На правах рукописи

ФЕДЕРАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

«МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ

им. Г.Н. ГАБРИЧЕВСКОГО» РОСПОТРЕБНАДЗОРА

Урбан Юлия Николаевна

Определение фенотипических и молекулярно-генетических характеристик штаммов Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae и Streptococcus pneumoniae, выделенных из ликвора детей, больных гнойным бактериальным менингитом.

03.02.03 – микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор С.С. Афанасьев доктор биологических наук Е.А.Воропаева Москва –

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ………………………………………..………….…….…………….... ВВЕДЕНИЕ…………………………………………….……………………….……… ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………….…………….…………………………. 1.1.Основные возбудители гнойного бактериального менингита….……………... 1.1.1.Streptococcus pneumoniae. Факторы патогенности, фенотипы……………… 1.1. 2.Neisseria meningitidis. Факторы патогенности, фенотипы……………….…. 1.1.3. Haemophilus influenzae. Факторы патогенности, фенотипы…………..…….. 1.2.Устойчивость основных возбудителей гнойного бактериального менингита к антибиотикам…………………………………………………………………………. 1.3. Лабораторная диагностика гнойного бактериального менингита………….... 1.4. Вакцинопрофилактика…………………………………………………………... СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………………………………….

ГЛАВА 2. АНАЛИЗ РАСПОСТРАНЕНИЯ ОСНОВНЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ

ГНОЙНОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО МЕНИНГИТА В СТАНАХ СНГ….…....….... 2.1.Идентификация возбудителей гнойного бактериального менингита в спинномозговой жидкости…………………………………………………………………… 2.2. Характеристика выделенных штаммов………………………………….……...

ГЛАВА 3. ПРОФИЛИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ

ПРЕПАРАТАМ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГНОЙНОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО МЕНИНГИТА, ВЫДЕЛЕНЫХ ИЗ СМЖ БОЛЬНЫХ ДЕТЕЙ…………………

3.1. Анализ антибиотикочувствительности штаммов S.pneumoniae……………... 3.2. Анализ антибиотикочувствительности штаммов N. meningitidis…….……... 3.3. Анализ антибиотикочувствительности штаммов H.influenzae………………

ГЛАВА 4. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ШТАММОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ

СМЖ ……………………………………...…………………………………………... 4.1. Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов S.pneumoniae…...………… 4.2. Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов N.meningitidis………...…… 4.3. Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов H.influenzae …….………… ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬЫЙ АНАЛИЗ ШТАММОВ S. pneumoniae, ВЫЗЫВАЮЩИХ ИНВАЗИВНЫЕ И НЕИНВАЗИВНЫЕ ФОРМЫ ИНФЕКЦИЙ……….....

ГЛАВА 6. АЛГОРИТМА ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГНОЙНОГО

БАКТЕРИАЛЬНОГО МЕНИНГИТА………………………………………………... ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………..…………………………………...………. ВЫВОДЫ………………………………………………………………..….......…….. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ………………………………………….….. ПРЕСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ……………...………… СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ…………………………………………………………... СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………………. ВВЕДЕНИЕ. Актуальность темы исследования Гнойный бактериальный менингит (ГБМ), как форма инфекционной нейропатологии, занимает важное место в структуре заболеваний нервной системы и остается одной из причин летальности и инвалидизации больных. Во всем мире ведущими возбудителями бактериального менингита Neisseria meningitidis (менингококк), Streptococcus pneumoniae (пневмококк) Haemophilus influenzae тип b (Hib) [28, 47,180,181].

Ежегодно в мире по расчетным данным регистрируется более 1,2 миллиона случаев бактериальных менингитов [181]. Показатели заболеваемости и летальности от бактериальных менингитов колеблются в зависимости от региона, страны, конкретного патогена и возрастной группы. При отсутствии лечения уровень летальности может доходить до 70 процентов, а у одного из каждых пяти выживших после бактериальных менингитов могут возникать осложнения, включая тугоухость, неврологические расстройства или потерю конечности [28, 29, 181].

Для идентификации N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae широко используются микробиологические методы: бактериологический метод, микроскопический метод, иммунохимический метод (реакция латекс – агглютинации).

Хотя бактериологический метод и принято считать золотым стандартом для подтверждения случаев заболевания в условиях клиники, уровень положительных результатов этого исследования относительно низок по причине несоблюдения оптимальных условий хранения и транспортировки материала и/или проведения антибактериальной терапии до взятия клинического материала, а учет результатов реакции латекс - агглютинации носит субъективный характер и может быть сложным для интерпретации [28, 181]. Поэтому в последние годы, для диагностики основных возбудителей бактериального менингита широко применяются молекулярные методы, в частности метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот метод позволяет обнаружить специфическую ДНК патогенных бактериальных агентов и для этого не требуются живые клетки. В настоящее время ПЦР находит широкое применение в диагностике и эпиднадзоре за патогенными бактериальными агентами благодаря своей высокой чувствительности, специфичности и большей производительности [77, 138, 148,181].

Определение серогруппового пейзажа N. meningitidis, S. pneumoniae и H.

influenzae играет важную роль в эпиднадзоре и внедрении вакцин, которые необходимы для профилактики бактериальных менингитов [180].

Своевременная и адекватная антибиотикотерапия бактериального гнойного менингита позволяет снизить смертность и инвалидизацию пациентов [28, 112, 180]. Однако, лечение данного заболевания может быть неэффективными вследствие пониженной чувствительности к антибактериальным препаратам (АБП) штаммов N. meningitidis, H. influenzae и S. pneumoniae. Поэтому необходимо определение чувствительности штаммов возбудителя к основным антибиотикам в лабораторных исследованиях. Трудности в выделении культур обуславливают необходимость использования молекулярно-генетических методов для выявления маркеров, определяющих устойчивость к антибиотикам [121, 181].

Для полноценного эпидемиологического надзора за N. meningitidis, H.

influenzae и S. pneumoniae необходимы исследования, которые позволяют проанализировать популяцию возбудителя [108]. Данные об эволюции и закономерностях распространения патогенных бактерий, полученные с помощью метода мультилокусного сиквенс типирования (МЛСТ), наиболее информативны, так как позволяют измерять генетическую связь между штаммами и оценивать степень филогенетического родства возбудителей, а так же дает представления о географическом распределении патогенов [34, 156].

В ряде стран входящих в состав содружества независимых государств (СНГ) для идентификации S.pneumoniae, N.meningitidis, H.influenzae в лабораториях используются, в основном, бактериологические и серологические методы, и полноценной картины о распространении на этих территориях возбудителей гнойного бактериального менингита нет. Актуальность работы заключается в необходимости всестороннего изучения циркулирующих штаммов N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae вызывающих гнойный бактериальный менингит в странах СНГ.

Степень разработанности темы исследования Гнойные бактериальные менингиты по-прежнему остаются серьезной проблемой здравоохранения и, поэтому необходимо внедрение вакцин против патогенов, вызывающих данное заболевание [180, 181]. Для этого, необходимо проводить мониторинг циркулирующих патогенов. Мониторинг, проведенный на этапе после внедрения вакцинации, позволит выявить серогрупповые/серотиповые замены циркулирующих возбудителей [44, 181]. В современных условиях, использование молекулярно-генетических методов, совместно с классическими бактериологическими методами позволяет провести полноценный мониторинг циркулирующих патогенов, а использование молекулярных методов для определения детерминант, отвечающих за устойчивость к антибактериальным препаратам позволяет понять природу их устойчивости [44].

В России мониторингом циркулирующих возбудителей ГБМ с использованием, как классических бактериологических методов, так и современных молекулярно-генетических методом занимаются Миронов К.О., Королева И.С. Костюкова Н.Н. Козлова Р.С., Платонова А.Е. Шипулин Г.А., Савинова Т.А., Сидоренко С.И. и др. [26, 27, 29, 31, 37, 44, 45].

Однако, работ посвящённые полноценному мониторингу за возбудителями ГБМ с использованием молекулярно-генетических методов в странах СНГ нет, и, до сих пор, остается неясной циркуляция доминирующих возбудителей гнойного менингита в страх СНГ, их антибиотикорезистентность и филогенетические отношения. Данные исследования являются важными для Российской Федерации в связи с географической близостью и миграцией людей из стран входящих в состав содружества независимых государств.

Провести микробиологический и молекулярно-генетический скрининг образцов СМЖ и штаммов из ликвора, полученных от детей, больных гнойным бактериальным менингитом, для оценки фенотипических, молекулярногенетических и филогенетических свойств S. pneumoniae, N. meningitidis и H.influenzae.

Задачи исследования 1. Провести мониторинг циркуляции N. meningitidis, S. pneumoniae и H.

influenzae в странах СНГ. Определить их серогрупповую и серотиповую принадлежность.

