WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ

ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ

ИМЕНИ К. И. СКРЯБИНА»

На правах рукописи

Разин Александр Николаевич

Технология получения биологически активной субстанции из Phallus impudicus и её применение для конструирования биопрепаратов с противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, М.Ю. Волков Москва –

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ПЕРЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………..... 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Высшие базидиомицеты, их характеристика и свойства

1.2. Условия культивирования базидиомицетов

1.3. Биологически активные вещества базидиомицетов

1.4. Биологическая активность полисахаридов базидиомицетов............... 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ……..………………………….... 2.2.1. Исследования процесса глубинного культивирования базидиомицета в жидких питательных средах

2.2.2. Определение питательных потребностей Phallus impudicus.......... 2.2.3. Оптимизация питательной среды

2.2.4. Приготовление лабораторной серии препарата

2.2.5. Промышленное получение биомассы мицелия Phallus impudicus

2.2.6.Хранение культуры Phallus impudicus

2.2.7. Физико-химические свойства препарата мицелия Phallus impudicus

2.2.8. Биологические свойства препаратов мицелия базидиомецетов на примере биологической модели in vivo

3.ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

5.ВЫВОДЫ…………………………………………………………………....

6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ…………………………………………………………………

7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ

ВЫВОДОВ…………………………………………………………………....... 8. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ………………….…....... ПРИЛОЖЕНИЯ……………………………………………………………........

ПЕРЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

АТЛ - аппаратурно-технологическая линия;

БАВ - биологически активное вещество;

ГЛФ - готовая лекарственная форма;

КLа - сульфитный коэффициент, характеризующий процесс массопередачи кислорода;

МГАВМиБ - Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина;

НК (КЖ) - нативная культура (культуральная жидкость);

НД - нормативно документация;

ПД - посевная доза;

ПМФ - посторонняя микрофлора;

ПО - питательная основа;

рН - водородный показатель;

ТРО - торможение роста опухоли PLE - препарат Lentinus edodes АКЭ - аденокарцинома Эрлиха ХЛ - хемилюминесценция СХЛ - спонтанная хемилюминесценция АОА - антиоксидантная активность УРД - уридиндифосфат АМФ - аденозинмонофосфат ГМФ - гуанизинмонофосфат БС - базидиомецетная субстанция ЦТК - Цикл трикарбоновых кислот ГПС - Глюкозопептонная среда ГЖХ - Газо-жидкостная хроматография АФК Активная форма кислорода

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Одним из перспективных направлений борьбы со злокачественными новообразованиями является химиопрофилактика биологически активными и активизирующим звено неспецифической противоопухолевой защиты и повышающим продукцию интерферона в крови (Ikekawa T., 2005, Takehara M.

2007).

Проведенный анализ профилактики раковых заболеваний (Заикина Н.А. и др., 2007; Oi V. at all, 1999) установил, что некоторые базидиомицеты, и в том числе Lentinus edodes (Шиитаке) и Fallus impudicus (Веселка обыкновенная), обладают защитными свойствами, снижающими частоту и риск появления злокачественных неоплазий.

профилактических и лечебных средств, оказывающих общеукрепляющее и тонизирующее действие на организм (Цивилева О.М. и др., 2001).

В медицине используются экстракты базидиомицета Phallus impudicus, Действующие вещества Phallus impudicus способствуют понижению незаживающих язв, заболеваний желудочно-кишечного тракта, воспалений почек и печени. Метаболиты Phallus impudicus оказывают противоопухолевое и антимикробное действие. Противоопухолевое действие базидиомицета Phallus impudicus обусловлено продуцированием полисахарида-глюкоманнана и некоторых других биологически активных веществ, вызывающих активацию цитотоксических лимфоцитов, усиление выработки перфоринов, что и приводит к уничтожению опухолевых клеток (апоптозу) (Никитина В.Е., 2008). Антимикробная активность метаболитов штамма Phallus impudicus определена способностью выработки антибиотических веществ (грибных фитонцидов), которые в том числе инактивируют вирусы герпеса, гриппа и гепатита (Денисова Н.П,. 1998).



Благодаря развитию биотехнологии стало возможным искусственное выращивание базидиомицетов методом глубинного культивирования в жидких питательных средах в аппаратах-ферментерах, обеспечивающее получение значительных количеств мицелия грибов и позволяющее выделять биологически активные метаболиты, применяемые для конструирования биопрепаратов с противоопухолевой активностью.

Цель работы.

Разработать технологию получения биологически активной субстанции из базидиомицета Phallus impudicus и на её основе создать биопрепараты, обладающие противоопухолевой и антиоксидантной активностью.

Задачи исследования.

1. Обосновать выбор штамма базидиомицета Phallus impudicus в качестве продуцента биологически активной базидиомицетной субстанции (БС) для конструирования биопрепаратов с противоопухолевыми свойствами.

2. Определить питательную потребность штамма базидиомицета Phallus impudicus и оптимизировать питательную среду для его глубинного культивирования.

3. Определить основные технологические параметры глубинного культивирования базидиомицета Phallus impudicus для максимального накопления БС.

4. Приготовить лабораторные образцы БС по разработанной технологии.

5. Приготовить 5 производственных серий БС и оценить ее противоопухолевые и антиоксидантные свойства на лабораторных животных.

6. Рассчитать экономическую эффективность технологии глубинного культивирования базидиомицета Phallus impudicus.

7. Разработать биологически активную добавку к пище «Веселка» на основе БС.

8. Разработать проект нормативной документации на лекарственное средство для животных: Базидиомицетная субстанция «ВЕСЕЛКА-2» и методы контроля ее качества.

Научная новизна.

Впервые разработаны технологические параметры и условия глубинного культивирования Phallus impudicus на новой питательной среде и получена базидиомицетная субстанция для конструирования биопрепаратов с противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами на модели аденокарциномы Эрлиха (далее АКЭ).

Впервые установлено, что БС Phallus impudicus обладает выраженным противоопухолевым действием, стимулируя функциональную активность иммунокомпетентных клеток.

Впервые установлено наличие прямой связи между скоростью роста АКЭ и интенсивностью эндогенного образования оксида азота.

Определена антирадикальная активность БС в условиях in vitro в модельной системе гемоглобин-люминол-пероксид водорода.

неспецифической противоопухолевой и антиоксидантной защитой для людей и животных на основе биологически активной субстанции БС, полученной из культуры музейного штамма Phallus impudicus Linnaeus, 1753: Persoon штамм 0781.

Практическая значимость работы.

Определена питательная потребность культуры Phallus impudicus и разработана пропись жидкой оптимизированной глюкозопептонной биореакторах.

На базе ООО «Шиитаке» (г. Санкт-Петербург) создана технологическая линия по производству субстанции БС из Phallus impudicus глубинным методом культивирования в промышленных маштабах.

Для применения в ветеринарии предложена отечественная субстанция БС противоопухолевыми и антиоксидантными свойствами.

Разработана биологически активная добавка к пище «Веселка» на основе разработанной субстанции Phallus impudicus (ТУ 9164-005-58301249-04, ТИ 10-005-58301249-04, СГР № 77.99.23.3.У.18).

Разработан проект нормативной документации на субстанцию БС и методы контроля ее качества для внедрения в ветеринарную практику: стандарт регламент производства.

Результаты исследований по оптимизации питательных сред и выбора технологических параметров и условий глубинного культивирования «Биотехнология» в ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И. Скрябина.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы доложены на Международной научно-практической конференции «Здоровое развитие ради будущих "Актуальные проблемы альгологии, микологии и гидроботаники" (Ташкент, 2009).

Личный вклад соискателя.

Автор организовал и непосредственно осуществил исследования по выбору штамма и обоснованию использования штамма Phallus impudicus, оптимизации питательной среды, разработке компонентного состава питательных сред, отработке режимов и параметров глубинного способа выращивания штамма Phallus impudicus, оценке качества препарата, установлению противоопухолевых, иммунокомпетентных и антиоксидантных свойств, анализу и теоретическому обобщению полученных данных, подготовке нормативной документации.

В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с Дерягиной В.П. (Институт онкогенеза РАН, г. Москва), Заикиной Н.А. и Галынкиным В.А. (ФГОУ СПбХФА, г. Санкт-Петербург), Коваленко А.Е. (Ботанический институт им. Комарова, г. Санкт-Петербург), которым выражаю благодарность за помощь и поддержку.

Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных работ, все в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 104 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (135 источников, из которых 90 отечественных и 45 иностранных).

Работа содержит 18 таблиц, 11 рисунков, 12 страниц приложений.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизированный состав жидкой глюкозопептонной питательной среды на основе установленной питательной потребности базидиомицета Phallus impudicus позволяет накапливать БС в заданных объемах.

