период 2003 – 2013 гг., наибольшей антигенной вариабельностью обладали вирусы гриппа А(H3N2), вакцинный штамм которых менялся 7 раз в течении этот периода, у вирусов гриппа В – 6 раз, а у вирусов гриппа А(H1N1) – 4 раза.

Под воздействием коллективного иммунитета населения происходит отбор вирусов, отличающихся по особенностям поверхностных антигенов от исходного родительского штамма. При этом отдельные гены вируса гриппа человека аккумулируют мутации почти с постоянной скоростью, что позволяет говорить о «молекулярных часах» вируса гриппа (He C.Q. et al., 2008). Антигенные (дрейфовые) варианты вирусов гриппа А появляются и доминируют в течение 2- лет, а затем замещаются следующей антигенной разновидностью. Необходимо добавить, что постоянный уровень гетерогенности штаммов, циркулирующих в один и тот же эпидемический сезон, служит хорошим фоном для природной селекции, затрудняя, однако правильный выбор вакцинного штамма (Hay A.J. et al., 1994; Koelle K. et al., 2006).

Еще одним механизмом изменчивости вирусов гриппа являются процессы реассортации, происходящие внутри одного подтипа и даже антигенного варианта.

В некоторых странах были выявлены множественные реассортантные случаи между различными филогенетическими линиями и подгруппами циркулирующих вирусов гриппа А(H3N2). Яркий пример – вирусы гриппа А(H1N1), вызвавшие крупную эпидемию в 1947 г. Установлено, что гемагглютинин этих вирусов сформировался в результате внутритиповой реассортации (Zimmer S.M., Burke D.S., 2009). Отличия были настолько сильны, что вирусы данной антигенной характеристики получили собственное наименование («А-прим», по старой классификации; ранее циркулировавшие вирусы обозначались как А0). Т.о. не только антигенный дрейф, но и генетическая реассортация может способствовать вариабельности вирусов гриппа А (Holmes E.C. et al., 2005; Lindstrom S. et al., 1998;

Shen J. et al., 2009).

Безусловно, реассортация является одним из наиболее важных механизмов изменчивости вирусов гриппа, однако существует достаточное количество данных, что вирусы гриппа А подвергаются различным формам негомологичной нуклеопротеина и полимеразными комплексами человеческих и свиных линий вируса гриппа А (Orlich M. et al., 1994; Boni M.F, 2008; Hao W, 2011). Возможность механизма рекомбинации в мутировании вирусов гриппа была отмечена и в других работах, а анализ структуры генов вирусов гриппа позволяет выявить характерные участки НА, NA и NS генов, которые можно отнести к потенциальным рекомбиногенным областям (Киселев О.И., 2005). Выявлен природный случай рекомбинации гена НА птиц (подтипа Н7) с клеточной 28рРНК, в результате чего сайт кливеджа увеличился на 30 АК, а вирус приобрел высокопатогенные свойства (He C.Q et al., 2009). Возможность такого типа рекомбинации была известна ранее, однако получение подобных штаммов было описано только в лабораторных условиях. Внутригенная рекомбинация, на фоне одновременной циркуляции, а, следовательно, и репликации, различных подтипов вируса гриппа А, может привести к значительному дрейфу или шифту вируса (Monto A.S., 2005; Worobey M., Holmes E.C., 1999).

Подводя итог, можно заключить, что для вирусов гриппа А характерны следующие механизмы изменчивости:

1. Антигенный шифт, в основе которого лежит реассортация генов поверхностных и внутренних белков, относящихся к различным подтипам вируса гриппа А, в том числе и к вирусам гриппа животных и птиц.

2. Антигенный дрейф, обусловленный точечными мутациями, короткими делециями и инсерциями, приводящий к аминокислотным изменениям белков вируса, а, следовательно, и к изменению атигенных свойств.

3. Реассортация генов поверхностных и внутренних белков, внутри одного подтипа вируса гриппа А, что приводит к ещё большему антигенному разнообразию штаммов, циркулирующих в один и тот же период времени.

4. Внутригенная и межвидовая рекомбинация, как механизм усиления патогенности и антигенной изменчивости.

1.2.1 Гипотезы о возникновении пандемических штаммов Анализ механизмов изменчивости вирусов гриппа позволил сформировать представления о возникновении новых пандемических вирусов и их распространении в человеческой популяции.

Предложено несколько концепций, рассматривающих механизмы возникновения новых пандемических вариантов. Каждая из них по-своему решает проблему происхождения пандемических вирусов. В основе многочисленных теорий о возникновения пандемических вариантов вируса гриппа лежат антропонозная и зоонозная гипотезы. Согласно антропонозной гипотезе, одним из способов сохранения вирусов гриппа А в человеческой популяции является его персистенция в организме людей (Смородинцев А.А., 1975, 1984; Смородинцев А.А. и др., 1979; Hope-Simpson R.E., Golubev D.A., 1987). Сторонники этой гипотезы предполагают, что после пандемий/эпидемий вирусы гриппа не исчезают из человеческой популяции вообще, а продолжают циркулировать среди людей как вирусная инфекция в хронической или латентной форме. Через многие месяцы и даже годы вирус способен реактивироваться. Некоторые исследователи полагают, что именно с этим феноменом связаны случаи выделения так называемых антигенных анахронизмов, т.е. вирусов гриппа с антигенной структурой прошлых (или последующих) пандемий. По-видимому, наличие латентной и персистентной инфекции может объяснить механизм антигенного шифта и повторные включения в циркуляцию основных подтипов вируса гриппа А (Hope-Simpson R.E., Golubev D.A., 1987). Другие факты, лежащие в основе антропонозной теории связаны с лабораторным надзором за гриппом и свидетельствуют о том, что после активной циркуляции вирусы гриппа А «человеческих» подтипов (H1N1, H2N2, H3N2) не покидают популяцию людей, а продолжают в ней оставаться, о чем свидетельствуют данные серологических исследований, случаи выделения нетипичных вирусов, а также наиболее яркий факт – возвращение на эпидемическую арену вируса А(H1N1) в 1977 г. Стоит отметить, что механизмы сохранения вирусов в человеческой популяции согласно данной теории предполагают «генетическую консервацию генофонда вирусов практически без мутаций» (Голубев Д.Б., Солоухин В.З., 1989).

Вторая принципиальная концепция происхождения пандемических штаммов – зоонозная. В основе этой концепции лежит идея о том, что пандемические штаммы вирусов гриппа А формируются за счет реассортации вирусов гриппа человека и вирусов гриппа животных. Такие принципиально новые варианты вируса попадают в человеческую популяцию, не имеющую значимого коллективного иммунитета к новому вирусу, и потому распространение пандемических штаммов происходит стремительно и вызывает резкий подъем заболеваемости. Хотя большинство из зарегистрированных пандемических вирусов были получены в результате реассортации вирусов гриппа человека и вирусов гриппа птиц, многие исследователи полагают, что такие вирусы в редких случаях способны эффективно инфицировать людей и устойчиво передаваться от человека к человеку (Kawaoka Y. et al., 1989). Для этого им необходима дополнительная адаптация, возможно, с использованием промежуточного хозяина.

В роли такого хозяина рассматривают свиней, поскольку эти животные чувствительны как к вирусам гриппа птиц, так и вирусам гриппа человека (Scholtissek C. et al., 1978). В этой связи возникла теория о том, что свиньи являются «смешивающим сосудом» для формирования новых шифтовых вариантов вирусов гриппа, поражающих людей, в том числе и пандемических (Brown I.H. et al., 1995;

Ludwig S. et al., 1995; Scholtissek C., 1990;1996). Была также показана возможность передачи не только птичьеподобных свиных вирусов людям, но и реассортантов, содержащих только тот или другой сегмент РНК современных свиных штаммов.

Такие реассортанты были изолированы от больных детей в Канаде, США и некоторых странах Европы (Chutinimitkul S. et al., 2008; Scholtissek C., 1996).

Обобщением зоонозной теории может служить рисунок 1.3, на котором приведены три возможных сценария формирования пандемических вирусов согласно зоонозной теории. Наиболее вероятным Рисунок 1.3. Механизмы формирования пандемических вирусов гриппа А согласно зоонозной концепции (по Haaheim L.R., Oxford J.S., 2013).