2. Оценить уровень фенотипической антибиотикочувствительности штаммов N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae. Выявить наличие изменений в генах pbp1a, pbp2x и pbp2b, обуславливающих снижение чувствительности к пенициллину, и наличие генов mefA и ermB, ответственных за устойчивость к макролидам, у штаммов S. pneumoniae.

3. Определить доминирующие сиквенс-типы и клональные комплексы штаммов S. pneumoniae, N. meningitidis и H. influenzae, циркулирующих в странах СНГ, провести анализ филогенетического родства с построением дендрограмм.

4. Установить степень филогенетического родства между штаммами S.

pneumoniae, выделенными из СМЖ и со слизистой носоглотки.

5. Разработать алгоритм идентификации возбудителей гнойного бактериального менингита.

Впервые охарактеризована популяционная структура штаммов S.

pneumoniae, N. meningitidis и H. influenzae, вызывающих гнойный бактериальный менингит у детей в странах СНГ с помощью метода мультилокусного сиквенстипирования (МЛСТ). Выявлено, что штаммы S.pneumoniae относились к сиквенс-типам СТ 239, 246, 2436, 473, а также СТ 230 и СТ 1176, в которые вошли штаммы, устойчивые к пенициллину, N.meningitidis - к клональному комплексу ST-11 complex/ET-37 complex и H. influenzae - к клональному комплексу А1/А2.

Проведено молекулярно-генетическое исследование детерминант антибиотикорезистентности S. pneumoniae и показано, что устойчивость к пенициллину у S. pneumoniae связана с изменениями в генах, кодирующих чувствительность к пенициллину, а устойчивость к эритромицину обусловлена приобретением соответствующих островков патогенности (генов резистентности к антибиотикам).

Впервые идентифицированы два новых сиквенс-типа N.meningitidis CTи СТ- 10736, которые размещены в международной базе Neisseria Pubпод идентификационными номерами MLST (http://pubmlst.org/perl/bigsdb/bigsdb.pl?page=profileInfo&db=pubmlst_neisseria_seqd ef&scheme_id=1&profile_id=10735) (http://pubmlst.org/perl/bigsdb/bigsdb.pl?page =profileInfo&db=pubmlst_neisseria_seqdef&scheme_id=1&profile_id=1073, что способствует повышению эффективности эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией.

Разработанный алгоритм идентификации возбудителей гнойного бактериального менингита позволяет сделать заключение о клинической значимости возбудителя в инфекционном процессе и оптимизировать лечебнопрофилактические мероприятия.

Теоритическая и практическая значимость работы Предложенный алгоритм идентификации инвазивных и неинвазивных штаммов с применением классических бактериологических и молекулярногенетических методов позволит оценить патогенетическую значимость различных возбудителей гнойного бактериального менингита в инфекционном процессе.

Сведения о составе и распределении серогруппового/серотипового пейзажа N.meningitidis, S.pneumoniae и H. influenzae в странах СНГ дают возможность обосновать введение в национальный календарь прививок вакцин против данных возбудителей.

Данные о наличии антибиотикорезистентности у штаммов S.pneumoniae и N.meningitidis могут быть использованы для оптимизации антибиотикотерапии гнойных бактериальных менингитов в странах СНГ.

Создан банк ДНК N.meningitidis, S.pneumoniae, H.influenzae для дальнейших исследований, определения генетической структуры (сиквенс-типы) и определения антибиотикорезистентности, связанной с генетическими изменениями циркулирующих патогенов.

Результаты исследований и разработок внедрены в научноисследовательскую работу лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (Акт внедрения от 24 июля 2014 г.) Оптимизированные молекулярно-генетические методы типирования основных возбудителей гнойного бактериального менингита используются в Региональном референс-центре по инвазивным бактериальным заболеваниям, управляемым вакцинацией (РРЛ по ИБЗ), Европейского Регионального Бюро Всемирной Организации Здравоохранения (ЕРБ ВОЗ) при проведении мониторинга за основными возбудителями гнойных бактериальных менингитов в странах СНГ. Результаты проведенных исследований размещены в базе данных ВОЗ и включены в ежегодно издаваемые бюллетени по наблюдению за возбудителями гнойных бактериальных менингитов в Европейском регионе ВОЗ.

Методология и методы исследования Методология данной работы спланирована согласно поставленной цели.

Основными объектами исследования стали фенотипические, молекулярногенетические и филогенетические свойства циркулирующих штаммов, вызывающих ГБМ. Научная литература, посвящённая проблеме основных свойств S.pneumoniae, N.meningitidis и H.influenzae была проанализирована формальнологическими методами исследования. Предметом исследования явились штаммы S.pneumoniae, N.meningitidis и H.influenzae, выделенные из спинномозговой жидкости (СМЖ) детей больных ГБМ. В работе были использованы бактериологические, иммунохимические и молекулярно-генетические методы исследования.

Материалы исследования Результаты диссертационной работы основаны на лабораторном исследовании 810 образцов СМЖ и 33 клинических штаммов, выделенных из СМЖ, взятой у детей в возрасте от 1 месяца до 59 месяцев и 29 дней, поступивших в дозорные госпиталя с подозрением на менингит. СМЖ и клинические штаммы поступали из следующих стран: Азербайджан, Армения, Грузия, Белоруссия, Узбекистан и Украина за период 2007-2013 гг. Для сравнения с клиническими штаммами S.pneumoniae, выделенных из СМЖ детей из стран СНГ были взяты клинических штаммов из СМЖ и 9 клинических штаммов, выделенных со слизистой носоглотки, у пациентов клинико-диагностического центра ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского. Исследования с применением бактериологических, методов проводились в ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора на базе которого располагается Региональная Референс Лаборатории (РРЛ) по инвазивным бактериальным заболеваниям ЕРБ ВОЗ. Часть работы проводилась в Глобальной Референс Лаборатории (ГРЛ) по инвазивным бактериальным заболеваниям расположенной на базе Клинического Диагностического Центра (CDC) г. Атланта, США.

Схема идентификации возбудителей Грамположительные Культура Каталазоотри- хину (зона задержки роста 14 задержки роста 36 до 40 рассматривался как неопределенное, и образец подлежал повторному анализу после разведения ДНК-матрицы 1:5 и 1:10 водой для ПЦР с целью снижения воздействия каких-либо ингибирующих факторов, которые могут влиять на проведение реакции. Амплификацию с детекцией в режиме реального времени производили с помощью амплификатора ABI 7500 (Applied Biosystems, США).

Для определения серотипов S.pneumoniae применяли метод мПЦР.

Метод мультиплексной ПЦР позволяет одновременно обнаруживать несколько серотипов S.pneumoniae. Последовательности праймеров и протоколы реакции (http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/pcr.htm).

представлена на рисунке 4.

Амплификацию проводили в 25 мкл смеси, состоящей из 12,5 мкл смеси для мультиплексной ПЦР Qiagen Multeplex PCR kit(Qiagen, США), 2,5 мкл ДНК исследуемого образца, праймеры согласно протоколу, и доводили до объема мкл водой для ПЦР. После амплификации 10 мкл образца смешивали с 6 кратным буфером для загрузки и вносили в 2% агарозный гель (0,5 мкг/мл ЭБР).

Электрофорез проводили при 50 А, 100 В на 1 см2 в течение 30 минут (камера SEHelicon, Россия; источник питания Powerpac Basic Power Supply, BioRad, США).

Продукты амплификации визуализировали на трансиллюминаторе ECX-20L (Vilber Lourmat, Германия).

Определение генетической чувствительности к пенициллину и генетической резистентности к макролидам штаммов S. pneumoniae производили с использованием праймеров и флуоресцентно меченых зондов рекомендованных Chiba N [69] (таблица 6).

Позитивный LytA ПЦР мультиплекс Рисунок 4. Схема определение серотипов S.pneumoniae методом мультиплексной ПЦР.

Праймеры и зонды, используемые для выявления генов антибиотикочувствительности к пенициллину и макролидам праймеров и зондов, используемых в ПЦР растворов Предлагаемые модификации PBP 1A

AAACCGCGACTGGGGATCAAC

GGTTGAGTCCGACCTTGTTT

CGCGATCACTGGATAGGGGCTACTTTGGCGATCGCG

PBP2X

CCAGGTTCCACTATGAAAGTG

ATCCCAACGTTACTTGAGTGT

CGCGATCAGATGCCACGATTCGAGATTGGGGATCGCG

PBP2B

CCTATATGGTCCAAACAGCCT

GGTCAATTCCTGTCGCAGTA

CGCGATCTCGGCACCAGCAATCTAGAGTCTGATCGCG

mefA

GGACCTGCCATTGGTGTGC

CCCAGCTTAGGTATACGTAC

CGCGATCCCCCAGCACTCAATGCGTTACACGATCGCG

ermB

CGTACCTTGGATATTCACCG

GTAAACAGTTGACGATATTCTCG

CGCGATCCCGCCATACCACAGATGTTCCGATCGCG

Амплификации проводили в 25 мкл смеси, состоящей из 12,5 мкл смеси для ПЦР РВ Platinum Quantitave PCR SuperMix – UDG (Qiagen, США), 0,2 µМ каждого праймера, 0,3 µМ зонда, 2 мкл ДНК, 0,5 мкл референтного красителя ROX (Qiagen, США), 4 мкл воды. Для улучшения амплификации был изменен температурный режим, амплификация проводилась при следующих условиях: цикл: 950С - 15 мин; 45 циклов - 940С - 30 сек, 550С - 40 сек, 720С - 15 сек. Детекция сигнала проводилась при 550С. Амплификацию с детекцией накопления продуктов реакции в режиме реального времени производили с помощью амплификатора ABI 7500 (Applied Biosystems, США). Значение Ct 38 считалось положительным, а значение Ct > 38 – отрицательным.