2. Технологические параметры и условия глубинного культивирования Phallus impudicus позволяют получать субстанцию БС в промышленных масштабах.

3. Противоопухолевая эффективность субстанции БС Phallus impudicus при АКЭ и антиоксидантные свойства позволяют использование ее в конструировании биопрепаратов для людей и животных.

Автор работы выражает глубокую признательность и благодарность сотрудникам ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, ООО «Шиитаке», Генеральному директору ООО «Центр Фунготерапии Ирины Филипповой»

Филипповой Ирине Александровне, генеральному директору ООО «НПО «Биолюкс» Филиппову А.П., НИИ канцерогенеза, д.б.н. Дерягиной В.П. и к.м.н. Рыжовой Н. И., а также руководству этих организаций за возможность выполнения научных и практических исследований по оценке биологических свойств и постановке на производство разработанного препарата.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Высшие базидиомицеты, их характеристика и свойства Базидиомицеты (Basidiomycota) — это высшие совершенные грибы, характеризующиеся наличием пряжек на мицелии. Отдел Basidiomycota включает около 30% всех известных видов грибов, с подотделами Agaricomycotina, Pucciniomycotina, Ustilaginomycotina. Среди базидиомицетов есть почвенные сапротрофы (шампиньоны, навозники и др.), опасные паразиты растений (головневые, ржавчинные грибы) и микоризообразующие грибы (около половины видов всех шляпочных грибов), которые успешно развиваются только в тесном контакте с корнями древесных растений (например, белый гриб, подберезовик, подосиновик и др.). Есть среди них и древесные сапротрофы – активные разрушители древесины и валежника [39, 43].

Для отдела Basidiomycota, или базидиальных грибов, диагностическим признаком является наличие базидии (мейоспорангия) с экзогенными базидиоспорами, которые образуются в результате полового процесса – соматогамии. Большинство базидиомицетов являются макромицетами, образующими плодовые тела – базидиокарпы (Flamulina sp., Ganoderma sp.,Tramates sp. Boletus и др.). Другие существуют в виде микроскопического мицелия или дрожжевых клеток (Rhodotorula sp.,Sporobolomyces sp, и др.) и являются микромицетами [50].

Отдел базидиомицетов объединяет три подотдела, различающихся строением базидии:

холобазидиомицеты (грибы с неразделенной одноклеточной булавовидной или цилиндрической базидией, развивающейся непосредственно из производящей ее и затем разрастающейся клетки);

гетеробазидиальные грибы (имеют сложную многоклеточную базидию с очень крупными стеригмами);

телиоспоромицеты (грибы, у которых спора вырастает из толстостенной покоящейся клетки - телиоспоры) [22].

Плодовые тела мицелиальных базидиомицетов бывают двух типов:

гимениальные и гастеруальные. У плодовых тел гимениального типа базидии образуют гимений на поверхности плодового тела. Гимений покрывает все плодовое тело или, чаще, только его специализированную часть – гименофор.

У плодовых тел гастеруального типа базидии образуются внутри плодового тела, замкнутого до полного созревания базидиоспор, после чего оболочка плодового тела разрывается и споры освобождаются.

Плодовые тела гастеромицетов очень разнообразны по форме. В начале своего развития они чаще шаровидные, яйцевидные, клубневидные или цилиндрические. У некоторых видов эта форма сохраняется до полного созревания (виды родов Lycoperdon, Bovista, Calvatia и др.). У большинства видов по мере развития плодового тела его форма изменяется и становится бокальчатой, воронковидной, звездообразной или принимает необычные очертания («грибы-цветы» из родов Dictyophora, Podaxis, Simblum, Clathrus).

Плодовые тела разнообразны по размерам: от 1 до 60-70 см в диаметре.

Они могут быть подземными, полуподземными и наземными. Наземные плодовые тела бывают сидячими (Bovista sp.), с ложной ножкой, образованной из суженной нижней части плодового тела (Lycoperdon sp.), и с настоящей ножкой (Tulostoma sp.). У некоторых видов образуется особый плодоносец рецептакул, часто в виде ножки, обычно ячеистой или губчатой структуры (Phallus sp., Dictyophora sp.) [43]. Плодовые тела гастеромицетов могут быть различной формы и консистенции. Они могут состоять из шляпки и ножки, быть копытообразными, шаровидными, паутинистыми, рыхлыми, плотновойлочными, волокнистыми, мясистыми, могут иметь форму пленок, корочек и т.п. [43].

В цикле развития базидиальных грибов преобладает дикариотический мицелий. Гаплоидная фаза короткая. Она представлена базидиоспорами и выросшим из них мицелием, который существует недолгое время, а затем его клетки сливаются и дают начало дикариотическому мицелию [43].

На концах дикариотических гиф образуются базидии. На базидиях развиваются базидиоспоры. Число базидиоспор типично для большинства видов – четыре, однако встречаются виды с двумя, тремя, шестью и восьмью базидиоспорами. Каждая спора соединяется с базидией роговидными или нитевидными отростками – стеригмами. Дикариотический мицелий у большинства видов базидиальных грибов характеризуется наличием пряжек, особых клеток вблизи септы мицелия. Пряжки служат для передачи цитоплазмы и ядер из клетки в клетку. У большинства базидиомицетов базидии с базидиоспорами образуются на плодовых телах или внутри них.

Плодовые тела образованы дикариотическим мицелием. У большинства базидиомицетов рассеивание базидиоспор происходит путем их активного выброса. В основе этого явления лежит повышение внутриклеточного давления при гидролизе гликогена [43].

Важной структурно-химической характеристикой грибов и, в частности, базидиомицетов является состав и строение их клеточных стенок. У мицелиальных базидиомицетов различают первичную и вторичную клеточные стенки. Клетки образуются на кончике растущей гифы (апексе) и по мере ее роста становится внутренним слоем зрелой клеточной стенки.

Основной ее компонент – хитин, полимер N-ацетил-глюкозамина, связанного 1,3 -1,4-глюкозидными связями. Вторая стадия образования клеточной стенки соответствует появлению вторичного слоя, включающего глюкан, маннан и другие полимеры, расположенные на первичной клеточной стенке. Зрелая клеточная стенка мицелиальных грибов имеет толщину 100-280 нм и может составлять до 60% сухой массы клеток. Микрофибриллы хитина выполняют функцию ее скелета, а другие полимеры (полисахариды, белки, липиды, гликопротеины) являются матриксом, в котором локализованы макрофибриллы. Помимо хитина, опорную функцию у некоторых грибов выполняет хитозан – полимер неацетилированного или частично ацетилированного глюкозамина. Содержание хитина в клеточной стенке зависит от видовой принадлежности гриба и способов его культивирования и составляет у мицеллиальных грибов 0,2-26,2% сухой массы стенок [85].

Полисахариды в клеточной стенке могут быть связаны с белками и липидами. Некоторые из грибных белков являются ферментами. Их содержание в грибах находится в пределах 0,5-20%. Липиды клеточной стенки составляют 1-28% сухой массы. Они определяют ее гидрофобность, что особенно заметно проявляется у спорангиофоров и спор. Некоторые из них входят в состав матрикса. Липиды принимают участие в синтезе компонентов клеточной стенки, активируя хитинсинтетазу, связанную с мембраной хитосом специфических мембранных органоидов, в которых происходит синтез хитина. Помимо хитоса, в синтезе клеточной стенки принимают участие особые пузырьки (везикулы), которые образуются на мембранах аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулума и содержат ферменты и другие вещества, необходимые для образования структур клеточной стенки. Перемещение везикул к апексу происходит вместе с током цитоплазмы и при участии микрофиламентов цитоскелета [38].

Сборка полимеров происходит из активированных мономеров, чаще всего из уридиндифосфатов (УДФ-глюкозы, УДФ-ацетил-глюкозамина, УДФгалактозы), реже из ГДФ. Мономеры образуют в цитоплазме активированные олигомеры, которые поступают в эндоплазматический ретикулум и упаковываются там вместе с ферментами (например, хитинсинтезой) в пузырьки, проходящие через плазмалемму к участкам синтеза клеточной стенки. Первый способ считается преимущественным при сборке полисахаридного матрикса, второй – микрофибрилл [44].

биомассы, толщина ее у разных видов колеблется в пределах 40-250 нм. Как и у мицелиальных грибов, она построена из аморфного матрикса и микрофибрилл, образующих ее ригидный скелет. Матрикс состоит преимущественно из маннанов, а каркас клеточной стенки – из -глюканов, часто связанных с хитином. Основную механическую нагрузку несет маннан, а глюкановый слой, расположенный под ним, эластичен и способен выдержать значительные напряжения клеточной стенки в процессе почкования.