представляется первый сценарий, когда вирусы гриппа птиц и человека коинфицируют свиней, в которых формируются реассортантные вирусы, способные инфицировать человека и эффективно передаваться в человеческой популяции.

Второй сценарий – это прямая передача вирусов гриппа птиц к человеку и последующее распространение такого вируса в человеческой популяции. Третий сценарий рассматривается как наиболее редкий, и предполагает одновременное инфицирование человека вирусами гриппа птиц и человека, что также может привести к формированию нового потенциально пандемического вируса.

Стоит отметить, что в последнее время, говоря о механизмах формирования пандемических вирусов гриппа, нет четко разделения на антропозную и зоонозную теории, а все больше принято говорить об антропозоонозной теории формирования пандемических штаммов.

1.2.2 Гипотезы «вымирания» пандемических штаммов Одним из «острых» аспектов антропозоонозной теории остается вопрос об исчезновении предыдущих вирусов гриппа, циркулировавших до прихода пандемических вирусов. Антропонозная теория предполагает сохранение вирусного генофонда за счет хронической формы инфекции, однако уточняет, что вирус сохраняется практически в неизменной форме. В последнее время появилась другая гипотеза о возможных причинах «вымирания» вирусных подтипов (Palese P., Wang T.T., 2011). Авторы этой гипотезы предполагают, что вытеснение предыдущих подтипов вирусов гриппа происходит за счет формирования антител, направленных на стеблевой участок молекулы НА, а также за счет антинейраминидазных антител. Суть гипотезы такова. Несмотря на то, что существует значительное разнообразие подтипов молекул НА в целом, нужно учитывать, что большинство антигенных детерминант, определяющих эту вариабельность, расположены в головке НА. При этом стеблевой участок молекулы НА гораздо более консервативен, и филогенетически, все стебельковые участки молекул НА разных подтипов относятся лишь к двум группам – группе (куда попадают НА подтипов H1, H2, H5 и др.) и группе 2 (НА подтипов Н3, Н6 и др.). Известно, что антитела, формируемые к стебельковому участку НА образуются в меньшем количестве, однако они обладают противовирусной активностью, что показано на животных моделях. Поскольку эти антитела формируются к доменам, обладающим высокой степенью консервативности, они могут быть кросс-реактивными к НА разных подтипов. Так, при пандемии 1957 г.

вирус А(H2N2) вытеснил ранее циркулировавший А(H1N1) за счет кросснейтрализующих антител, присутствовавших у большинства взрослого населения, направленных к стебельковому участку молекулы НА, поскольку НА подтипов Н и Н2 относятся к одной и той же группе. Этого не произошло при последующей пандемии 1968 г, т.к. пришедший вирус принадлежал к другой группе, однако в данном случае, как полагают авторы, решающую роль сыграли антинейраминидазные антитела, т.к. нейраминидаза пандемического вируса г. не изменилась по сравнению со штаммом 1957 г. Возвращение вируса А(H1N1) в 1977 г. не привело к вытеснению предыдущего штамма, т.к. в этот раз НА опять был из группы, отличной по стебельковому участку от ранее циркулировавшего штамма, да и нейраминидаза была изменена. По-видимому, большая часть населения не имела антител к вирусам А(H1N1), и потому оба подтипа закрепились в популяции. В случае с вирусом пандемического гриппа А(H1N1)pdm09 и НА, и NA имели ту же антигенную формулу, что и циркулировавший вирус сезонного гриппа А(H1N1). В этой связи авторы предполагают, что антитела, направленные как на стеблевой участок НА, так и на NA вирусов сезонного гриппа А(H1N1) привели к быстрой элиминации этого возбудителя из популяции, как менее приспособленного по сравнению с пандемическим вирусом. Дальнейшее подтверждение своей гипотезы авторы опубликовали в более поздней работе по роли анти-стебельковых нейтрализующих антител в иммунном ответе у животных (Pica N. et al, 2012).

Обзор механизмов изменчивости вирусов гриппа и анализ возможных механизмов формирования пандемических штаммов, также, как и вытеснения отдельных подтипов сезонного гриппа, свидетельствуют о том, что несмотря на большой объем накопленных знаний по эпидемиологии, вирусологии и лабораторной диагностике вирусов гриппа А, на сегодняшний день нет четких механизмов предсказания возможных путей эволюции этого вируса с тем, чтобы определить время и характер будущих пандемических угроз. В этой связи вопросы надзора за изменчивостью вируса гриппа типа А как у людей, так и у животных попрежнему не теряют своей актуальности. Для того, чтобы повысить уровень готовности к новым угрозам, связанным с пандемическим гриппом, Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) в 2005 инициировала разработку планов пандемической готовности, которые были составлены многими государствами по всему миру. Разработка этого плана была основана на том, что пандемия гриппа развивается поэтапно, и период ее развития можно описать 6-ю фазами развития пандемии. Однако события последних лет показали, что возникновение и развитие пандемии происходит столь неожиданно и стремительно, что их можно описать предпандемической, пандемической, пост-пандемической и межпандемической.

Пандемический грипп А(H1N1)pdm 1.3.1 Краткий обзор событий пандемии 2009-2010 г в мире и в РФ В период с 2006 по 2009 год шла интенсивная работа по подготовке к предстоящей пандемии. Это было связано с несколькими событиями. Во-первых, отсутствие пандемических событий с 1977 г говорило о том, что прошел 40-летний период, в течение которого не было зарегистрировано ни одной пандемии.

Учитывая цикличный характер гриппозных пандемий было очевидно, что появление подобного штамма должно состояться. Среди возможных кандидатов на роль пандемического вируса бесспорное лидерство принадлежало вирусам гриппа А(H5N1), поскольку еще в 1997 г. была зарегистрирована первая вспышка заболеваемости людей данным вирусом птичьего гриппа, а с 2004 регулярно наблюдались случаи инфицирования. Высокий уровень летальности от птичьего гриппа и тяжелейшее течение заболевания у пациентов вызывали опасения о грядущей пандемии невероятной тяжести. В этой связи ВОЗ инициировала программу подготовки к грядущей пандемии с разработкой национальных планов пандемической готовности. Несмотря на то, что этиологическим агентом пандемии стал вирус A(H1N1)pdm09, разработанные стратегии готовности к пандемии во многом предопределили согласованные действия стран и международных организаций, направленные на снижение ущерба и тяжести пандемии. Возможно, именно поэтому первая пандемия 21 века оказалась сравнительно «легкой» по сравнению со всеми предыдущими пандемическими событиями. Вместе с тем, это и наиболее изученная пандемия, позволяющая оценить проведенные мероприятия и оптимизировать планы пандемической готовности на будущее.

В начале 2009 г. в Мексике наблюдались небольшие вспышки заболевания, вызванные вирусом гриппа неизвестной природы. В середине марта уровень заболеваемости возрос, вместе в ним отмечалось и необычно высокое число случаев тяжелых гриппоподобных заболеваний (ГПЗ) среди молодых прежде здоровых людей. Образцы от больных были отправлены в референс лаборатории в Атланту, США (CDC) и Канаду. В середине апреля в США были диагностированы 2 случая инфицирования детей в Калифорнии и Техасе новым вирусом гриппа свиней, генетический состав которого ранее не встречался среди вирусов, выделяемых от людей. К концу апреля вспышка ГПЗ, вызванная нетипируемым вирусом гриппа А была зарегистрирована на юге США в штатах, граничащих с Мексикой и впоследствии было установлено, что все случаи инфицирования в Мексике и США вызваны вирусом A(H1N1), ранее не встречавшимся у людей.

Вирус был назван «свиным гриппом», и впоследствии обозначен как A(H1N1)pdm09. Название «свиной» связано с тем, что отдельные комбинации геномных сегментов нового вируса обнаруживалась у вирусов гриппа свиней североамериканской и евроазиатской линий. Эталонными штаммами нового вируса стали штаммы А/Калифорния/04/09 и А/Калифорния/07/09 (WHO, 2009a).