Наличие детекции генов pbp1a, pbp2x и pbp2b, свидетельствовало об отсутствии мутаций в специфичных участках, к которым были разработаны праймеры, и штаммы считались генетически чувствительными к пенициллину (гПЧ).

Если отсутствовала детекция одного или двух генов, штамм считался генетически промежуточно устойчивым к пенициллину (гППУ), если отсутствовала детекция всех трех генов, штамм считался генетически устойчивым к пенициллину (гПУ). Положительная детекция генов ermB и/или mefA, свидетельствовало о генетической устойчивости к макролидам.

Молекулярно-генетическое типирование штаммов N.meningitidis, H. influenzae и S. pneumoniae осуществляли методом МЛСТ. Последовательность праймеров для амплификации и секвенирования генов «домашнего хозяйства» представлены в таблицах 7-9. Амплификацию генов «домашнего хозяйства» проводили в 25 мкл смеси: 2,5 мкл ПЦР буфера (10) (Fermentas, Латвия): 700 mM ТрисHCl, pH 8,6 / 25 oC, 166 mM (NH4)2SO; 2,5 мкл 25 mM MgCl2 (Fermentas, Латвия); 1 мкл 10mM dNTPs (Fermentas, Латвия) по 1 мкл 20mM прямого и обратного праймера, 0,5 мкл Taq– полимераза(Fermentas, Латвия), 2,5 мкл ДНК, вода для ПЦР – 18 мкл. Амплификацию фрагментов проводили на амплификаторе GeneAmp 2700 (Applied Biosystems, США).

При амплификации фрагментов генов «домашнего хозяйства» H. influenzae применяли следующие условия проведения реакции: 1 цикл: 95°C – 15 мин., затем 35 циклов: 94°C – 30 сек., 55°C – 30 сек., 72°C – 1 мин., 1 цикл: 72°C – 2 мин., охлаждение до 4°C с последующим хранением при 10°C.

Для амплификации фрагментов генов «домашнего хозяйства» N. meningitidis применяли следующие условия проведения реакции: 1 цикл: 95°C – 15 мин., затем 35 циклов: 94°C – 30 сек., 60°C – 45 сек., 72°C – 45 сек., 1 цикл: 72°C – мин., охлаждение до 4°C с последующим хранением при 10°C. Для гена pgm применялись следующие условия: 1 цикл: 95°C – 15 мин., затем 35 циклов: 94°C – 30 сек., 60°C – 45 сек (с каждым циклом уменьшение температуры на 0,5°C), 72°C – 45 сек., 10 циклов: 94°C – 30 сек., 50°C – 45 сек., 72°C – 45 сек., 1 цикл: 72°C – 2 мин., охлаждение до 4°C с последующим хранением при 10°C.

Для амплификации фрагментов генов «домашнего хозяйства» S. pneumoniae применяли следующие условия: 1 цикл: 95°C – 15 мин., затем 35 циклов:

94°C – 30 сек., 58°C – 45сек., 72°C – 1 мин., 1 цикл: 72°C – 2 мин., охлаждение до 4°C с последующим хранением при 10°C. Контроль наработки фрагментов осуществляли в 2% агарозном геле, 5 мкл образца смешивали с 6 кратным буфером для загрузки и вносили в агарозный гель (0,5 мкг/мл ЭБР). Электрофорез проводили при 50 А, 100 В на 1 см2 в течение 30 минут (камера SE-2, Helicon, Россия;

источник питания Powerpac Basic Power Supply, BioRad, США). Продукты амплификации визуализировали на трансиллюминаторе ECX-20L (Vilber Lourmat, Германия).

Определение нуклеотидной последовательности фрагментов проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием набора реагентов для секвенирования BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США), согласно рекомендациям производителя. Исследования проводились на базе ЗАО «ПИННИ» («Постгеномные и нанотехнологические инновации», CJSC «PYNNY» Инновационного центра медицинских нанобиотехнологий ГУ НИИ физико-химической медицины МЗ РФ, г. Москва). Результаты секвенирования, полученные в формате хроматограммы, обрабатывали в программе CromasLite, секвенированные последовательности сопоставляли с международной on-line базой MLST (http://pubmlst.org). Выравнивание последовательностей проводилось с помощью сервиса BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=bl ast2seq&LINK_LOC=align2seq).

осуществляли методом присоединённых соседей (Neigbor joining –NJ) с использованием программного обеспечения MEGA 5.0 [171].

Список праймеров, используемых для МЛСТ S. pneumoniae кус

TATTTCTCCCTTC GATTGGCCATCCATGCCCACACTG

ATGGACAAACCAGCNAGYTT GCTTGAGGTCCCATRCTNCC

GGCATTGGAATGGGATCACC TCTCCCGCAGCTGACAC

CTCAAATAGAAGG CATGGATGGCTTCC

GAAAGGTAAGTTATGAATTT TCTCGGCC

GAGGTCTTATG GAG

GCGTGTTCTGG TGGG

Для данного случая R = смесь в равных долях A и G; W = смесь в равных долях A и T; и т.д.

Список используемых праймеров для МЛСТ N. meningitidis кус abc abcZ- AATCGTTTATGTACCGCAGR abcZ-S2 GAGAACGAGCCGGGATAGGA fum fumC-S1 TCCGGCTTGCCGTTTGTCAG fumC- TTGTAGGCGGTTTTGGCGAC pdh pdhC-S1 TCTACTACATCACCCTGATG pdhC- ATCGGCTTTGATGCCGTATTT Для данного случая R = смесь в равных долях A и G; W = смесь в равных долях A и T; и т.д.

Список используемых праймеров для МЛСТ H. influenzae adk

CAGGTAA

atp atpG-up ATGGCAGGTGCAAAAGA- atpG-dn TTGTACAACAGGCTTTTGCG frdB-up CTTATCGTTGGTCTTGCCGT frdB-dn TTGGCACTTTCCACTTTTCC frdB fucK-up ACCACTTTCGGCGTGGATGG fucK-dn AAGATTTCCCAGGTGCCAGA fuc mdh-up TCATTGTATGATATTGCCCC mdh-dn ACTTCTGTACCTGCATTTTG mdh pgi reGAAAA Статистическая обработка полученных данных Для сравнения качественных признаков между исследуемыми группами использовали критерий хи-квадрат (2) [3,15, 44]. При p< 0,05 различия между сравниваемыми величинами признавали статистически достоверными. Статистическую обработку полученных данных проводили, применяя стандартный пакет статистических программ Microsoft Excel 2007.

Результаты секвенирования, полученные в формате хроматограммы, обрабатывали в программе CromasLite. Анализ последовательностей генов «домашнего хозяйства» с определением сиквенс типов (СТ) проводили с использованием базы данных МЛСТ http://spneumoniae.mlst.net, http://pubmlst.org/neisseria, http://haemophilus.mlst.net/. Для определения клональности исследуемых штаммов использовали алгоритм eBURSTv3 интегрированный в МЛСТ вебсайт (http://eburst.mlst.net). С использованием программы «Vector NTI Suite v.

9»проводили склеивание полученных нуклеотидных последовательностей. Выравнивание последовательностей проводилось с помощью сервиса BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=bl ast2seq&LINK_LOC=align2seq). Построение филогенетической дендограммы осуществляли методом присоединённых соседей (Neigbor joining –NJ) с использованием программного обеспечения MEGA 5.0 [171].

Личное участие автора в получении результатов.

Личное участие соискателя в получении результатов, изложенных в диссертации, заключалось в выполнении молекулярно-генетических (ПЦР РВ, мПЦР) исследованиях, в обработке и анализе данных секвенирования, проведении биоинформационного анализа полученных данных, теоретическом обобщение результатов, статистической обработка данных. Бактериологические исследования проводились в соавторстве с сотрудниками лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора: ведущим научным сотрудником Егоровой Е.А., младшим научным сотрудником Оганесяном А.Н.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Для выявления и определения серогрупп и серотипов N. meningitidis, S.

pneumoniae и H. influenzae в спинномозговой жидкости целесообразно использовать молекулярно-генетические и бактериологические методы.