Глюканы и маннаны составляют более половины сухой массы клеточной стенки дрожжей. Они связаны с белками, которые располагаются на поверхности клетки и в основном являются ферментами-гидролизами. На поверхности располагаются и липиды, которые могут также проникать внутрь клетки. Содержание белков составляет 5-22 %, а липидов 2-17 % сухой массы клеточной стенки. Глюкозамин (1-3 %) частично входит в состав хитина, а в основном является компонентом гликопротеидов. Хитин располагается преимущественно в зоне почечных рубцов [35].

Состав и архитектоника клеточной стенки зависит не только от видовой принадлежности гриба, но и от его возрастной фазы. Например, клеточная стенка дрожжей, находящихся в фазе логарифмического роста, может быть разрушена с помощью литических ферментов, тогда как при переходе в стационарную фазу в ней появляются компоненты, повышающие ее устойчивость к действию ферментов и превращению в протопласт.

Характерной особенностью клеточной стенки дрожжей являются рубцы, которые образуются при почковании клеток. Они имеют особую структуру, которая зависит от типа почкования или деления клетки. Количество рубцов определяет возраст клетки [84].

1.2. Условия культивирования базидиомицетов Количество грибов в природе в последние годы катастрофически сокращается. [33, 56, 89] Причиной этого является уменьшение площади лесов, загрязнение почвы, водоёмов и воздуха [46]. Сбор дикорастущих грибов может осуществляться не более 4-6 месяцев в году, вместе с тем, спрос на грибы в пищевой, а также фармацевтической промышленности указывает на необходимость их искусственного разведения и расширения ассортимента культивируемых грибов. Промышленное производство грибов во многих странах выделилось в самостоятельную высокопроизводительную отрасль.

С целью определения возможности промышленного культивирования были испытаны около 100 видов базидиомицетов. В настоящее время освоено выращивание в коммерческих целях около 35 видов, наиболее популярными из которых являются: Agaricus bisporus, Lentinus edodes, Pleorotus sp., Flammulina velutipes, Pholiola nameco, Tramella fuciformis и др., а в последние годы в коммерческое культивирование вошли новые виды грибов, такие как Ganoderma lucidum, Pleorotus citrinopileatus, Lepista nuda [25, 26, 27, 45, 61].

Чистую культуру мицелия начали получать из спор в XIX веке [41].

Первоначально как посадочный материал использовали дикорастущую грибницу, которую собирали в местах естественного обитания грибов.

Наиболее универсальным является метод выделения чистых культур высших базидиомицетов из плодовых тел, поскольку он позволяет получить дикариотическую мицелиальную культуру без дополнительных скрещиваний гаплоидного мицелия (метод споровых отпечатков) [20, 39].

Для выделения мицелиальных культур из плодовых тел последние тщательно очищают, промывают, обжигают над пламенем горелки и в асептических условиях берут кусочек из внутренней части (размером 3 - мм) и помещают на поверхность плотной питательной среды в чашке Петри.

В качестве питательной среды используют сусло-агар или картофельноглюкозный отвар с рН 4,0-5,0 и добавлением дрожжевого автолизата и отвара дубовой коры. Для предотвращения бактериального загрязнения в среду добавляют пенициллин и стрептомицин по 100-200 Ед/мг. При появлении роста мицелия его переносят в пробирки с аналогичной чистой средой.

Чистые мицелиальные культуры, выделенные из плодовых тел на суслоагаре, поддерживаются на плотных питательных средах длительное время [57].

Питательный субстрат выбирают в соответствии с потребностями данного вида, используя в основном наиболее доступное и экономически выгодное сырье, как правило, отходы дереобрабатывающей и пищевой промышленности, и сельского хозяйства [39].

Большое значение для культивирования имеет микробиота субстрата.

Установлено, что Agaricus bisporus и Agaricus campestris облигатно связаны в своем развитии с микробиотой почвы, а на стерильном субстрате не образуют плодовых тел. Для культивирования шампиньонов часто используют конский навоз, для кольцевика – увлажнённую соломенную сечку. Также посевной мицелий можно выращивать на зерне злаков – пшеницы, ржи, овса, проса, кукурузы.

Pleurotus ostreatus культивируется на специально подготовленных субстратах из отходов сельского хозяйства. При подготовке субстрата для выращивания Pleorotus ostreatus используют чистые культуры термофильных бактерий рода Bacillus, которые обладают антагонистическими свойствами к контаминирующим макромицетам, образуют витамины и другие БАВ, благоприятно действующие на рост гриба [13, 24].

Освещение, температура и содержание углекислого газа в воздухе так же имеют значение при искусственном выращивании грибов[45].

Благодаря развитию биотехнологии стало возможным выращивание базидиомицетов методом глубинного культивирования с использованием мицелиальных штаммов грибов. Так, для накопления биомассы вешенки питательная среда должна содержать следующие соли, г/л: КН2РО4 - 0,5;

К2НРО4 - 0,5; MgS04*7H20 - 0,25. В качестве источников углерода возможно использовать: кукурузный экстракт, концентрат картофельного сока, дрожжевой экстракт, дрожжевой автолизат, нативный картофельный сок. При этом максимальный выход биомассы может быть получен при использовании концентрата картофельного сока, а наиболее высокое содержание протеина отмечается в биомассе, выращенной на среде с кукурузным экстрактом.

Биомасса, полученная таким образом, может использоваться как в пищу, так и в качестве сырья в фармацевтической промышленности при производстве препаратов на основе гриба вешенки [24, 91].

Шиитаке (Lentinus edodes) – гриб, традиционно используемый в пищу в странах Юго-Восточной Азии. В настоящее время популярность шиитаке возросла в связи с определением у него лечебных свойств [61, 66, 73, 93, 108].

Традиционный метод культивирования Lentinula edodes – на свежих древесных обрубках. Период инокуляции (разрастания мицелия) на обрубках составляет 6-18 месяцев. Оптимальная температура – 20-26°С. Образование зачатков грибов требует освещённости на уровне 100 люкс и влажности воздуха 70-85% и происходит в течение 3-10 дней после замачивания обрубков в воде на 1-3 суток. В настоящее время мицелий Lentinula edodes выращивают в погружной культуре [111].

Установлено, что накопление биомассы определяется сочетанием источников углерода и азота, причём достаточно интенсивное накопление биомассы имеет место на среде с мальтозой, глюкозой, маннитом и галактозой; из источников азота наиболее подходящими оказались нитрат и сульфат аммония, а также нитрат натрия. Вместе с тем, мицелий, полученный методом глубинного культивирования, содержит больше белка, чем плодовые тела [127].

искусственных условиях. Опёнок зимний выращивают интенсивным методом на опилках лиственных деревьев. В качестве питательной добавки вносят отруби и другие отходы пищевой промышленности, золу, минеральные азотсодержащие соединения, известняк. Зачатки плодовых тел образуются при температуре 10-12°С, влажности воздуха 80-85%, освещении 50 люкс в течение 10-14 дней (после предварительного развития мицелия при температуре 20-25 °С и влажности 65% в течение 20-23 суток) [135].

В последние 20 лет резко возрос коммерческий интерес к продуктам медицинского назначения, получаемым из трутовика лакированного (Ganoderma lucidum). Культуру хранят на картофельно-глюкозном-агаре или сусло-агаре с добавлением дрожжевого автолизата, так как для Ganoderma lucidum необходим витамин B 1. Субстратом для твердофазного культивирования служит древесина широколиственных пород, к которой добавляют отруби (18%), сахарозу и мел (по 1 %), и воду. Субстрат помещают в специальные мешки или бутыли из синтетического термостойкого материала, стерилизуют в автоклаве при 121°С 14 мин [5, 92].

Также в качестве твёрдых сред используют ячмень, ячмень с осиновыми опилками, пшеницу, лузгу подсолнечника, рис; для жидких сред используют неохмелённое сусло, отвары из вышеперечисленных зерновых культур с добавками микроэлементов и кальция.

Для жидкофазного культивирования применяют среду следующего состава: сахароза – 50 г, сукцинат аммония – 3,2 г, KH2PO4 – 1.0 г, MgS04*7H20 – 0,3 г, FeS04*7H20 – 13 мг, ZnS04*7H20 – 4 мг, дрожжевой экстракт – 10 г, вода – до 1 л, рН 5.2; ферментацию проводят при 30°С.

В опытах по определению питательной потребности Ganoderma lucidum было установлено влияние различных источников углерода, таких как моносахариды (арабиноза, галактоза, глюкоза, ксилоза, манноза, фруктоза), дисахариды (лактоза, мальтоза, сахароза), полиолы (маннит, сорбит) и полисахариды (крахмал, целлюлоза) на выход биомассы.