Поскольку случаи ГПЗ в Мексике и США были вызваны одним и тем же новым этиологическим агентом стало очевидно, что новый вирус уже распространяется среди людей, и 25 апреля 2009 г. ВОЗ объявила угрозу общественному здоровью международного значения, связанную с распространением A(H1N1)pdm09 (WHO, 2009a). Спустя 4 дня стало ясно, что новый вирус обнаружен и в странах Европы (Великобритания, Испания), а также Канады и Новой Зеландии, в связи с чем фаза пандемической опасности была повышена до 5 уровня. В конце мая стало очевидным глобальное распространение A(H1N1)pdm09 в мире, т.к. случаи его обнаружения подтвердились в Южной и Северной Америках, Европе, Среднем Востоке, Азии и Австралии. 6 июня 2009 г новый вирус A(H1N1)pdm09 был детектирован в 214 старанх на всех континентах и была зарегистрирована его передача более чем в одном из регионов ВОЗ. Это событие явилось последним критерием для перехода их 5-ой фазы пандемической опасности в 6-ую фазу и 11 июня 2009 председатель ВОЗ Маргарет Чан объявила первую в 21 веку пандемию гриппа (WHO, 2009b).

Дальнейшее развитие пандемических событий по миру было неодинаковым.

Во многих странах северного полушария наблюдалась одна волна пандемического гриппа и подъем заболеваемости часто был связан с началом учебного сезона.

Однако в некоторых странах Европы были зарегистрированы две отчетливые волны пандемии в 2009 г, особенно ярко отмеченные для Великобритании, где рост заболеваемости в весенние месяцы сменился резким спадом в связи с началом летних каникул, однако с началом учебного года отмечался резкий подъем заболеваемости и интенсивность второй волны была намного выше первой (см.

рис. 1.4). Подобная же ситуация наблюдалась в странах Северной Америки (США, Канада) (Mytton O.T. et al., 2012).

Рисунок 1.4. Пандемические волны (первая и вторая) в Великобритании в период 2009гг. (по работе Mytton O.T. et al., 2012).

В странах южного полушария развитие пандемии пришлось на середину эпидемического сезона по гриппу (июнь в южном полушарии приходится на зимний сезон). При этом, в Австралии наблюдалось одна волна пандемии, которая развивалась во временном промежутке, характерном для эпидемических сезонов по гриппу (май-сентябрь, с пиком заболеваемости в июле-августе). В Южной Африке наблюдалась другая картина: в начале пандемии в стране регистрировалась эпидемия гриппа, вызванная вирусами А(H3N2), которая впоследствии сменилась волной пандемического гриппа. В странах Южной Америки (например, Аргентине и Чили) также наблюдалась лишь одна волна пандемии в середине 2009 г, как в Австралии и Новой Зеландии, в то время как в Африке, особенно в западной части континента, была отмечена единственная волна пандемического гриппа в середине 2010 г (McMenamin J., Van-Tam J., 2013).

В России с апреля 2009 г. был усилен эпидемиологический надзор за циркуляцией вирусов гриппа. Первый лабораторно подтвержденный случай инфицирования вирусом гриппа A(H1N1)pdm09 был зарегистрирован 21 мая г. в Москве, затем отдельные случаи заболевания были зарегистрированы в СанктПетербурге и на Дальнем Востоке, однако все эти единичные случаи были завозными. По данным ЦЭЭГ НИИВ в начальном предпандемическом периоде с 11 июня по 15 августа 2009 г было выявлено 73 пациента с инфекцией, вызванной A(H1N1)pdm09 у прибывающих из-за рубежа (Львов Д.К. и др., 2009). Однако учесть все случаи инфицирования было невозможно. Очевидно, что именно в этот период началось широкое распространение пандемического вируса в нашей стране.

С 15 августа 2009 г. начался период развития пандемии, в течение которого наблюдался рост числа регистрируемых случаев инфекции A(H1N1)pdm09.

Нарастание эпидемических событий, связанных с новым возбудителем стало очевидным в сентябре 2009 г. в Дальневосточном регионе (Южно-Сахалинск, Хабаровск), хотя первые заносы пандемического гриппа на Дальний Восток произошли на 2-2,5 месяца позже Европейской части России, а затем и на западе страны в Калининграде (Щелканов М.Ю. и др., 2010; Львов Д.К. и др., 2010б). В течение октября - первых недель ноября эпидемия распространилась по всей территории России, а частота подтверждённых случаев пандемического гриппа методом ПЦР на пике эпидемии в Москве и Санкт-Петербурге составляла 49%. К декабрю 2009 г. по данным московского ФЦГ и сотрудничающих с ним территорий было выделено 202 штамма пандемического гриппа, при этом число установленных случаев инфицирования составило 3053 (Львов Д.К. и др., 2010б).

В ФЦГ при НИИ гриппа (Санкт-Петербург) было обследовано 1558 материалов от 905 больных и 308 секционных материалов от умерших, выделен 251 штамм пандемического гриппа. За указанный период с сентября по декабрь 2009 г. в обоих центрах по гриппу не было выделено штаммов вирусов гриппа, относящихся к других антигенным разновидностям, что свидетельствовало о моноэтиологическом характере пандемии 2009 г. С декабря 2009 г. отмечалось снижение уровня заболеваемости гриппом до сезонных уровней, а последующий подъем заболеваемости в начале 2010 г. был связан с возвращением в циркуляцию вирусов гриппа В (Киселев О.И. и др., 2011).

Официальное завершение пандемии было объявлено ВОЗ 10 августа 2010 г.

(WHO, 2010b). Однако очевидно, что вирус A(H1N1)pdm09, циркулировавший в пандемический сезон 2009-2010 гг., не сильно отличался от вируса A(H1N1)pdm09, выявляемого в эпидемическом сезоне 2010-2011 гг., и в этой связи многие страны северного и южного полушария наблюдали вторую (и даже третью) волну пандемического гриппа, порой не уступавшую по интенсивности первой волне в год пандемии.

Еще в начале развития пандемии 2009 г. стало ясно, что лица, родившиеся до 1950 г. обладают популяционным иммунитетом к вновь появившемуся вирусу A(H1N1)pdm09 (Lemaitre M., Carrat F., 2010). Наиболее уязвимыми к новому возбудителю оказалась дети и подростки (0-4 и 5-14 лет), а наименее подверженными заболеванию лица старше 65 лет, однако и в группе 45-64 лет уровень заболеваемости был намного ниже, чем среди лиц молодого возраста (Riley S. et al., 2011). В группе повышенного риска оказались не только лица с хроническими заболеваниями дыхательной, эндокринной и других систем, а также иммуносупрессивными заболеваниями, но и лица, страдающие ожирением, что было впервые отмечено за всю историю наблюдения гриппозных пандемий.

Особую группу риска составили беременные женщины. Случаи заболевания среди беременных не были чаще, однако вероятность госпитализации беременных и тяжелого течения болезни был в пять-семь раз выше, чем среди других женщин тех же возрастных категорий (Myles P.R. et al., 2012).

1.3.2 Биологические свойства вирусов гриппа А(H1N1)pdm Появление нового вируса подтипа H1N1 реассортантной природы ставило вопрос о биологических свойствах этого возбудителя. В этой связи в начальный период пандемии был проведен ряд исследований для сравнительной оценки биологических характеристик вирусов гриппа А(H1N1)pdm09 с сезонными вирусами гриппа А(H1N1) и другими вирусами гриппа человека, а также вирусами гриппа свиней и птиц.

Поскольку пандемические потенции штамма определяют три основных свойства – новизна для иммунной системы, вирулентность и трансмиссивность – основные исследования по изучению биологических свойств вирусов гриппа А(H1N1)pdm09 были направлены на изучение этих свойств.

Эпидемиологические данные позволили определить, что пожилые люди старше 60 лет, обычно представляющие основную группу риска при гриппе, поражались новым вирусом достаточно редко, по сравнению с молодыми людьми.

Этот феномен был связан с антигенным родством нового вируса А(H1N1)pdm09 с вирусами 1950-хх гг. циркуляции, в связи с чем у людей старше 60 лет сохранились антитела, способные нейтрализовать вирус пандемического гриппа 2009 г.