2. Среди циркулирующих штаммов N. meningitidis, H. influenzae и S.

рneumoniae в странах СНГ механизмы антибиотикорезистентности определялись видовыми особенностями возбудителей.

3. Исследуемые штаммы N. meningitidis, S. pneumoniae и H. influenzae принадлежат к широко распространённым сиквенс-типам и клональных комплексам.

4. Филогенетический анализ позволил установить определённую связь между штаммами S. pneumoniae, выделенными из спинномозговой жидкости и со слизистой носоглотки.

Степень достоверности и апробация результатов исследования О достоверности полученных результатов работы свидетельствует достаточный объем выборки анализируемых образцов (810 образцов СМЖ и 47 клинических штамма), использование сертифицированных бактериологических, иммунохимических и молекулярно-генетических методов, которые характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью. Комплексное бактериологическое, иммунохимическое и молекулярно-генетическое исследование клинических штаммов позволило получить сопоставимые данные, что свидетельствует о достоверности полученных результатах.

Диссертация апробирована на заседании секции Учёного Совета ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (протокол № 2 от 22 мая 2014г.).

Результаты диссертационной работы представлены, доложены и обсуждены на The 29th Annual Meeting of the European society for pediatric infectious diseases, 7-11 June, 2011, Hague, Netherlands; The 4th Congress of Europen Microbiologist, June 26-30, 2011, Geneva, Switzerland; The 27th International Congress of Pediatrics 2013 (ICP), August 24-29, 2013, Melbourne, Australia; на VI ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 24-26 марта, 2014.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 4 – в рецензируемых изданиях, 6 – в сборниках материалов конференций.

1.1. Основные возбудители гнойного бактериального менингита Основными возбудителями гнойного бактериального менингита (ГБМ) у детей являются Haemophilus influenzae типа b (Hib), Streptococcus pneumoniae и Neisseria meningitidis [30,47,180]. Хотя основной возраст заболевших составляет от 6 недель до 5 лет [47], но в основном в группу риска входят дети первого года жизни. Распространенность ГБМ определяется условиями жизни населения и географической зоной, в связи, с чем в неразвитых странах заболеваемость и микробный спектр всегда выше, чем в развитых [47]. Гнойные бактериальные менингиты редко являются следствием эпидемиологических вспышек, а чаще имеют спорадический характер [47].

Патогенез ГБМ можно представить в виде следующих стадий:

1 стадия бактериемии - внедрение возбудителя в орофарингеальный эпителий, 2 стадия - проникновение через гематоэнцефалический барьер, 3 стадия - внутричерепная гипертензия и оттек мозга с повреждением мозговой ткани [24,47].

Через орофарингеальный эпителий в лимфоидную ткань, где формируется локальная иммунная реакция, бактерии проникают, выделяя фермент металлопротеиназу, расщепляющий IgA1[24]. После чего, происходит проникновение патогена в кровь [47]. Проницаемость через гематоэнцефалический барьер и вторжение микроорганизмов в центральную нервную систему происходит в результате выброса микробных токсинов, таких как, липополисахаридов у менингококка и Hib, тейхоевой кислоты и пептидагликанов у пневмококков, которые адсорбируются на клетках крови и эндотелии сосудов, вызывая ответный «цитокиновый взрыв» с развертыванием каскада воспалительных реакций организма [24, 4].

1.1.1.Streptococcus pneumoniae. Факторы патогенности, фенотипы Вид S.pneumoniae – относится к факультативно-анаэробным грамположительным коккам рода Streptococcus, семейства Streptococcaceae. Морфотип характеризуется овальными или ланцетовидными диплококками, окруженными типоспецифичной капсулой [20, 26, 27, 68]. Для S. pneumoniae характерны следующие факторы вирулентности: полисахаридная капсула, протеаза секреторного иммуноглобулина (sIgA), пневмолизин, тейхоевые кислоты, фрагменты пептидогликана, поверхностный клеточный адгезин, аутолизин [26, 68, 77, 170].

Несмотря на то, что пневмококковый капсулярный полисахарид не обладает прямым токсическим действием, именно он является основным фактором патогенности микроорганизма. Капсулярный полисахарид, проявляя антифагоцитарную активность, препятствует комплемент-зависимому лизису бактерий, тем самым способствуя нарушению фагоцитоза пневмококков полиморфоядерными лейкоцитами. Кроме того он играет ключевую роль в индукции воспалительных процессов [37,129, 170]. В настоящее время, на основании химических различий в строении капсулярных полисахаридов и способности иммунной системы кроликов распознавать эти различия путем выработки специфических антител, выделяют более 90 серотипов пневмококков [99,158]. Однако многие из этих серотипов редко встречаются при серьезных заболеваниях, и только около 15 являются причиной основных инвазивных пневмококковых инфекций во всем мире [26, 37, 66, 97]. Так пневмококковый менингит чаще всего вызывается серотипами 14, 6В, 18С, 23F, 19F и 6А [52]. Кроме того, имеются сведения о зависимости тяжести инфекции от серотипа пневмококка [37, 97, 141].

Помимо капсулярного полисахарида, факторами патогенности пневмококков являются два мощных аутолитических фермента: N-ацетилмурамоил-Lаланинамидазу и эндо--1,4-N-ацетилглюкозаминидазу [89]. Основная роль аутолизинов в патогенезе пневмококковых инфекций заключается в высвобождении пневмолизина, а так же других повреждающих компонентов клеточной стенки [140]. Пневмолизин принадлежит к семейству тиолозависимых токсинов, которые обладают двухэтапным механизмом действия. Первый этап включает в себя связывание с холестерином мембраны клетки и встраивание токсина в липидный биослой, на втором этапе происходит латеральная диффузия и сборка олигомерной структуры с высокой молекулярной массой, которая является трансмембранной порой [43, 56]. Так же данный белок стимулирует высвобождение фактора некроза опухоли (ФНО), что приводит к воспалительной реакции [140, 185]. Кроме того, одним из механизмом действия пневмолизина является его способность к активации фосфолипазы А в эндотелиальных клетках легочных артерий [152].

Важной особенностью пневмолизина так же является его уникальная способность вызывать активацию системы комплимента по классическому пути при отсутствии специфических антител, в результате чего снижается опсонизирующая активность сыворотки [142, 143, 183]. Синтез пневмолизина кодируется геном ply [66]. Сравнение аминокислотного состава пневмолизинов у штаммов пневмококков различных серотипов, показало практически 90% сходство аминокислотных последовательностей, что указывает на универсальную роль данного токсина в патогенезе инфекционного процесса независимо от серотипа изолята [186].

Еще одним из факторов патогенности у пневмококков являются поверхностные адгезины, в частности пневмококковый поверхностный адгезин А (PsaA), пневмококковые поверхностные антигены А и С, а также холинсвязывающие белки, которые формируют своеобразный мост между бактерией и рецепторами эпителиальных клеток [52, 62, 132]. Со стороны эпителиальных клеток контакт осуществляется с помощью N-ацетилгалактозамин--1-4-галактозой, которая является одним из трех серотипнезависимых антигенов и близкородственным липопротеиновым адгезином других стрептококков, колонизирующих ротовую полость [131]. Таким образом, основная биологическая роль PspA заключается в обеспечении эффективной колонизации слизистых оболочек, что приводит к последующей защите пневмококков от фиксации комплемента, и как следствие, снижением опсонизации. Кроме того, PspА способен связывать лактоферрин, что позволяет S. pneumoniae конкурировать с клетками организма хозяина за железо, необходимое для метаболизма возбудителя [17, 27, 30, 170]. Близким сродством к PspА обладает пневмококковый протеин С (PspС). Данный белок необходим для более эффективной колонизации эпителиальных клеток [151]. В целом, говоря о роли этих белов, следует подчеркнуть, что антитела против PspA обеспечивают защиту макроорганизма от колонизации бактериями, а так же от развития инвазивных пневмококковых инфекций, что может быть связано с их перекрестной реактивностью с PspС [131]. Фазовые вариации пневмококков, которые являются результатом модификации структуры клеточной стенки, так же могут играть существенную роль в различиях адгезивной способности штаммов [109,180].

Известно, что пневмолизин, PspA и PspС представляют собой группу из трех серотипнезависимых антигенов, что может быть применено при разработке новых диагностических направлений и в создании новых вакцинных препаратов [26, 30]. Наличие в составе генома генов, которые кодируют синтез факторов вирулентности, таких как пневмолизина, аутолизина, капсулы и поверхностного протеина А (ply, lytA, cpsA и psaA, соответственно), является, чаще всего, указанием на принадлежность исследуемого изолята к виду S. pneumoniae [170]. Данные гены можно рассматривать как специфические маркеры видовой принадлежности, что находит широкое применение в молекулярной диагностике пневмококковых инфекций [27,30,37,181].