Одним из важнейших факторов, регулирующих рост и метаболизм высших базидиомицетов в культуре, является рН питательной среды. Этот показатель влияет на свойство клеточных стенок, транспорт питательных веществ, мембранные реакции, скорость роста, характер метаболизма.

Большинство грибов растут при значительном изменении показателей кислотности, хотя для многих грибов оптимальными значениями рН являются 5,0-6,0. Например, Ganoderma lucidum может также расти в широком диапазоне начальных значений рН с оптимумом 4,0-6,0 [39,45].

Изучение питательных потребностей базидиомицетов позволяет установить физиологические особенности грибов и перейти к выбору субстратов для крупномасштабного глубинного культивирования. Этот метод, использующий достижения современной биотехнологии, позволяет значительно интенсифицировать процесс получения исходного сырья за счёт сокращения длительности культивирования и увеличения выхода целевых метаболитов. Однако этот способ выращивания в настоящее время применяется не широко из-за трудностей, связанных в основном с медленным ростом базидиомицетов, необходимостью использовать богатые питательные среды и опасности контаминации ферментационной среды посторонними микроорганизмами.

В настоящее время для получения плодовых тел базидиомицетов их выращивают на твердом субстрате, а для получения биомассы мицелия грибы культивируют в жидкой питательной среде.

В качестве твердого органического субстрата для выращивания плодовых тел макромицетов используют любой лингинсодержащий материал: солому, камыш, лузгу подсолнечника, опил лиственных пород деревьев и т.п. [39].

Для глубинного культивирования могут применяться натуральные (жидкое сусло) и синтетические среды (глюкозопептонная среда и др.).

Важную роль в процессе роста культуры играют источники углерода, так как культуре для развития необходимо достаточное количество легко утилизируемых сахаров, а содержание азота в среде не оказывает существенного влияния на накопление биомассы. Вместе с тем, установлено, что грибы-базидиомицеты не способны расти на средах, содержащих только неорганические источники азота. Для большинства грибов оптимальная температура в период разрастания мицелия – 20-26°С при значениях рН 4.0при этом время культивирования составляет 14-17 суток на агаровых блоках или 10-12 суток на посевном материале, подращенном в течение суток.

1.3. Биологически активные вещества базидиомицетов История развития медицины свидетельствует, что до XVIII века при лечении самых различных заболеваний применялись преимущественно средства растительного происхождения. Начиная с середины XIX века, в связи со значительными успехами в области химии, официальная медицина практически полностью и очень быстро переориентировалась на использование в лечебной практике химических препаратов. И только открытие пенициллина в середине XX века послужило стимулом к научному изучению фармакологически активных веществ грибного происхождения на основе новых подходов и с учетом накопленного опыта создания лекарственных препаратов. Сегодня хорошо известные народной медицине разных стран целебные грибы, а также «благородные плесени», широко используются в основе самых разнообразных лекарственных средств и биологически активных добавок, применяемых для профилактики и терапии многих заболеваний.

Биологическая активность высших базидиомицетов определяется присутствием в их плодовых телах, культуральном мицелии и культуральной жидкости активных компонентов, среди которых наибольшее значение имеют полисахариды, терпеноиды и иммуномодулирующие протеины (лектины) [3, 5, 7, 11].

Некоторые полисахариды обладают антивирусной, антибактериальной, антиоксидантной, противовоспалительной, антидиабетической и гипогликемической активностью, а также гепатопротективным, гипохолестеринемическим и ранозаживляющим действием [6, 34, 132].

Среди природных макромолекул полисахариды отличаются высокой способностью к передаче биологической информации – благодаря высокому потенциалу структурной вариабельности, обеспечивающей необходимую гибкость регуляторных механизмов межклеточного взаимодействия у высших организмов. С этим связано и разнообразие процессов, в которых проявляется их биологических активность [123].

Иммуномодулирующие и противоопухолевые полисахариды содержатся в грибах, водорослях, лишайниках и растениях. Они разнообразны по структуре. В основном это глюканы с -1, 3 и -1,6-, а также с -1,3гликозидными связями. Некоторые являются гетерогликанами или протеогликанами. Противоопухолевое действие связано с их способностью активировать клетки иммунной системы: макрофаги, Т-лимфоциты, естественные киллеры. Предположительно, эти вещества способны индуцировать экспрессию генов некоторых цитокинов. Активация сопровождается образованием фактора некроза опухоли, интерлейкинов, интерферона, повышением фагоцитарной реакции макрофагов [,23, 34, 45].

Иммунобиологические эффекты большинства изученных полисахаридов осуществляются, в первую очередь, через активацию мононуклеарных фагоцитов. Предполагают, что одним из механизмов иммуномодулирующего действия полисахаридов является их контакт с поверхностью мембраны иммунокомпетентных клеток. Связываясь с рецепторами мембран лимфоцитов и мононуклеарных фагоцитов, полисахариды могут усиливать функциональную активность этих клеток, что приводит к усилению сопротивляемости организма [63].

изолированные из грибов родов Agaricus, Auricularia, Boletus, Coriolus, Calvatia, Coptinus, Flammulina, Ganoderma, Grifola, Hohenbuehelia, Hericium, Inonotus, Lentinus, Nidula, Paxillus, Piptoporus, Pleurotus, Tremella, Tricholoma, Volvariella. Эти гликаны по своей природе оказались водорастворимыми -Dглюканами с сильно разветвленной структурой, в состав которых входит глюкоза, ксилоза, манноза, галактоза и другие моно-и полисахариды, а также - D- гликанпротеиновые комплексы (протеогликаны) [8, 117, 124].

Так, шизофиллан (-1, 3--1,6-глюкан), выделенный из клеток гриба Schisophyllum commune fries, стимулирует цитотоксическую и фагоцитарную активность макрофагов благодаря тому, что полисахарид аккумулируется в макрофагах и повышает в них уровень ферментов – кислой фосфатазы, 3глюкуронидазы. Фагоцитарная активность макрофагов под действием шизофиллана усиливается как in vivo, так in vitro. Установлено, что этот глюкан вызывает секрецию интерферона и ИЛ-1 макрофагов. За счет активации цитотоксичности перитонеальных, легочных и бронхоальвеолярных макрофагов шизофиллан проявлял противоопухолевый эффект.

Его цитотоксическое действие на клетки опухоли было связано не только с участием макрофагов, но и лимфоцитов, проявлявших повышенный пролиферативный ответ на митогены [113].

Полисахариды из Pleurotus ostreatus представляют собой -1,3-связаные глюканы. Они оказывают стимулирующее действие на функциональную активность системы мононуклеарных фагоцитов [94, 99].

В экспериментальных исследованиях было установлено, что это вещество ингибирует рост и возникновение многих раковых опухолей, разрушает вирусы иммунодефицита человека (ВИЧ), стимулирует активность Т-лимфоцитов [133].

Биологически активное действие гриба Грифола курчавая (Grifola frondosa) в основном обусловлено высоким содержанием полисахарида -1,6глюкана [135].

Из гриба Pleurotus citrinopileatus было экстрагировано несколько биологически активных полисахаридсодержащих соединений. Водорастворимая фракция представляет собой гетерополисахарид, содержащий 9,8% белка, галактозу, маннозу, арабинозу и галактозы. Водонерастворимая фракция содержит белоксодержащие -1,3-D-глюканы. Все гликоконьюгаты обладают противоопухолевой активностью, сравнимой с действием крестина, в отношении саркомы-180. При этом эффект водонерастворимых соединений является более выраженным, чем водорастворимых [112].

Население провинции Нагона (Япония), которое занимается выращиванием (опёнок зимний), значительно меньше подвергается раковым заболеваниям, чем жители других провинций.

Противоопухолевые свойства определены у низкомолекулярного глюкан-протеиного комплекса (ЕА6), выделенного из плодовых тел Flamulina velutipes и состоящего из молекул глюкозы, маннозы, арабинозы и 16-ти аминокислот. Установлено, что он реализует противоопухолевое действие через активацию иммунной системы [135].

Биологически активные полисахариды, выделенные из Ganoderma lucidum, в специфическом сочетании -глюканов, арабиноглюканов и эргостеринов стимулируют деятельность иммунной системы и определяют лечебные свойства этого базидиомицета [14, 92].

Lentinus edodes относится к высшим базидиомицетам. Лекарственные свойства Lentinus edodes известны с древнейших времен. В старинных китайских трактатах написано: «Шиитаке концентрирует жизненную энергию, спасает от голода, помогает переносить холод и наполняет тело жизненной энергией». Lentinus edodes занимает первое место по объему производства среди других грибов в Японии. [68, 69].