(Lemaitre M., Carrat F., 2010; Viboud et al., 2010). Еще до объявления пандемии было установлено, что вирус А(H1N1)pdm09 обладает принципиальными антигенными отличиями от вирусов сезонного гриппа А(H1N1), и что вакцинация не способна обеспечить защиту против нового вирусного агента (Garten R. et al., 2009).

Для изучения трансмиссивности нового вируса были предприняты серии исследований, включающих изучение рецепторной специфичности вирусов А(H1N1)pdm09, способность к репликации на различных клеточных линиях, как первичных, так и перевиваемых, а также на эксплантах респираторных тканей, и опыты по трансмиссивности пандемического гриппа на животных.

Рецептор-связывающий сайт НА вирусов А(H1N1)pdm09 находится на дистальном конце каждого мономера и, как и у других вирусов гриппа, представлен тремя структурными элементами: 190 спиралью (АК 184-191), 220 петлей (АК 218и 130 петлей (АК 131-135), а также включает консервативные аминокислотные остатки Y91, W150, H180 и Y192 в основании рецепторсвязывающего кармана (см. рис. 1.5).

Рисунок 1.5. Структура рецептор-связывающего сайта вирусов гриппа A(H1N1)pdm09.

Представлены основные структурные элементы: 190 спираль (желтая), 130 петля (синяя), петля (зеленая). По материалам статьи (Yang H. et al., 2010).

Данные по типу предпочтительного связывания рецепторов для вирусов пандемического гриппа 2009 г. несколько разняться. Так, ранние исследования, выполненные на вирусах А/Калифорния/04/2009 и А/Гамбург/5/2009 (Childs R.A et al., 2009) выявили двойную рецепторную специфичность, как к сиаловым кислотам с -2,3 галактозной связью, так и с -2,6. Однако данные для австралийского штамма А/Дарвин/2001/2009 и других вирусов пандемического гриппа с использованием олигосахаридного микрочипа однозначно указывают на предпочтительное связывание только рецепторных аналогов с -2,6 типом связей, и отсутствие взаимодействия с -2,3 (Yang H. et al., 2010). Этот профиль сравним с вирусом сезонного гриппа А/Брисбен/59/07.

респираторных эксплантах свиней (Van Poucke S.G.M. et al., 2010). Авторы разработали методику получения эксплантов из носовых ходов, трахеи, бронхов и использованием растительных лектинов, а также провели сравнительное изучение репликации вирусов гриппа свиней, птиц и человека. В результате было установлено, что сиаловые рецепторы -2,6 типа встречались во всех протестированных эксплантах, в то время как -2,3 тип был обнаружен только в бронхах и легких. Эти результаты отличались от полученных в классических работах Ито и Сузуки с соавторами (Ito T. et al., 1997; Suzuki Y. et al., 2000), однако авторы использовали более современные и чувствительные методы анализа, чем возможно и объясняется несколько различный спектр полученных данных. Из этой распространение сиаловых рецепторов -2,3 и -2,6 типов в респираторном тракте свиньи полностью соответствует таковому у человека. Во-вторых, авторы доказали, что вирусы гриппа А(H1N1) и А(H3N2) человека, также, как и вирусы гриппа А(H1N1) свиней, эффективно реплицируются лишь в эксплантах, полученных из верхних дыхательных путей свиней, в то время как вирусы гриппа птиц подтипа А(H5N1) реплицировались преимущественно только в эксплантах, выделенных из нижних дыхательных путей. Таким образом было четко показано, что тканевой тропизм вирусов гриппа А различных подтипов определяется типом сиаловых кислот, присутствующих на клетках соответствующих отделов респираторного тракта.

В этой связи представляют интерес исследования, проведенные китайскими учеными на перевиваемых культурах клеток (Li I.W.S. et al., 2009). Они сравнили эффективность репликации вирусов гриппа А(H1N1)pdm09 с вирусами сезонного гриппа А(H1N1) и вирусами гриппа птиц A(H5N1) с использованием 13 клеточных линий человека и 4 линий животного происхождения. Репродукцию вируса учитывали по цитопатическому действию (ЦПД), иммунофлуоресценции (ИФ) и количественной ПЦР в реальном времени. В результате было установлено, что вирусы гриппа птиц инфицировали весь спектр протестированных линий, что было подтверждено результатами ИФ и высокой вирусной нагрузкой (108 копий РНК/мл). При этом, ЦПД наблюдали во всех линиях животного происхождения, но только в 8 из 13 линий человеческого происхождения, что говорит о том, что некоторые клеточные линии способны поддерживать вирусную репликацию без видимых признаков деградации. Репликация вирусов гриппа А(H1N1)pdm09 была сравнима с вирусами сезонного гриппа А(H1N1), как по индукции ЦПД, так и по данным ИФ. В большинстве случаев, она была низкой. Лишь одна культура клеток – CaCo-2 (клетки эпителия кишечника человека) – поддерживала репродукцию вирусов гриппа А(H1N1)pdm09 и А(H1N1) на уровне, сравнимом с вирусами гриппа А(H5N1). Данные о высокой пермиссивности линии CaCo-2 к различным вирусам гриппа птиц, свиней и человека подтверждены и в работах других исследователей (Жирнов О.П., Кленк Х., 2003, Chiapponi C. et al., 2010, Jahangir A.

et al., 2010). Авторы также подчеркивают, что культура клеток почечного эпителия свиней РК-15 была нечувствительной к вирусам гриппа свиней, что, как они считают, свидетельствует о том, что вирусы А(H1N1)pdm09 более адаптированы к размножению в человеке, чем в свиньях.

Изучение патогенетического действия вируса пандемического гриппа в культурах клеток человека CaCo-2 и Calu-3 (культура дифференцированного эпителия бронхов) показало, что в обеих линиях происходит внутриклеточный протеолиз НА0 на НА1 и НА2, т.е. для созревания вирусного НА не требуется добавление эндогенного трипсина, как это необходимо при работе на клетках MDCК (Жирнов О.П. и др., 2013). Более того, авторы установили, что эти клеточные культуры способны длительное время поддерживать вирусную репликацию в связи со слабой индукцией апоптоза и аутофагии в данных линиях, что позволяет рекомендовать эти линии для выделения вирусов гриппа из проб от людей. Отметим, однако, что более ранние работы авторов указывали на отсутствие апоптотической гибели клеток СаСо-2, приводя убедительные доказательства индукции некротического пути гибели данной клеточной линии при инфицировании раличными вирусами гриппа (Zhirnov O.P., Klenk H.D., 2003).

Индукция апоптоза в клетках, инфицированных вирусом гриппа, была описана в 1994 г. Хиншоу с соавторами (Hinshaw V. et al., 1994). Считается, что апоптоз – это основной механизм гибели клеток, инфицированных вирусами гриппа различного происхождения. Интенсивность индукции апоптоза зависит от многих факторов и также является биологической характеристикой вируса. Вирус гриппа способен индуцировать апоптоз как в пермиссивных клетках (МDСК), так и в непермиссивных (НеLa, Raji, SMMC-7721, SPC-A-1) клеточных линиях (Li H.

et al., 2003).

В 1997 году была опубликована работа Прайса с соавторами (Price G.E. et al., 1997), в которой они впервые показали, что вирусы гриппа А различных подтипов индуцируют апоптоз с разной интенсивностью. В качестве модельных вирусов были выбраны два штамма: вирус A/Фиджи/15899/83 (H1N1) и реассортантный вирус 7а (гены M и РВ2 от вируса А/Пуэрто-Рико/8/34, остальные от А/Англия/939/69 (H3N2)). При одинаковой интенсивности репродукции вирусов на клеточных культурах MDCK и U-937, вирусы индуцировали различную цитотоксичность и апоптоз: вирус подтипа А(H3N2) (7а) индуцировал апоптоз уже через 12 часов после инфицирования; через 48 часов количество клеток, погибших в результате апоптоза для клона 7а составляло 40%, тогда как для вируса A/Фиджи/15899/83 (H1N1) только 10%. Было также доказано, что для индукции апоптоза необходима вирусная репликация, поскольку УФ-инактивированные штаммы не вызывали апоптоз.