Neisseria meningitidis. Факторы патогенности, фенотипы Neisseria meningitidis относится к семейству Neisseriaceae, род Neisseria.

Грамотрицательные диплококки в форме кофейного зерна, располагаются как внеклеточно, так внутриклеточно. Оптимальный рост наблюдается при температуре 35-37оС в атмосфере с 5% СО2. Менингококк способен расти как на кровяном, так и на «шоколадном» агаре. На кровяном агаре N.meningitidis формирует серые непигментированные колонии, гладкие, влажные с блестящей поверхностью, выпуклые с округлой формой и идеально ровными краями. На «шоколадном» агаре N.meningitidis растет в виде крупных, от бесцветных до серых полупрозрачных колоний [32, 68, 181]. Штаммы N.meningitidis могут быть как капсулированные, так и некапсулированные. Капсула играет важную роль для выживания организма в крови или спинномозговой жидкости, так как обеспечивает резистентность к антителам, компонентам комплимента и препятствует фагоцитозу [68]. Капсулы основных серогрупп менингококков, ассоциируемых с инвазивными заболеваниями, состоят из сиаловой кислоты, за исключением серогуппы А, капсула которой состоит из повторяющихся единиц N-ацетил-маннозамин-1фосфата, N-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac) и синтезируется из Nацетилманозамина (ManNAc) и фосфоенолпирувата [58]. Neu5Ac является общим компонентом всех сиаловых кислот организма человека, таким образом, включение Neu5Ac в капсулу позволяет капсулярным менингококкам становиться незаметным для иммунной системы организма хозяина [83, 107]. Яркий пример представляет собой капсула серогруппы В, в которой A (2–8)- связывающий сиаловую кислоту гомополимер, идентичен гомополимеру в нервных клетках человека, тем самым обеспечивая слабый иммунный ответ против данного серотипа [71, 188]. На основании различий в химическом составе капсулярных полисахаридных антигенов вид N.meningitidis разделяют на следующие серогруппы: A, B, C, D, X, Y, Z, W135, 29E, H, I, K, L. С менингококковыми инфекциями наиболее часто связаны серогруппы A, B, C, X, Y, W135 [28, 31].

Кроме полисахаридной капсулы вирулентными факторами N.meningitidis являются поверхностный адгезивный белок, наружные мембранные белки, пили, порины – PorA и PorB, адгезивные молекулы Opa и Орс [84, 88, 120].

Менингококки имеют пили, представляющие собой полифункциональные и изменчивые органеллы. Пили состоят из весьма изменчивого белка – пилина.

Пили играют ключевую роль в дебюте каждого этапа патогенеза менингококковой инфекции [101]. Именно они в большей степени обеспечивают прочное прикрепление клеток менингококка к эпителию и эндотелию [31.] Без адгезии попавшие на слизистую бактериальные клетки будут удалены за счет механизмов мукоцилиарного клиренса [105]. Пили способствуют и сцеплению клеток менингококка друг с другом, что проявляется у бескапсульных штаммов в виде спонтанной агглютинации [42, 72, 104]. Белки-порины, способствуют адгезии и инвазии менингококков, блокируют также функцию фагоцитов [169].

Белок Por В имеет структурно-функциональную гомологию с анионными поринами митохондрий эукариотической клетки, оба пориновых белка (А и В) способны связывать пуриннуклеозидтрифосфаты, регулируя размер и селективность пор клетки хозяина [87, 115]. Так же белки Por А и Por В характеризуются и высокой иммуногенностью, индуцируя синтез бактерицидных антител и опсонинов. Благодаря этим свойствам они могут быть использованы в качестве компонентов будущей менингококковой вакцины [31, 32, 43].

Ора В и Ора D-белки способствуют адгезии к эпителию и эндотелию макроорганизма. Орс-белок (инвазин) ответственен за инвагинацию менингококков в клеточную стенку и дальнейшую пенетрацию внутрь клетки [65]. В развитии последней, участвуют также два белка хозяина: сывороточный (гепаринсвязывающий гликопротеин) и витронектин из семейства интегринов. Образовавшийся «тройной комплекс» (белок Орс + витронектин +гепарин) способствует распространению и диссеминации патогена через клетки в подслизистый слой [8, 65]. Для N.meningitidis так же характерен горизонтальный перенос генов, антигенные вариации, «молекулярная» мимикрия, позволяющая организму успешно адаптироваться на слизистой оболочке [165].

Haemophilus influenzae. Факторы патогенности, фенотипы H. influenzae – факультативный анаэроб, относится к роду Haemophilus, который входит в семейство Pasteurellaceae. H influenzaе представляют собой небольшие грамотрицательные, сферические, овальные и палочковидные клетки [43, 93, 110].

К основным факторам вирулентности H.influenzae относятся наружный мембранный белок (OMP), пили, IgA протеаза, липополисахариды, капсулы. [53, 93, 110].

Исходя из химического строения и антигенных свойств полисахаридной капсулы бактерии, выделяют 6 серотипов H. influenzae: a, b, c, d, e, f, а так же бескапсульные штаммы [117]. Капсула серотипа b состоит из полирибозилрибитолфосфата (ПРФ), а типов a, c, d, e и f из тейхоевых кислот [126,139]. Именно капсульный полисахарид является фактором вирулентности H. influenzae типа b (Hib), вероятно, за счет содержания гексозы, обеспечивающей подавление комплемент-зависимой бактериолитической активности крови, опсонизации и фагоцитарной активности лейкоцитов [9]. С другой стороны, капсульный полисахарид является основным антигеном, к которому вырабатываются антитела при заболевании гемофильной инфекций типа b или здоровом носительстве Hib [9,181].

Штаммы H. influenzae экпрессируют около 20 наружных белков размером от 16 до 98 kDa. Наиболее часто экспрессируется белок Р2, взаимодействующий с липополисахаридами клеточной стенки хозяина, и белок Р5, участвующий во вторжении микроорганизмов в слизистые клетки эпителия [76, 94, 126,139]. Пили имеют высокую адгезию к буккальному эпителию и являются медиаторами при прикреплении бактерий к слизистой поверхности и, тем самым, способствуют колонизации дыхательных путей [48, 95]. IgA протеаза – белок размером 169 – кДа участвует в инактивации человеческого IgA, способствуя колонизации бактерий [112]. Липополисахарид (ЛПС) Н. influenzae является основным компонентом наружной мембраны, играет важную роль в патогенезе и образует комплекс с плазменным белком, который связывает мембрану клеток [98, 118].

1.2. Устойчивость возбудителей гнойного бактериального менингита Современная медицина активно использует различные АБП для лечения бактериальных менингитов, однако их повсеместное использование при отсутствии показаний привело к стремительной селекции резистентных штаммов микроорганизмов [181]. В настоящее время считается, что из трех основных возбудителей, только менингококки сохраняют высокую чувствительность к пенициллину [180]. Однако в последние годы сообщается о появлении штаммов менингококков устойчивых как к пенициллину, так и хлорамфениколу [91]. Так же в последнее время в мире отмечается появление пенициллин резистентных пневмококков (до 20-50%) и ампициллин резистентных Hib (до 50-60%) [180, 181]. В различных странах и географических регионах уровень резистентности этих возбудителей варьирует [181, 182]. Имеются сведения, что значительная часть пенициллиноустойчивых пневмококков может обладать перекрестной резистентностью к другим -лактамным антибиотикам, что связано с изменением структуры пенициллинсвязывающих белков [90]. У пневмококков снижение аффинности пенициллин связывающих белков (ПСБ) в большинстве случаев приводит к развитию устойчивости к препаратам пенициллинового ряда [69]. Основная функция данной группы мембранных белков, являющихся ферментами (трансгликозилазами и транспептидазами) состоит в катализе биосинтеза муреина [170]. Их активные центры способны образовывать ковалентные связи с бета-лактамным кольцом пенициллинов и цефалоспоринов, в результате чего ферменты инактивируются и бактериальная клетка теряет способность к синтезу клеточной стенки [2]. В настоящее время у S. pneumoniae выделяют 6 ПСБ, их подразделяют на ПСБ с высокой молекулярной массой класса А (HMW class A) (PBP1a; PBP 1b и PBP 2a), с высокой молекулярной массой класса B (HMW class B) (PBP2x; PBP 2b) и с низкой молекулярной массой (LMW PBPP3) [170]. Все перечисленные ПСБ имеют в своей структуре N- концевой пенициллин - связывающий домен, мутации в котором вызывают снижение аффинности ПСБ к бета-лактамам, и, соответственно, для подавления роста культур in vitro требуются более высокие концентрации препаратов, что проявляется в повышении их минимальной ингибирующей концентрации (МИК) [4, 27, 170]. Имеются сведения, что наиболее выраженное снижение чувствительности клинических изолятов к бета-лактамам связано с мутационными изменениями в генах pbp1a, pbp2x и pbp2b, которые кодируют соответствующие белки PBP1a, PBP2x и PBP2b [69,170]. У пенициллин устойчивых (ПУ) или пенициллин – промежуточно-устойчивых (ППУ) штаммов S. pneumoniae имеется аномальная мозаичная структура генов pbp1a, pbp2x и/ или pbp2b, которая является нормальной у пенициллин чувствительных (ПЧ) изолятов. Так же наличие мутации в генах pbp1a, pbp2x свидетельствует не только о принадлежности штамма к ППУ, но и о его сниженной чувствительности к цефалоспоринам III – го поколения - препаратам выбора при лечении бактериальных менингитов [113,114,122,123].