Lentinus edodes получают как в виде плодовых тел, так и в виде мицелия в погруженной культуре. Биологическая полифункциональность определяется уникальными компонентным составом Lentinus edodes.

Питательная ценность Lentinus edodes обусловлена наличием важнейших в рационе питания аминокислот, в том числе, незаменимых, среди них много лейцина и лизина. В составе Lentinus edodes обнаружено достаточное количество витамина D.

Особая ценность Lentinus edodes определяется не только высоким содержанием белка, но и наличием липидов С18-30, составляющих до 73% от общей суммы жирных кислот. Разнообразен и микроэлементный состав тел Lentinus edodes, включающий железо, медь, цинк, калий и др.. Большую часть массы Lentinus edodes составляют полисахариды: в шляпке – 38.3 (39.5%); в ножке – 48.7 (51.6%); в мицелии – 53.5 (59.3%) [109].

В основном, полисахаридный компонент высших базидиомицетов находится в клеточной стенке гриба. Эти полисахариды можно разделить на две группы: структурные компоненты, к которым относят полиаминосахара щелочерастворимые компоненты, которые являются маннано-протеинами, глюкурономаннанопротеинами и -1-3 глюканами.

Интенсивное изучение углеводных полимеров Lentinus edodes позволило растворимости. Водорастворимые полисахариды представлены, в частности, гетерополисахаридами, связанными с белком и состоящими из глюкозных, маннозных, арабинозных и галактозных остатков. Нерастворимые полисахариды представлены -D-глюканами, в основном, (1-3)-D-глюканами.

Наличие -D-глюкана, гетерогликана и гликопротеина делает некоторые съедобные грибы важнейшим источником получения современных антиканцерогенных препаратов [75].

представлена полиглюканами с -1-3-связями в основной цепи и - 1- 6 в боковой с м.м. 500000 кДа.

На основе полисахаридов Lentinus edodes разработаны лекарственные препараты, используемые в настоящее время в медицинской практике для комплексной профилактики и терапии опухолевых заболеваний, а также ряд иммуномодуляторов.

Несколько гликоконъюгатов с иммуномодулирующей активностью было выделено и из базидиального гриба Trametes (coriolus) versicolor, например, крестин. Крестин является хорошо изученным и применяемым в лечебной практике -1,4-, -1,3-, -1,6- глюканом, содержащим 25-38% белка [12].

Антивирусная и антимикробная активность полисахаридов грибов, вероятно, связана с их способностью активировать защитные силы организма. Так, сульфатированные лентинан и шизофиллан активны в отношении ВИЧ, однако противоопухолевое действие модифицированных полисахаридов слабее, чем нативных.

Антиоксидантная активность и способность выводить свободные радикалы, возможно, связана с индукцией экспрессии генов, кодирующих антиоксидантные ферменты (глютатионпероксидаза и Мn-супероксиддисмутаза) в макрофагах. Помимо этого некоторые протеогликаны сами являются антиоксидантами и способствуют выведению из организма супероксидных радикалов [40]. Так, экстракт плодовых тел из гриба Pleurotus ostreatus, содержащий жирные кислоты, обладает высокой антиоксидантной активностью [32].

Гепатопротективное действие отмечено у лентинана, шизофиллана, полисахаридов Ganoderma lucidum, Trametes versicolor, Grifola frondosa, Dendropolyporus umbellatus, Tremella fuciformis, Wolfiporis cocos. Оно определяется способностью полисахаридов связывать вещества, токсичные для клеток печени и активировать биосинтетические процессы последних. В экспериментах на животных было показано, что полисахариды Ganoderma lucidum снижают уровень трансаминазы и коллагена в печени [40,32].

Противовоспалительная активность полисахаридов некоторых грибов показана в модельных экспериментах, где выявлена их способность подавлять проницаемость сосудов и активность медиаторов воспалительного процесса [40].

Антидиабетическая и гипогликемическая активность полисахаридов Ganoderma lucidum (ганодерманы А, В, С) и кислого полисахарида Tremella aurantia установлена в экспериментах. Полисахарид ганодермы вызывает повышение содержания инсулина в плазме и ускорение метаболизма глюкозы [8]. Такое же действие обнаружено у гликопротеинов Grifola frondosa и Trametes versicolor [48].

Ранозаживляющее действие отмечено у аминополисахаридов грибов – хитина и хитаноза, которые способствуют росту фибробластов и представляют матрикс, способный их удерживать, что приводит к активному отложению коллагена и грануляции ткани [32,40].

Грибы базидиомицеты содержат большие количества волокон, растительных стиролов, белков, микроэлементов и обладают низкой калорийностью, поэтому являются идеальным диетическим продуктом;

оказывают гипохолестеринемическое и гиполипидемическое действие и используются для предупреждения сердечно-сосудистых заболеваний.

Гиполипидимическую активность грибов связывают с взаимодействием сырых волокон (-глюканы, пектин) и хитозана с желчными кислотами в тонком кишечнике. Благодаря способности связывать желчные кислоты эти компоненты подавляют образование мицелл, необходимых для абсорбции липидов. Увеличенная экскреция и пониженная циркуляция в кишечнике и печени желчных кислот увеличивает катаболизм холестерина по принципу обратной связи. Протеины грибов содержат аминокислоты (аспаргиновую, липопротеинов; грибы содержат вещества, подобные ловастатину (мевинолину) – конкретному ингибитору 3-гидрокси, 3-метил-глютарилКоА-редуктазы, ключевого фермента метаболизма холестерина. Из гриба Pleurotus ostreatus (Вешенка устричная) получены коммерческие препараты, тонизирующие нервную систему и обладающие гипохолестеринемическим и гиполипидемическим действием [38,42].

Потенциальные продуценты ловастатина – грибы рода Pleurotus: P.

ostreatus, P. cornucopiae, P. eryngii, P. sapidus. Больше всего ловастатина обнаружено в P. ostreatus, в шляпке зрелых плодовых тел, которые рекомендуются в диете для снижения уровня холестерина. Включение в диету плодовых тел или пищевых добавок Lentinus edodes приводит к снижению уровня холестерина в крови, благодаря присутствию в них эритаденина (лентинацин, лентазин) С10Н11О4N5. Эритаденин способствует выводу холестерина из организма и его разложению. Коррекцию метаболизма липидов и уровня холестерина наблюдали в экспериментах при включении в диету животных плодовых тел и препаратов из Auricularia auricula-judae, Armillaria mellae, Coprinus domesticus, Flammulina velutipes, Grifola frondosa, Trametes versicolor, Tremella fuciformis, Volvariella volvacea [38,42].

Перспективно использование гриба Ganoderma lucidum в клинике сердечнососудистой патологии – тритерпеновая кислота снижает у людей группы риска уровень триглицеридов и липопротеидов низкой плотности в плазме крови на 68-74%, активно ингибирует биосинтез холестерина, причем лечебный эффект тем значительнее, чем выше уровень гиперхолестеринемии.

кровоснабжения и уменьшении потребности в кислороде. Лечение препаратами ганодермы больных кардиологических отделений было эффективным в 81,8% случаев при назначении в течение месяца, а в одном из отделений, где больные получали препарат до 4 месяцев, положительный результат достиг 93,3% [37].

Многие базидиомицеты содержат антибиотические вещества, активные против бактерий и грибов: полиацетилены (Marasmius spp., polyporus spp., Lepsita nuda., Serpula lacrimans, Clitocybe spp., Tricholoma nudum, Agrocybe dura ), фенольные соединения (Armillaria mellea, Kuehneromyces mutabilis, Pleurotus ostreatus, Pholiota, spp., Cortinarius armillatus, Hypholoma spp.), сесквитерпены (Lactarius vellereus, Pleurotellus hyponophilus), кориолин (Trametes spp.), кампестрин (Agaricus campestris), полипорин (Trametes versicolor), клитоцидин (Clitocybe spp.), муцидин (Oudemansiella mucida), иллуидины и др. Муцидин внедрен в промышленное производство и применяется при дерматомикозах.

Полициклический антибиотик плевротин, выделяемый из культуральной жидкости Hohenbuehelia grisea (Pleurotus griseus), активен против широкого спектра микроорганизмов, используется в ветеринарии [3,31].

Антибиотики базидиомицетов перспективны как средство борьбы с культуральная жидкость Polyporus sulphureus, Daedalea quercina, Kuerheromyces mutabilis, Panus conchatus угнетает рост некоторых грибоввредителей леса. Peniophora gigantea используется для получения биопрепаратов против возбудителей корневой гнили древесных пород.

Антивирусное действие веществ, содержащихся в плодовых телах и мицелии высших базидиомицетов, определяет их иммуномодулирующую активность. Такой эффект отмечен для лентинана из мицелия Lentinla edodes, лигана, препаратов из Ganoderma lucidum и G. Applanatum [6,8,45].