Эта же исследовательская группа позднее установила, что вирусная нейраминидаза также принимает участие в индукции апоптоза (Morris S.J. et al., 1999). Используя те же штаммы вирусов гриппа, они показали, что частичный блок индукции апоптоза происходит при добавлении в среду соединений, блокирующих нейраминидазную активность на стадии входа вируса в клетку или раньше. При этом при использовании фетуина в качестве субстрата было установлено, что NA подтипа N2 обладает большей активностью по сравнению с NA подтипа N1.

Активные центры обоих ферментов идентичны по аминокислотной последовательности, что указывает на то, что различия в специфичности и активности NA определяют и другие аминокислотные остатки, входящие в состав фермента. Однако роль нейраминидазы в индукции апоптоза, по-видимому, невелика и реализуется на начальной стадии входа вируса в клетку. Вирусы, обработанные UV, теряют способность к репликации, однако сохраняют NA активность более чем на 75%. При этом способность таких инактивированных штаммов вызывать апоптоз очень невелика.

При сравнении выборки из пяти штаммов А(H3N2) и двух штаммов А(H1N1):

штамма, выделенного от человека, а также вируса свиней подтипа А(H1N1) - было установлено, что вирусы подтипа А(H3N2) индуцируют высокий уровень апоптоза и вирусной инфекции, в то время как вирусы подтипа А(H1N1), как выделенные от людей, так и от свиней, обладают более низкой инфекционностью и являются слабыми индукторами апоптоза (Mohsin M.A. et al., 2002). Это объясняется более слабой степенью связывания вирусов А(H1N1) с клеточными рецепторами, различием в гликозилировании НА, особенно в районе рецептор-связывающего сайта, и низкой активностью NA подтипа N1.

Анализ серии генетически измененных вирусов с одиночными или тройными заменами сегментов, полученных на основе вирусов 7а и А/Фиджи/15899/83, кодирующих гены HA, NA, M, PA, PB1, PB2, NP, NS не позволил установить влияние какого-то конкретного сегмента или их комбинаций на индукцию апоптоза (Morris S.J. et al., 2005). Это говорит о том, что предсказать интенсивность вызываемого апоптоза для рекомбинантного вируса невозможно, поскольку на уровень его индукции оказывают влияние как ген, который был интродуцирован, так и генетический фон исходных генов, а также их взаимодействие. Исходя из этих данных, авторы делают вывод о невозможности предсказать степень вирулентности новых штаммов, возникающих в природе.

Работы in vitro по сравнению индукции апоптоза у вирусов сезонного гриппа A(H1N1) и вирусов пандемического гриппа 2009 г. немногочисленны и показывают, что в вирусы А(H1N1)pdm09 способны вызывать апоптоз с большей интенсивностью, чем вирусы сезонного гриппа A(H1N1) (Yang N. et al., 2011;

Gerlach R.L. et al, 2013). Однако сравнительных исследований с широким спектром вирусов гриппа человека и животных не опубликовано.

Интенсивность индукции апоптоза определяется не только поверхностными белками вируса гриппа, но и многими внутренними белками вируса. Среди них ведущая роль принадлежит белку NS1 (Schultz-Cherry S. et al., 2001; Ehrhardt, C. et al., 2007). В экспериментах Жирнова с соавторами (Zhirnov O.P. et al., 2002) рекомбинантный вирус гриппа, лишенный NS гена, индуцировал более мощный апоптоз по сравнению со штаммом дикого типа. Это объясняется индукцией апоптоза интерфероном, синтез которого не подавлялся белком NS1, что, как отмечают авторы, свидетельствует об антиапоптозной роли NS1. Сейчас установлена многофакторная роль NS1: с одной стороны, он блокирует развитие апоптоза в клетке на ранних стадиях репликации, а с другой стороны активирует апоптоз на поздних стадиях жизненного цикла, что может способствовать дальнейшему распространению вируса в соседние клетки (Ludwig S. et al., 2006).

Важнейшая роль в индукции апоптоза также отводится белку PB1-f2, описанному в 2001 г. (Chen W. et al., 2001). Этот небольшой по размерам белок PB1-F2 – 87 аминокислот – содержит последовательность митохондриальной локализации (Gibbs J.S. et al., 2003) и взаимодействует с белками ANT (транслокатор адениновых нуклеотидов) на внутренней мембране митохондрий и с ионным каналом VDAC1 (voltage-dependent anion channel) на внешней митохондриальной мембране, которые вовлечены в изменение проницаемости митохондриальной мембраны в процессе апоптоза (Zamarin D. et al., 2005).

Установлено, что добавление синтетического PB1-F2 к клеткам приводит к запуску апоптоза, а штаммы, неспособные к экспрессии PB1-F2 индуцируют более слабый апоптоз в человеческих моноцитах, чем штаммы дикого типа (Chen W. et al., 2001).

Однако последующие исследования позволили установить, что PB1-F2 варьирует по длине, экспрессируется лишь у некоторых штаммов вирусов гриппа и локализуется не только в митохондриальной мембране, но также в ядре инфицированных клеток (Chen C.J. et al., 2010). Ряд исследователей указывает на то, что эффекты PB1-F2 штаммоспецифичны и очень сильно зависят от конкретных условий проведения эксперимента (клеточной линии, вирусного штамма), а фосфорилирование PB1-F2 и его роль в работе полимеразного комплекса не влияют на патогенез (McAuley J.L. et al., 2010).

культурах клеток различного происхождения, и изучение их способности индуцировать апоптоз различной интенсивности позволяет сделать выводы о возможной вирулентности/патогенности вирусов данного подтипа. Так, на основании опытов, проведенных in vitro, можно заключить, что вирусы пандемического гриппа 2009 г., также, как и вирусы сезонного гриппа, обладают выраженной рецепторной специфичностью в отношении сиаловых кислот с -2, типом связи, и, соответственно, эффективно прикрепляются к клеткам-мишеням расположенным в верхних дыхательных путях. Для репликации в нижних отделах респираторного тракта необходимы изменения в рецептор-связывающем сайте молекулы НА. Поскольку эти вирусы несут нейраминидазу подтипа N1 они индуцируют апоптоз невысокой интенсивности, и потому их репликация во многих клеточных линиях не может быть детектирована за счет ЦПД. Все биологические свойства вирусов A(H1N1)pdm09, протестированные in vitro, указывают на то, что это низкопатогенные вирусы, близкие по характеристикам к штаммам сезонного гриппа A(H1N1).