Кроме устойчивости к бета – лактамам, в последние годы становится все более актуальной проблемой резистентность S. pneumoniae к макролидам, в частности к эритромицину и фторхинолонам [27,85, 122, 132, 162]. Для S. pneumoniae известны 3 основных механизма лекарственной устойчивости к макролидам:

1) постранскрипционное метилирование аденина в остатке А2058 под воздействием фермента аденин-N6-метилтрансферазы. А2058 входит в состав домена V консервативного региона 23S рРНК и играет основную роль в связывании с макролидами. Метилирование нарушает его способность к взаимодействию с этими антибиотиками. Синтез аденин-N6-метилтрансферазы кодируется генами ermA и ermB [122];

2) мутационные изменения в генах, кодирующих рибосомальные белки L и L22, а также в А2058 и А2059 домена V консервативного региона 23S рРНК.

Эти мутации приводят к модификации мишени действия макролидов [170];

3) активный выброс (эффлюкс) антибиотика из бактериальной клетки, который осуществляется за счет протонной помпы, кодирующейся геном mefA [26,170].

Проблема резистентности Hib к пенициллинам и цефалоспоринам связана с продукцией -лактамазы [55]. Так же описаны штаммы Hib, устойчивость которых к ампициллину связанна с изменением пенициллинсвязывающих белков или снижением проницаемости наружной клеточной стенки [104] Эти штаммы получили название -лактомазонегативных ампициллин-резистентных и считаются нечувствительными к ингибиторозащищеным пенициллинам и цефалоспоринам II-го поколения [41, 177]. Устойчивость Hib к макролидам чаще всего связана со снижением в результате хромосомной мутации аффинности к антибиотикам 50S субъединицы рибосомы [115].

В последнее время стали повсеместно появляться штаммы N. meningitidis, устойчивые к сульфаниламидным препаратам. Также, обнаружены изоляты, устойчивые к рифампицину, хлорамфениколу, цефтриаксону, ципрофлоксацину [49, 75, 81, 172]. Резистентность к хлорамфениколу связана с продукцией бактериями фермента ацетилтрансферазы. Меньшее значение имеет снижение проницаемости внешних структур микробной клетки [103].

Рифампицин проявляет антибактериальное действие в результате ингибирования ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Для рифампицина характерна высокая частота развития резистентности в процессе лечения, которая формируется в результате хромосомных мутаций в генах РНК-полимеразы, приводящая к снижению способности данного фермента связываться с антибиотиком [156, 166].

Механизм действия хинолонов связан в основном с ингибированием фермента, обеспечивающего суперспирализацию бактериальной ДНК. Резистентность к хинолам обусловлена мутациями в генах ДНК-гиразы, приводящими к снижению аффинности фермента к препаратам [86, 127, 172].

Эпиднадзор за антибиотикорезистентными штаммами, основанный на данных лабораторных исследований, важен для отслеживания распространения менее чувствительных штаммов. Информация, полученная в процессе, может быть использована при составлении руководств по эмпирическому подбору антимикробных препаратов [181].

1.3. Лабораторная диагностика гнойных бактериальных менингитов Лабораторная диагностика гнойных бактериальных менингитов включает в себя комплекс методов, направленных на определение этиологически значимого микробного агента. К таким методам относится бактериологические, биохимические, серологические и молекулярно-генетические методы [28, 29].

Для обеспечения ростовых потребностей S. pneumoniae и N.meningitidis в состав искусственных питательных сред должны входить аминокислоты в форме L- изомеров (лизин, аргинин, метионин, треонин, гистидин, глицин, цистеин, аспарагин, изолейцин, валин и глутаминовая кислота, а так же холин, витамины группы В и их соединения, аденин, гуанин и урацил [2, 11, 12, 13, 14, 21, 22, 24].

Наиболее оптимальными средами, отвечающими этим требованиям, являются колумбийский или триптиказо-соевый агары [2], к которым добавляют дефибринированную кровь животных (барана, лошади или козла) до объемной концентрации 5% [27, 111]. В некоторых лабораториях используют человеческую кровь, однако экспертами ВОЗ это делать не рекомендуется, вследствие возможного наличия антител к пневмококковым антигенам и ряда других факторов [100, 182].

Одними из основных тестов лабораторного определения пневмококков являются «тест на растворимость в желчи» и тест с оптохином. Для пневмококка характерна чувствительность к оптохину [27]. Тест с солями желчных кислот является позитивным для всех капсулярных пневмококков и некоторых бескапсулярных. Энзим N-ацетилмурамилl-L-аланин амидаза (аутолизин) растворяет пептидогликан клеточной стенки [170]. Данный аутолитический процесс усиливается поверхностно активными агентами такими, как желчь, или солями желчи [68], а при добавлении дезоксихолата натрия (2%) в суспензию клеток пневмококка с нейтральной pH лизис происходит в течение короткого времени и раствор становится прозрачным [33, 51, 111].

Существуют также разработки по выявлению пневмококковых антигенов с помощью встречного иммуноэлектрофореза, иммуннофлюоресцентного и иммунноферментного анализов [122]. Хотя эти методы и имеют определенные достоинства, но имеются ограничения связанные с их стоимостью и относительно недостаточными параметрами чувствительности и специфичности [161]. Так, например, выявление антител к пневмолизину показало высокую (80-90%) чувствительность и специфичность, однако, учитывая отсроченность антительного ответа, данный метод применяется только ретроспективно при мониторинге [149]. В последние время все большую популярность набирает иммунохроматографический экспресс-анализ для выявления пневмококкового клеточного полисахарида (С-полисахарида) [151].

Для определения серогрупп и серотипов возбудителей ГБМ широко используется метод латекс-агглютинации [1, 70, 101]. К преимуществам этого метода относят скорость и простота использования, а к недостаткам – стоимость, и сравнительно низкая специфичность [21], в следствие возможных перекрестных реакций [57, 60, 81, 169]. Одним из серологических методов идентификации серотипов пневмококков является реакция набухания капсулы (тест Нейфельда).

Набухание капсулы происходит под влиянием сыворотки, содержащей поликлональные антикапсулярные антитела, и визуализируется при фазово-контрастной или обычной микроскопии [51]. К преимуществам данной методики относится ее быстрота, а к недостаткам – необходимость выделения чистой культуры и недостаточная чувствительность (не все штаммы имеют капсулу), а так же дороговизна метода и субъективность интерпретации [26,181].

Для культивирования H.influenzae необходимо присутствие в питательной среде X и V факторов роста [68]. Термостабильный фактор роста Х (гемин) образуется из гема, входящего в состав гемоглобина, путем окисление двухвалентного иона железа до трехвалентного. Фактор V - это термолабильный кофермент никотинамидадениндинуклеотид (НАД), участвующий в окислительновосстановительных реакциях бактериальной клетки [68, 181]. Исходя из этого, оптимальной средой для культивирования H.influenzae является «шоколадный агар», в состав которого входит «гретая кровь», содержащая X и V факторы, выделяющиеся при термическом разрушении эритроцитов. [29, 68].

Таким образом, несмотря на очевидные преимущества, бактериологического и иммунохимического методов исследования, скорость получения результата и их чувствительность являются сравнительно невысокими, что привело к попыткам разработки новых диагностических подходов, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР) [26, 84,145].

Для обнаружения S. pneumoniae используется серия генов-мишеней включающих пневмолизин (ply), аутолизин (lytA) и ген адгезии пневмококков к поверхности клетки (psaA) [66]. Однако, по данным литературы известно, что при анализе образцов материала из верхних дыхательных путей были получены ложноположительные результаты ПЦР, которые были основаны на детекции гена ply. Возможной причиной этих ложноположительных результатов могло быть выявление -гемолитических стрептококков, которые не относятся к виду S.

pneumoniae [138, 167], но обычно присутствуют в микрофлоре дыхательных путей (например, виды Streptococcus mitis и Streptococcus oralis) и они могут иметь ген ply [179].Таким образом, рекомендуется проводить реакцию ПЦР для выявления S. pneumoniae с использованием специфического сегмента гена аутолизина (lytA), так как он обладает более высокой внутриродовой консервативностью [152].