Антитромбические вещества – протеолитические ферменты некоторых базидиомицетов – могут представлять интерес как фибринолитические и тромболитические агенты (протеиназы Flammulina velutipes, Coprinus domecticus, С. Cinereus, Cerrena unicolor). Высокая протеолитическая активность у Pleurotus ostreatus, Armillaria mellea, Panus tigrinus, Lyophyllum ulmarium и др. [36].

Производные нуклеиновых кислот и нуклеотиды (5-АМФ, 5-ГМФ, эритаденин, дезоксилентинацин) обладают способностью угнетать агрегацию тромбоцитов, предупреждая образование тромбов.

Из мицелия Flammulina velutipes был получен ферментный препарат, обладающий прямой фибрино- и тромболитической активностью, что делает возможным использование его в медицине при комплексной терапии заболеваний сердечно-сосудистой системы [37].

1.4. Биологическая активность полисахаридов базидиомицетов определяющая перспективность использования их в качестве лекарственных препаратов и в составе БАД, связана с противоопухолевой, антимикробной и иммуномодулирующей активностью [109, 111, 115], а также с входящими в их состав полимерами, обладающими сорбиционными свойствами.

Полисахариды используются в комплексной противоопухолевой терапии в качестве препаратов, задерживающих развитие опухолей различной этимологии. Однако полисахариды не оказывают прямого токсического действия на опухолевые клетки, а ингибируют опухолевый рост и препятствуют образованию метастазов через активацию иммунной системы.

Так, полисахарид связывается с поверхностью лимфоцитов или со специфическими белками плазмы крови, которые активируют макрофаги, Тхелперы, натуральные киллеры (NК) и другие эффекторные клетки. Эти механизмы активации приводят к увеличению выработки антител, противоопухолевый эффект полисахаридов выражается в повышении иммунного статуса макроорганизма.

Полисахариды применяются в основном как противоопухолевый онкологических заболеваний. Однако иммуностимулирующие действия полисахаридов расширяют область применения, позволяя использовать их при разнообразных иммунодефицитных состояниях (перенесенных заболеваниях, в том числе инфекционных, стрессах, переутомлении и др.).

Применение полисахаридов приводит к восстановлению сниженной восстановление активности Т-хелперов, выделяющих ряд биологически активных факторов, которые повышают количество активированных макрофагов, антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов, усиливают кооперативное взаимодействие иммунокомпетентных клеток. В результате действия полисахаридов осуществляется коррекция иммунного статуса организма.

комплексы a-маннана с пептидами, которые являются водорастворимыми и могут быть выделены экстракцией горячей водой из Lentinus edodes. Другие полисахаридные фракции (гетерогликаны), составляющие незначительную иммуностимулирующим и противоопухолевым действием.

Полисахариды Lentinus edodes проявляют биологическую активность, противовирусную и противомикробную, как при пероральном, так и при парентеральном применении. Установлено, что полисахариды способны ингибировать репликацию некоторых аденовирусов, вирусов везикулярного стоматита и энцефалита [7]. Кроме того, они усиливают действие химиотерапевтических препаратов на вирус иммунодефицита человека, а также снижают их токсический эффект. Установлен терапевтический эффект полисахаридов и при некоторых микробных инфекциях, вызванных Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans.

Вместе с тем, полисахариды повышают сопротивляемость организма при потенциально летальных инфекциях, например, вызванных Listeria monocytogenes.

Основным механизмом антимикробной активности полисахаридов является усиление фагоцитоза [5].

Известно, что высокомолекулярные соединения, которые не перевариваются и не всасываются в организме человека, относят к пищевым волокнам. К таким соединениям можно отнести -глюканы, хитин, гетерополисахариды, входящие в полисахаридный комплекс Lentinus edodes.

Эти полимеры используются в составе низкокалорийных диетических продуктов и входят в состав БАД. Такие пищевые волокна сорбируют ионы тяжелых металлов, токсины, радионуклиды, а также канцерогенные соединения. Применение пищевых волокон такого состава способствует повышению защитных сил макроорганизма.

Наряду с высокой функциональной активностью -глюканов Lentinus edodes следует отметить важную роль хитина, входящего в состав полисахаридного комплекса. В плодовых телах высших базидиомицетов содержится 5-7% хитина [8]. В настоящее время большое внимание уделяется хитину и его деацетилированному производному – хитозану, входящему в состав многих биологически активных добавок к пище [9].

Хитин и хитозан, как и другие - гликаны Lentinus edodes, являются иммуностимуляторами. Они усиливают фагоцитарную активность макрофагов, активируют В-лимфоциты и продукцию цитокинов, таким образом стимулируя разные звенья иммунного ответа. При этом отмечаются сорбционные и эмульгирующие свойства хитина, которые, в частности, выражаются в липотропном действии, имеющем важное значение при сердечно-сосудистой патологии.

Кроме иммуностимулирующей, энтеросорбционной активности хитин обладает мощным ранозаживляющим эффектом. Хитин/хитозан оказывает влияние на цитоморфологию и размножение фибробластов. Эти полимеры представляют собой матрикс, способный удерживать и активировать рост фибробластов, что лежит в основе репарационных процессов [1].

Сочетание безвредности и биологической активности полисахаридов является важным фактором для создания на их основе биопрепаратов с противоопухолевыми свойствами.

БАВ базидиомицета Phallus impudicus (веселка). Базидиомицет Phallus impudicus (веселка) содержит много различных аминокислот, минеральных и других биологически активных веществ. Большой активностью обладает сок, извлечённый из плодовых тел гриба [23].

Phallus impudicus обладает иммуномодулирующим действием [23]:

активирует звено неспецифической противоопухолевой защиты, усиливают активность моноцитов и макрофагов. Наряду с этим, при опухолевом росте гриб веселка способен регулировать в сторону нормализации такие показатели как общее количество иммунокомпетентных клеток в полиморфоядерных лейкоцитов крови.

Препараты весёлки обладают противовоспалительным действием, повышают выносливость организма в борьбе с различными простудными и инфекционными заболеваниями [23].

Грибные фитонциды весёлки инактивируют вирусы герпеса, гриппа, гепатита и даже СПИДа.

Phallus impudicus способствует восстановлению клеток эпидермиса – заживляет раны, ожоги, обморожения, экземы, псориаз, трофические язвы и др., уменьшает боль и устраняет онемелость суставов.

Действующие вещества весёлки способны выводить холестерин и понижать давление, укрепляют и тонизируют организм (желе веселки с медом), устраняют усталость и защищают от негативного воздействия стресса.

Мицелий Phallus impudicus используется:

при лечении гастрита, язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, печени, почек, а также ревматизма и подагры;

для профилактики и лечения злокачественных и доброкачественных опухолей любой локализации, а также после химио- и лучевой терапии;

для лечения женских заболеваний – миомы, рака матки, мастопатии (при мастопатии сок гриба смешивают с белой глиной и на ночь накладывают на грудь);

для лечения простатита, для повышения потенции.

для лечения геморроя, разрывов прямой кишки и раковых заболеваний.

Полифункциональность действия и недостаток литературы по культивированию и биологической активности гриба веселки вызывают глубокий интерес у исследователей и практикующих врачей, которым необходимо получить достоверную научную информацию по применению и возможностью промышленного культивирования мицелия Phallus impudicus.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2005 по 2010 годы на кафедре биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И.Скрябина (г. Москва), в НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН им. Н.Н.Блохина, лаборатории профилактики онкологических профессиональных заболеваний (г. Москва), в производственной лаборатории ООО «ШИИТАКЕ» (г. Санкт-Петербург) и в СанктПетербургской химико-фармацевтической академии, кафедре микробиологии (г. Санкт-Петербург).

Культура микроорганизмов.

В работе была использована культура гриба базидиомицета штамм Phallus impudicus коллекции культур Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН (г. Санкт-Петербург).

Научное описание: Phallus impudicus Linnaeus, 1753: Persoon,1801; Отряд Basidiomycetes; порядок phallales; семейство phallaceae.

В качестве объекта исследования использовали культуру гриба базидиомицета штамм Phallus impudicus.

Phallus impudicus (Веселка обыкновенная) – сапротрофный гриб, обитающий в лиственных лесах и среди кустарников, на подстилке. Молодые плодовые тела веселки яйцевидные, реже шаровидные, белые или кремовые. При созревании перидий разрывается на 2-3 лопасти и остается в виде вульвы при основании рецептакула. Рецептакул полый, удлиненно-цилиндрический, высота 12-22 см и толщина 2-4 см. На вершине спороносная глеба в виде колокольчатой шляпки 4- см. высотой (рис.1), с сетью углублений, свободная, оливково-зеленоватая. Зрелый гриб имеет сильный неприятный запах. Гриб не ядовит, съедобен на стадии яйца.