Для изучения трансмиссивности и вирулентности вирусов гриппа A(H1N1)pdm09 были проведены многочисленные опыты на животных. При изучении трансмиссивности вирусов гриппа A(H1N1)pdm09 в сравнении с вирусами гриппа A(H5N1) на модели морских свинок было показано, что эффективность передачи вирусов гриппа птиц намного превосходит таковую для вирусов пандемического гриппа 2009 г. (Дубровина И.А., 2013). При изучении трансмиссивности вирусов A(H1N1)pdm09 в сравнении с вирусами сезонного гриппа A(H1N1) на модели хорьков разные группы исследователей получили различающиеся результаты. Так, группа под руководством Майнса установила, что вирусы пандемического гриппа 2009 г. обладали более низкой трансмиссивностью по сравнению с вирусами A(H1N1) (Maines et al., 2009). Противоположные результаты были получены другим коллективом авторов, которые постулировали более высокую трансмиссивность вирусов пандемического гриппа 2009 г. по сравнению со штаммами сезонного гриппа (Perez et al., 2009). При этом в опытах голландских исследователей трансмиссивность вирусов A(H1N1)pdm09 и A(H1N1) оказалась равной (Munster V. et al., 2009). Стоит отметить, что клинические исследовательскими группами, носили схожий характер. Так, еще в начале пандемии было установлено, что вирусы A(H1N1)pdm09 способны эффективно вызывать инфекцию у мышей без предварительной адаптации. При этом, течение инфекции у мышей было схожим для обоих подтипов вирусов, и характеризовалось легким или средним течением болезни (Belser J. et al., 2009; 2011; Bouvier N.M., Lowen A.C., 2010). Другая картина наблюдалась при инфицировании хорьков. У хорьков, зараженных вирусами сезонного гриппа A(H1N1) наблюдалось легкое течение болезни, вирус регистрировался в носовых пазухах и в верхних отделах респираторного тракта. Репликации вируса в нижних отделах респираторного тракта не выявлялось (Maines T. et al., 2009; Guarner J., Falcon-Escobedo R. 2009). В противоположность этому вирусы пандемического гриппа A(H1N1)pdm приводили к развитию выраженных клинических симптомов болезни у хорьков, вирусные антигены определялись как в верхних, так и нижних отделах респираторного тракта. Репликация вирусов A(H1N1)pdm09 у инфицированных хорьков была отмечена в легких в высоких титрах, а выделение вируса было успешным как из верхних, так и из нижних отделов респираторного тракта, а также из образцов кишечного эпителия (Maines T. et al., 2009; Kwon D. et al., 2010). Мыши и хорьки также послужили моделью для доказательства того, что вирусы гриппа, как пандемического, так и сезонного, могут попадать в организм не только через микрокапли во вдыхаемом воздухе, но и через слизистую оболочку глаз, содержащую сиаловые рецепторы, схожие с таковыми в респираторном тракте (Belser J. et al., 2009; Belser J. et al., 2013). При этом, инфекционная доза, необходимая для инфицирования восприимчивых животных через окулярный путь была даже ниже, чем доза, необходимая для развития болезни при передачи классическим воздушно-капельным путем. Еще одной моделью для изучения патогенности вирусов гриппа А(H1N1)pdm09 послужили домашние птицы цыплята и утки, которых инфицировали вирусами гриппа А(H1N1)pdm09 и вирусами гриппа A(H1N1) 1918 г. Ни в одном из случаев клинической картины заболевания не наблюдалось, а в случае с вирусом А(H1N1)pdm09 вирус не определялся методом ПЦР ни в слизистых секретах, ни в тканях зараженных птиц.

Более того, 28 дней спустя после инфекции было установлено, что сероконверсия у инфицированных птиц происходила только в ответ на вирус 1918 г. и не наблюдалась ни у одной особи, инфицированной гриппом А(H1N1)pdm09, что позволяет сделать вывод о крайне низком инфекционном потенциале этих вирусов для птиц (Babiuk S. et al., 2010).

Еще одна интересная работа по сравнению биологических свойств вирусов гриппа А(H1N1)pdm09 с возбудителями прошлых пандемий принадлежит отечественным авторам (Kiseleva I. et al., 2009) и рассматривает вопросы температурной чувствительности вирусов, устойчивость к нейтрализующим свойствам сывороточных гамма-ингибиторов и способность агглютинировать эритроциты разных млекопитающих и птиц. Вирусы прошлых пандемий (А/Сингапур/1/57 (H2N2) и А/Гонконг/1/68 (H3N2)), а также возбудители крупных эпидемий, демонстрируют выраженную способность к репликации при повышенных температурах (non-ts), устойчивость к сывороточным ингибиторам и неспособность репродуцироваться при пониженных температурах. При изучении свойств вируса А/Калифорния/07/09 было установлено, что, как и эталонные штаммы прошлых пандемий, он обладает всеми характерными свойствами:

отсутствием температурочувствительности, устойчивстью к сывороточным ингибиторам и нехолодоадаптированным фенотипом. В реакции гемагглютинации было выявлено, штамм А/Калифорния/07/09 агглютинирует эритроциты цыплят, морской свинки и человека с одинаковой эффективностью. Авторы подчеркивают, что появление антигенно новых штаммов сопровождается non-ts фенотипом, который постепенно, с течением времени сменяется ts-фенотипом, при этом вирусы сохраняют антигенное родство с «родительскими» штаммами, несущими non-ts фенотип. Антигенный дрейф приводит к накоплению мутаций и появлению новых антигенных вариантов, которые, как правило, опять несут non-ts фенотип.

Таким образом, отслеживая температурочувствительность природных изолятов вирусов гриппа можно прогнозировать появление новых антигенных вариантов в популяции.

1.3.3 Эволюция и механизмы изменчивости вирусов гриппа А(H1N1) и А(H1N1)pdm 1.3.3.1. Вирусы гриппа А(H1N1) 1918-2009 гг.

Несмотря на то, что первый вирус гриппа человека был выделен в 1933 г., на сегодняшний день мы имеем возможности проанализировать эволюционную изменчивость вирусов гриппа А(H1N1) почти за 100 лет его циркуляции в человеческой популяции. Это стало возможным благодаря уникальной работе, проведенной Д. Таубенбергером с коллегами по экстракции вирусной РНК из тканей легких от людей, погибших в результате пандемии 1918 г. и последующего секвенирования фрагментов генома вируса гриппа 1918 г. (Taubenberger J.K. et al., 2001; Taubenberger J.K. et al., 2006).

расшифровка последовательностей НА вирусов, выделенных от пяти человек.

Интересно, что несмотря на то, что эти люди погибли в разных частях света (в США и в Англии), и в разное время (с разницей в 6 месяцев), гомология последовательностей НА вирусов гриппа составила 99%. Наиболее интригующим вопросом было происхождение данного пандемического штамма. Ведь все остальные штаммы, вызывавшие пандемии, были реассортантными. Однако в случае вируса А(H1N1) 1918 г. происхождение пандемического штамма не столь очевидно.

Филогенетический анализ, проведенный Рейд с соавторами (Reid A.H. et al., 1999), четко указывает на то, что НА вирусов 1918 г. расположен в кластере НА подтипа Н1 вирусов гриппа млекопитающих, а не птиц, в то время как НА вирусов 1957 и 1968 гг. четко попадают в соответствующие подгруппы НА вирусов гриппа птиц Н2 и Н3 соответственно. Однако очень многие признаки указывают и на птичье происхождение НА вирусов 1918 г.: это и консервативные для птичьих НА сайты гликозилирования, и рецепторная специфичность, и анализ антигенных сайтов, подвергающихся селекции (Matrosovich M. et al., 1997; Brownlee G.G., Fodor E., 2001). Так, известно, что в НА вирусов гриппа птиц содержится консервативных сайта гликозилирования, в то время как современные вирусы гриппа человека А(H1N1) содержат как минимум пять дополнительных к этим сайтов гликозилирования для маскировки антигенных эпитопов. В НА вирусов 1918 г. обнаружены только 4 консервативных «птичьих» сайта гликозилирования.

При сравнении аминокислотных последовательностей, был проведен анализ аминокислотных остатков, которые могут служить мишенью для иммунной системы и потому подвергаются селекции за счет антигенного дрейфа. 37 из таких аминокислот оказались схожими с позициями, обнаруживаемыми в НА вирусов гриппа птиц, что отчетливо указывает на отсутствие иммунологического пресса на НА вирусов гриппа до 1918 г. (Reid A.H. et al., 1999). Рецепторсвязывающий сайт в НА обладает типичной для птичьих вирусов -2, специфичностью, и отличается от консенсуса всего одной аминокислотной заменой E190D.

И несмотря на это, результаты Таубенбергера убедительно указывают на то, что этот вирус не попал в человеческую популяцию напрямую от птиц. Возможно, этот вирус циркулировал в каком-то промежуточном хозяине до того, как попасть в человеческую популяцию, и наиболее вероятным хозяином являются свиньи.

Существуют описания клинической картины гриппа у свиней в 1918 г. (Koen J.S., 1919), а также четкие указания на то, что до 1918 г. свиньи не болели инфекционным заболеванием с такой клинической картиной, что свидетельствует в пользу того, что в популяцию свиней вирус А(H1N1) попал именно в 1918 г.

(Shope R.E, 1936). Однако вирусы гриппа свиней редко выделяются от человека, что затрудняет предположение о прямом «переходе» вирусов гриппа от свиней к людям как возможном источнике пандемического вируса 1918 г. Более того, в г. в популяцию свиней в Европе впервые был интродуцирован вирус гриппа птиц подтипа H1N1, и сейчас есть уникальная возможность проследить эволюционную изменчивости вирусов данного подтипа у свиней. Все данные об анализе вирусов «птичьего» гриппа H1N1 в популяции свиней указывают на то, что он сохранил характерные черты своего происхождения несмотря на 20-летнюю эволюцию (Reid A.H., Taubenberger J.K., 2003). Так, уже в 1979 отличия H1N1 у птиц и у свиней составляли от 7 до 12 АК, три из которых располагались в антигенных сайтах.