При разработке праймеров для генотипирования пневмококков с помощью ПЦР, рекомендуется, придерживаются следующих генетических постулатов [64]:

1. Гены, которые кодируют биосинтез каждого полисахарида, являются типоспецифическими и располагаются на хромосоме [27];

2. Типоспецифические гены, которые кодируют различные капсулярные типы, могут располагаться на идентичных участках хромосомы [105];

3. Типоспецифичные гены передаются комплексом во время генетической трансформации и интегрируются в донорскую хромосому путем рекомбинации гомологичных сегментов (механизм кассеты) [119];

4. Степень гомологичности между типоспецифическими генами различных капсулярных типов является минимальной [26];

5. В одном штамме присутствует только один набор типоспецифичных генов (за редко встречающимся исключением – бинарно-инкапсулированными штаммами) [150];

6. Только у капсулированных штаммов есть гены, ответственные за выработку капсулярного полисахарида [64].

Для идентификации N. meningitidis в роли мишеней могут выступать два гена – ctrA и sodC. Ген капсулярного транспортного белка клеточной поверхности – ctrA отличается высокой консервативностью среди изолятов, обуславливающих развитие инвазивных менингококковых инфекций [136]. Этот ген расположен внутри локуса капсулы. Однако более чем у 16% менингококков отсутствует носительство ctrA [73,78,153]. Ген sodC – ген супероксиддисмутазы Cu/Zn генетически не связан с локусом капсулы и позволяет выявлять не только капсулированные менингококки, но и не группируемые менингококки, не содержащие интактный ctrA, которые могут быть выделены при проведении исследований на носительство. Ген sia обеспечивающий биосинтез сиаловой кислоты [79,96], который также известен как ген syn, отвечающий за биосинтез, используется при генотипирования N. meningitidis серогрупп B (synD), C (synE), Y (synF) и W135 (synG) [88,168]. Ген sacB является мишенью для серогруппы A, тогда как ген xcbA, кодирующий капсульную полимеразу, выступает в качестве мишени для серогруппы X [60,136].

В качестве гена-мишени для детекции H.influenzae используют гены, кодирующие наружный мембранный белок Р6, P2, однако эпитопы данных белков встречаются и у H. haemolyticus [128,174]. Часто в качестве гена – мишени используется и ген bex A, кодирующий белок, отвечающий за внутриклеточный транспорт капсулярного полисахарида, однако данный ген отсутствует у бескапсулярных штаммов [116, 154,176]. Ген hpd, отвечает за кодирование белка D, представленного высоко консервативным липопротеином наружной мембраны, который присутствует у всех штаммов H. influenzae, как капсулированных, так и некапсулированных [104, 124, 162]. Консервативный характер этого гена и его наличие во всех охарактеризованных до настоящего времени штаммах H.

influenzae служит основанием для того, чтобы использовать его в качестве мишени в разработке видоспецифической ПЦР [176]. Для генотипирования H.

influenzae в качестве гена-мишени используется серотипспецифический участок гена сар кодирующего синтез капсулы и являющегося уникальными для каждого серотипа [116,155,175].

В исследованиях возбудителей бактериальных инфекций и изучении генетической природы и эволюции популяции бактерий используется целый ряд методов молекулярного типирования, в основе которых лежит анализ на уровне ДНК [181]. Некоторые методы применяются для характеристики штаммов, вызывающих локальные вспышки; другие методы используются для определения долговременных связей штаммов между собой и изучения популяционных структур [61].

Для изучения локальных вспышек используются методы молекулярного типирования с высокой специфичностью, позволяющие определять незначительные различия у генетически родственных штаммов. Эти методы также используются для детекции изменений на молекулярном уровне в периоды продолжительных вспышек [134]. Высокоспецифичные методы анализа способны выявлять быстро накапливающиеся генетические изменения и могут использоваться для определения микровариаций, применяемых для идентификации штаммов, циркулирующих в определенной географической зоне [34]. Используемые с этой целью методы включают в себя: риботипирование, метод произвольной амплификации полиморфной ДНК, анализ полиморфизма длин фрагментов амплификации с использованием флуоресцентной метки, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), мультилокусный анализ вариабельных тандемных повторов (MLVA) и гель-электрофорез в пульсирующем поле (ППГЭ). [61, 80,130].

Метод ППГЭ является одним из наиболее распространенных методов молекулярного типирования, благодаря своей высокой специфичности. Принцип ППГЭ заключается в применении рестрикционного фермента, с помощью которого происходит разрезание геномной ДНК в определенном положении последовательности на фрагменты, которые затем фракционируют по размеру в агарозном геле. Полученный таким образом специфический набор полос на электрофореграмме анализируют и сравнивают с другими изолятами [181].

В MLVA вариабельные последовательности коротких тандемных повторов, локализующиеся на специфических участках генома, используются для получения ДНК «отпечатков» для эпидемиологических исследований.

Аналогично методу ППГЭ, установление локусов методом MLVA позволяет решить проблему кластеризации [124], а использование высоко вариабельных по числу тандемных участков обусловливает высокую степень дифференцировки, с соответствующей специфичностью, между штаммами вспышки или группы заболеваний [159].

Отслеживание популяционной биологии возбудителей бактериальных инфекций в глобальном или даже в национальном масштабе требует использования метода молекулярного типирования, основанного на выявлении постепенно накапливающихся, избирательно нейтральных генетических изменений, которые различаясь между генотипами, но, тем не менее, могут определять группы клонов [157]. Один из наиболее часто встречающихся избирательных нейтральных участков генома представлен генами «домашнего хозяйства», которые кодируют белки, участвующие в метаболизме микроорганизма. Одним из первых методов молекулярного типирования, в котором использовался данный признак, являлся мультилокусный энзимэлектрофорез (МЛЭЭ) [157, 181]. Метод МЛЭЭ позволяет анализировать электрофоретическую подвижность метаболических ферментов «домашнего хозяйства» в геле, и, соответственно, изменения в подвижности каждого фермента аллельного варианта каждого локуса [56]. Для достижения высокой специфичности по каждому изоляту анализируют болеe 20 локусов. Генетические изменения, обусловливающие перестройки, необходимые для сдвигов подвижности, считаются избирательно нейтральными, благодаря чему электрофоретический тип бактериального клона должен быть относительно стабильным во времени [80]. Однако техническое выполнение метода является трудоемким, а постановка МЛЭЭ исследования на основе геля сильно усложняет задачу сравнения результатов между лабораториями [159].

В 1998 г. Maiden и соавторы разработали основанный на ДНК метод молекулярного типирования вида N. meningitides – метод молекулярного сиквенс типирования (МЛСТ) за основу которого, при анализе генов «домашнего хозяйства», был взят принцип метода МЛЭЭ [130, 159]. Метод МЛСТ характеризует штаммы по их аллельным профилям с помощью нуклеотидных последовательностей внутренних фрагментов семи генов «домашнего хозяйства», а не с помощью изменения электрофоретической подвижности паттернов, кодируемых ими ферментов [130]. Принцип метода заключается в том, что выбирается ограничительное количество бактериальных «нейтральных» генов, не кодирующие известные факторы патогенности или вирулентности, но являющиеся маркерами филогенетического родства. В исследуемой популяции каждый ген должен встречаться в достаточном числе аллелей (более десяти) [159, 130]. Желательно, чтобы вариации в данных генах накапливались медленно, а обладание тем или иным аллелям маркерного гена само по себе не обуславливало явных эволюционных преимуществ штамма [130]. Этому условию соответствуют гены цитоплазматических ферментов, отвечающих за внутриклеточный метаболизм. Этот подход был адаптирован для использования в типировании многих типов бактерий, в том числе N.

meningitidis, H. influenzae и S. pneumoniae, и, в настоящее время, является самым наиболее используемым методом молекулярного типирования. Несмотря на высокую стоимость проведения МЛСТ, данный метод обладает преимуществами перед МЛЭЭ [130, 164, 181]:

1. Напрямую выявляет генетические изменения и за счет этого определяет больше аллелей на один локус [130];

2. Легко воспроизводим, и обладает высокой производительностью [130, 3. Данные секвенирования воспроизводимы и пригодны для сравнения между лабораториями [130];

4. Анализ последовательностей можно проводить дистанционно, а готовые результаты пересылать по Интернету [130];

5. Данные секвенирования могут быть внесены в централизованную базу данных и доступны для всех ученых, через интернет в качестве мощного инструмента в глобальной эпидемиологии [181];

6. Информацию можно получать посредством ПЦР-амплификации из клинического материала [181].

Гены «домашнего хозяйства», отобранные для МЛСТ, не тесно связаны между собой в структуре бактериальных геномов и имеют консервативные участки последовательностей, что является оптимальным в конструировании праймеров для ПЦР, позволяющих проводить амплификацию всех или почти всех изолятов [130, 181]. Длина внутренних фрагментов позволяет обеспечивать идентификацию разных аллелей, а также проведение точного секвенирования каждой цепи с использованием отдельного праймера на каждом направлении. [134, 163, 164] Гены «домашнего хозяйства» используемые для МЛСТ N. meningitidis, H. influenzae и S. pneumoniae приведены в таблицах 10-12 [181].