Используется в народной медицине. Употребляется внутренняя слизистая оболочка молодого плодового тела в стадии яйца.

На плотной питательной среде культура образовывала колонии с хорошо развитым пушистым, войлочным воздушным мицелием. Цвет колонии белый, край колонии бахромчатый, поднимающийся, внешняя линия колонии неровная.

Субстратные мицелии не окрашены. Запах слабый, неопределенный. Рост медленный. При росте на сусло-агаре при температуре 26°С колония покрывает чашку Петри (90мм) за 4 - 5 недель.

При микроскопии культуры были найдены вегетативные ветвящиеся тонкостенные гифы шириной 2.5-5.0 мкм, с пряжками. Пряжка образовывала параллельные, прямые, близко лежащие друг к другу гифы. Встречаются прорастающие пряжки и анастомозы. При культивировании на жидкой питательной среде гриб образует пелеты (шарообразные скопления мицелия) диаметром 2-3 мм.

Экспериментальные животные.

В экспериментах по изучению препарата и оценке его противоопухолевых свойств были использованы следующие животные: 352 мышей C57Bl разводки питомника «Столбовая» РАМН, массой 18-20 г, 129 мышей-гибридов F1(С57ВlxCBA) и Balb/c разводки питомника «Столбовая» РАМН, массой 18-20 г.

Материалы, питательные среды, растворы и реактивы.

При проведении экспериментов были использованы стандартные питательные среды на основе сусла (плотные и жидкие ПС), а также ПС, разработанные нами в ходе проведения исследований.

В работе также применяли дистиллированную воду, концентрированную соляную кислоту, фосфатный буфер, 50 %-ный раствор глюкозы, некоторые другие химические реактивы и растворы, состав и наименование которых изложены в соответствующих разделах работы.

Использовали сырье, реактивы и материалы, прошедшие входной контроль и отвечающие требованиям действующих нормативных документов.

Технологическое оборудование.

технологическое оборудование: ферментационный комплекс: ферментатор BioStat (ФРГ), ферментатор БИОР-250, АЦП-система сбора данных, компьютер Pentium Pro. Ферментатор BioStat снабжен датчиками температуры, рН и рО2, термостатом, автоматической системой поддержания рН и уровня пены, блоком подачи растворов, воздушными фильтрами, первичной системой регистрации данных, системой установки и поддержания числа оборотов мешалки. Общий объем ферментатора – литра. Рабочий объем – 1,8 литра.

Смешение с лактозой для капсулирования «Веселки» проводили в барабанном смесителе типа ЛШСИ-40 с 2-3 кг стальных шаров диаметром от 6 до 14 мм.

Порошок препарата Веселка рассыпали в двойные пакетики из ламинированной бумаги на автомате типа АР – И3.

Капсулирование проводили на ручных капсулирующих установках типа Feton. Упаковывали капсулы в полумягкую оболочку на автомате для упаковки таблеток АУТ-М, в контурную ячейковую оболочку на автомате типа Блистер, в полимерные банки на установке King.

Методы исследования.

В процессе работы было отобрано и исследовано 270 образцов крови, 54 образца мочи, 43 образца опухолевой ткани, 33 образца перитониального содержимого, 5 образцов мицелия Phallus impudicus, 3 образца маточного раствора.

Контроль качества приготовленных питательных основ и сред проводили по методам, рекомендованным ГИСК им. Л.А.Тарасевича, по следующим показателям: внешний вид, растворимость, цветность, влажность, показатель концентрации водородных ионов, показатели общего и аминного азота, золы, белка, хлоридов, сульфатов, различных микроэлементов, редуцирующих веществ и т.д. [53, 54, 55].

Аминокислотный состав приготовленных гидролизатов определяли по методикам, описанным Телишевской Л.Я. [118].

Изучение пептидного состава гидролизатов проводили методом колоночной жидкостной гель-хpоматогpафии [118].

Контроль технологических процессов изготовления ПС осуществляли по методам, описанным Артюхиным В.И. с соавт. [55].

Определение рН сред проводили потенциометрическим методом.

Общий азот определяли методами Къельдаля и Несслера. Для оценки содержания азота в составе аминогрупп использовали показатель «аминный азот», который определяли методом формольного титрования [55, 60, 99].

Хлор-ионы в питательной среде определяли аргентометрическим методом, где титрантом являлся стандартный раствор нитрата серебра.

Эффективность гидролиза оценивали как отношение концентрации аминного азота к концентрации общего азота.

Для определения подлинности белковых гидролизатов использовали реакции с биуретовым, фосфорно-вольфрамовым реактивом [28, 99].

Определение биологических показателей ПС проводили согласно «Методическим рекомендациям» ГИСК им. Л. А. Тарасевича [53].

Для сравнительной оценки свойств разработанных ПС в качестве контрольных использовали регламентные среды на основе сусла.

Оценку ростовых свойств жидких ПС проводили на спектрофотометре ультрафиолетовом UV -1601 фирмы Shimadzu (Япония) по изменению оптической плотности (ОП) за период инкубации посевов [89].

Общую концентрацию микроорганизмов (ОК) определяли методом последовательных десятикратных разведений материала в 0,85%-ном растворе хлористого натрия с последующим подсчетом бацилл в камере Горяева.

Концентрацию белка определяли по методу Лоури [67].

Определение редуцирующих сахаров выполняли по ГОСТ 12575-2001.

Количественный анализ моносахаридного состава проводили методом ГЖХ.

Кулонометрическим методом определяли антиоксидантную активность [131].

Хемилюминесцентную активность регистрировали прибором Биолюмат, модель 9500 (Berthoold, Германия).

Хемилюминесцентный метод измерения антиоксидантных свойств.

Выделение активных форм кислорода фагоцитами крови и перитонеальной жидкости (нейтрофилами, моноцитами и макрофагами) определяли по люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) [2,3,10].

Содержание нитритов (НИ) в биологических жидкостях: крови, перитонеальном содержимом и моче определяли методом Грисса [3].

Рост опухоли оценивали по торможению роста опухоли (ТРО) у животных опытных групп в сравнении с контрольной группой:

ТРО = (Vк-Voп)/Vк x 100 %, где:

Vк - средний объем опухоли в контрольной группе, Voп - средний объем опухоли в опытной группе (мм3).

Постороннюю микрофлору в исследуемом препарате определяли путем высева на чашки Петри с агаризованными средами методом Дригальского.

Безвредность препарата проверяли на белых мышах.

Экспериментальные данные обрабатывали методом корреляционного, вариационного и факторного статистического анализа с использованием пакета компьютерных программ «Statgraphics Plus for Windous», «Statistica 6,0» и анализом результатов по Ашмарину И.П. и Воробьеву А.А. [33].

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Изучение процесса культивирования базидиомицета в жидких питательных средах Получение посевной биомассы мицелия гриба Phallus impudicus осуществляли способом глубинного культивирования на жидкой глюкозопептонной среде следующего состава: пептон – 1,5 г/л, глюкоза – г/л, NaCl – 0,5 г/л, СаСl2 – 0,05 г/л, MgS04 – 0,5 г/л, КН2РО4 – 0,6 г/л, К2НРО – 0,4 г/л, дрожжевой экстракт – 1.5 г/л; а также жидкое сусло в концентрации 7,5% (по углеводам).

Стерилизацию среды проводили в автоклаве в течение 40 минут при избыточном давлении 0,5 атм. Дрожжевой экстракт стерилизован отдельно в течение 30 мин при 0,5 атм. Культуру выращивали на лабораторной качалке при 120 об/мин (при непрерывном перемешивании), при t = 24°C в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл. В качестве исходного посевного материала использовали штамм Phallus impudicus, выращенный на скошенном сусло-агаре. Для посева брали около 1 см2 плёнки гриба. Для получения посевного материала культуру выращивали в течение 3-4 суток и затем 10 мл посевного материала засевали в ферментационные колбы, содержание – 150 мл среды. Ферментацию проводили в течение 9 суток.

Выбор и оптимизацию условий культивирования проводили по важнейшим параметрами оказывающими влияние на рост биомассы: рН, температура культивирования и коэффициент массопередачи кислорода. Для механолабильных культур, к которым относятся базидиальные грибы, при использовании аппаратов с механическим перемешиванием ограничивающим фактором является также критическая линейная окружная скорость мешалки, при превышении которой происходит травмирование гиф гриба.