Спустя 20 лет циркуляции, эти отличия составили 17 АК, пять из них зарегистрированы в антигенных сайтах. Филогенетически и вирусы гриппа птиц H1N1, и вирусы гриппа свиней «птичьего» подтипа расположены в одном и том же клайде, что четко указывает на то, что двадцатилетнего периода эволюции вирусов гриппа птиц подтипа H1N в свиньях недостаточно для значительной дивергенции вирусов свиней от предкового вируса птиц. А это означает, что свиньи не могли стать источником вируса пандемии 1918 г.

В поиске ответа на вопрос о загадочном происхождении пандемического штамма 1918 г. М. Воробей и его сотрудники (Worobey M. et al., 2014) применили особую разновидность филогенетического анализа с использованием метода «молекулярных часов», что позволило им выдвинуть принципиально новую гипотезу о происхождении штамма 1918 г., а также вирусов классического гриппа свиней, и вирусов сезонного гриппа H1N1 периода 1922 по 1957 г. Для обоснования своей гипотезы авторы использовали весь спектр ретроспективных данных о смертности в периоды с 1830 по 1970 гг., сероархеологические данные периода 1890-1980 гг., секвенированные последовательности для вирусов гриппа, начиная с 1917 г., содержание урацила в последовательностях, кодирующих сегменты вирусов гриппа птиц, свиней и человека, а также данные о заболеваемости свиней.

Принципиальное отличие их теории происхождения штамма 1918 г. от остальных, выдвинутых ранее, заключается в следующем. Анализ всех фактов привел исследователей к выводу, что вирус подтипа Н1 внедрился в человеческую популяцию в 1900 гг. До этого в 1890-1900 гг. циркулировал штамм подтипа H3N8, на что указывают многие данные сероархеологических исследований. Однако после 1900 гг. уровень антител к вирусам гриппа Н3 неуклонно снижался в популяции, в то время как в 1904 г. пиковый уровень антител был обнаружен к вирусам подтипа Н1. Авторы предполагают, что именно в этот момент произошла интродукция вирусов Н1 в популяцию, и возможно (учитывая сохранившиеся антитела к N8 в популяции) возбудитель имел антигенную формулу H1N8. Этот предпандемический штамм циркулировал вплоть до пандемии 1918 г., и за 15- лет циркуляции вирусов подтипа Н1 среди людей давление отбора привело к диверсификации вирусов данного подтипа и появлению антигенно-разнообразных вариантов подтипа H1. Анализ временного интервала происхождения остальных генов вирусов 1918 г. привел Воробея с коллегами к заключению о том, что все они имеют один и тот же срок возникновения в районе 1915-1916 гг. По-видимому, в период 1915-1917 г. произошла реассортация вирусов гриппа птиц (наиболее вероятно подтипа H7N1) с вирусами гриппа человека, несущими минорный вариант Н1 (и вероятнее всего N8). Возникший штамм H1N1 и стал причиной тяжелейших событий 1918-1920 гг. Такая хронология событий хорошо объясняет, почему НА 1918 попадает в один клайд с вирусами гриппа млекопитающих, хотя и сохраняет многие «птичьи» черты.

поступательной. Сомнений нет в том, что именно в 1918 г. штамм пандемического гриппа попал в популяцию свиней в Северной Америке, Европе и чуть позднее в Китае (Reid A.H., Taubenberger J.K., 2003). Здесь, этот вирус эволюционировал особым образом, сохраняясь в малоизменненном виде вплоть до 1930 гг., когда он был выделен Шоупом (Shope R., Lewis P., 1931). Впоследствии, именно эти вирусы и будут названы вирусами «классического гриппа» свиней, в противоположность вирусам свиней H1N1, попавшим в популяцию свиней от птиц в 1979 г. Однако как протекала эволюция вирусов гриппа H1N1 у людей в постпандемический период 1920-1940 гг.? Ранее считалось, что в постпандемический период наблюдался постепенный антигенный дрейф вирусов 1918 г, а эволюция вирусов данного подтипа была линейной вплоть до 1957 г. Но существуют серологические данные, которые противоречат этой теории. Аргумент следующий: если вирусы гриппа H1N1 циркулировали без перерывов, начиная с 1918 г. и их эволюция была постепенной, то как объяснить факт, что в 1935 г. Эндрюс отметил, что дети, рожденные после 1922 г. не имеют антител к вирусам гриппа свиней, но обладают нейтрализующими антителами к вирусам сезонного гриппа (штамм A/WS/33). В то же время Шоуп показал, что младенцы до 6 месяцев, несущие материнские антитела, и люди старше 20 лет (т.е. 1916 г.р. и старше) имеют в сыворотке антитела, нейтрализующие вирус гриппа свиней (Shope R., 1936). Объяснение этим фактам также следует из современных данных филогенетического анализа.

Поскольку вирусы Н1 до пандемии 1918г. уже обладали генетическим (а скорее всего, и антигенным) разнообразием, то, несмотря на пандемию 1918 г., эти минорные популяции Н1 в человеческой популяции сохранились. Современные данные указывают на то, что в постпандемический период 1920-1922 гг. наиболее вероятно произошло еще одно событие реассортации/рекомбинации по НА, между вирусом пандемического гриппа 1918 г. и одним из минорных вариантов ранних вирусов H1N8. Таким образом, в 1922 г. в человеческой популяции стали широко распространяться новые реассортантные вирусы H1N1, которые были выделены лишь в 1933 г., и антигенно они были отличны от вирусов гриппа свиней 1930 г. (и вирусов пандемического гриппа 1918 г.), т.к. они несли антигенно отличный НА.

Суммарно эта информация представлена на рисунке 1.6.

Генетический анализ всех восьми сегментов генома вирусов гриппа А(H1N1) в период с 1918 по 2006 г показал, что их паттерны эволюции сходны с течением времени, что позволяет сделать вывод о том, что за этот период времени эти вирусы не приобретали новых генетических сегментов от птиц или других источников. И хотя общая тенденция эволюции вирусов гриппа H1N1 после пандемии 1918 г.

(Morens D.M. et al., 2009) может быть описана как линейная, определяемая антигенным дрейфом, заметим, что на протяжении этого периода отмечены случаи внутритиповой реассортации среди вирусов, относящихся к различным антигенным и генетическим ветвям.

Рисунок 1.6. Происхождение вирусов 1918г, вирусов гриппа свиней и вирусов сезонного гриппа 1922-1957 г. Звездочкой отмечена реассортация «раннего» вируса H1N8 человека с вирусом пандемического гриппа 1918 г., что привело к возникновению линии постпандемических вирусов H1N1 (по работе Worobei M. et al., 2014).

Так, в 1947 г сезонная вакцинация против гриппа оказалась неэффективной, хотя вирусы, циркулировавшие в этом сезоне, по-прежнему относились к подтипу H1N1. Как будет установлено позднее, эпидемию 1947-1948 гг. вызвал реассортантный штамм H1N1, который имел измененный НА с заменами во всех пяти антигенных областях (Kilbourne E.D. et al., 2002). Эта реассортация была внутритиповой, т.е. произошла между штаммами H1N1 1943-1946 гг циркуляции и антигенно отличными от них вирусами H1N1 человека, циркулировавшими в популяции. При этом NA штамма 1947 осталась неизменной и была подобно таковой более ранних штаммов. Подобный же тип реассортации был зарегистрирован и для штаммов 1950-1951 гг. Заболеваемость в этот сезон в Великобритании и в Канаде превысила значения, зарегистрированные впоследствии для пандемий 1957 и 1968 гг (Viboud C. et al., 2006). Однако в вирусы подтипа H1N1 были вытеснены из циркуляции новым пандемическим штаммом H2N2, впоследствии вытесненным H3N2. Были ли эти вирусы вытеснены из человеческой популяции до конца или же сохранялись в ней на протяжении двадцатилетнего периода, не ясно до сих пор. В 1974 г. впервые был выделен вирус «классическому» гриппу свиней. А в 1976 г. в Форте Дикс произошла вспышка гриппоподобного заболевания, этиологическим агентом которого оказался вирус гриппа H1N1 свиного происхождения. Всего год спустя произошел «русский грипп», который ознаменовал возвращение в циркуляцию вирусов H1N1.