Последовательности, которые различаются лишь в единственном нуклеотиде, считаются уникальными и не имеет значения число нуклеотидных замен в данной аллели [181]. Каждой уникальной аллели присваивается номер по порядку открытия и каждый изолят можно охарактеризовать по его мультиплексному генотипическому или аллельному профилю, обозначенному как сиквенс тип (СТ), который представляет собой набор аллелей по всем семи генетическим локусам [130, 157]. Сиквенс типы можно дополнительно разбить на клональные комплексы (КК), которые определены в базе данных как группа СТ, имеющие не менее четырех из семи общих локусов при наличии центрального СТ [159, 173]. Для более высокой дифференциации данные МЛСТ можно сочетать с данными секвенирования других, более вариабельных локусов, оказавшихся под положительным селективным давлением, как, например, пенициллинсвязывающие белки (ПСБ) у S. pneumonia [163, 164]. Кроме того, данные секвенирования для этих маркеров имеют большое значение в оценке аллельного распределения этих белков, как возможных кандидатов для рационального конструирования вакцин [181].

Гены «домашнего хозяйства», используемые для МЛСТ S. pneumoniae Гены «домашнего хозяйства», используемые для МЛСТ N. meningitidis Гены «домашнего хозяйства», используемые для МЛСТ H. influenzae Гены «домашнего хозяйства»

Вакцины являются основным инструментом для профилактики бактериальных менингитов и борьбы с ними [182]. Большинство вакцин против основных возбудителей ГБМ сконструированы на основе капсулярных полисахаридов.

Однако бактериальные полисахаридные антигены относятся к разряду Тнезависимых антигенов, которые слабо работают у детей до 2-х лет. Для усиления иммуногенности Т-независимых антигенов их конъюгируют с Т-независимыми носителями, в роли которых может выступать столбнячный или дифтерийный анатоксин [36].

Для профилактики инфекций, вызванных S. pneumoniae, существуют полисахаридные конъюгированные вакцины, которые были внедрены в практику во многих промышленно развитых странах, что обусловило резкое снижение заболеваемости пневмококковым менингитом у детей грудного и раннего возраста, а также у взрослых за счет индуцирования коллективного иммунитета [46, 102].

В настоящее время разработаны 7-валентная вакцина «Превенар 7» (Вайет, США), включающая полисахариды серотипов 4, 6B, 9V 14, 18C, 19F, 23F; 10валентная вакцина «Синфлорикс» (ГлаксоСмитКляйн, Бельгия), включающая полисахариды серотипов 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V 14, 18C, 19F, 23F) и 13-валентная пневмококковая конъюгированные вакцина «Превенар 13» (Вайет, США), включающая полисахариды серотипов 1, 3, 4, 5,6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F.

[67, 97]. Существует так же 23-валентная полисахаридная вакцина «Пневмо 23»

(Санофи Пастер, Франция). Однако данная вакцина не обладает эффективностью у детей моложе двух лет, то есть в группе, подверженной наибольшему риску заболеваемости менингитом, вызванным S. pneumoniae [102, 182]. Применяется эта вакцина для защиты детей старше 2-х лет, входящих в зону риска [36].

Вакцины против N. meningitidis, в состав которых входят капсульные полисахариды используются с начала 1970-х годов. В их число входит двухвалентная (против серогрупп A и C), трехвалентная (A, C, Y), и четырехвалентная вакцины (A, C, W135 и Y) [180, 182]. На территории Российской Федерации зарегистрированы следующие конъюгированные менингококковые вакцины, которые могут использоваться с 3-х месяцев: «Менинго А+С» (Санофи Пастер, Франция), «Менцевакс ACWY» (ГлаксоСмитКляйн, Бельгия). Имеются трудности в разработке вакцины на основе полисахарида против серогруппы В, так как гомополимер полисахаридной капсулы идентичен гомополимеру нервных клеток человека, что может вызвать различные аутоиммунные реакции [188]. Однако 29 мая года в Италии (Милан) была представлена мультикомпанентная вакцина для борьбы с менингококком группы B «Bexsero» (Новартис). Данная вакцина содержит 4 антигена – фактор Н связывающий белок (fHbp), нейссерия адгезин А (NadA), нейссерия гепарин связывающий антиген (NHBA), порин (PorA) серосубтип Р1.4. Данная вакцина может применяться у детей с 2-х месяцев, однако, она еще не зарегистрирована не в одной из стран СНГ, не в Российской Федерации[125].

Для детей раннего возраста уже существуют полисахаридная белковая конъюгированная Hib-вакцина [181]. В большинстве промышленно развитых стран эта вакцина позволила резко снизить заболеваемость Hib-менингитом и, в сущности, элиминировать данное заболевание как проблему общественного здравоохранения посредством прямого воздействия и формирования коллективного иммунитета [180, 181]. В последнее время многие развивающиеся страны уже внедрили или планируют внедрить Hib-вакцины путем введения ее в календарь прививок [182]. На территории Российской Федерации зарегистрированы следующие Hib конъюгированные вакцины: «Акт-Хиб» (Санофи Пастер, Франция) включает полисахарид конъюгированный со столбнячным анатоксином и «Хиберикс» (ГлаксоСмитКляйн, Бельгия) [36].

Своевременно проводимые массовые кампании вакцинации с использованием полисахаридных конъюгированных вакцин, могут успешно прерывать распространение эпидемий менингитов, так как конъюгированные вакцины, как правило, формируют более напряженный иммунитет, более длительную иммунную защиту, защиту у детей моложе 2 лет и могут разорвать цепь носительства и передачи инфекции, обеспечивая выработку коллективного иммунитета [120].

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. АНАЛИЗ РАСПОСТРАНЕНИЯ ОСНОВНЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ

ГНОЙНОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО МЕНИНГИТА В СТАНАХ СНГ

2.1 Идентификация возбудителей гнойного бактериального менингита в Было проведено исследование образцов СМЖ от 810 пациентов в возрасте от 1 месяца до 59месяцев и 29 дней с подозрением на бактериальный менингит. В региональную Референс лабораторию (РРЛ) образцы СМЖ поступали в замороженном в виде, поэтому данные образцы исследовались только методом ПЦР РВ и мультиплексной ПЦР (мПЦР).

Идентификация возбудителей из СМЖ проводили согласно алгоритму, представленному на рисунке 5 (рисунок 5).

Постановка видоспецифических реакций ПЦР в реальном времени:

Если sodC положитель- Если hpd положитель- Если lytA положительный:

Проведение серогруп- Проведение серотипо- мультиплексных реакций поспецифических реак- специфических реак- ПЦР на определение серотиций ПЦР в реальном ций ПЦР в реальном па.

времени на серогруппы времени на серотипы a, B, C, W135, X и Y.

Рисунок 5. Схема идентификации возбудителей БГМ из СМЖ методом ПЦР РВ При исследовании ликвора, первоначальным этапом был этап валидирования выделения ДНК, для этого проводили ПЦР в реальном времени с праймерами и зондом, разработанными к человеческой РНКазе. Все 810 образцов выделенных ДНК были позитивными по содержанию человеческой РНКазы, таким образом, данные образцы были признаны валидными для исследования с использованием молекулярно-генетическими методами.

В ходе дальнейшего исследования с применением видоспецифических праймеров зондов выявлено 267 (32%) позитивных образцов, из которых (55,4%) определены как N. meningitidis, 76 (28,4%) -S.pneumoniae и 43 (16,2%) H.influenzae (рисунок 6).

Рисунок 6. Распределение основных возбудителей ГБМ, определенных в СМЖ Таким образом, определено, что доминирующим возбудителем гнойного бактериального менингита, идентифицированным в СМЖ, был N.meningitidis, вторым по встречаемости был S.pneumoniae и реже встречался H.influenzae.

Для дальнейшего определения серотипов позитивных образцов были использованы метод ПЦР РВ для H.influenzae и N.meningitidis и метод мультиплексной ПЦР для S. pneumoniae.

Определение серотипов методом ПЦР РВ 43 позитивных образцов, в которых было выявлена ДНК H. influenzae, показало, что 100% (n=43) приходилось на H. influenzae группы b.

Определение серогруппы методом ПЦР РВ 148 образцов, в которых было выявлена ДНК N.meningitidis, показало, что 66,2% (n=98) приходилось на N.

meningitidis В; 22,2% (n=33) -N. meningitidis C; 6,1 % (n=9) -N. meningitidis W135;

4,8% (n=7) -N. meningitidis A; 0, 7% (n=1) - N. meningitidis Х (рисунок 7).

Рисунок 7. Распределение серотипов N.meningitidis в СМЖ.