Выбор оптимального показателя рН при сравнении с процессом при нерегулируемом рН обеспечивает наиболее высокую скорость роста и накопления биомассы культуры. Экспериментальное культивирование проводили в ферментаторе при рН 5,0, 4,5, 4.0, 3,5, результаты представлены в таблице 1.





Похожие работы:

«ШЕВЧЕНКО НЕЛЛИ ПЕТРОВНА УГОЛОВНАЯ ОТВЕТСТВЕННОСТЬ ЗА ВОВЛЕЧЕНИЕ НЕСОВЕРШЕННОЛЕТНЕГО В СОВЕРШЕНИЕ ПРЕСТУПЕНИЯ 12. 00. 08 – уголовное право и криминология; уголовно-исполнительное право ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата юридических наук Научный руководитель : доктор юридических наук, доцент Блинников Валерий Анатольевич Ставрополь, ОГЛАВЛЕНИЕ Введение.. Глава 1. Понятие и...»

«Пецух Ольга Петровна ФОРМИРОВАНИЕ ГУМАНИСТИЧЕСКОГО ДИСКУРСА УЧИТЕЛЯ-ЛОГОПЕДА В ДОПОЛНИТЕЛЬНОМ ПРОФЕССИОНАЛЬНОМ ОБРАЗОВАНИИ 13.00.08 – Теория и методика профессионального образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель : доктор педагогических...»

«Слюняев Андрей Юрьевич ЧИСЛЕННОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ СВЕРХЗВУКОВЫХ ТЕЧЕНИЙ ГАЗА НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО МЕТОДА РАСЩЕПЛЕНИЯ 05.13.18 – математическое моделирование, численные методы и комплексы программ Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель д.ф.-м.н., проф. В.М. Ковеня Новосибирск, ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава I. Исходная система уравнений и...»

«Захарова Татьяна Владимировна МОНИТОРИНГ ФАКТОРОВ РЕГИОНАЛЬНОЙ ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ (НА ПРИМЕРЕ ОТРАСЛИ РАСТЕНИЕВОДСТВА СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ) Специальность 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством: экономическая безопасность Диссертация на соискание ученой степени кандидата экономических наук Научный руководитель доктор экономических наук профессор А.И. Белоусов Ставрополь – Оглавление Введение 1.1. Устойчивое...»

«КУЗНЕЦОВ ЛЕВ АНДРЕЕВИЧ ФОРМИРОВАНИЕ ИНТЕГРИРОВАННОЙ СИСТЕМЫ ПРОДВИЖЕНИЯ КРУПНОГО ТУРИСТСКОГО ЦЕНТРА НА РОССИЙСКОМ И МЕЖДУНАРОДНОМ РЫНКАХ ТУРИСТСКИХ УСЛУГ Специальность 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством: экономика, организация и управление предприятиями,...»

«Стойлов Сергей Валентинович Уретральные стенты в терапии доброкачественной гиперплазии и рака предстательной железы (14. 00. 40 - урология) Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор Л.М. Рапопорт Москва, 2004 г Оглавление. Введение: Актуальность темы, цель, задачи, научная новизна, практическая ценность исследования Глава 1. Место...»

«Акбаева Галина Михайловна ОСОБЕННОСТИ ЭЛЕКТРОФИЗИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РЯДА СЕГНЕТОМЯГКИХ МАТЕРИАЛОВ НА ОСНОВЕ ЦТС 01.04.07 – физика конденсированного состояния Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель доктор физико-математических наук,...»

«МЕЛЬСИТОВ Владислав Александрович ОПТИМИЗАЦИЯ ОКАЗАНИЯ ХИРУРГИЧЕСКОЙ ПОМОЩИ БОЛЬНЫМ С СИНДРОМОМ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ СТОПЫ 14.01.17 – Хирургия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель : доктор медицинских наук Осинцев...»

«Горшков Антон Валерьевич МЕТОДЫ И АЛГОРИТМЫ РЕШЕНИЯ ЗАДАЧИ СТРУКТУРНОГО СИНТЕЗА СИСТЕМЫ ИСТОЧНИКОВ И ДЕТЕКТОРОВ ЗОНДИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ 05.13.01 – Системный анализ, управление и обработка информации (в наук е и промышленности) (технические науки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель д.т.н. Гергель Виктор Павлович Научный консультант к.ф.-м.н. Кириллин Михаил...»

«Фадеева Елена Ивановна КОЛЛЕГИАЛЬНОСТЬ СОСТАВА СУДА В ХОДЕ СУДЕБНОГО ПРОИЗВОДСТВА ПО УГОЛОВНЫМ ДЕЛАМ Специальность 12.00.09 – уголовный процесс Диссертация на соискание ученой степени кандидата юридических наук Научный руководитель : кандидат юридических наук,...»

«Емельянова Татьяна Геннадьевна СОЦИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ В ПРОФЕССИОНАЛЬНОМ САМООПРЕДЕЛЕНИИ СТУДЕНТОВ ССУЗА 19.00.07 - Педагогическая психология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата психологических наук ИЖЕВСК, 2006 СОДЕРЖАНИЕ Введение Глава 1. Социальные факторы в профессиональном самоопределении 1.1. Профессиональное самоопределение молодежи в...»

«Федосеева Лариса Абрамовна Экспрессия ключевых генов ренин-ангиотензиновой системы у гипертензивных крыс НИСАГ 03.02.07 – генетика ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: д.б.н., проф. А.Л.Маркель д.б.н., проф. Г.М.Дымшиц Новосибирск 2  ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..................»

«КАЛИНИН Владимир Анатольевич КЛИНИКО-ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И ТЕЧЕНИЕ ЭПИЛЕПСИИ В РАЗЛИЧНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУППАХ 14.01.11 - нервные болезни Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант : доктор медицинских наук, профессор И.Е. Повереннова...»

«МАТВЕЕВ Данила Викторович СТРУКТУРА И СВОЙСТВА МАССИВНЫХ АМОРФНЫХ И НАНОКРИСТАЛЛИЧЕСКИХ СПЛАВОВ НА ОСНОВЕ Zr И Fe 01.04.07 – физика конденсированного состояния Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель : доктор физико-математических наук, А.С. Аронин Черноголовка ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.. 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.. 1.1. Термодинамика и кинетика кристаллизации аморфных...»

«Харин Егор Сергееевич Древнерусское монашество в XI – XIII вв: быт и нравы. Специальность 07.00.02 – отечественная история Диссертация на соискание ученой степени кандидата исторических наук Научный руководитель кандидат исторических наук, доцент В.В. Пузанов Ижевск 2007 Оглавление Введение..3 ГЛАВА I. ИНСТИТУТ МОНАШЕСТВА...»

«Гасанов Сергей Сергеевич СОЦИАЛЬНЫЕ КОРНИ ПРЕСТУПНОСТИ НА СЕВЕРНОМ КАВКАЗЕ 09.00.11 – социальная философия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата философских наук Научный руководитель – доктор философских наук, профессор Гриценко Василий Петрович Краснодар – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ТЕОРЕТИКО-МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОЦИАЛЬНО-ФИЛОСОФСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПРЕСТУПНОСТИ.. 1. 1. Социальные...»

«Кикин Павел Михайлович РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ СОЗДАНИЯ ТЕМАТИЧЕСКИХ КАРТ СРЕДСТВАМИ ВЕБ-ТЕХНОЛОГИЙ 25.00.33 – Картография Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель : кандидат технических наук, доцент Касьянова...»

«Хайбрахманов Сергей Александрович Остаточное магнитное поле аккреционных дисков молодых звезд Специальность 01.04.02 — Теоретическая физика Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель : д.ф.-м.н., профессор Дудоров А.Е. Челябинск – Содержание Введение 1. Аккреционные диски молодых...»

«Шевчук Станислав Олегович РАЗРАБОТКА ФОТОГРАММЕТРИЧЕСКОГО СПОСОБА ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАВИГАЦИОННЫХ ПАРАМЕТРОВ АЭРОЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 25.00.34 – Аэрокосмические исследования Земли, фотограмметрия Диссертация на соискание учёной степени кандидата...»

«ДЕМЕХИН Филипп Владимирович ФОРМИРОВАНИЕ И РАСПАД РЕЗОНАНСНЫХ СОСТОЯНИЙ АТОМОВ И ПРОСТЫХ МОЛЕКУЛ, ВОЗБУЖДЕННЫХ МЯГКИМ РЕНТГЕНОВСКИМ И УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ 01.04.05 — оптика Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук Воронеж – 2007 2. Список сокращений АО атомная орбиталь ВПТВ второй порядок теории возмущений ВУ вековое (секулярное) уравнение ДЛП спектроскопия двойной лазерной плазмы...»






 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.