Антигенно вирусы 1977 года были близки с изолятами 1950 гг. (Zimmer S.M., Burke D.S., 2009). Эти данные косвенно свидетельствуют о том, что вирусы 1950х гг.

сохранялись в популяции на протяжении всего периода отсутствия активной циркуляции H1N1. Однако есть и противоположное мнение о том, что такое антигенное родство со «старыми» вирусами указывает на лабораторные источники возвращения H1N1 в циркуляцию (Kendal A.P. et al., 1978). В 1977 г. произошло и еще одно важное событие с точки зрения эпидемиологии и эволюции вирусов гриппа. Все предыдущие пандемии приводили к вытеснению штамма, предшествующего пандемическому из циркуляции. Однако с 1977 устойчиво наблюдается одновременная циркуляция вирусов гриппа А(H1N1) и А(H3N2).

Отметим, что в пандемический период 2009-2010 гг. отмечалась лишь циркуляция вирусов А(H1N1)pdm09, однако после окончания пандемии вирусы гриппа А(H3N2) вернулись в циркуляцию.

В 1976 г. импорт свиней из США в Италию привел к тому, что впервые на Европейский континент попал вирус «классического» гриппа свиней (Nardelli L. et al., 1978). Распространение данного вируса среди восприимчивых животных произошло молниеносно, а в 1979 г. в Европе был зарегистрирован новый подтип вирусов А(H1N1) у свиней, имеющих происхождение от диких уток. Этот новый штамм вытеснил вирус «классического гриппа» из циркуляции, что было отмечено не только в популяции европейских свиней, но также и в Китае (имеющем наибольшую популяцию свиней в мире). А в 1998 г. в США от свиней были впервые выделены тройные реассортанты, у которых 5 генов были сохранены от вируса «классического гриппа» свиней, а сегменты РА и РВ2 были родственны вирусам гриппа птиц, в то время как сегмент РВ1 вел свое присхождение от вирусов гриппа человека подтипа А(H3N2). Вскоре после этого момента были зарегистрированы первые заболевания людей такими тройными реассортантными штаммами свиней, которые регистрировались на территории Канады и США на протяжении 10-летнего периода с 1999 по 2009 г, однако они всегда носили спорадический характер и были связаны с тесным контактом заболевших со свиньями (Zimmer S.M., Burke D.S., 2009). Считается, что эволюция вирусов гриппа свиней идет медленнее, чем вирусов гриппа человека, и это подтверждают многочисленные факты. Но для тройных реассортантных штаммов, возникших в 1998 г. в США, это оказалось не так. Спустя всего 10 лет циркуляции они вновь подверглись реассортации, на этот раз с вирусами гриппа свиней евразийской линии А(H1N1), возникшей в 1979 г. Результатом этой реассортации стало появление нового тройного реассортанта, который в 2009 г. стал известен как вирус пандемического гриппа А(H1N1)pdm09.

Недавний углубленный филогенетический анализ вирусов гриппа А(H1N1), выделенных в период с 1918 по 2006, позволил выявить интересные особенности эволюции вирусов «сезонного» гриппа А(H1N1). Вирусы гриппа данного подтипа менее подвержены процессу антигенного дрейфа, а потому их эволюция, в отличие от вирусов гриппа А(H3N2), протекает медленнее и не сопровождается выраженными антигенными и генетическими отличиями, возникающими за короткий срок эпидемического сезона. Действительно, изменения в составе сезонных вакцин для вирусов гриппа А(H1N1) в период с 2000 по 2009 гг. были введены всего два раза (смена А/Новая Каледония/20/1999А/Соломоновы Острова/3/2006А/Брисбен/59/2007), в то время как для вирусов гриппа А(H3N2) эта смена произошла за указанный период 5 раз. Американские исследователи на большом фактическом материале установили, что помимо антигенного дрейфа, в изменчивости вирусов А(H1N1) значимую роль имеет внутритиповая реассортация, которая для разных сегментов генома выражена по-разному (Nelson M.I. et al., 2008). На рисунке 1.7 представлены суммарные данные, полученные для вирусов А(H1N1) 1918-2006 гг. выделения. Так, из рисунка следует, что вирусы 1947 г. произошли в результате реассортации вирусов 1943-1945 гг. (сегменты PB1, NA,M) и другой минорной группы вирусов, давшей сегменты PB2, PA,HA, NP, NS.

Подобная же ситуация отмечена и для вирусов 1951 г. Еще одно важное наблюдение можно сделать, проанализировав дину ветвей филогенетического дерева, соединяющих различные секции. Видно, что наиболее короткая ветвь соединяет секции IV (изоляты 1950-хх) и V (ранние изоляты 1977-1978). Это свидетельствует о самых незначительных изменениях данных вирусов за двадцатилетний период, что является еще одним подтверждением того, что штамм, вернувшийся в 1977 г., был лабораторным изолятом, а не природносохранившимся вирусом. В общем, можно отметить, что большинство клайдов (A,B,C,H,I,J) расположены на филогенетическом дереве на единственной ветви, а значит не являются реассортантными. В то же время клайды D,E,F, и G одновременно занимают различные ветви, что свидетельствует о реассортации.

Так, клайд D присутствует в секции II (для сегментов PB1, NA, Рисунок 1.7. Схематическая репрезентация филогенетических паттернов восьми сегментов генома вирусов гриппа А(H1N1), циркулировавших с 1918 по 2006 гг. Римскими числами отмечены секции вирусов, латинскми буквами – клайды. Внутри клайдов указаны соответствующие геномные сегменты, раскрашенные соответственно своему эволюционному паттерну: желтый – PB2 и НА; оранжевый – РВ1, NA, M; зеленый – NP и РА; фиолетовый – NS.

(по материалам статьи Nelson M.I. et al., 2008).

M) вместе с клайдами B и С, а в секции III (для сегментов PB2, PA, HA, NP, NS) формирует или отдельную секцию, или вместе к клайдом Е (сегменты PA, NP, NS).

Все это свидетельствует что, во-первых, в 1940-е гг. циркулировало как минимум 3 антигенно отличных ветви вирусов А(H1N1), а во-вторых, об активной реассортации вирусов из клайда D с вирусами из других клайдов, которые теперь уже не всегда можно установить. В целом, филогенетический анализ полногеномно-секвенированных изолятов позволил выявить 4 эволюционных паттерна для вирусов гриппа А(H1N1). Для сегментов РВ2 и НА установлена линейная эволюция, с единственным событием реассортации с участием клайда D.

Для NA, M и PB1 характерен второй паттерн с реассортацией в клайде Е. Третий отмечен для сегментов РА и NP с двумя реассортациями с участием клайдов D и Е.

Четвертый паттерн характерен для сегмента NS, для которого зарегистрировано как минимум три акта реассортации с участием клайдов D, E, F, G.

Подводя итог, можно сказать что для вирусов сезонного гриппа А(H1N1) характерно два основных механизма эволюционной изменчивости: антигенный дрейф с постепенным накоплением антигенно значимых мутаций и внутритиповая реассортация, регистрируемая для всех сегментов генома, и наименее характерная для НА.

1.3.3.2. Изменчивость гемагглютинина вирусов гриппа А(H1N1) 1918гг. выделения и роль позитивной селекции.

Кристаллическая структура НА для субъединицы НА1 установлена для вируса А/Пуэрто Рико/8/34; с использованием моноклональных антител определены основные антигенные сайты. Для НА подтипа Н1 выделяют пять антигенных сайтов (см. рис. 1.8), основным из которых является антигенный сайт Sb, который расположен на верхушке молекулы НА. В работе Стрей и Питтман были применены новые методы оценки антигенных сайтов на основе биофизических характеристик молекул НА (Stray S.J., Pittman L.B., 2012). В результате авторы предложили дополнительный антигенный сайт для молекулы НА1, названный Н1с. Стоит отметить, что экспериментально данный антигенный сайт не был подтвержден.